Summary
במחקר זה, אנו מתארים את התהליך של בידוד לימפוציטים T מדגימות טריות של שסתומי אבי העורקים מסוידים ואת השלבים האנליטיים של שיבוט תאי T לאפיון של תת קבוצות לויקוציטים אדפטיביים באמצעות ניתוח ציטומטריית זרימה.
Abstract
מחלת שסתום אבי העורקים מסוידת (CAVD), תהליך מחלה פעיל החל עיבוי קל של השסתום להסתיידות חמורה, קשורה לתמותה גבוהה, למרות אפשרויות טיפוליות חדשות כגון החלפת שסתום אבי העורקים transcatheter (TAVR).
המסלולים המלאים שמתחילים בהסתיידות שסתום ומובילים לה היצרות אבי העורקים חמורה נשארים מובנים רק חלקית. על ידי מתן ייצוג הדוק של תאי שסתום אבי העורקים ב vivo, בדיקת לימפוציטים T מרקמת שסתום סטנוטית יכולה להיות דרך יעילה להבהיר את תפקידם בהתפתחות של הסתיידות. לאחר כריתה כירורגית, דגימת שסתום אבי העורקים הטרי מנותחת בחתיכות קטנות ואת לימפוציטים T הם מתורבתים, משובטים ואז מנותחים באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS).
הליך הכתמים הוא פשוט ואת צינורות מוכתמים ניתן גם לתקן באמצעות 0.5% של paraformaldehyde וניתח עד 15 ימים מאוחר יותר. התוצאות שנוצרו מלוח הכתמים ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר שינויים בריכוזים תאי T לאורך זמן ביחס להתערבות, יכול בקלות להיות מפותח עוד יותר כדי להעריך מצבי הפעלה של תת סוגים ספציפיים של תא T של עניין. במחקר זה, אנו מראים את הבידוד של תאי T, המבוצע על דגימות שסתום אבי העורקים מסויד טרי ואת השלבים של ניתוח שיבוטים תא T באמצעות cytometry זרימה כדי להבין עוד יותר את התפקיד של חסינות אדפטיבית בפתופיזיולוגיה CAVD.
Introduction
מחלת שסתום אבי העורקים קלציפי (CAVD) היא אחת ההפרעות הנפוצות ביותר שסתום הלב, עם השפעה כבדה על הבריאות. תדירות החלפת שסתום אבי העורקים בשנים האחרונות גדלה באופן דרמטי וצפויה לגדול עוד יותר, בשל הגידול באוכלוסיית הקשישים1.
הפתופיזיולוגיה הבסיסית של CAVD ידועה רק באופן חלקי והאסטרטגיות הטיפוליות הנוכחיות מוגבלות לצעדים שמרניים או להחלפת שסתום אבי העורקים, בין אם באמצעות הליכים כירורגיים או עוריים. עד כה, שום טיפול רפואי יעיל לא יכול לעכב או להפוך התקדמות CAVD ותמותה גבוהה קשורה עם הופעת סימפטום מוקדם, אלא אם כן החלפת שסתום אבי העורקים (AVR) מבוצעת2. בחולים עם היצרות חמורה של כאבי העורקים, הישרדות ללא תסמינים 3 שנים דווח נמוך כמו 20%3. החלפת שסתום אבי העורקים Transcatheter (TAVR) מייצגת אפשרות חדשה, מהפכה בטיפול בחולים בסיכון גבוה, במיוחד בקרב קשישים וצמצמה באופן דרמטי את התמותה, שהייתה גבוהה באופן מהותי באוכלוסייה זו4,5,6. למרות התוצאות המבטיחות של TAVR, דרוש מחקר נוסף כדי להבין פתופיזיולוגיה CAVD כדי לזהות מטרות טיפוליות מוקדמות חדשניות7,8,9.
בעבר נחשב תהליך פסיבי, ניווני, CAVD מוכר כעת כמחלה מתקדמת פעילה, המאופיינת על ידי מתג פנוטיפ osteoblastic של תאים interstitial שסתום אבי העורקים10. מחלה זו כרוכה מינרליזציה מתקדמת, שינויים פיברוקליפיים ותנועתיות מופחתת של עלוני שסתום אבי העורקים (טרשת), אשר בסופו של דבר לחסום את זרימת הדם המובילה היצרות (היצרות) של פתח שסתום אבי העורקים11.
דלקת נחשבת תהליך מפתח בפתופיזיולוגיה CAVD, בדומה לתהליך של טרשת עורקים וסקולרית. פגיעה אנדותל מאפשרת תצהיר והצטברות של מינים שומנים בדם, במיוחד ליפופרוטאינים מחומצנים בשסתום אבי העורקים12. ליפופרוטאינים מחומצנים אלה מעוררים תגובה דלקתית, שכן הם ציטוטוקסיים, עם הפעילות הדלקתית המובילה מינרליזציה. תפקידה של חסינות מולדת ומסתגלת בהתפתחות CAVD והתקדמות המחלה הודגש לאחרונה13. ההפעלה וההרחבה של תת-קבוצות ספציפיות של תאי T זיכרון תועדו בחולים עם CAVD ועלוני שסתום אבי העורקים מינרליזציה, כך שתהליכים דלקתיים מניחים להיות מעורבים לפחות בפיתוח של CAVD וככל הנראה בהתקדמות המחלה גם כן14. למעשה, למרות תאים אנטיגן מציג מקרופאגים נמצאים הן שסתום בריא ומחלות, נוכחות של לימפוציטים T מעידה על שסתום אבי העורקים מיושן וחולים. לימפוציטים זה לחדור יחד עם עלייה ניאווסקולריזציה מטאפלזיה אופייניים סימנים היסתולוגיים של CAVD15.
אנו משערים את קיומה של אינטראקציה בין תאי ביניים שסתום אבי העורקים ואת ההפעלה של המערכת החיסונית, אשר פוטנציאל מפעיל את תחילתו של תהליך דלקתי כרוני בשסתום אבי העורקים. בדיקת תאי T מרקמת שסתום אבי העורקים stenotic יכולה להיות דרך יעילה להבהיר את תפקידם בהתפתחות הסתיידות, שכן היא יכולה לספק ייצוג הדוק של תאי שסתום אבי העורקים ב vivo. בעבודה הנוכחית, באמצעות רקמת שסתום אבי העורקים, אנו מבודדים לימפוציטים T, תרבות לשכפל אותם, ולאחר מכן לאפיין אותם באמצעות מיון תאים המופעלים פלואורסצנטית (FACS). דגימות שסתום אבי העורקים טריים נכרתו מחולי CAVD שקיבלו החלפת שסתום כירורגי להיפוך אבי העורקים החמור. לאחר כריתת הכירורגיה, דגימת השסתום הטרי נותחה בחתיכות קטנות ותאי ה- T היו בתרבית, שוכפלו ואז נותחו באמצעות ציטומטריית זרימה. הליך הכתם הוא פשוט ואת הצינורות מוכתמים ניתן לתקן באמצעות 0.5% של paraformaldehyde וניתח עד 15 ימים מאוחר יותר. הנתונים שנוצרו מלוח הכתמים יכולים לשמש כדי לעקוב אחר שינויים בהתפלגות לימפוציטים T לאורך זמן ביחס להתערבות, ניתן לפתח בקלות עוד יותר כדי להעריך מצבי הפעלה של תת-קבוצות ספציפיות של תאי T של עניין.
מיצוי של רקמה מסוידת, בידוד של לויקוציטים מרקמה מסוידת ובמיוחד השימוש בציטומטריית זרימה על סוג זה של רקמה יכול להיות מאתגר, בשל בעיות כגון autofluorescence. פרסומים מעטים קיימים בפרוטוקולים למטרה ספציפית זו16,17,18. כאן אנו מציגים פרוטוקול שתוכנן במיוחד לבידוד ישיר ותרבות של לימפוציט T מדגימות שסתום אבי העורקים האנושי. הרחבת כלין של לימפוציטים היא סימן היכר של חסינות אדפטיבית. לימוד תהליך זה במבחנה מספק מידע תובנה על רמת הטרוגניות הלימפוציטים19. לאחר תקופת דגירה של שלושה שבועות, שיבוטי תאי T מוכנים להסבר, שכן הושגה כמות מספקת של תאי T מכל שיבוט, כדי לאפשר את המחקר הפנוטיפי והתפקודי. לאחר מכן הפנוטיפ של שיבוטי T נחקר על ידי ציטפלואורומטריה.
פרוטוקול אימונולוגי זה הוא התאמה של שיטה שפותחה בעבר על ידי Amedei et al. לבידוד תאי T ואפיון מרקמה אנושית, המיועדת במיוחד לרקמה אנושית מסוידת, כגון CAVD20,21,22. הפרוטוקול כאן לבידוד של PBMCs (תאים מונונוקלאריים בדם היקפי) באמצעות מעיל באפי מוקרן מתאר דרך יעילה להשיג תאי מאכילה (FC), המותאמים במיוחד לשלב השיבוט של לימפוציטים T מבודדים מתאי ביניים שסתום. שכבת המאכיל מורכבת מתאים עצורים בצמיחה, שעדיין הם בני קיימא וביואקטיביים. התפקיד של תאי מאכיל חשוב כדי לתמוך בהישרדות במבחנה וצמיחה של לימפוציטים T מבודדים תאים ביניים שסתום23. על מנת למנוע התפשטות תאי הזנה בתרבית, תאים אלה חייבים לעבור מעצר גדילה. זה יכול להיות מושגת בשתי דרכים: באמצעות שיטות פיזיות כגון הקרנה, או באמצעות טיפול עם כימיקלים ציטוטוקסיים, כגון mitomycin C (MMC), אנטיביוטיקה אנטיטומורלית שניתן ליישם ישירות על פני השטח התרבותיים24. כאן אנו מראים מעצר צמיחה תא מאכיל שהושג באמצעות הקרנת תאים.
שיטה זו מציגה דרך יעילה וחסכונית לבודד ולאפיין תאי T מרקמת שסתום אבי העורקים, התורמת להרחבת הספקטרום של שיטות אימונולוגיות לחקר פתופיזיולוגיה CAVD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
המחקר נערך על פי חוקת הצדקה להבטחת פרקטיקה מדעית טובה וכובדו ההנחיות וההוראות המשפטיות בנושא פרטיות ואתיקה. ועדת האתיקה אישרה את כל הניסויים בבני אדם והפרטיות והאנונימיות של המטופלים נשמרו בהתאם לכללים המדווחים בטופס האתי.
הערה: עבור הפרוטוקול המתואר להלן דגימות שסתום סטאוטי אנושי טרי שימשו.
1. הכנת ריאגנט
- הכן את RPMI מועשר מדיום מלא על ידי הוספת RPMI 1640 בינוני: חומצות אמינו לא חיוניות; נתרן פירובט, L- גלוטמין, ß-Mercaptoethanol ופניצילין-סטרפטומיצין (עט/סטרפטו אחרונים). סנן אותו לפני השימוש. יש לאחסן ב-+4 מעלות צלזיוס ולהשתמש תוך חודשיים.
- הכן את המדיום של תרבית התא (CCM) לשלב השיבוט באמצעות סרום בקר עוברי מועשר 1640 בינוני הוסיף חום (FBS), בינוני בזאלי HB, 50 U של Interleukin 2 (IL-2) וסרום אנושי (HS). סנן ולהשתמש בו בתוך יום. אל תאחסן.
- הכן את המדיום של תרבית התא לשלב ההזנה מחדש באמצעות המדיום המועשר RPMI 1640 עם תוספת FBS, בינוני בזאלי HB, 30 U של IL-2 ו- HS. סנן ולהשתמש בו בתוך יום. אל תאחסן.
- הכן את מאגר הכביסה המכיל 250 מ"ל של RPMI ו 5 מ"ל עט / סטרפטופון. יש לאחסן ב-+4 °C (7°F), יש להשתמש תוך חודשיים.
2. בידוד לימפוציטים T אנושי ותרבות לתוך T-25 צלוחיות
- מניחים את דגימת השסתום הסטאוטי לתוך צלחת פטרי סטרילית מלאה חוצץ לשטוף, להבטיח כי מדגם השסתום כולו מכוסה בו. תן לעמוד במשך 15 דקות.
- חותכים את השסתום הסטoטי לחתיכות קטנות באמצעות אזמל ולתת לו לעמוד שוב במשך 10 דקות.
- הכן את המדיום של תרבית התא עם 50 U של IL-2, כפי שתואר בעבר, וסנן אותו.
- מוסיפים את CCM בתוך צלוחיות T25 ושימוש צבת פלסטיק סטרילי, מניחים את חתיכות השסתום בתוך הבקבוקונים.
- לאחסן את הבקבוקונים במיקום אנכי בתוך אינקובטור CO2 במשך שבוע אחד, תוך כדי דאגה להתבונן במצב הבקבוקון מתחת למיקרוסקופ. שיבוטים של תאי T צריכים להיות גלויים כשלושה ימים לאחר שלב התרבות; לתצפית טובה יותר מומלץ למקם את הבקבוקונים במצב אופקי במשך 20 דקות לפני הניתוח המיקרוסקופי.
הערה: כמות המדיום של תרבית התא תלויה בכמות המדגם הקיימת ובכמה צלוחיות T25 ישמשו. בהתחשב בכך שכל פיסת שסתום דורש 10 מ"ל של CCM בתוך בקבוקון, 25 מ"ל של CCM בבקבוק T25 מתאים 3 חתיכות של שסתום.
3. שלב השיבוט
הערה: עבור שלב השיבוט של תאי T, יש צורך להתחיל עם בידוד של תאי מאכיל ממעיל באפי מוקרן (BC), בעקבות פרוטוקול PBMCs.
- פתח את שקית BC מתחת למכסה המנוע זרימה למינאר באמצעות ספייק שקית עם שסתום ללא מחט ולהעביר 50 מ"ל של דם בבקבוק T150. הוסף 70 מ"ל של PBS כדי לדלל דם בתוך הבקבוקון.
- קח ארבעה צינורות חרוט 50 מ"ל ומניחים 20 מ"ל של צפיפות הדרגתית בינונית בכל שכבה בזהירות 30 מ"ל של דם על זה.
- צנטריפוגה למשך 25 דקות ב 800 x g ו 20 °C (70 °F) עם הבלם כבוי.
- שאפו בזהירות את הסופר-טבעי והשליכו אותו כפסולת. לאסוף את טבעת PBMCs בצינור חרוטי 50 מ"ל חדש הוספת בתוך פתרון PBS עד נפח של 50 מ"ל.
- צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 400 x g ו 20 °C (50 °F).
- השלך את supernatant ולהשעות את הכדור על ידי הוספת בתוך פתרון PBS עד נפח של 50 מ"ל. חזור על שלב צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 400 x g ו 20 °C (70 °F).
- השלך את supernatant ולהשעות את FCs ב 10 מ"ל של תרבות התא בינוני.
- קח צינור אוסף חדש לדלל את FCs עם PBS 1:10 על ידי הוספת בתוך 9.9 מ"ל של PBS ו 100 μL מהצינור עם FCs ומדיום תרבית התא. לשטוף היטב עם pipette ולקחת 7 μL מן הדילול הזה ולספור את התאים מתחת למיקרוסקופ.
- הכן את המדיום תרבית התא לשלב השיבוט: 70 מ"ל עם 50 U של IL-2, ולאחר מכן לחלק אותו לשני צינורות חרוטיים 50 מ"ל, כל צינור יכיל 25 מ"ל של מדיום תרבית התא, כמתואר להלן:
- צינור 1: 25 מ"ל של CCM + FCs + 0.6% של פיטוהמגלוטינין (PHA)
- צינור 2: 25 מ"ל של לימפוציטים CCM + T
הערה: המטרה של שיטת PMBCs היא להשיג 2 x 106 תאים עבור כל מ"ל, ולכן 25 מ"ל של CCM מוכן (Tube 1) צריך להיות מחושב בהתאם. הנוסחה הכללית בה נעשה שימוש היא: מספר התאים שנספרו x 106: 1 מ"ל = CCM x 106: X
4. תרבות לימפוציטים T בצלחות רב-ווליות
- באמצעות pipette אלקטרוני, לאסוף את כל המדיום תרבית התא בתוך הבקבוקונים ולהעביר אותו לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. הבקבוקונים הריקים יכולים להיזרק.
- גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 400 x g ו 20 °C (70 °F).
- להשליך את supernatant, להשעות את הכדור ב 50 מ"ל של PBS ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 400 x g ו 20 °C (70 °F). חזור על שלב זה פעמיים.
- להשליך את supernatant ולהשעות את הכדור ב 1 מ"ל של CCM. קח 7 μL מהדיקול הזה וספור את התאים מתחת למיקרוסקופ.
הערה: יש להכפיל את מספר התאים שנספרו עבור נפח התא ולהחלת דילול. - המשך לדלל את התאים שנספרו מ 105 ל 103 במדיום תרבית התא ולאחר מכן לקחת 500 μL מ 103 ולשים אותו בתוך Tube 2.
- יוצקים את המדיום תרבית התא 25 מ"ל של Tube 1 בתוך צלחת פטרי פלסטיק 100 מ"מ x 15 מ"מ.
- קח ארבע צלחות multiwell התחתון 96 U ושימוש pipette רב ערוצי להגדיר 100 μL זרע FCs בכל באר.
- קח את Tube 2 ויוצקים את מדיום תרבית התא בתוך צלחת פטרי. באמצעות פיפטה רב ערוצית להגדיר 100 μL, זרע תאי T בכל באר.
- אחסן את הצלחות הרב-ווליות בתוך חממת CO2 למשך שבוע.
5. שלב ההזנה מחדש הראשון
- באמצעות שקית מעיל באפי מוקרן, בצע את שיטת PBMCs כדי להשיג FC כמתואר בשיטה הקודמת.
- הכן את הכמות המתאימה של CCM ללא PHA וסנן אותו.
- באמצעות pipette רב ערוצי, להסיר 100 μL מכל באר, להבטיח לא לגעת בתחתית הבאר.
- הוסף 100 μL של FCs בכל הבארות כמו שכבת האכלה כדי לספק חומרים מזינים תרבית התא ולשנות את המדיום.
הערה: עבור כל multiwell מומלץ לשקול 6 מ"ל של CCM, כך הכמות המומלצת עבור 4 multiwells הוא כ 30 מ"ל. PHA (0.4% מכמות CCM הכוללת) צריך להתווסף ל- CCM אחת לשבועיים.
6. שלב ההזנה מחדש השני
- חזור על שלב ההזנה מחדש לאחר הקטע המתואר לעיל. יש להוסיף 0.4% PHA למדיום תרבית התאים.
7. שלב הפיצול הראשון מ 1 טוב / מדגם ל 2 בארות / מדגם
- בדוק את כל ארבעת multiwells תחת המיקרוסקופ וללכת קדימה פיצול בארות אלה עם שיבוטים תא T (TCCs).
- פעלו לפי פרוטוקול ה-PBMCs כדי לבודד תאי מאכילה משקית מעיל באפי מוקרן.
- הכן את המדיום תרבית התא עם 30 U של IL-2. הוסף את ה- FCs וקח צלחת מולטיוול חדשה 96-well עם תחתית U.
- באמצעות פיפטה להגדיר 100 μL, לשטוף היטב בתוך בארות של הדגימות שנבחרו ולחלק את 200 μL של נפח הכלול בכל באר לתוך 2 בארות חדשות של צלחת multiwell החדש, על מנת לקבל 100 μL של נפח עבור כל אחת 2 בארות החדשות.
- הוסף 100 μL של FCs בתוך כל הבארות החדשות. כל באר חייבת להכיל נפח כולל של 200 μL.
- הגדר את הצינור ב 100 μL ולהוסיף 100 μL לתוך שתי בארות נוספות, המכיל רק FCs לשמש כפקד.
הערה: השתמש במיקרוסקופיה קלה כדי לבחון את כל הלוחות הרב-ווליים כדי לקבוע אילו בארות גידלו בהצלחה TCC. כדי להקל על בחירת השיבוטים, ניתן לבצע השוואה לפקד (שתי הבארות המכילות רק FCs), כאשר השיבוט נראה כהה וגדול יותר בהשוואה לפקד. בארות להיבחר הם אלה עם שיבוט גדול, ברור, עגול, עם לימפוציטים ארוזים בצפיפות יחד. אם אין TCCs נוכחים לאחר שבועיים של הזנה מחדש, מומלץ לחכות עוד שבוע אחד ולבצע שלב הזנה מחדש נוסף.
8. שלב הפיצול השני מ-2 בארות/דגימה ל-4 בארות/דגימה
- הגדר את הפיפטה ל 100 μL, לשטוף היטב בתוך שתי בארות של כל מדגם לזרוע שתי בארות חדשות של 100 μL עבור כל אחד.
- הכן את המדיום של תרבית התא עם 30 U של IL-2 ופעל לפי טכניקת ה- PBMCs כדי לחלץ את ה- FCs מתיק המעילים של באפי ולהניח את ה- FCs בתוך ה- CCM.
- הגדר את הפיפטה ל 100 μL ולזרוע את FCs בכל הבארות. אחסן את multiwells בחממה CO2 במשך שבוע אחד.
9. שלב הפיצול השלישי מ-4 בארות/דגימה ל-8 בארות/דגימה:
- באמצעות פיפטה רב ערוצית להגדיר 100 μL, לשטוף היטב בתוך כל ארבע בארות של כל מדגם לזרוע 100 μL לתוך כל אחת מארבע בארות חדשות בצלחת חדשה 96 טוב.
- הכן את המדיום של תרבית התא ובצע את טכניקת ה- PBMCs כדי לחלץ את ה- FCs משקית מעיל באפי מוקרן.
- מקם את ה- FCs בתוך CCM. הגדר את הפיפטה ל 100 μL ולזרוע את FCs בכל הבארות. אחסן את multiwells בחממה CO2 במשך שבוע אחד
10. ניתוח ציטופלואורימטרי
- קח את צלחת multiwell עם התאריך העתיק ביותר מן החממה CO2 ולזהות את צינורות האיסוף עם מספרי המדגם לנתח.
- באמצעות פיפטה רב ערוצית להגדיר 200 μL עם 2 טיפים, לשטוף ביסודיות בתוך שתי בארות של אותה מדגם ולשים את שניהם בתוך אותו צינור אוסף. חזור על שלב זה עבור כל הדגימות.
הערה: דגימות ה- FCs לא ינותחו, מכיוון שהן משמשות רק כפקדים.
11. הכנת לוח כתמי נוגדנים לניתוח ציטפלואורימטרי
- הוסף 1 מ"ל של פתרון PBS עבור כל צינור צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 400 x g ו 20 °C (70 °F).
- לאחר שלב הצנטריפוגה להשליך את supernatant.
הערה: ניתן למצוא את לוח הכתמת הנוגדנים בטבלה 1. כל ריכוז נוגדנים יחיד מחושב הוא כ 2 μL / מדגם. מומלץ לסובב בקצרה את צינורות הנוגדנים לפני השימוש. כדי להגן על הנוגדנים המצומדים מפני פלואורופור מפני אור, כל השלבים צריכים להתבצע בחושך. - הכן את תערובת הנוגדנים בתוך צינור 1.5 מ"ל ומערבולת זה.
- מוסיפים את הנוגדנים בתוך הדגימות ומשאירים דגימות לדגור בחושך בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.
- הוסף 1 מ"ל של PBS בכל דגימה וצנטריפוגה במשך 10 דקות ב 400 x g ו 20 °C (70 °F).
- להשליך את supernatant ולהשעות את הכדור עם 500 μL של פתרון PBS.
- המשך בניתוח הציטופלואורימטרי (ניתוח FACS, טבלה 1).
הערה: ניתן לתקן את הדגימות המוכתמות באמצעות 0.5% paraformaldehyde (PFA) מדולל בפתרון PBS וניתח עד 15 ימים מאוחר יותר.
זהירות: PFA רעיל ויש לטפל בו בזהירות.
| סמן | פלואורופור |
| CD3 | PE/Cy7 |
| CD4 | אלכסה פלור 488 |
| CD8 | סגול מבריק 510 |
| CD14 | סגול מבריק 421 |
| CD25 | PE |
| CD45 | סגול מבריק 711 |
טבלה 1. לוח כתמי נוגדנים כדי לזהות את אוכלוסיית לימפוציטים T בהסתיידות מחלת שסתום אבי העורקים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השתמשנו בשיטה פשוטה וחסכונית כדי לאפיין את אוכלוסיית הלויקוציטים של דגימות שסתום אבי העורקים טריות שמקורן בחולים אנושיים עם היצרות שסתום אבי העורקים חמורה (עיין בפרוטוקול). השיטה לבידוד PBMCs היא צעד חיוני בהשגת תאי מאכילה, המשמשים בכל שלב של הניסוי (שיבוט, הזנה מחדש ופיצול שלבי) ומאפשרים זיהוי ואפיון של לויקוציטים חודרים בדגימות שסתום אבי העורקים. שלבי המפתח של שיטה זו מוצגים באיור 1.
איור 1. בידוד קרנות כיפי ממעיל באפי. (A) דם בשכבות מעל צפיפות הדרגתית בינונית (B) טבעת תאי דם לבנים המתקבלת לאחר צנטריפוגה (C) תאי דם לבנים שנאספו והוצמדו מחדש בתמיסת PBS (D) תאים לבנים שנצפו תחת מיקרוסקופיה קלה אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
לאחר שבועיים של דגירה, שיכפלנו בהצלחה וגידלנו אוכלוסיית תאי T, כפי שמוצג באיור 2.
איור 2. שיבוט תא T לאחר שבועיים של דגירה נצפתה באמצעות מיקרוסקופיה קלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 ממחיש את תוכנית הג'טינג המשמשת לניתוח תת-אוכלוסין של תאי T בחולים עם CAVD. כפי שניתן לראות מהתוצאה של ניתוח FACS, ישנם יותר תאי T CD4+ (43.032%) מאשר CD8+ תאי T (1.079%).
איור 3. ערכת Gating מנוצלת עבור ניתוח תת-אכלוס תא T. (A) הוחל שער כדי לזהות את אוכלוסיית תאי ה- T הספציפית בשסתום סטנוטי. (B) לימפוציטים שליליים CD14 ולימפוציטים חיוביים CD3. (C) לימפוציטים CD3 מגודרים כדי להבחין בין תאי CD4+ T לתאי CD8+ T. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
כדי להראות שאותם סמני תאי T נמצאים הן בדגימות שסתום מקוריות והן בדגימות משובטות, ביצענו ניתוח FACS ללא שלב השיבוט, כפי שמודגם באיור 4.
איור 4. FACS ניתוח תוצאות של שתי דגימות שסתום. השווינו את תאי ה- T שהתקבלו מדגימת שסתום מקורית ודגימה משובטת, המאמתת שתאי ה- T שנמצאו בשסתום המקורי חולקים סמנים ספציפיים של תאי ה- T במוצר המשובט הסופי. (A) תוצאות FACS של דגימת שסתום מקורית, ללא שלב השיבוט. (B) תוצאות FACS של דגימת השסתום נותחו לאחר שלב השיבוט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
זרימת העבודה כולה מסוכמת באיור 5, החל מניתוח שסתום אבי העורקים האנושי ועד לניתוח ה-FACS. כל השלבים נדרשים לניתוח של דגימת שסתום אבי העורקים אחת. שלב 1 מראה את בידוד הלימפוציטים מרקמת שסתום אבי העורקים. דגימות השסתום צריכות להיחתך ולהניח בצלחת פטרי מלאה במאגר כביסה. חתיכות שסתום ניתן להציב בתוך בקבוקון T25 מלא CCM ומאוחסן בחממה CO2 במשך שבוע. שלב 2 מציג את שלב השיבוט, המורכב משני חלקים: 1) בידוד FCs משקית מעיל באפי מוקרן ו -2) שלב שיבוט תאי T ומגיע לשיאו עם תרבית התא בצלחת רב-וולס של 96 בארות, המאוחסנת בחממה CO2 למשך שבוע. שלבים 3 ו-4 מורכבים משלב ההזנה מחדש באמצעות FCs ממעיל באפי מוקרן; שלב זה חייב לחזור על עצמו במשך שבועיים רצופים. שלבים 4, 5 ו-6 מציגים את שלב הפיצול של שיבוטי תאי T; שלב הפיצול הראשון הוא מ 1 טוב / מדגם לשתי בארות עבור כל מדגם בצלחת multiwell חדשה; הפיצול השני הוא מ 2 בארות / מדגם ל 4 בארות עבור כל אחד באותה צלחת multiwell; שלב הפיצול השלישי והאחרון הוא מ-4 בארות/דגימה ל-8 בצלחת רב-וולית חדשה. שלב 7 הוא השלב הסופי, שבו הדגימות מנותחות באמצעות ניתוח FACS.
איור 5. זרימת עבודה ניסיונית של CAVD. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
מהתוצאות הראשוניות (איור 2) ניתן להסיק כי לימפוציטים, יחד עם CD45+ לויקוציטים נמצאים בשסתומים אבי העורקים מסוידים, ובכך מצביעים על כך שמחלת שסתום אבי העורקים קלציפי קשורה להפעלת המערכת החיסונית ופעילות דלקתית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מציגים שיטה לאפיון תת-אוכלוסין של לימפוציטים מסוג T המבודדים מדגימות שסתום אבי העורקים, באמצעות ציטומטריית זרימה. שיטה זו דורשת שימוש במעיל באפי מוקרן כדי לבודד את מחשבי ה-PBMCs. תדירות הקרינה שאליה יש לחשוף את שקיות המעילים היא 9000 Rad/90 Gray (Gy) והיא מייצגת צעד מכריע לעצירת התפשטות תאי המאכיל. תפקידם של התאים המבודדים משקיות המעילים של באפי הוא לפעול רק כתאי מאכילים ולספק חומרים מזינים לתאי ה- T המבודדים מהשסתומים. השימוש בשקית מעיל באפי לא רשמית יקדם התפשטות של מחשבים אישיים בתרבות, כפי שצוין ב-25 השנים האחרונות. תדר קרינה מתחת ל-90 ג'י הראה התפשטות של מחשבים אישיים בתרבות, אז אנחנו ממליצים להשתמש בדיוק ב-90 ג'י של קרינה. ראוי לציין, מומלץ להשתמש במעיל באפי מוקרן באותו יום או לכל היותר למחרת, שמירה אותו על מכשיר שמחזיק אותו נסער מתמיד. צעד מכריע נוסף של שיטה זו יכול להיות מיוצג על ידי שלב שיבוט הלימפוציטים, אשר יכול להיות מושפע על ידי חפצים; כדי למנוע אירוע זה אנו מבצעים את ה- FACS על דגימות שסתום אבי העורקים טריות. שלב השיבוט של לימפוציטים T יש את היתרון של קבלת מספר גדול יותר של שיבוטי T (ממוצע של 15 שיבוטים תאי T עבור כל שסתום) להיות מנותח פנוטיפיקי ופונקציונלי, מאשר המספר המתקבל מניתוח של מדגם טרי אחד. טכניקת השיבוט שימשה קבוצת מחקר זו במשך שנים רבות ובהתאם לסוג הרקמה שנותחה, פרופיל הלימפוציטים היה שונה21,26,27. המעבר הראשון של השיטה נוגע לבידוד תאי T מ שסתום אבי העורקים stenotic. כל השלבים המתוארים חייבים להתבצע תחת מכסה המנוע זרימה למינאר בתנאים סטריליים מומלץ מאוד לחטא את כל החומרים לפני השימוש. הזמן הנדרש כדי להשיג תוצאות היה 6 שבועות ואת הממוצע של תאי לימפוציטים T שהתקבלו משלב השיבוט היה 20 x 106 תאים. שלב הניטור של הלוחות הרב-וולים חשוב מאוד ואסור להתעלם ממנו. שינוי בצבע המדיום לצהוב יכול לייצג זיהום חיידקי, ובמקרה זה כל המכשירים המשמשים צריכים להיות מעוקרים ואת הצלחות multiwell נזרק.
לפני ניתוח FACS חשוב להקים שער מתאים, כדי לוודא שאין חפיפה ספציפית בין ערוצי הנוגדנים. זה מאפשר הפרדה אופטימלית בין שערים חיוביים ושליליים. השימוש באותם הרבה נוגדנים לכל הדגימות המעורבות במחקר מומלץ להשיג תוצאה הומוגנית. כמו כן יש צורך להגן על נוגדנים מצומדים פלואורופור מפני אור, ביצוע כל השלבים עם האור כבוי.
שיטה זו יעילה בהפקת תוצאות עם רבייה גבוהה ואינה יקרה. מגבלה של שיטה זו היא גודל המדגם הקטן, בשל הזמינות המוגבלת של דגימות שסתום אנושי, כמו גם היעדר קבוצת ביקורת.
התוצאות הראשוניות תומכות בתפקידה של חסינות אדפטיבית כמרכיב מכריע בהתפתחות ובהתקדמות מחלת שסתום אבי העורקים הקלציפית. כל החולים שנרשמו למחקר זה היו אבחנה של היצרות העורקים סימפטומטית חמורה, עם גיל ממוצע של 70, בעיקר זכר. קיומן של אוכלוסיות תאי T בשסתומי אבי העורקים שניתחו מספק ראיות לפעילות הדלקתית של שסתום אבי העורקים החולה כמחסום של הפעלת תאי החיסון. נקודה של עניין עתידי יכולה להיות לנתח את הפונקציונליות של תאי T חודרי CAVD ולאפיין את הספציפיות של תאי T כפי שדווח בעבר במחלות דומות, כגון טרשת עורקים28,29,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
כל שקיות המעילים של באפי ששימשו לפרוטוקול הזה הוקרנו הודות לזמינותם של ד"ר פיטר רוזנטל, ד"ר דירק בהמר וכל הצוות של מחלקת הרדיולוגיה של צ'רייט בנג'מין פרנקלין. בעל מלגה / מרי רוקסנה כריסטופר, עבודה זו נתמכת על ידי מלגה מאגודת הלב הגרמנית (DGK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL plastic syringes | Fisherbrand | 9000701 | |
| 96- well U- bottom Multiwell plates | Greiner Bio-One | 10638441 | |
| Bag Spike (needle free) | Sigma | P6148 | Dilute to 4% with PBS |
| CD14 Brilliant violet 421 | Biolegend | 560349 | |
| CD25 PE | Biolegend | 302621 | |
| CD3 PE/Cy7 | Biolegend | 300316 | |
| CD4 Alexa Fluor 488 | Biolegend | 317419 | |
| CD45 Brilliant violet 711 | Biolegend | 304137 | |
| CD8 Brilliant violet 510 | Biolegend | 301047 | |
| Eppendorf tube 1.5 mL | Eppendorf | 13094697 | |
| Eppendorf tube 0.5 mL | Thermo Scientific | AB0533 | |
| Falcon 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 10136120 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Falcon | 10788561 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | BD | 2300E | |
| Fast read 102 plastic counting chamber | KOVA INTERNATIONAL | 630-1893 | |
| Filters for culture medium 250 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 168-0045 | |
| Filters for culture medium 500 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| HB 101 Lyophilized Supplement | Irvine Scientific | T151 | |
| HB Basal Medium | Irvine Scientific | T000 | |
| Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum) | Euroclone | ECS0180L | |
| HS (Human serum) | Sigma Aldrich | H3667 | |
| Human IL-2 IS | Miltenyi Biotec | 130-097-744 | |
| L-Glutamine | Gibco | 11140050 | |
| Lymphoprep | Falcon | 352057 | |
| Non-essential amino acids solution | Sigma | 11082132001 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 10538931 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070063 | 10000 U/mL |
| PHA (phytohemagglutinin) | Stem Cell Technologies | 7811 | |
| Plastic Petri dishes | Thermo Scientific | R80115TS | 10 0mm x 15 mm |
| RPMI 1640 Media | HyClone | 15-040-CV | |
| Sodium pyruvate | Gibco by Life technologies | 11360070 | |
| Syringe Filters 0,45µl | Rotilabo-Spritzenfilter | P667.1 | |
| T-25 Cell culture flasks | InvitrogenThermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| T-75 Cell culture flask | Thermo Fisher Scientific | 10232771 | |
| β- Mercaptoethanol | Gibco | A2916801 |
References
- Nkomo, V. T., et al. Burden of valvular heart diseases: a population-based study. Lancet. 368 (9540), 1005-1011 (2006).
- Clavel, M. A., et al. Impact of aortic valve calcification, as measured by MDCT, on survival in patients with aortic stenosis: results of an international registry study. Journal of the American College of Cardiology. 64 (12), 1202-1213 (2014).
- Rosenhek, R., et al. Predictors of outcome in severe, asymptomatic aortic stenosis. The New England Journal of Medicine. 343 (9), 611-617 (2000).
- Alushi, B., et al. Pulmonary Hypertension in Patients With Severe Aortic Stenosis: Prognostic Impact After Transcatheter Aortic Valve Replacement: Pulmonary Hypertension in Patients Undergoing TAVR. JACC: Cardiovascular Imaging. 12 (4), 591-601 (2019).
- Figulla, H. R., Franz, M., Lauten, A. The History of Transcatheter Aortic Valve Implantation (TAVI)-A Personal View Over 25 Years of development. Cardiovascular Revascularization Medicine. 21 (3), 398-403 (2020).
- Lauten, A., et al. TAVI for low-flow, low-gradient severe aortic stenosis with preserved or reduced ejection fraction: a subgroup analysis from the German Aortic Valve Registry (GARY). Euro Intervention Journal. 10 (7), 850-859 (2014).
- Mirna, M., et al. Multi-biomarker analysis in patients after transcatheter aortic valve implantation (TAVI). Biomarkers. 23 (8), 773-780 (2018).
- Wernly, B., et al. Transcatheter aortic valve replacement for pure aortic valve regurgitation: "on-label" versus "off-label" use of TAVR devices. Clinical Research in Cardiology. 108 (8), 921-930 (2019).
- Wernly, B., et al. Transcatheter valve-in-valve implantation (VinV-TAVR) for failed surgical aortic bioprosthetic valves. Clinical Research in Cardiology. 108 (1), 83-92 (2019).
- Mathieu, P., Bouchareb, R., Boulanger, M. C. Innate and Adaptive Immunity in Calcific Aortic Valve Disease. Journal of Immunology Research. 2015, 851945 (2015).
- Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. Calcific Aortic Valve Disease: Molecular Mechanisms and Therapeutic Approaches. European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).
- Olsson, M., Thyberg, J., Nilsson, J. Presence of oxidized low density lipoprotein in nonrheumatic stenotic aortic valves. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 19 (5), 1218-1222 (1999).
- Mazzone, A., et al. T-lymphocyte infiltration, and heat shock protein-60 are biological hallmarks of an immunomediated inflammatory process in end-stage calcified aortic valve stenosis. Journal of the American College of Cardiology. 43 (9), 1670-1676 (2004).
- Wu, H. D., et al. The Lymphocytic Infiltration in Calcific Aortic Stenosis Predominantly Consists of Clonally Expanded T Cells. The Journal of Immunology. 178 (8), 5329-5339 (2007).
- Raddatz, M. A., Madhur, M. S., Merryman, W. D. Adaptive immune cells in calcific aortic valve disease. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 317 (1), 141-155 (2009).
- Galkina, E., et al. Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent. The Journal of Experimental Medicine. 203 (5), 1273-1282 (2006).
- Poursaleh, A., et al. Isolation of intimal endothelial cells from the human thoracic aorta: Study protocol. Medical journal of the Islamic Republic of Iran. 33, 51 (2019).
- Yun, T. J., Lee, J. S., Shim, D., Choi, J. H., Cheong, C. Isolation and Characterization of Aortic Dendritic Cells and Lymphocytes in Atherosclerosis. Methodsin Molecular Biology. 11559, 419-437 (2017).
- Adams, N. M., Grassmann, S., Sun, J. C. Clonal expansion of innate and adaptive lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 20 (11), 694-707 (2020).
- Amedei, A., et al. Characterization of tumor antigen peptide-specific T cells isolated from the neoplastic tissue of patients with gastric adenocarcinoma. Cancer Immunology & Immunotherapy. 58 (11), 1819-1830 (2009).
- Niccolai, E., et al. Intra-tumoral IFN-gamma-producing Th22 cells correlate with TNM staging and the worst outcomes in pancreatic cancer. Clinical Science (London). 130 (4), 247-258 (2016).
- Niccolai, E., et al. The Different Functional Distribution of "Not Effector" T Cells (Treg/Tnull) in Colorectal Cancer. Frontiers in Immunology. 8, 1900 (2017).
- Llames, S., Garcia-Perez, E., Meana, A., Larcher, F., del Rio, M. Feeder Layer Cell Actions and Applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 21 (4), 345-353 (2015).
- Ponchio, L., et al. Mitomycin C as an alternative to irradiation to inhibit the feeder layer growth in long-term culture assays. Cytotherapy. 2 (4), 281-286 (2000).
- Delso-Vallejo, M., Kollet, J., Koehl, U., Huppert, V. Influence of Irradiated Peripheral Blood Mononuclear Cells on Both Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells and Change in Cellular Property. Frontiers in Immunology. 8, 854 (2017).
- Amedei, A., et al. Molecular mimicry between Helicobacter pylori antigens and H+, K+ --adenosine triphosphatase in human gastric autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 198 (8), 1147-1156 (2003).
- Lienhardt, C., et al. Active tuberculosis in Africa is associated with reduced Th1 and increased Th2 activity in vivo. European Journal of Immunology. 32 (6), 1605-1613 (2002).
- Benagiano, M., et al. Chlamydophila pneumoniae phospholipase D (CpPLD) drives Th17 inflammation in human atherosclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1222-1227 (2012).
- Benagiano, M., et al. Human 60-kDa heat shock protein is a target autoantigen of T cells derived from atherosclerotic plaques. Journal of Immunology. 174 (10), 6509-6517 (2005).
- Benagiano, M., et al. T helper type 1 lymphocytes drive inflammation in human atherosclerotic lesions. Procceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6658-6663 (2003).
