Summary
Bakers Hefe mitochondriales Genom kodiert acht Polypeptide. Das Ziel des aktuellen Protokolls ist es, sie alle zu beschriften und anschließend als separate Bänder zu visualisieren.
Abstract
Mitochondrien sind essentielle Organellen von eukaryotischen Zellen, die aerobe Atmung können. Sie enthalten kreisförmige Genom- und Genexpressionsapparate. Ein mitochondriales Genom der Bäckerhefe kodiert acht Proteine: drei Untereinheiten der Cytochrom-C-Oxidase (Cox1p, Cox2p und Cox3p), drei Untereinheiten der ATP-Synthase (Atp6p, Atp8p und Atp9p), eine Untereinheit des Ubiquinol-Cytochrom-c-Oxidoreduktivase-Enzyms, Cytochrom b (Cytb) und mitochondrialem ribosomalem Protein Var1p. Der Zweck der hier beschriebenen Methode ist es, diese Proteine gezielt mit 35S Methionin zu kennzeichnen, sie durch Elektrophorese zu trennen und die Signale als diskrete Bänder auf dem Bildschirm zu visualisieren. Das Verfahren umfasst mehrere Schritte. Zunächst werden Hefezellen in einem Galaktose-haltigen Medium kultiviert, bis sie das späte logarithmische Wachstumsstadium erreichen. Als nächstes blockiert die Cycloheximid-Behandlung die zytoplasmatische Translation und erlaubt 35S-Methionin-Einarbeitung nur in mitochondriale Translationsprodukte. Anschließend werden alle Proteine aus Hefezellen extrahiert und durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt. Schließlich wird das Gel getrocknet und mit dem Speicherphosphor-Bildschirm inkubiert. Der Bildschirm wird auf einem Phosphorimager gescannt, der die Bänder enthüllt. Die Methode kann angewendet werden, um die Biosyntheserate eines einzelnen Polypeptids in der Mitochondrie eines mutierten Hefestamms mit dem Wildentyp zu vergleichen, der für die Untersuchung von mitochondrialen Genexpressionsdefekten nützlich ist. Dieses Protokoll liefert wertvolle Informationen über die Übersetzungsrate aller Hefe mitochondrialen mRNAs. Es erfordert jedoch mehrere Kontrollen und zusätzliche Experimente, um richtige Schlussfolgerungen zu ziehen.
Introduction
Mitochondrien sind die Organellen, die tief in den Stoffwechsel einer eukaryotischen Zelle involviert sind. Ihre Elektronentransferkette versorgt die Zelle mit ATP, der wichtigsten energetischen Währung, die in mehreren biochemischen Bahnen verwendet wird. Außerdem sind sie an Apoptose, Fettsäure- und Hämsynthese und anderen Prozessen beteiligt. Dysfunktion der Mitochondrien ist eine bekannte Quelle der menschlichen Krankheit1. Es kann aus Mutationen in nuklearen oder mitochondrialen Genen resultieren, die strukturelle oder regulatorische Komponenten der Organellen kodieren2. Bakers Hefe Saccharomyces cerevisiae ist aus mehreren Gründen ein ausgezeichneter Modellorganismus für die Untersuchung der mitochondrialen Genexpression. Erstens ist ihr Genom vollständig sequenziert3, gut annotiert, und eine große Summe von Daten ist bereits in der Literatur dank der langen Geschichte der Untersuchungen mit diesem Organismus durchgeführt. Zweitens sind die Manipulationen mit ihrem Kerngenom aufgrund ihrer schnellen Wachstumsrate und ihres hocheffizienten homologen Rekombinationssystems relativ schnell und einfach. Drittens ist die Bäckerhefe S. cerevisiae einer der wenigen Organismen, für die die Manipulationen mit mitochondrialen Genomen entwickelt werden. Schließlich ist Bäckerhefe ein aerobe-anaerobe fakultativer Organismus, der die Isolierung und Untersuchung von atemmedizinischen defekten Mutanten ermöglicht, da sie in Medien wachsen können, die fermentierbare Kohlenstoffquellen enthalten.
Wir beschreiben die Methode zur Untersuchung der mitochondrialen Genexpression der Bäckerhefe S. cerevisiae auf der Translationsebene4. Sein Hauptprinzip ergibt sich aus mehreren Beobachtungen. Erstens kodiert das Hefemitochondrialgenom nur acht Proteine: drei Untereinheiten der Cytochrom-c-Oxidase (Cox1p, Cox2p und Cox3p), drei Untereinheiten der ATP-Synthase (Atp6p, Atp8p und Atp9p), eine Untereinheit des Ubiquinol-Cytochrom-c-Oxidoreduktivase-Enzyms, Cytochrom b (Cytb) und mitochondriales ribosomales Protein Var1p5. Diese Zahl ist klein, und alle von ihnen können durch Elektrophorese auf einem einzigen Gel unter den entsprechenden Bedingungen getrennt werden. Zweitens gehören mitochondriale Ribosomen eher zur prokaryotischen Klasse als zu eukaryotischen6, und daher ist die Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika bei Hefezytoplasma- und Mitochondrienribosomen unterschiedlich. Es ermöglicht die Hemmung der zytoplasmatischen Translation mit Cycloheximid, die Bedingungen, wenn die markierte Aminosäure(35S-Methionin) nur in mitochondrialen Übersetzungsprodukten enthalten ist. Als Ergebnis liefert das Experiment Informationen über die Rate der Aminosäure-Inkorporation in mitochondrialen Proteinen synthetisiert de novo, was die Gesamteffizienz der mitochondrialen Übersetzung für jedes der acht Produkte widerspiegelt
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Protocol
1. HefekulturVorbereitung
- Streifen Hefe aus den gefrorenen Stockkulturen auf frischen Tellern mit dem entsprechenden Medium. Legen Sie die Platten in einen Kultur-Inkubator bei 30 °C für 24-48 h.
HINWEIS: Lassen Sie die temperaturempfindlichen Mutanten bei der freizügigen Temperatur wachsen. - Hefekulturen in 2 ml YPGal-Medium (2% Pepton, 1% Hefeextrakt, 2% Galaktose) aus dem frischen Streifen in 15 ml-Röhrchen impfen und über Nacht bei 200 U/min bei 30 °C aufregen.
- Messen Sie die optische Dichte der Kultur bei einer Wellenlänge von 600 nm (OD600).
- Nehmen Sie das Volumen von 0,2 Absorptionseinheiten in sterilen Röhren, Pellethefezellen bei 9.000 x g für 30 s bei Raumtemperatur, und entsorgen Sie den Überstand.
- Waschen Sie Zellen mit 0,5 ml sterilem Wasser durch Wirbeln für 5 s. Pellethefezellen bei 9.000 x g für 30 s bei Raumtemperatur und entsorgen den Überstand. Verdünnung der Zellen in 2 ml frischem YPGal-Medium.
- Inkubieren Sie bei 200 Umdrehungen/ Min.und 30 °C, bis OD600 1,5–1,9 Werte erreicht.
HINWEIS: Die Hefewachstumsraten variieren, also seien Sie bereit zu warten. Es ist vernünftig, die Schritte 1.3–1.6 am frühen Morgen zu machen. Es dauert in der Regel 4-5 h, kann aber länger dauern.
2. Radioaktive Isotopen-Einarbeitung
- Übertragen Sie das Kulturvolumen, das einer optischen Einheit in einem Mikrozentrifugenrohr entspricht. Drehen Sie die Rohre bei 3.000 x g für 1 min und entsorgen Sie den Überstand. Mit 0,5 ml sterilem Wasser durch Wirbeln für 5 s waschen.
- Pellethefezellen bei 9.000 x g für 30 s bei Raumtemperatur und entsorgen den Überstand. Hefezellen in 0,5 ml sterilem Translationspuffer resuspendieren. Legen Sie die Aufhängung in ein 15 ml Rohr.
HINWEIS: Der Translationspuffer ist eine Lösung, die 2% Galaktose (w/v) und 50 mM Kaliumphosphat mit pH 6.0 enthält.
- Pellethefezellen bei 9.000 x g für 30 s bei Raumtemperatur und entsorgen den Überstand. Hefezellen in 0,5 ml sterilem Translationspuffer resuspendieren. Legen Sie die Aufhängung in ein 15 ml Rohr.
- Cycloheximid bis zu einer Endkonzentration von 0,2 mg/ml zur Zellsuspension hinzufügen. Inkubieren Sie für 5 min Aufreger bei 200 Rpm und 30 °C, um die zytosolische Übersetzung zu hemmen.
HINWEIS: Cycloheximidlösung (20 mg/ml, in Ethanol) sollte vor dem Experiment frisch zubereitet werden. Chloramphenicol kann erfolgreich mit Anisomycin in der gleichen Konzentration ersetzt werden7. - Fügen Sie der Zellsuspension 25–30 Ci von 35S-Methionin hinzu und inkubieren Sie 30 min Aufreger bei 200 Umdrehungen bei 200 Rprossen und 30 °C.
HINWEIS: Die Mischung aus 35S-Methionin und 35S-Cystein kann auch verwendet werden. Pure 35S-Methionin ergibt das stärkste Signal und das beste Signal-Rausch-Verhältnis. Im Allgemeinen ist Methionin effektiver als Cystein, weil der Gehalt dieser Aminosäure in mitochondrialen Proteinen höher ist. Die EasyTag-Mischung aus 35S-Methionin und Cystein ist jedoch kostengünstiger und liefert vergleichbare Ergebnisse7.
VORSICHT: 35S-Methionin ist radioaktiv. Befolgen Sie die üblichen Sicherheitspraktiken für den Umgang mit radioaktiven Stoffen.
HINWEIS: Es ist allgemein bekannt, dass die Einbeziehung von Radioaktivität eine Grenze erreicht, aufgrund derer sich die Gesamtsignale im Laufe der Zeit absetzen. Sobald diese Grenze erreicht ist, ist es fast unmöglich, die Raten zu bestimmen, mit denen die verschiedenen Übersetzungsprodukte synthetisiert werden. Um die Rate der mitochondrialen Übersetzung zu analysieren, ist es zwingend erforderlich, in einem Zustand zu sein, in dem die Signalintensität mit der Zeit der Inkubation mit 35S-Methionin in linearer Weise zunimmt. Bei gängigen Labor-Wildtyp-Stämmen ist das Signal bereits für Inkubationszeiten gesättigt, die weit kürzer sind als die 30 min. Translationale Mutanten können sich sehr unterschiedlich verhalten. Es sollte ein Zeitkurs durchgeführt werden, um die Kinetik der Radioaktivitätsintegration und damit die Übersetzungsrate zu ermitteln, zumindest wenn mit einer neuen Sorte gearbeitet wird. Hierfür empfehlen wir, Proben mit einem Intervall von mehreren Minuten (z. B. 2,5, 5,0, 7,5, 10 und 20 min) zu nehmen. - Fügen Sie unbeschriftetes "kaltes" Methionin (Endkonzentration sollte 20 mM betragen) und Puromycin (Endkonzentration sollte 1–10 g/ml betragen) hinzu, um die Etikettierung zu stoppen. 10 min aufstellen bei 200 Umdrehungen bei 200 Umdrehungen und 30 °C inkubieren.
HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig, um Ribosomen Zeit zu geben, um die Übersetzung der Peptide abzuschließen. Andernfalls werden alle Polypeptide, die kürzer als die volle Länge sind, in einer anderen Größe erkannt. In diesem Schritt kann ein Zeit-Kurs-Experiment (Pulse-Chase) durchgeführt werden, um die Stabilität von mitochondrialen Übersetzungsprodukten zu bestimmen. Setzen Sie dazu die Inkubationsaufnahme mit einem Intervall von 30 min (z. B. 30, 60, 90 und 120 min) fort.
3. Hefezelllyse und Extraktion von Proteinen
- Sammeln Sie Hefezellen durch Zentrifugation bei 9.000 x g für 30 s. Waschen Sie die Zellen mit 0,5 ml sterilem Wasser, indem Sie 5 s wirbeln. Pellethefezellen bei 9.000 x g für 30 s bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand.
Hinweis. Das Protokoll kann hier angehalten werden. Lagern Sie die Proben bei -20 °C. - Fügen Sie dem Pellet 75 L Lysepuffer und Wirbel für 5–10 s hinzu.
HINWEIS: Lysispuffer ist eine Lösung aus 1,8 M NaOH, 1 M β-Mercaptoethanol und 1 mM PMSF in Wasser. Vermeiden Sie eine übermäßige Inkubation mit Lysepuffer, der zu einer alkalischen Hydrolyse von Proteinen führt. Fahren Sie sofort mit Schritt 3.3 fort. - Fügen Sie 500 l von 0,5 M Tris-HCl Puffer mit pH 6.8 hinzu. Wirbel kurz.
4. Niederschlag von Proteinen
VORSICHT: Methanol und Chloroform sind organische Lösungsmittel. Befolgen Sie die üblichen Sicherheitspraktiken für den Umgang mit organischen Stoffen.
- Fügen Sie der Probe 600 l Methanol hinzu. Wirbel für 5 s.
- Fügen Sie der Probe 150 l Chloroform hinzu. Wirbel für 5 s.
- Zentrifugieren Sie die Proben für 2 min bei 12.000 x g. Entsorgen Sie die obere Phase vorsichtig mit einem Sampler.
- Fügen Sie der Probe 600 l Methanol hinzu. Mischen Sie sorgfältig, indem Sie das Rohr mehrmals invertieren.
- Zentrifugieren Sie die Proben für 2 min bei 12.000 x g. Entsorgen Sie den Überstand.
- Das Pellet 2 min bei 80 °C lufttrocknen.
HINWEIS: Die gesamte Flüssigkeit sollte verdampfen. Es besteht die Gefahr einer abwegigen Trennung von Proteinen im Gel, wenn das Pellet unzureichend getrocknet wurde. Es ist jedoch nicht möglich, das Pellet zu übertrocknen, so dass es sogar über Nacht bei 4 °C gelagert werden kann. - Lösen Sie ausgefällte Proteine in 60 l 1x Laemmli-Probenpuffer auf.
- 10 min bei 40 °C erhitzen.
HINWEIS: Vermeiden Sie das Kochen der Proben bei 95 °C, da dies zu einer Aggregation führt. Wenn sich die Aggregate noch bilden, drehen Sie die Proben bei 12.000 x g für 2 min und sammeln Sie den Überstand. Proben können bei -20 °C gelagert werden. Das Protokoll kann hier angehalten werden.
5. SDS-PAGE
- Gießen Sie das 17,5% Laemmli SDS-Polyacrylamid-Gel.
HINWEIS: 6 M Harnstoff kann dem Gel hinzugefügt werden, um besser atp8 und atp9 aufzulösen. Gradient 15%–20% Gele können auch eine bessere Auflösung geben. - Legen Sie 15 l (40–50 g) jeder Probe in die Taschen.
HINWEIS: Es ist nicht notwendig, die Proteinkonzentration zu messen, wenn die OD600-Werte in Schritt 1.6 nahe waren. Wenn nicht, messen Sie die Proteinkonzentrationen mit dem Assay mit waschmittelkompatiblen Reagenzien. - Führen Sie das Gel in einem kalten Raum, bis der blaue Farbstoff etwa 65% der Gellänge erreicht.
HINWEIS: Für das verwendete System (z. B. Protean II xi Cell) verwenden wir einen der beiden Modi: 16–17 h bei 5 V/cm oder 5 h bei 15 V/cm. Keine Proteine laufen schneller als der Bromphenol-Blaufarbstoff, aber lange Läufe können zu Einer Verwischung der atp8- und atp9-Signale führen. - Färben Sie das Gel mit Coomassie brillant blau und machen Sie einen Scan oder Foto, die als Ladekontrolle erforderlich ist.
HINWEIS: Eine alternative Möglichkeit, eine Belastungskontrolle zu machen, ist die Immunoblotting mit einem Antikörper gegen das mitochondriale "Haushalte"-Gen, z. B. Porin 1.
6. Autoradiographie
- Trocknen Sie das Gel in einem Gel-Trockner. Bewahren Sie es 3–5 Tage lang mit einem Phosphor-Speicherbildschirm in der Kassette auf.
HINWEIS: Eine Alternative zum Screening des getrockneten Gels ist die Übertragung von Proteinen auf eine Nitrocellulosemembran durch Elektro-Blotting und anschließendes Screening. Es führt zu stärkeren Signalen und schärferen Bändern. - Scannen Sie den Bildschirm auf einem Phosphorimager.
HINWEIS: Als Alternative zur Phosphor-Bildgebung kann auch Röntgenfilm verwendet werden, um die Signale zu offenbaren.
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Representative Results
Nach dem oben beschriebenen Protokoll haben wir mitochondriale Übersetzungsprodukte aus zwei S. cerevisiae Stämmen zugewiesen: den wilden Typ (WT) und eine mutierte Lagerlöschung des AIM23-Gens (AIM23 ),die mitochondrialen Translationinitiationsfaktor 3 (Tabelle 1)8kodieren. Mitochondriale Übersetzungsprodukte wurden in SDS-PAAG9 radioaktiv gekennzeichnet und getrennt. Die Proben wurden alle 2,5 min vor der Sättigung gesammelt, um einen Zeitkurs zu erstellen (Abbildung 1A). Das Gel wurde nach der 5-tägigen Exposition gebeizt, getrocknet und gesiebt (Abbildung 1A).
Bei einem erfolgreichen Experiment zeigt das Bild acht Bänder, die nach dem Standardmuster4zugeordnet sind. Die Intensitäten der einzelnen Bänder können jedoch je nach Dehnung und experimentellen Bedingungen sehr variabel sein. Jede Band entspricht einem Übersetzungsprodukt. Die Daten (Abbildung 1A) deuten darauf hin, dass der AIM23-Stamm in der Lage ist, mitochondriale Proteinsynthese zu betreiben, da alle Produkte, die in der WT erscheinen, in dieser Mutante sichtbar sind. Die Intensitäten der Bänder unterscheiden sich jedoch von der WT, was bedeutet, dass die Deletion von AIM23 die mitochondriale Genexpression8beeinflusst. Coomassie Brilliant Blue Färbung dient als Ladekontrolle.
Die resultierenden Daten können quantifiziert werden (Abbildung 1B), um Unterschiede zwischen Stämmen oder experimentellen Bedingungen mit ImageJ10 oder ImageQuant-Software zu identifizieren. Dazu werden die Verhältnisse des Signals berechnet, die jedem Produkt zum Gesamtsignal entsprechen. Mittelwerte und Standardabweichungen werden in mindestens drei unabhängigen Experimenten berechnet.
Die Kinetik des Synthetisierungs-Proteinumsatzes wird in einem Puls-Chase-Experiment untersucht (Abbildung 1C). Die Proben werden zu den angegebenen Zeitpunkten gesammelt, nachdem die Etikettierungsreaktion durch kaltes Methionin und Puromycin in Schritt 2.4 gestoppt wurde. Diese Kontrolle ist notwendig, um die Stabilität der Produkte abzuschätzen, da die Intensität des Signals das Ergebnis zweier entgegengesetzter Prozesse ist: Synthese neuer Ketten und Proteinabbau. Die Immunostainierung mit Antiporin-1-Antikörpern ist eine Belastungskontrolle.
Abbildung 1: Repräsentative radioaktive Kennzeichnung von Hefemitochondrial-Übersetzungsprodukten. (A) Zeitverlauf von 35S-Methionin-Inkorporation in mitochondrially synthetisierten Proteinen in lebenden Hefezellen von WT- und AIM23-Stämmen. Coomassie Brilliant Blue Färbung ist eine Ladekontrolle. (B) Gehalt an mitochondially-kodierten Proteinen nach 5 min Etikettierung mit 35S-Methionin. Die relative Expression wird zur Gesamtexpression mitochondrially kodierter Proteingene normalisiert. Fehlerbalken geben die Standardabweichung des Mittelwerts von mindestens drei unabhängigen Experimenten an. (C) Umsatz mitochondrierter Proteine in Wild- und Aim23-Stämmen. Die Etikettierung wurde gestoppt und die Proben zu den angegebenen Zeitpunkten entnommen. Die Immunostainierung mit Antiporin-1-Antikörper ist eine Belastungskontrolle. (D) Suboptimales Experiment mit altem 35S-Methionin, Radioautographie. Abbildung 1A, B,C sind von8 mit kleineren Modifikationen angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Belastung | Genotyp |
| Wt | MAT-mal |
| AIM23 | MAT-mal, AIM23::KanMX4 |
Tabelle 1. Genotypen von S. cerevisiae Stämmen
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Discussion
Untersuchungen der Genexpression spielen einen zentralen Teil der modernen Biowissenschaften ein. Es wurden zahlreiche Methoden entwickelt, die Einblicke in diesen komplexen Prozess geben. Hier beschrieben wir die Methode, die den Zugang zur Proteinbiosynthese in der Bäckerhefe S. cerevisiae mitochondria ermöglicht. Es wird in der Regel angewendet, um die Übersetzungseffizienz der mRNAs in Mitochondrien des mutierten Hefestamms im Vergleich zum Wildtyp zu vergleichen, um auf die Folgen der untersuchten Mutation zuzugreifen. Dies ist eines der grundlegenden Experimente, die die Forscher durchführen, wenn sie die mitochondriale Funktion von Hefezellen untersuchen, die die Mutation tragen, die vorgeschlagen wurden, Mitochondrien8,11,12,13zu beeinflussen. Es wird oft mit den Messungen der Sauerstoffverbrauchsrate und des mitochondrialen Membranpotenzials kombiniert. Die darin zur Verfügung stehten Informationen reichen jedoch nicht aus, um zu unterscheiden, welches Stadium der Genexpression betroffen ist. Eine Reihe zusätzlicher Experimente ist erforderlich, um es herauszufinden. Erstens ist die Bewertung von mitochondrialen mRNAs durch den nördlichen Blot oder RT-qPCR erforderlich, um den Transkriptionsschritt zu bewerten. Zweitens sollte ein westlicher Fleck von Gesamtproteinextrakten mit spezifischen Antikörpern durchgeführt werden, um den Proteingehalt zu bewerten. Drittens sollte der Puls von 35S-Methionin (heiß) mit der Zugabe von unbeschriftestem (kaltem) Methionin (Chase) fortgesetzt und mehrere Zeitpunkte auf dem Gel analysiert werden, um die Stabilität der Proteine zu untersuchen.
Eine genaue Analyse der mitochondrialen Genexpression mit 35S Pulsbeschriftung erfordert Kontrollreaktionen, insbesondere wenn dem Forscher die Erfahrung fehlt, damit umzugehen, oder wenn er mit einem neuen Hefestamm oder einem Mutanten arbeitet. In diesen Fällen ist eine gute Negativkontrolle ein Rho0-Stamm ohne mitochondriale DNA. Es zeigt eine effiziente Cycloheximid-Hemmung der zytosolischen Übersetzung und bestätigt, dass das Banding-Muster mitochondrial elektyliert ist. Wenn der Rho0-Stamm nicht verfügbar ist, schlagen wir vor, Chloramphenicol zusammen mit Cycloheximid einzuschließen, um die gesamte Proteinsynthese zu hemmen, um die Cycloheximid-Effizienz und Spezifität des Banding-Musters zu bestätigen.
Die nächste Modifikation des Protokolls ist die Pulsjagd, wenn die Kultur im Shaker (Schritt 2.4) länger inkubiert wird als im Pulsexperiment vorgeschlagen (Abbildung 1C). Es wird verwendet, um den Umsatz und die Stabilität von mitochondrialen Übersetzungsprodukten zu untersuchen. Es gibt eine weitere Änderung der Methode, wenn die radioaktive Etikettierung in Organello erfolgt, nicht in vivo4. Es schlägt die Isolierung von Mitochondrien aus Hefezellen vor. Diese Modifikation ist schneller, wenn gefrorene Mitochondrien zuvor in Aliquots gelagert wurden. Ein weiterer Vorteil ist das Fehlen einer Cycloheximid-Behandlung, die verschiedene Aspekte des Zellstoffwechsels betrifft. Die Isolierung von Mitochondrien und das Einfrieren können jedoch die Übersetzungskomplexe in den Organellen stören, die ein künstliches Bild liefern. Eine weitere wichtige Änderung des Protokolls kann nach der Trennung von mitochondrialen Translationsprodukten in Polyacrylamid-Gel (Schritt 5) vorgenommen werden. Anstelle von Coomassie Brilliant Blue, das das Gel färbt und trocknet, kann das Protein durch Elektro-Blotting auf die Nitrozellulosemembran übertragen werden. Dies führt zu stärkeren und schärferen Signalen. Der Hauptgrund ist, dass 35S durch Emission von Beta-Partikeln mit sehr kurzer Penetration zerfällt, so dass das Signal in diesem Ansatz leicht abgeschirmt werden kann. Elektrophoretische Bedingungen können auch geändert werden, um eine bessere Auflösung zu bieten. Ein Punkt ist 6M Harnstoff in das Gel, das die Trennung von atp8 und atp914verbessert. Eine andere Möglichkeit ist die Verwendung von Gradienten 15%–20% Gele.
Translational Profiling15 ist die Methode, die verwendet wird, um tiefer in die Veränderungen der mitochondrialen Übersetzung einzutauchen. Im Vergleich zur radioaktiven Etikettierung ermöglicht es die Festlegung von Positionen von mitochondrialen Ribosomen auf der mRNA, wodurch es möglich ist, den genauen Schritt (Einleitung, Dehnung oder Beendigung) zu finden, der betroffen ist. Profilerstellung ist jedoch viel teurer, komplizierter und zeitaufwändiger. Rationell kann dies nach dem Label-Inkorporationsexperiment erfolgen, nicht umgekehrt. Kürzlich wurde ein neuartiger Ansatz zur Überwachung der mitochondrialen Hefeübersetzung entwickelt16. Es vermeidet eine Behandlung mit Cycloheximid, was vorteilhaft ist, weil eine solche Behandlung den Zellstoffwechsel und die Signalwege beeinflusst. Anstelle der radioaktiv markierten Aminosäure-Inkorporation nutzt es die Einfügung eines rekodierten Gens für supergefaltetes GFP (sfGFP) in das hefemitochondriale Genom, das eine direkte Messung der mitochondrialen Translation mittels Durchflusszytometrie ermöglicht. Die Anwendung dieses Ansatzes erfordert jedoch den speziellen Hefestamm mit modifizierter mitochondrialer DNA, die sfGFP-Kodierungssequenz enthält, die zwischen 5'- und 3'- flankierenden Sequenzen eines bestimmten mitochondrialen Gens platziert wird.
Das Label-Incorporation-Experiment umfasst mehrere kritische Schritte, die in einem erfolgreichen Experiment nicht kompromittiert werden können. Zunächst sollten frische Hefekulturen verwendet werden (Schritt 1.1). Hefen länger als 1 Monat auf den Platten zu halten ist nicht zu empfehlen; Andernfalls können sie sich in diesem Test unvorhersehbar verhalten. Zweitens sollte die Cycloheximid-Lösung vor dem Experiment frisch zubereitet und nicht länger als 1 Woche gefroren gelagert werden (Schritt 2.1). Die alte Lösung verliert ihre Fähigkeit, die zytoplasmatische Übersetzung zu hemmen, was zu einem völlig abnormen Bandmuster in der Radioautographie führt. Drittens sollten 35S-Methionin frisch und aktiv sein (Schritt 2.2), andernfalls werden die Intensitäten der Bänder schwach sein (Abbildung 1D). Die Verwendung des Reagenzes, das vier Halbwertszeiten (4 x 87,4 Tage) überschritten hat, wird nicht empfohlen. Vermeiden Sie das Kochen der Proteinproben bei 95 °C, wie Standard-Probenvorbereitungshandbücher nahelegen (Schritt 4.8), da mitochondriale Proteine hoch hydrophob und anfällig für Aggregation sind.
Es gibt mehrere häufige Probleme, die man erleben kann, umgang mit dieser Methode. Die erste ist die schwache Intensität der Bands auf der Radioautographie. Um es zu beheben, stellen Sie sicher, dass frische 35S-Methionin verwendet wird, eine ausreichende Menge an Hefezellen genommen wird, und die Proteine nicht in den Taschen auf dem Gel aggregieren, die durch Coomassie Färbung gesteuert werden können. Bewahren Sie das getrocknete Gel mit dem Bildschirm für nicht weniger als 3 Tage auf. Das zweite Problem ist das falsche Bandmuster. Wenn es auftritt, stellen Sie sicher, dass frische Hefeplatten und frisch zubereitetes Cycloheximid verwendet werden. Denken Sie daran, dass die relativen Intensitäten der Bänder in verschiedenen Hefestämmen und Elektrophoresebedingungen stark variieren können. Es macht wenig Sinn, die Protein-Molekulargewichtsleiter auf das Gel zu laden, da mitochondriale Translationsprodukte in diesem Verfahren nie nach ihren Molekularmassen getrennt werden, da sie hochhydrophob sind. So wandert Cox I (58 kDa) schneller als Var 1 (47 kDa). Je nach Pufferbedingungen können die Proteine sogar die Positionen mit einem der Nachbarn wechseln. Das dritte häufige Problem ist das verschwommene Bild ohne scharfe Bänder, die nach der Coomassie-Färbung beobachtet wurden. Es zeigt die Fehler beim Gießen des Gels, falsche Pufferzusammensetzung oder Abbau von Proteinen in den Proben. Es wird empfohlen, neue Gelpuffer und Ausgeführte Puffer sorgfältig vorzubereiten und die Zusammensetzung und die pH-Werte sorgfältig zu überprüfen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde von der Russischen Stiftung für Grundlagenforschung, Stipendium Nummer 18-29-07002, finanziert. P.K. wurde durch die staatliche Zuweisung des Ministeriums für Wissenschaft und Hochschulbildung der Russischen Föderation, Fördernummer AAAA-A16-116021660073-5 unterstützt. M.V.P. wurde vom Ministerium für Wissenschaft und Hochschulbildung der Russischen Föderation, Fördernummer 075-15-2019-1659 (Programm des Kurchatov Center of Genome Research) unterstützt. Die Arbeit wurde teilweise an der Ausrüstung im Rahmen des Moskauer Staatlichen Universitätsprogramms für Entwicklung gekauft getan. I.C., S.L. und M.V.B. wurden zusätzlich vom Stipendium der Staatlichen Universität Moskau "Leading Scientific School Noah es Ark" unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A9099 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 | |
| Biowave Cell Density Meter CO8000 | BIOCHROM US BE | 80-3000-45 | |
| BRAND standard disposable cuvettes | Sigma-Aldrich | Z330361 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| D-(+)-Galactose | Sigma-Aldrich | G5388 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| digital block heater | Thermo Scientific | 88870001 | |
| EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution | Perkin Elmer | NEG709A500UC | |
| Eppendorf Centrifuge 5425 | Thermo Scientific | 13-864-457 | |
| GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE29-0171-33 | |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7279 | |
| New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator | New Brunswick Scientific | ||
| Peptone from meat, bacteriological | Millipore | 91249 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Pierce 660nm Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 22662 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Protean II xi cell | Bio-Rad | 1651802 | |
| Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Storm 865 phosphor imager | GE Healthcare | ||
| Trizma base | Sigma-Aldrich | 93352 | |
| Vacuum Heated Gel Dryer | Cleaver Scientific | CSL-GDVH | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
References
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