Summary
I denne undersøgelse beskriver vi processen med T-lymfocytisolation fra friske prøver af forkalkede aortaventiler og de analytiske trin i T-cellekloning til karakterisering af de adaptive leukocytundersæt ved hjælp af flowcytometrianalyse.
Abstract
Brændværdi aortaklappen sygdom (CAVD), en aktiv sygdom proces lige fra mild fortykkelse af ventilen til svær forkalkning, er forbundet med høj dødelighed, på trods af nye terapeutiske muligheder såsom transkateter aortaklappen udskiftning (TAVR).
De komplette veje, der starter med ventil forkalkning og føre til svær aorta stenose forbliver kun delvist forstået. Ved at give en tæt repræsentation af aortaklappen celler in vivo, assaying af T lymfocytter fra stenotisk ventil væv kunne være en effektiv måde at afklare deres rolle i udviklingen af forkalkning. Efter kirurgisk excision dissekeres den friske aortaklappen i små stykker, og T-lymfocytterne dyrkes, klones derefter analyseres ved hjælp af fluorescensaktiveret cellesortering (FACS).
Farvningsproceduren er enkel, og de farvede rør kan også fastgøres ved hjælp af 0,5% af paraformaldehyd og analyseres op til 15 dage senere. Resultaterne fra farvningspanelet kan bruges til at spore ændringer i T-cellekoncentrationer over tid i forhold til intervention og kan let videreudvikles for at vurdere aktiveringstilstande af specifikke T-celleundertyper af interesse. I denne undersøgelse viser vi isoleringen af T-celler, udført på friske forkalkede aortaklappen prøver og trinene til at analysere T-celle kloner ved hjælp af flowcytometri til yderligere at forstå den rolle, adaptive immunitet i CAVD patofysiologi.
Introduction
Brændværdi aortaklappen sygdom (CAVD) er en af de mest almindelige hjerteklap lidelser, med en tung indvirkning på sundhedspleje. Hyppigheden af aortaklappen udskiftning i de sidste år er steget dramatisk og forventes at stige yderligere, på grund af den voksende ældre befolkning1.
Den underliggende patofysiologi af CAVD er kun delvist kendt, og de nuværende terapeutiske strategier er begrænset til konservative foranstaltninger eller aortaklappen udskiftning, enten gennem kirurgiske eller perkutane procedurer. Til dato kan ingen effektiv medicinsk behandling hindre eller vende CAVD progression og høj dødelighed er forbundet med tidlig symptom-debut, medmindre aortaklappen udskiftning (AVR) udføres2. Hos patienter med svær symptomatisk aortastenose blev den 3-årige symptomfri overlevelse rapporteret så lavt som 20%3. Transcatheter aortaklappen udskiftning (TAVR) repræsenterer en ny mulighed, revolutionerende behandling for høj-risiko patienter, især blandt ældre og har dramatisk reduceret dødeligheden, som var i sig selv høj i denne population4,5,6. På trods af de lovende resultater af TAVR er yderligere forskning nødvendig for at forstå CAVD-patofysiologi for at identificere nye tidlige terapeutiske mål7,8,9.
Tidligere menes at være en passiv, degenerativ proces, CAVD er nu anerkendt som en aktiv progressiv sygdom, karakteriseret ved en osteoblastisk fænotype switch af aortaklappen interstitielle celler10. Denne sygdom indebærer progressiv mineralisering, fibrocalcific ændringer og reduceret motilitet af aortaklappen foldere (sklerose), som i sidste ende hindrer blodgennemstrømningen fører til indsnævring (stenose) af aortaklappen åbning11.
Inflammation betragtes som en nøgleproces i CAVD patofysiologi, svarende til processen med vaskulær åreforkalkning. Endotelskade muliggør aflejring og akkumulering af lipidarter, især oxiderede lipoproteiner i aortaklappen12. Disse oxiderede lipoproteiner fremkalder en inflammatorisk reaktion, da de er cytotoksiske, med den inflammatoriske aktivitet, der fører til mineralisering. Den rolle, som medfødte og adaptive immunitet i CAVD udvikling og sygdom progression er for nylig blevet fremhævet13. Aktivering og klonisk udvidelse af specifikke delmængder af hukommelse T-celler er dokumenteret hos patienter med CAVD og mineraliserede aortaklappens foldere, således at inflammatoriske processer antages at være involveret i det mindste i udviklingen af CAVD og formodentlig også i sygdomsprogression14. Faktisk, selv om antigen-præsentere celler og makrofager er til stede i både den sunde og syge ventil, tilstedeværelsen af T-lymfocytter er tegn på en alderen og syge aortaklappen. Denne lymfocytiske infiltrere sammen med en stigning i neovascularization og metaplasi er karakteristiske histologiske tegn på CAVD15.
Vi hypoteser eksistensen af en interaktion mellem aortaklappen interstitielle celler og aktivering af immunsystemet, som potentielt udløser indledningen af en kronisk inflammatorisk proces i aortaklappen. Analysen af T-celler fra stenotisk aortaklappen væv kunne være en effektiv måde at afklare deres rolle i forkalkning udvikling, da det kan give en tæt repræsentation af aortaklappen celler in vivo. I det nuværende arbejde, ved hjælp af aortaklappen væv, isolerer vi T-lymfocytter, kultur og kloner dem og karakteriserer dem efterfølgende ved hjælp af fluorescensaktiveret cellesortering (FACS). Friske aortaklappen prøver blev fjernet fra CAVD patienter, der fik kirurgisk ventil udskiftning for svær aorta stenose. Efter den kirurgiske excision blev den friske ventilprøve dissekeret i små stykker, og T-cellerne blev kultiveret, klonet derefter analyseret ved hjælp af flowcytometri. Farvningsproceduren er enkel, og de farvede rør kan fastgøres ved hjælp af 0,5% af paraformaldehyd og analyseres op til 15 dage senere. De data, der genereres fra farvningspanelet, kan bruges til at spore ændringer i T-lymfocytfordelingen over tid i forhold til intervention og kan let videreudvikles for at vurdere aktiveringstilstande for specifikke T-celleundersæt af interesse.
Udvinding af forkalket væv, isolering af leukocytter fra forkalket væv og især brugen af flowcytometri på denne type væv kan være udfordrende på grund af problemer som autofluorescence. Der findes kun få publikationer med protokoller til dette specifikke formål16,17,18. Heri præsenterer vi en protokol designet specielt til direkte isolation og kultur af T lymfocyt fra humane aortaklappen prøver. Kloniske udvidelse af lymfocytter er et kendetegn for adaptiv immunitet. Undersøgelse af denne proces in vitro giver indsigtsfulde oplysninger om niveauet af lymfocyt heterogenitet19. Efter en tre-ugers inkubationsperiode er T-celleklo klonerne klar til at blive forplantet, da der blev opnået en passende mængde T-celler fra hver klon, så den fænotypiske og funktionelle undersøgelse blev tilladt. Efterfølgende studeres fænotypen af T-kloner af cytofluorometri.
Denne immunologiske protokol er en tilpasning af en metode, der tidligere er udviklet af Amedei et al. til T-celleisolation og karakterisering fra humant væv, specielt designet til forkalket humant væv, såsom i CAVD20,21,22. Protokollen her for isolering af PBMCs (perifere blod mononukleare celler) ved hjælp af bestrålet buffy pels beskriver en effektiv måde at opnå feeder celler (FC), specielt justeret for kloning fase af T lymfocytter isoleret fra ventil interstitielle celler. Fødelaget består af vækstarresterede celler, som stadig er levedygtige og bioaktive. Fødecellernes rolle er vigtig for at understøtte in vitro-overlevelse og vækst af T-lymfocytter isoleret fra ventilinterstitielle celler23. For at undgå spredning af fødeceller i kulturen skal disse celler gennemgå en vækstarrest. Dette kan opnås på to måder: gennem fysiske metoder såsom bestråling eller gennem behandling med cytotoksiske kemikalier, såsom mitomycin C (MMC), et antitumoralt antibiotikum, der kan anvendes direkte på kulturoverfladen24. Her viser vi feeder cellevækst anholdelse opnået gennem celle bestråling.
Denne metode præsenterer en effektiv, omkostningseffektiv måde at isolere og karakterisere T-celler fra aortaklappen væv, der bidrager til at udvide spektret af immunologiske metoder til at udforske CAVD patofysiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Undersøgelsen blev gennemført i henhold til statutten for Charité for Sikring af god videnskabelig praksis, og de juridiske retningslinjer og bestemmelser om privatlivets fred og etik blev overholdt. Den etiske komité godkendte alle menneskelige eksperimenter, og patienternes privatliv og anonymitet blev opretholdt i overensstemmelse med de regler, der er rapporteret på etikformularen.
BEMÆRK: For den protokol, der er beskrevet nedenfor, blev der anvendt friske humane stenotiske ventilprøver.
1. Reagens forberedelse
- Forbered det berigede RPMI komplette medium ved at tilføje i RPMI 1640 Medium: Ikke-essentielle aminosyrer; Natrium pyruvat, L- Glutamin, ß-Mercaptoethanol og Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep). Filtrer det før brug. Opbevares ved +4 °C og anvendes inden for to måneder.
- Indbered cellekulturmediet (CCM) til kloningsfasen ved hjælp af det berigede RPMI 1640 komplette mediumtilsatte varmeinaktiverede fosterkvægsserum (FBS), HB basal medium, 50 U Interleukin 2 (IL-2) og Human Serum (HS). Filtrer og brug det inden for dagen. Opbevar ikke.
- Forbered cellekulturmediet til refeedingfasen ved hjælp af det berigede RPMI 1640 komplette medium med tilsat FBS, HB basal medium, 30 U IL-2 og HS. Filtrer og brug det inden for dagen. Opbevar ikke.
- Vaskebufferen, der indeholder 250 mL RPMI og 5 mL Pen/Strep, forberedes. Opbevares ved +4 °C, skal du bruge inden for to måneder.
2. Human T lymfocyt isolation og kultur i T-25 kolber
- Placer stenotisk ventilprøven i en steril petriskål fyldt med vaskebuffer, så hele ventilprøven er dækket af den. Lad stå i 15 minutter.
- Skær stenotisk ventil i små stykker ved hjælp af en skalpel og lad den stå igen i 10 minutter.
- Forbered cellekulturmediet med 50 U IL-2, som tidligere beskrevet, og filtrer det.
- Tilsæt CCM inde i T25 kolber og ved hjælp af en steril plast tænge, placere ventilen stykker inde i kolber.
- Kolberne opbevares lodret inde i en CO2-inkubator i en uge, idet de sørger for at observere kolbens status under mikroskopet. T-cellekloner skal være synlige ca. tre dage efter kulturtrinnet; for bedre observation er det tilrådeligt at placere kolberne i vandret position i 20 minutter før den mikroskopiske analyse.
BEMÆRK: Mængden af cellekulturmedie afhænger af mængden af tilstedeværende prøver og af, hvor mange T25-kolber der vil blive brugt. I betragtning af at hvert stykke ventil kræver 10 mL CCM inde i en kolbe, er 25 mL CCM i en T25-kolbe passende til 3 stykker ventil.
3. Kloningsfase
BEMÆRK: For kloningsfasen af T-celler er det nødvendigt at starte med isolering af fødeceller fra en bestrålet buffy coat (BC) efter PBMCs-protokollen.
- Åbn BC-posen under laminar flow hætten ved hjælp af posen spike med nålefri ventil og overføre 50 mL blod i en T150 kolbe. Der tilsættes 70 mL PBS for at fortynde blod inde i kolben.
- Tag fire 50 mL koniske rør og læg 20 mL tæthedsgradientmedie i hvert og forsigtigt lag 30 mL blod over det.
- Centrifuge i 25 min ved 800 x g og 20 °C med bremsen slukket.
- Slud forsigtigt supernatanten og kassér den som affald. Saml PBMCs ringen i et nyt 50 ml koniske rør, der tilføjer inde i PBS-opløsningen op til et volumen på 50 ml.
- Centrifuge i 10 min ved 400 x g og 20 °C.
- Kassér supernatanten, og afbryd pelleten ved at tilføje op til et volumen på 50 mL inde i PBS-opløsningen. Centrifugeringsfasen gentages i 10 min ved 400 x g og 20 °C.
- Kassér supernatanten, og ophæng FCs i 10 mL cellekulturmedie.
- Tag et nyt opsamlingsrør og fortynd FCs med PBS 1:10 ved at tilføje inde 9,9 mL PBS og 100 μL fra røret med FCs og cellekultur medium. Skyl godt med en pipette og tag 7 μL fra denne fortynding og tæl cellerne under mikroskopet.
- Forbered cellekulturmediet til kloningsfasen: 70 mL med 50 U IL-2, og del det derefter i to 50 mL koniske rør, hvert rør vil indeholde 25 mL cellekulturmedie, som beskrevet nedenfor:
- Rør 1: 25 mL CCM + FCs + 0,6% af phytohemagglutinin (PHA)
- Rør 2: 25 mL CCM + T lymfocytter
BEMÆRK: Formålet med PMBCs-metoden er at opnå 2 x 106 celler for hver mL, så de 25 mL CCM forberedt (Tube 1) skal beregnes i overensstemmelse hermed. Den generelle anvendte formel er: Antal optalte celler x 106: 1 mL = CCM x 106: X
4. T lymfocytter kultur i multiwell plader
- Brug den elektroniske pipette til at samle alle cellekulturmediet inde i kolberne og overføre det til et 50 mL konisk rør. De tomme kolber kan smides væk.
- Pjætcellerne ved centrifugering i 10 min ved 400 x g og 20 °C.
- Supernatanten kasseres, pjelen suspenderes i 50 mL PBS, og cellerne opsamles ved centrifugering i 10 min ved 400 x g og 20 °C. Gentag dette trin to gange.
- Kassér supernatanten, og afhæng pelleten i 1 mL CCM. Tag 7 μL fra denne fortynding og tæl cellerne under mikroskopet.
BEMÆRK: Antallet af optalte celler skal multipliceres for kammerets volumen og til fortynding. - Fortsæt med at fortynde cellerne tælles fra 105 til 103 i cellekulturmedium og derefter tage 500 μL fra 103 og læg det inde i Tube 2.
- Hæld 25 mL cellekulturmediet rør 1 inde i en 100 mm x 15 mm plastik petriskål.
- Tag fire 96-U bund multiwell plader og ved hjælp af en multikanal pipette indstillet til 100 μL frø FCs i hver brønd.
- Tag Tube 2 og hæld cellekulturmediet inde i en petriskål. Ved hjælp af en multikanal pipette indstillet til 100 μL, frø T-celler i hver brønd.
- Opbevar multiwellpladerne i en CO2-inkubator i en uge.
5. Første genfeeding fase
- Ved hjælp af en bestrålet buffy coat taske, følg PBCS metode til at opnå FCs som beskrevet i den tidligere metode.
- Forbered den passende mængde CCM uden PHA og filtrer den.
- Brug en multikanal pipette, fjern 100 μL fra hver brønd, så du ikke rører bunden af brønden.
- Tilsæt 100 μL FCs i alle brønde som et fodringslag for at give cellekultur næringsstoffer og ændre mediet.
BEMÆRK: For hver multiwell anbefales det at overveje 6 mL CCM, så den anbefalede mængde for 4 multiwells er ca. 30 mL. PHA (0,4% af den samlede CCM mængde) skal tilføjes til CCM en gang hver anden uge.
6. Anden genfeeding fase
- Gentag genfeedingfasen efter den passage, der er beskrevet ovenfor. 0,4% PHA skal føjes til cellekulturmediet.
7. Første opdelingsfase fra 1 brønd/prøve til 2 brønde/prøve
- Tjek alle de fire multiwells under mikroskopet og gå videre opdele disse brønde med T celle kloner (TCCs).
- Følg PBMCs-protokollen for at isolere fødeceller fra en bestrålet buffy coat taske.
- Forbered cellekulturmediet med 30 U IL-2. Tilsæt FCs og tag en ny 96-godt multiwell plade med U bund.
- Ved hjælp af en pipette indstillet til 100 μL skylles godt inde i brøndene på de udvalgte prøver og del de 200 μL volumen, der er indeholdt i hver brønd i 2 nye brønde af den nye multiwellplade, for at have 100 μL volumen for hver af de nye 2 brønde.
- Tilsæt 100 μL FCs inde i alle de nye brønde. Hver brønd skal indeholde et samlet volumen på 200 μL.
- Sæt pipetten til 100 μL og tilsæt 100 μL i yderligere to brønde, der kun indeholder FCs til at tjene som en kontrol.
BEMÆRK: Brug let mikroskopi til at observere alle multiwell plader for at afgøre, hvilke brønde der med succes er vokset TCC. For at gøre valget af kloner lettere, kan der foretages en sammenligning med kontrolelementet (de to brønde, der kun indeholder FCs), med klonen ser mørkere og større i forhold til kontrollen. De brønde, der skal vælges, er dem med en stor, klar, rund klon, med lymfocytter tæt pakket sammen. Hvis der ikke er TCCs til stede efter to ugers genfeeding, anbefales det at vente en uge mere og udføre en ekstra genfeedingsfase.
8. Anden opdelingsfase fra 2 brønde/prøve til 4 brønde/prøve
- Sæt pipetten til 100 μL, skyl godt inde i de to brønde i hver prøve og frø to nye brønde på 100 μL for hver enkelt.
- Forbered cellekulturmediet med 30 U IL-2 og følg PBPC'er-teknikken til at udtrække FCs fra buffy coat-posen og placere FCs inde i CCM' en.
- Sæt pipetten til 100 μL og frø FCs i alle brønde. Opbevar multiwells i en CO2-inkubator i en uge.
9. Tredje opdelingsfase fra 4 brønde/prøve til 8 brønde/prøve:
- Ved hjælp af en multikanal pipette indstillet til 100 μL, skyl godt inde i alle fire brønde af hver prøve og frø 100 μL i hver af de fire nye brønde i en ny 96-brønd plade.
- Forbered cellekulturmediet og følg PBMCs teknik til at udtrække FCs fra en bestrålet buffy frakke taske.
- Placer FCs inde i CCM. Sæt pipetten til 100 μL og frø FCs i alle brønde. Opbevar multiwells i en CO2-inkubator i en uge
10. Cytofluorimetrisk analyse
- Tag multiwellpladen med den ældste dato fra CO2-inkubatoren , og identificer opsamlingsrørene med prøvenumrene, der skal analyseres.
- Ved hjælp af en multikanal pipette indstillet til 200 μL med 2 spidser, grundigt skylles inde i to brønde af samme prøve og sætte begge inde i samme indsamling rør. Gentag dette trin for alle prøverne.
BEMÆRK: FCs prøverne vil ikke blive analyseret, da de kun tjener som kontroller.
11. Forberedelse af antistofpletplet til cytofluorimetrisk analyse
- Der tilsættes 1 mL PBS-opløsning til hvert rør og centrifuge i 10 min ved 400 x g og 20 °C.
- Efter centrifugeringsfasen kasseres supernatanten.
BEMÆRK: Antistoffarvningspanelet findes i tabel 1. Hver enkelt antistofkoncentration beregnet er ca. 2 μL/prøve. Det anbefales kort at dreje antistofrørene før brug. For at beskytte de fluorophore-konjugerede antistoffer mod lys skal alle trin udføres i mørke. - Forbered antistofblandingen inde i et 1,5 ML rør og hvirvle det.
- Tilsæt antistofferne inde i prøverne og lad prøverne inkubere i mørket ved stuetemperatur i 15 min.
- Der tilsættes 1 mL PBS i hver prøve og centrifuge i 10 min ved 400 x g og 20 °C.
- Kassér supernatanten, og afhæng pelleten med 500 μL PBS-opløsning.
- Fortsæt med cytofluorimetrisk analyse (FACS-analyse, tabel 1).
BEMÆRK: De farvede prøver kan fastsættes ved hjælp af 0,5% paraformaldehyd (PFA) fortyndet i PBS-opløsning og analyseres op til 15 dage senere.
FORSIGTIG: PFA er giftig og skal håndteres omhyggeligt.
| Markør | Fluorophore |
| CD3 | PE/Cy7 |
| CD4 | Alexa Fluor 488 |
| CD8 | Strålende violet 510 |
| CD14 | Strålende violet 421 |
| CD25 | PE |
| CD45 | Strålende violet 711 |
Tabel 1. Antistof farvning panel til at opdage T lymfocytter befolkning i forkalkning aortaklappen sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi brugte en enkel og omkostningseffektiv metode til at karakterisere leukocytpopulationen af friske aortaklappenprøver fra humane patienter med svær aortaklappen stenose (se protokollen). Metoden til isolering af PBMCs er et vigtigt skridt i at opnå feederceller, som bruges i hvert trin i eksperimentet (kloning, genfeeding og opdelingsfaser) og muliggør påvisning og karakterisering af infiltrerende leukocytter i aortaklappenprøver. De vigtigste trin i denne metode er vist i figur 1.
Figur 1. FCs isolation fra buffy frakke. (A) Blod lagdelt over densitetsgradient medium (B) Hvide blodlegemer ring opnået efter centrifugering (C) Hvide blodlegemer indsamlet og suspenderet i PBS opløsning (D) Hvide celler observeret under lys mikroskopi Klik her for at se en større version af dette tal.
Efter to ugers inkubation klonede og voksede vi med succes en T-cellepopulation, som vist i figur 2.
Figur 2. T celle klon efter to ugers inkubation observeret ved hjælp af lys mikroskopi. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 illustrerer den gating ordning, der anvendes til analyse af T-celle delpopulationer hos patienter med CAVD. Som det fremgår af resultatet af FACS-analysen, er der flere CD4+ T-celler (43,032%) end CD8+ T-celler (1,079%).
Figur 3. Gating ordning anvendes til T celle-subpopulation analyse. (A) Der er anvendt en port til at identificere den specifikke T-cellepopulation i en stenotisk ventil. (B) CD14 negative lymfocytter og CD3 positive lymfocytter. (C) CD3-lymfocytter er gated for at skelne CD4 + T-celler fra CD8 + T-celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
For at vise, at de samme T-cellemarkører er til stede i både indfødte ventilprøver og klonede prøver, udførte vi FACS-analyse uden kloningsfasen, som illustreret i figur 4.
Figur 4. FACS analyseresultater af to ventilprøver. Vi sammenlignede T-cellerne fra en indbygget ventilprøve og en klonet prøve, der validerede, at T-cellerne, der findes i den oprindelige ventil, deler specifikke markører for T-cellerne i det endelige klonede produkt. (A) FACS-resultater af en oprindelig ventilprøve uden kloningsfasen. B) FACS-resultaterne af ventilprøven analyseret efter kloningsfasen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Hele arbejdsgangen er sammenfattet i figur 5, startende fra dissektionen af den menneskelige aortaventil og op til FACS-analysen. Alle trin er nødvendige for analyse af en aortaklappen prøve. Fase 1 viser lymfocyt isolation fra stenotisk aortaklappen væv. Ventilprøverne skal skæres og placeres i en petriskål fyldt med vaskebuffer. Ventilstykkerne kan placeres inde i en T25-kolbe fyldt med CCM og opbevares i en CO2-inkubator i en uge. Fase 2 viser kloningsfasen, som består af to dele: 1) FCs isolation fra bestrålet buffy coat taske og 2) T-celler kloning fase og kulminerer med cellekulturen i en 96-brønde multiwell plade, som opbevares i en CO2 inkubator i en uge. Fase 3 og 4 består af gentilførselsfasen ved hjælp af FCs fra bestrålet buffycoat; denne fase skal gentages i to på hinanden følgende uger. Fase 4, 5 og 6 viser opdelingsfasen af T-cellekloner; den første opdelingsfase er fra 1 brønd/prøve til to brønde for hver prøve i en ny multiwellplade den anden opdeling er fra 2 brønde / prøve til 4 brønde for hver i samme multiwell plade; den tredje og sidste opdelingsfase er fra 4 brønde/prøve til 8 i en ny multiwellplade. Fase 7 er den afsluttende fase, hvor prøverne analyseres ved hjælp af FACS-analyse.
Figur 5. CAVD Eksperimentel arbejdsproces. Klik her for at se en større version af dette tal.
Fra de foreløbige resultater (figur 2) kan vi konkludere, at lymfocytter sammen med CD45+ leukocytter er til stede i forkalkede aortaventiler, hvilket indikerer, at brændværdi aortaklappen sygdom er forbundet med aktivering af immunsystemet og inflammatorisk aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her præsenterer vi en metode til at karakterisere T lymfocyt subpopulationer isoleret fra stenotiske aortaklappen prøver, ved hjælp af flow cytometri. Denne metode kræver brug af bestrålet buffycoat til at isolere PBMCs. Strålingsfrekvensen, som buffy coat poser skal udsættes for, er 9000 Rad/90 Gray (Gy), og det repræsenterer et afgørende skridt til at standse spredningen af feeder celler. Cellernes rolle isoleret fra buffy coat poser er kun at fungere som feeder celler og give næringsstoffer til T-celler isoleret fra ventilerne. Brugen af en unirradiaded buffy coat taske ville fremme spredningen af PBMCs i kultur, som det er blevet bemærket i de sidste25. En strålingsfrekvens under 90 Gy viste PBMCs spredning i kultur, så vi anbefaler at bruge præcis 90 Gy af stråling. Bemærk, at det er tilrådeligt at bruge buffy coat bestrålet på samme dag eller højst den næste dag og holde den på en enhed, der holder den i konstant agitation. Et andet afgørende skridt i denne metode kunne være repræsenteret ved lymfocyt kloning fase, som kan blive påvirket af artefakter; for at undgå denne hændelse udfører vi FACS på friske aortaklappen prøver. Kloningsfasen af T-lymfocytter har den fordel, at der opnås et større antal T-kloner (i gennemsnit 15 T-celler kloner for hver ventil), der skal analyseres fænotypisk og funktionelt, end antallet fra analysen af en frisk prøve. Kloningsteknikken har været anvendt af denne forskningsgruppe i mange år, og afhængigt af den type væv, der blev analyseret, var lymfocytprofilen forskellig21,26,27. Den første passage af metoden vedrører T-celleisolering fra en stenotisk aortaventil. Alle de beskrevne trin skal udføres under en laminar flow hætte under sterile forhold, og det anbefales kraftigt at desinficere alle materialer før brug. Den tid, der kræves for at opnå resultater var 6 uger, og gennemsnittet af T-lymfocytceller fra kloningsfasen var 20 x 106 celler. Overvågningsfasen af multiwellpladerne er meget vigtig og må ikke overses. En ændring i farven på medium til gul kunne repræsentere bakteriel forurening, i hvilket tilfælde alle de anvendte instrumenter skal steriliseres og multiwell plader smidt væk.
Før FACS-analyse er det vigtigt at etablere en passende port for at kontrollere, at der ikke er nogen specifik overlapning mellem antistofkanalerne. Dette muliggør den optimale adskillelse mellem positive og negative porte. Det anbefales at anvende de samme masse antistoffer til alle prøver, der er involveret i undersøgelsen, for at opnå et homogent resultat. Det er også nødvendigt at beskytte de fluorophore-konjugerede antistoffer mod lys og udføre alle trin med lyset slukket.
Denne metode er effektiv til at give resultater med høj reproducerbarhed og er ikke dyrt. En begrænsning af denne metode er den lille prøvestørrelse på grund af den begrænsede tilgængelighed af de menneskelige ventilprøver samt manglen på en kontrolgruppe.
De foreløbige resultater understøtter adaptive immunitets rolle som et afgørende element i udviklingen og progressionen af brændværdi aortaklappens sygdom. Alle de patienter, der var indskrevet i denne undersøgelse, havde en diagnose af svær symptomatisk brændværdig aortastenose med en gennemsnitsalder på 70, for det meste mandlig. Eksistensen af T-cellepopulationer i de aortaventiler analyseret giver bevis for den inflammatoriske aktivitet af den syge aortaklappen som et kontrolpunkt for immuncelleaktivering. Et punkt af fremtidig interesse kunne være at analysere funktionaliteten af CAVD-infiltrere T-celler og karakterisere T-celle specificitet som tidligere rapporteret i lignende sygdomme, såsom i åreforkalkning28,29,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Alle de buffy frakkeposer, der blev brugt til denne protokol, blev bestrålet takket være tilgængeligheden af Dr. Peter Rosenthal, Dr. Dirk Böhmer og hele holdet af Radiology Department of Charité Benjamin Franklin. Scholarship Holder / Mary Roxana Christopher, dette arbejde er støttet af et stipendium fra det tyske hjerteselskab (DGK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL plastic syringes | Fisherbrand | 9000701 | |
| 96- well U- bottom Multiwell plates | Greiner Bio-One | 10638441 | |
| Bag Spike (needle free) | Sigma | P6148 | Dilute to 4% with PBS |
| CD14 Brilliant violet 421 | Biolegend | 560349 | |
| CD25 PE | Biolegend | 302621 | |
| CD3 PE/Cy7 | Biolegend | 300316 | |
| CD4 Alexa Fluor 488 | Biolegend | 317419 | |
| CD45 Brilliant violet 711 | Biolegend | 304137 | |
| CD8 Brilliant violet 510 | Biolegend | 301047 | |
| Eppendorf tube 1.5 mL | Eppendorf | 13094697 | |
| Eppendorf tube 0.5 mL | Thermo Scientific | AB0533 | |
| Falcon 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 10136120 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Falcon | 10788561 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | BD | 2300E | |
| Fast read 102 plastic counting chamber | KOVA INTERNATIONAL | 630-1893 | |
| Filters for culture medium 250 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 168-0045 | |
| Filters for culture medium 500 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| HB 101 Lyophilized Supplement | Irvine Scientific | T151 | |
| HB Basal Medium | Irvine Scientific | T000 | |
| Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum) | Euroclone | ECS0180L | |
| HS (Human serum) | Sigma Aldrich | H3667 | |
| Human IL-2 IS | Miltenyi Biotec | 130-097-744 | |
| L-Glutamine | Gibco | 11140050 | |
| Lymphoprep | Falcon | 352057 | |
| Non-essential amino acids solution | Sigma | 11082132001 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 10538931 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070063 | 10000 U/mL |
| PHA (phytohemagglutinin) | Stem Cell Technologies | 7811 | |
| Plastic Petri dishes | Thermo Scientific | R80115TS | 10 0mm x 15 mm |
| RPMI 1640 Media | HyClone | 15-040-CV | |
| Sodium pyruvate | Gibco by Life technologies | 11360070 | |
| Syringe Filters 0,45µl | Rotilabo-Spritzenfilter | P667.1 | |
| T-25 Cell culture flasks | InvitrogenThermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| T-75 Cell culture flask | Thermo Fisher Scientific | 10232771 | |
| β- Mercaptoethanol | Gibco | A2916801 |
References
- Nkomo, V. T., et al. Burden of valvular heart diseases: a population-based study. Lancet. 368 (9540), 1005-1011 (2006).
- Clavel, M. A., et al. Impact of aortic valve calcification, as measured by MDCT, on survival in patients with aortic stenosis: results of an international registry study. Journal of the American College of Cardiology. 64 (12), 1202-1213 (2014).
- Rosenhek, R., et al. Predictors of outcome in severe, asymptomatic aortic stenosis. The New England Journal of Medicine. 343 (9), 611-617 (2000).
- Alushi, B., et al. Pulmonary Hypertension in Patients With Severe Aortic Stenosis: Prognostic Impact After Transcatheter Aortic Valve Replacement: Pulmonary Hypertension in Patients Undergoing TAVR. JACC: Cardiovascular Imaging. 12 (4), 591-601 (2019).
- Figulla, H. R., Franz, M., Lauten, A. The History of Transcatheter Aortic Valve Implantation (TAVI)-A Personal View Over 25 Years of development. Cardiovascular Revascularization Medicine. 21 (3), 398-403 (2020).
- Lauten, A., et al. TAVI for low-flow, low-gradient severe aortic stenosis with preserved or reduced ejection fraction: a subgroup analysis from the German Aortic Valve Registry (GARY). Euro Intervention Journal. 10 (7), 850-859 (2014).
- Mirna, M., et al. Multi-biomarker analysis in patients after transcatheter aortic valve implantation (TAVI). Biomarkers. 23 (8), 773-780 (2018).
- Wernly, B., et al. Transcatheter aortic valve replacement for pure aortic valve regurgitation: "on-label" versus "off-label" use of TAVR devices. Clinical Research in Cardiology. 108 (8), 921-930 (2019).
- Wernly, B., et al. Transcatheter valve-in-valve implantation (VinV-TAVR) for failed surgical aortic bioprosthetic valves. Clinical Research in Cardiology. 108 (1), 83-92 (2019).
- Mathieu, P., Bouchareb, R., Boulanger, M. C. Innate and Adaptive Immunity in Calcific Aortic Valve Disease. Journal of Immunology Research. 2015, 851945 (2015).
- Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. Calcific Aortic Valve Disease: Molecular Mechanisms and Therapeutic Approaches. European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).
- Olsson, M., Thyberg, J., Nilsson, J. Presence of oxidized low density lipoprotein in nonrheumatic stenotic aortic valves. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 19 (5), 1218-1222 (1999).
- Mazzone, A., et al. T-lymphocyte infiltration, and heat shock protein-60 are biological hallmarks of an immunomediated inflammatory process in end-stage calcified aortic valve stenosis. Journal of the American College of Cardiology. 43 (9), 1670-1676 (2004).
- Wu, H. D., et al. The Lymphocytic Infiltration in Calcific Aortic Stenosis Predominantly Consists of Clonally Expanded T Cells. The Journal of Immunology. 178 (8), 5329-5339 (2007).
- Raddatz, M. A., Madhur, M. S., Merryman, W. D. Adaptive immune cells in calcific aortic valve disease. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 317 (1), 141-155 (2009).
- Galkina, E., et al. Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent. The Journal of Experimental Medicine. 203 (5), 1273-1282 (2006).
- Poursaleh, A., et al. Isolation of intimal endothelial cells from the human thoracic aorta: Study protocol. Medical journal of the Islamic Republic of Iran. 33, 51 (2019).
- Yun, T. J., Lee, J. S., Shim, D., Choi, J. H., Cheong, C. Isolation and Characterization of Aortic Dendritic Cells and Lymphocytes in Atherosclerosis. Methodsin Molecular Biology. 11559, 419-437 (2017).
- Adams, N. M., Grassmann, S., Sun, J. C. Clonal expansion of innate and adaptive lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 20 (11), 694-707 (2020).
- Amedei, A., et al. Characterization of tumor antigen peptide-specific T cells isolated from the neoplastic tissue of patients with gastric adenocarcinoma. Cancer Immunology & Immunotherapy. 58 (11), 1819-1830 (2009).
- Niccolai, E., et al. Intra-tumoral IFN-gamma-producing Th22 cells correlate with TNM staging and the worst outcomes in pancreatic cancer. Clinical Science (London). 130 (4), 247-258 (2016).
- Niccolai, E., et al. The Different Functional Distribution of "Not Effector" T Cells (Treg/Tnull) in Colorectal Cancer. Frontiers in Immunology. 8, 1900 (2017).
- Llames, S., Garcia-Perez, E., Meana, A., Larcher, F., del Rio, M. Feeder Layer Cell Actions and Applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 21 (4), 345-353 (2015).
- Ponchio, L., et al. Mitomycin C as an alternative to irradiation to inhibit the feeder layer growth in long-term culture assays. Cytotherapy. 2 (4), 281-286 (2000).
- Delso-Vallejo, M., Kollet, J., Koehl, U., Huppert, V. Influence of Irradiated Peripheral Blood Mononuclear Cells on Both Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells and Change in Cellular Property. Frontiers in Immunology. 8, 854 (2017).
- Amedei, A., et al. Molecular mimicry between Helicobacter pylori antigens and H+, K+ --adenosine triphosphatase in human gastric autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 198 (8), 1147-1156 (2003).
- Lienhardt, C., et al. Active tuberculosis in Africa is associated with reduced Th1 and increased Th2 activity in vivo. European Journal of Immunology. 32 (6), 1605-1613 (2002).
- Benagiano, M., et al. Chlamydophila pneumoniae phospholipase D (CpPLD) drives Th17 inflammation in human atherosclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1222-1227 (2012).
- Benagiano, M., et al. Human 60-kDa heat shock protein is a target autoantigen of T cells derived from atherosclerotic plaques. Journal of Immunology. 174 (10), 6509-6517 (2005).
- Benagiano, M., et al. T helper type 1 lymphocytes drive inflammation in human atherosclerotic lesions. Procceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6658-6663 (2003).
