Summary
Le génome mitochondrial de levure de Baker code huit polypeptides. Le but du protocole actuel est de les étiqueter tous et de les visualiser par la suite comme des bandes distinctes.
Abstract
Les mitochondries sont des organites essentiels des cellules eucaryotes capables de respirer aérobie. Ils contiennent un génome circulaire et un appareil d'expression génique. Un génome mitochondrial de levure de boulanger code huit protéines : trois sous-unités de la cytochrome c oxidase (Cox1p, Cox2p, et Cox3p), trois sous-units de la synthase ATP (Atp6p, Atp8p, et Atp9p), une sous-unité de l'enzyme ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase, cytochrome b (Cytb), et la protéine ribosomique mitochondriale Var1p. Le but de la méthode décrite ici est d'étiqueter spécifiquement ces protéines avec de la méthionine 35S, de les séparer par électrophoresis et de visualiser les signaux comme des bandes discrètes à l'écran. La procédure comporte plusieurs étapes. Tout d'abord, les cellules de levure sont cultivés dans un milieu contenant de la galactose jusqu'à ce qu'elles atteignent le stade de croissance logarithmique tardive. Ensuite, le traitement cycloheximide bloque la traduction cytoplasmique et ne permet l'incorporation de 35S de méthionine que dans les produits de traduction mitochondrique. Ensuite, toutes les protéines sont extraites des cellules de levure et séparées par électrophoresis gel polyacrylamide. Enfin, le gel est séché et incubé avec l'écran de phosphore de stockage. L'écran est scanné sur un phosphorimager révélant les bandes. La méthode peut être appliquée pour comparer le taux de biosynthèse d'un seul polypeptide dans les mitochondries d'une souche de levure mutante par rapport au type sauvage, ce qui est utile pour étudier les défauts d'expression des gènes mitochondriaux. Ce protocole donne des informations précieuses sur le taux de traduction de tous les ARNm mitochondriaux de levure. Toutefois, il faut plusieurs contrôles et des expériences supplémentaires pour tirer des conclusions appropriées.
Introduction
Les mitochondries sont les organites profondément impliqués dans le métabolisme d'une cellule eucaryotique. Leur chaîne de transfert d'électrons fournit à la cellule de l'ATP, la principale monnaie énergétique utilisée dans de multiples voies biochimiques. En outre, ils sont impliqués dans l'apoptose, l'acide gras et la synthèse de l'hème, et d'autres processus. Le dysfonctionnement des mitochondries est une source bien connue de maladie humaine1. Il peut résulter de mutations dans des gènes nucléaires ou mitochondriques codant des composants structurels ou réglementaires des organites2. La levure saccharomyces cerevisiae de Baker est un excellent organisme modèle pour étudier l'expression des gènes mitochondriaux pour plusieurs raisons. Tout d'abord, leur génome estcomplètement séquencé 3, bien annoté, et une grande somme de données est déjà disponible dans la littérature grâce à la longue histoire des enquêtes menées avec cet organisme. Deuxièmement, les manipulations avec leur génome nucléaire sont relativement rapides et faciles en raison de leur taux de croissance rapide et de leur système de recombinaison homologue très efficace. Troisièmement, la levure de boulanger S. cerevisiae est l'un des rares organismes pour lesquels les manipulations avec des génomes mitochondriaux sont développées. Enfin, la levure de boulanger est un organisme de faculté d'aérobe-anaérobie, qui permet l'isolement et l'étude des mutants respiratoires défectueux, car ils peuvent se développer dans des médias contenant des sources de carbone fermentescibles.
Nous décrivons la méthode pour étudier l'expression mitochondrique de gène de la levure de boulanger S. cerevisiae au niveau translationnel4. Son principe principal provient de plusieurs observations. Tout d'abord, le génome mitochondrial de levure ne code que huit protéines : trois sous-unités de la cytochrome c oxidase (Cox1p, Cox2p, et Cox3p), trois sous-units de la synthase ATP (Atp6p, Atp8p, et Atp9p), une sous-unité de l'enzyme ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase, cytochrome b (Cytb), et la protéine ribosomique mitochondriale Var1p5. Ce nombre est faible, et tous peuvent être séparés par électrophoresis sur un seul gel dans les conditions appropriées. Deuxièmement, les ribosomes mitochondriques appartiennent à la classe procaryotique plutôt qu'à l'eucaryotique6, et donc, la sensibilité aux antibiotiques est différente pour les ribosomes cytoplasmiques et mitochondriques de levure. Il permet l'inhibition de la traduction cytoplasmique avec le cycloheximide, fournissant les conditions où l'acide aminé étiqueté(35S-méthionine) est incorporé seulement dans les produits de traduction mitochondrial. En conséquence, l'expérience donne des informations sur le taux d'incorporation d'acides aminés dans les protéines mitochondriales synthétisées de novo, reflétant l'efficacité globale de la traduction mitochondriale pour chacun des huit produits
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Protocol
1. Préparation de culture de levure
- Streak levure des cultures de bouillon congelés sur des assiettes fraîches avec le milieu approprié. Mettez les assiettes dans un incubateur de culture à 30 °C pendant 24-48 h.
REMARQUE : Laissez pousser les mutants sensibles à la température à la température permissive. - Inoculer les cultures de levure dans 2 mL de milieu YPGal (2% de peptone, 1% d'extrait de levure, 2% de galactose) de la strie fraîche dans des tubes de 15 mL et les incuber toute la nuit agitant à 200 rpm à 30 °C.
- Mesurer la densité optique de la culture à une longueur d'onde de 600 nm (OD600).
- Prenez le volume correspondant à 0,2 unités d'absorption dans les tubes stériles, les cellules de levure de granulés à 9.000 x g pendant 30 s à température ambiante, et jetez le supernatant.
- Laver les cellules avec 0,5 mL d'eau stérile en tourbillonnant pendant 5 s. Pelleter les cellules de levure à 9000 x g pendant 30 s à température ambiante et jeter le supernatant. Diluer les cellules dans 2 mL de milieu YPGal frais.
- Incuber l'agitation à 200 rpm et 30 °C jusqu'à ce que l'OD600 atteigne 1,5 à 1,9 valeur.
REMARQUE: Les taux de croissance de levure varient, alors soyez prêt à attendre. Il est raisonnable de faire des pas 1.3-1.6 tôt le matin. Il faut généralement 4-5 h, mais peut prendre plus de temps.
2. Incorporation d'isotopes radioactifs
- Transférer le volume de culture équivalent à une unité optique dans un tube de microcentrifugeuse. Faire tourner les tubes à 3 000 x g pendant 1 min et jeter le supernatant. Laver avec 0,5 mL d'eau stérile en tourbillonnant pendant 5 s.
- Pelleter les cellules de levure à 9000 x g pendant 30 s à température ambiante et jeter le supernatant. Resuspendez les cellules de levure dans 0,5 mL de tampon de traduction stérile. Placer la suspension dans un tube de 15 mL.
REMARQUE : Le tampon de traduction est une solution contenant 2 % de galactose (w/v) et 50 mM de phosphate de potassium avec pH 6,0.
- Pelleter les cellules de levure à 9000 x g pendant 30 s à température ambiante et jeter le supernatant. Resuspendez les cellules de levure dans 0,5 mL de tampon de traduction stérile. Placer la suspension dans un tube de 15 mL.
- Ajouter le cycloheximide à la suspension cellulaire jusqu'à une concentration finale de 0,2 mg/mL. Incuber pendant 5 min agitant à 200 rpm et 30 °C pour inhiber la traduction cytosolique.
REMARQUE : La solution cycloheximide (20 mg/mL, en éthanol) doit être préparée fraîchement avant l'expérience. Le chloramphénicol peut être remplacé avec succès par de l'anisomycine dans la même concentration7. - Ajouter 25-30 μCi de 35S-méthionine à la suspension cellulaire et incuber pendant 30 min agitant à 200 tours et 30 °C.
REMARQUE : Le mélange de 35S-méthionine et de 35S-cystéine peut également être utilisé. Pure 35S-methionine se traduit par le signal le plus fort et le meilleur rapport signal-bruit. Généralement, la méthionine est plus efficace que la cystéine parce que la teneur de cet acide aminé dans les protéines mitochondriques est plus élevée. Cependant, le mélange EasyTag de 35S-méthionine et cystéine est moins cher et donne des résultats comparables7.
ATTENTION: 35S-méthionine est radioactif. Suivez les pratiques de sécurité habituelles pour la manipulation des matières radioactives.
REMARQUE : Il est bien connu que l'incorporation de la radioactivité atteint une limite en raison de laquelle le total des signaux se nivelle au fil du temps. Une fois cette limite atteinte, il est presque impossible de déterminer les taux de synthèse des différents produits de traduction. Pour analyser le taux de traduction mitochondrique, il est impératif d'être dans un état dans lequel l'intensité du signal augmente avec le temps d'incubation avec 35S-méthionine d'une manière linéaire. Pour les souches courantes de type sauvage de laboratoire, le signal est déjà saturé pour des temps d'incubation beaucoup plus courts que les 30 min. Les mutants translationnels peuvent se comporter très différemment. Un cours du temps devrait être effectué pour établir la cinétique de l'incorporation de radioactivité et donc le taux de traduction, au moins lorsque vous travaillez avec une nouvelle souche. Pour cela, nous suggérons de prélever des échantillons avec un intervalle de plusieurs minutes (p. ex., 2,5, 5,0, 7,5, 10 et 20 min). - Ajouter la méthionine « froide » non étiquetée (la concentration finale devrait être de 20 mM) et la puromycine (la concentration finale devrait être de 1 à 10 μg/mL) pour arrêter l'étiquetage. Incuber pendant 10 min agitant à 200 rpm et 30 °C.
REMARQUE : Cette étape est essentielle pour donner aux ribosomes le temps de finir de traduire les peptides. Dans le cas contraire, tous les polypeptides plus courts que la pleine longueur seront détectés à une taille différente. Une expérience de cours du temps (pulse-chase) peut être faite à cette étape pour déterminer la stabilité des produits de traduction mitochondrial. Pour cela, poursuivre l'incubation en prélevant des échantillons avec un intervalle de 30 min (p. ex., 30, 60, 90 et 120 min).
3. Lyse de cellules de levure et extraction des protéines
- Recueillir les cellules de levure par centrifugation à 9 000 x g pendant 30 s. Laver les cellules avec 0,5 mL d'eau stérile en tourbillonnant pendant 5 s. Cellules de levure de granulés à 9.000 x g pour 30 s à température ambiante. Jeter le surnatant.
note. Le protocole peut être mis en pause ici. Conserver les échantillons à -20 °C. - Ajouter 75 μL de tampon de lyse à la pastille et au vortex pendant 5 à 10 s.
REMARQUE : Le tampon de lyse est une solution de 1,8 M NaOH, 1 M β-mercaptoéthanol et 1 MM PMSF dans l'eau. Évitez l'incubation excessive avec tampon de lyse menant à l'hydrolyse alcaline des protéines. Passez immédiatement à l'étape 3.3. - Ajouter 500 μL de tampon Tris-HCl de 0,5 M avec pH 6,8. Vortex brièvement.
4. Précipitation de protéines
ATTENTION : Le méthanol et le chloroforme sont des solvants organiques. Suivez les pratiques de sécurité habituelles pour la manipulation des substances organiques.
- Ajouter 600 μL de méthanol à l'échantillon. Vortex pour 5 s.
- Ajouter 150 μL de chloroforme à l'échantillon. Vortex pour 5 s.
- Centrifugeuse les échantillons pendant 2 min à 12.000 x g. Jetez soigneusement la phase supérieure à l'avec un échantillonneur.
- Ajouter 600 μL de méthanol à l'échantillon. Mélanger soigneusement en inversant le tube plusieurs fois.
- Centrifugeuse les échantillons pendant 2 min à 12.000 x g. Jeter le surnatant.
- Sécher à l'air le granulé pendant 2 min à 80 °C.
REMARQUE : Tout le liquide doit s'évaporer. Il y a un risque d'avoir une séparation aberrante des protéines dans le gel si la pastille a été séchée insuffisamment. Cependant, il n'est pas possible de trop sécher la pastille, de sorte qu'elle peut même être stockée pendant la nuit à 4 °C. - Dissoudre les protéines précipitées dans 60 μL de tampon échantillon 1x Laemmli.
- Chauffer pendant 10 min à 40 °C.
REMARQUE : Évitez de faire bouillir les échantillons à 95 °C, car cela provoque une agrégation. Si les agrégats se forment encore, faites tourner les échantillons à 12 000 x g pendant 2 min et recueillez le supernatant. Les échantillons peuvent être stockés à -20 °C. Le protocole peut être mis en pause ici.
5. SDS-PAGE
- Jetez le gel Laemmli SDS-polyacrylamide 17,5%.
NOTE: 6 M d'urée peuvent être ajoutés au gel pour résoudre mieux atp8 et atp9. Gradient 15%-20% gels peuvent également donner une meilleure résolution. - Chargez 15 μL (40-50 μg) de chaque échantillon dans les poches.
REMARQUE : Il n'est pas nécessaire de mesurer la concentration en protéines si les valeurs del'OD 600 étaient proches à l'étape 1.6. Si ce n'est pas le cas, mesurez les concentrations de protéines à l'aide de l'analyse avec des réacompteurs compatibles avec le détergent. - Faire fonctionner le gel dans une pièce froide jusqu'à ce que le colorant bleu atteigne environ 65% de la longueur du gel.
REMARQUE : Pour le système utilisé (p. ex., protéien II xi cell), nous utilisons l'un ou l'autre des deux modes : 16-17 h à 5 V/cm ou 5 h à 15 V/cm. Aucune protéine ne court plus vite que le colorant bleu bromophénol, mais de longues courses peuvent entraîner un brouillage des signaux atp8 et atp9. - Tacher le gel avec coomassie bleu brillant et faire un scan ou une photo, qui est nécessaire comme un contrôle de chargement.
REMARQUE : Une autre façon de faire un contrôle de chargement est l'immunoblotting avec un anticorps au gène mitochondrique de « ménage », par exemple, porine 1.
6. Autoradiographie
- Sécher le gel dans un séchoir à gel. Gardez-le dans la cassette avec un écran de phosphore de stockage pendant 3-5 jours.
REMARQUE : Une alternative au criblage du gel séché est le transfert de protéines à une membrane de nitrocellulose par électroblotting et criblage par la suite. Il en résulte des signaux plus forts et des bandes plus nettes. - Scannez l'écran sur un phosphorimager.
REMARQUE : Comme alternative à l'imagerie au phosphore, le film à rayons X peut également être utilisé pour révéler les signaux.
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Representative Results
Suivant le protocole décrit ci-dessus, nous avons attribué des produits de traduction mitochondrique à partir de deux souches de S. cerevisiae : le type sauvage (WT) et une suppression mutante du gène AIM23 (AIM23Δ), codant le facteur d'initiation à la traduction mitochondrique 3 (tableau 1)8. Les produits de traduction mitochondrial ont été étiquetés et séparés radioactivement dans SDS-PAAG9. Les échantillons ont été prélevés toutes les 2,5 minutes avant la saturation pour construire un cours du temps( figure 1A). Le gel a été taché, séché et filtré après l'exposition de 5 jours (Figure 1A).
Dans le cas d'une expérience réussie, l'image montre huit bandes assignées selon le modèle standard4. Cependant, les intensités des bandes individuelles peuvent être très variables selon la souche et les conditions expérimentales. Chaque bande correspond à un produit de traduction. Les données (Figure 1A) suggèrent que la souche AIM23Δ est capable de synthèse des protéines mitochondriales parce que tous les produits apparaissant dans le WT sont visibles chez ce mutant. Cependant, les intensités des bandes sont différentes de la WT, ce qui signifie que la suppression d'AIM23 affecte l'expression du gène mitochondrial8. Coomassie Brilliant Blue coloration sert de contrôle de chargement.
Les données qui en résultent peuvent être quantifiées (figure 1B) pour identifier les différences entre les souches ou les conditions expérimentales à l'aide du logiciel ImageJ10 ou ImageQuant. Pour cela, les ratios du signal correspondant à chaque produit au signal total sont calculés. Les valeurs moyennes et les écarts types sont calculés dans au moins trois expériences indépendantes.
La cinétique du chiffre d'affaires des protéines synthétisées est étudiée dans le cadre d'une expérience de chasse aupouls (figure 1C). Les échantillons sont prélevés aux points de temps indiqués après que la réaction d'étiquetage soit arrêtée par la méthionine froide et la puromycine à l'étape 2.4. Ce contrôle est nécessaire pour estimer la stabilité des produits car l'intensité du signal est le résultat de deux processus opposés : la synthèse de nouvelles chaînes et la dégradation des protéines. L'immunostaining avec des anticorps anti-porine 1 est un contrôle de chargement.
Figure 1 : Étiquetage radioactif représentatif des produits de traduction mitochondrial de levure. (A) Cours du temps de 35S-méthionine incorporation dans les protéines synthétisées mitochondrially dans les cellules de levure vivante des souches WT et AIM23Δ. Coomassie Brilliant Blue coloration est un contrôle de chargement. (B) Niveaux de protéines codées mitochondrialement après 5 min d'étiquetage avec 35S-méthionine. L'expression relative est normalisée à l'expression totale des gènes de protéine mitochondrially codés. Les barres d'erreur indiquent l'écart type de la moyenne d'au moins trois expériences indépendantes. (C) Chiffre d'affaires des protéines synthétisées mitochondrialement dans le type sauvage et les souches Aim23Δ. L'étiquetage a été arrêté et les échantillons ont été prélevés aux points de temps indiqués. L'immunostaining avec l'anticorps anti-porin 1 est un contrôle de chargement. (D) Expérience sous-optimale avec l'ancienne 35S-méthionine, radioautographie. Figure 1A,B,C sont adaptés à partir de8 avec des modifications mineures. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| filtrer | génotype |
| Wt | MATα mal |
| AIM23Δ | MATα mal, AIM23::KanMX4 |
Tableau 1. Génotypes de souches de S. cerevisiae
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Discussion
Les études de l'expression des gènes occupent une place centrale dans les sciences de la vie modernes. De nombreuses méthodes donnant un aperçu de ce processus complexe ont été développées. Ici, nous avons décrit la méthode permettant d'accéder à la biosynthèse protéique dans la levure de boulanger S. cerevisiae mitochondries. Il est généralement appliqué pour comparer l'efficacité de traduction des ARNH dans les mitochondries de souche de levure mutante par rapport au type sauvage pour accéder aux conséquences de la mutation étudiée. C'est l'une des expériences de base que les chercheurs mènent lorsqu'ils étudient la fonction mitochondriale des cellules de levure portant la mutation suggérée pour influencer les mitochondries8,11,12,13. Il est souvent combiné avec les mesures du taux de consommation d'oxygène et du potentiel memitochondrial de membrane. Toutefois, l'information qu'il fournit ne suffit pas à distinguer le stade d'expression des gènes. Un ensemble d'expériences supplémentaires est nécessaire pour le savoir. Tout d'abord, l'évaluation de tache nordique ou de RT-qPCR des ARNM mitochondrial est nécessaire pour évaluer l'étape transcriptionnelle. Deuxièmement, une tache occidentale d'extraits totaux de protéines avec des anticorps spécifiques devrait être fait pour évaluer le niveau de protéines. Troisièmement, le pouls de 35S-méthionine étiquetée (chaud) doit être continué avec l'ajout de méthionine non étiquetée (froid) (chasse) et plusieurs points de temps devraient être recueillis et analysés sur le gel pour étudier la stabilité des protéines.
L'analyse précise de l'expression du gène mitochondrial à l'aide de l'étiquetage 35S nécessite des réactions de contrôle, surtout lorsque le chercheur n'a pas l'expérience de la manipuler ou travaille avec une nouvelle souche de levure ou un mutant. Dans ces cas, un bon contrôle négatif est une souche rho0 dépourvue d'ADN mitochondrial. Il montre l'inhibition efficace de cycloheximide de la traduction cytosolic et confirme que le modèle de baguage est spécifique à la traduction mitochondrique. Si la souche rho0 n'est pas disponible, alors nous suggérons d'inclure le chloramphénil avec le cycloheximide pour inhiber toute synthèse protéique pour confirmer l'efficacité cycloheximide et la spécificité du modèle de baguage.
La modification la plus proche du protocole est la chasse aux impulsions lorsque la culture est incubée dans le shaker (étape 2.4) plus longue que suggérée dans l'expérience d'impulsions (figure 1C). Il est utilisé pour étudier le chiffre d'affaires et la stabilité des produits de traduction mitochondrial. Il ya une autre modification de la méthode lorsque l'étiquetage radioactif se fait en organello, pas in vivo4. Il suggère l'isolement des mitochondries des cellules de levure. Cette modification est plus rapide si les mitochondries congelées étaient précédemment stockés en aliquots. Un autre avantage est l'absence de traitement cycloheximide, qui affecte différents aspects du métabolisme cellulaire. Cependant, l'isolement des mitochondries et leur gel-dégel peuvent perturb les complexes de traduction dans les organites fournissant une image artificielle. Une autre modification importante du protocole peut être effectuée après la séparation des produits de traduction mitochondrique dans le gel polyacrylamide (étape 5). Au lieu de coomassie bleu brillant colorant et séchant le gel, la protéine peut être transférée à la membrane de nitrocellulose par électroblotting. Il en résulte des signaux plus forts et plus aigus. La raison principale est que 35S se décompose par émission de particules bêta avec une pénétration très courte, de sorte que le signal est facilement filtré dans cette approche. Les conditions électrophorétiques peuvent également être modifiées pour fournir une meilleure résolution. Un point est d'ajouter 6M d'urée dans le gel, ce qui améliore la séparation de l'atp8 et atp914. Une autre façon est d'utiliser gradient 15%-20% gels.
Le profilagetranslationnel 15 est la méthode utilisée pour plonger plus profondément dans les altérations de la traduction mitochondriale. Par rapport à l'étiquetage radioactif, il permet d'établir des positions de ribosomes mitochondriques sur l'ARNm, ce qui permet de trouver l'étape exacte (initiation, allongement ou terminaison) affectée. Toutefois, le profilage est beaucoup plus coûteux, compliqué et prend beaucoup de temps. Rationnellement, il peut être fait après l'expérience d'incorporation d'étiquette, et non l'inverse. Récemment, une nouvelle approche de la surveillance de la traduction mitochondrique de levure a été développée16. Il évite le traitement par cycloheximide, ce qui est avantageux parce qu'un tel traitement affecte le métabolisme cellulaire et les voies de signalisation. Au lieu de l'incorporation radioactivement étiquetée d'acide aminé, il utilise l'insertion d'un gène recodé pour GFP super plié (sfGFP) dans le génome mitochondrial de levure, qui permet la mesure directe de la traduction mitochondrique utilisant la cytométrie de flux. Cependant, l'application de cette approche exige la souche spéciale de levure avec l'ADN mitochondrique modifié contenant la séquence de codage de sfGFP placée entre 5'- et 3'- séquences de flanc d'un certain gène mitochondrial.
L'expérience d'incorporation d'étiquettes comprend plusieurs étapes critiques, qui ne peuvent pas être compromises dans une expérience réussie. Tout d'abord, les cultures de levures fraîches doivent être utilisées (étape 1.1). Garder les levures dans les assiettes plus de 1 mois n'est pas recommandé; sinon, ils peuvent se comporter de façon imprévisible dans cet essai. Deuxièmement, la solution cycloheximide doit être préparée fraîchement avant l'expérience et stockée congelée au plus tard 1 semaine (étape 2.1). L'ancienne solution perd sa capacité à inhiber la traduction cytoplasmique résultant en un modèle de bande complètement aberrant dans la radioautographie. Troisièmement, 35S-methionine devrait être frais et actif (étape 2.2), sinon, les intensités des bandes seront faibles (Figure 1D). Il n'est pas recommandé d'utiliser le réaccérable qui a passé quatre demi-vies (4 x 87,4 jours). Évitez de faire bouillir les échantillons de protéines à 95 °C comme le suggèrent les guides de préparation d'échantillons standard (étape 4.8) parce que les protéines mitochondriales sont très hydrophobes et sujettes à l'agrégation.
Il y a plusieurs questions communes que l'on peut éprouver traitant de cette méthode. Le premier est la faible intensité des bandes sur la radioautographie. Pour le fixer assurez-vous, que frais 35S-méthionine est utilisé, une quantité suffisante de cellules de levure est prise, et les protéines ne s'agrègent pas dans les poches sur le gel, qui peut être contrôlé par la coloration Coomassie. Gardez le gel séché avec l'écran pendant pas moins de 3 jours. Le deuxième problème est le modèle de bande incorrect. S'il est rencontré, assurez-vous que des plaques de levure fraîche et du cycloheximide fraîchement préparé sont utilisés. Gardez à l'esprit que les intensités relatives des bandes peuvent varier considérablement dans différentes souches de levure et conditions d'électrophoresis. Il est peu logique de charger l'échelle de poids moléculaire protéique sur le gel puisque les produits de traduction mitochondrique ne sont jamais séparés selon leurs masses moléculaires dans cette procédure parce qu'ils sont fortement hydrophobes. Ainsi, Cox I (58 kDa) migre plus vite que Var 1 (47 kDa). Selon les conditions tampons, les protéines peuvent même changer de position avec l'un des voisins. Le troisième problème commun est l'image floue sans bandes pointues observées après la coloration coomassie. Il indique les erreurs dans le moulage du gel, la composition tampon incorrecte, ou la dégradation des protéines dans les échantillons. Il est recommandé de préparer de nouveaux tampons de gel et d'exécuter tampon soigneusement vérifier la composition et les valeurs de pH.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par la Fondation russe pour la recherche fondamentale, subvention numéro 18-29-07002. P.K. a été soutenu par l'Affectation d'État du Ministère des sciences et de l'enseignement supérieur de la Fédération de Russie, numéro de subvention AAAA-A16-116021660073-5. M.V.P. a été soutenu par le Ministère des sciences et de l'enseignement supérieur de la Fédération de Russie, subvention numéro 075-15-2019-1659 (Programme de Kurchatov Center of Genome Research). Les travaux ont été réalisés en partie sur l'équipement acheté dans le cadre du Programme de développement de l'Université d'État de Moscou. I.C., S.L., et M.V.B. ont été en outre soutenus par la subvention de l'Université d'État de Moscou « Leading Scientific School Noah's Ark ».
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A9099 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 | |
| Biowave Cell Density Meter CO8000 | BIOCHROM US BE | 80-3000-45 | |
| BRAND standard disposable cuvettes | Sigma-Aldrich | Z330361 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| D-(+)-Galactose | Sigma-Aldrich | G5388 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| digital block heater | Thermo Scientific | 88870001 | |
| EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution | Perkin Elmer | NEG709A500UC | |
| Eppendorf Centrifuge 5425 | Thermo Scientific | 13-864-457 | |
| GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE29-0171-33 | |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7279 | |
| New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator | New Brunswick Scientific | ||
| Peptone from meat, bacteriological | Millipore | 91249 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Pierce 660nm Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 22662 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Protean II xi cell | Bio-Rad | 1651802 | |
| Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Storm 865 phosphor imager | GE Healthcare | ||
| Trizma base | Sigma-Aldrich | 93352 | |
| Vacuum Heated Gel Dryer | Cleaver Scientific | CSL-GDVH | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
References
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