Summary
In deze studie beschrijven we het proces van T-lymfocytenisolatie uit verse monsters van verkalkte aortakleppen en de analytische stappen van T-celklonen voor de karakterisering van de adaptieve leukocytensubsets met behulp van flowcytometrie-analyse.
Abstract
Calcific aortaklepziekte (CAVD), een actief ziekteproces variërend van milde verdikking van de klep tot ernstige verkalking, wordt geassocieerd met hoge mortaliteit, ondanks nieuwe therapeutische opties zoals transkatheter aortaklepvervanging (TAVR).
De volledige routes die beginnen met klepverkalking en leiden tot ernstige aortastenose blijven slechts gedeeltelijk begrepen. Door een nauwe weergave van de aortaklepcellen in vivo te bieden, zou het testen van T-lymfocyten uit stenotisch klepweefsel een efficiënte manier kunnen zijn om hun rol in de ontwikkeling van verkalking te verduidelijken. Na chirurgische excisie wordt het verse aortaklepmonster in kleine stukjes ontleed en worden de T-lymfocyten gekweekt, gekloond en vervolgens geanalyseerd met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS).
De kleuringsprocedure is eenvoudig en de gekleurde buizen kunnen ook worden bevestigd met 0,5% paraformaldehyde en tot 15 dagen later worden geanalyseerd. De resultaten van het kleuringspaneel kunnen worden gebruikt om veranderingen in T-celconcentraties in de loop van de tijd te volgen in relatie tot interventie en kunnen gemakkelijk verder worden ontwikkeld om activeringstoestanden van specifieke T-celsubtypen van belang te beoordelen. In deze studie tonen we de isolatie van T-cellen, uitgevoerd op verse verkalkte aortaklepmonsters en de stappen van het analyseren van T-celklonen met behulp van flowcytometrie om de rol van adaptieve immuniteit in CAVD-pathofysiologie verder te begrijpen.
Introduction
Calcific aortaklepziekte (CAVD) is een van de meest voorkomende hartklepaandoeningen, met een zware impact op de gezondheidszorg. De frequentie van aortaklepvervanging is de laatste jaren dramatisch toegenomen en zal naar verwachting verder toenemen, als gevolg van de groeiende oudere bevolking1.
De onderliggende pathofysiologie van CAVD is slechts gedeeltelijk bekend en de huidige therapeutische strategieën zijn beperkt tot conservatieve maatregelen of aortaklepvervanging, hetzij door chirurgische of percutane procedures. Tot op heden kan geen enkele effectieve medische behandeling de progressie van CAVD belemmeren of omkeren en is hoge mortaliteit geassocieerd met vroege symptoom-aanvang, tenzij aortaklepvervanging (AVR) wordt uitgevoerd2. Bij patiënten met ernstige symptomatische aortastenose werd de 3-jaars symptoomvrije overleving gerapporteerd zo laag als 20%3. Transkatheter aortaklepvervanging (TAVR) vertegenwoordigt een nieuwe optie, die een revolutie teweegbrengt in de behandeling van patiënten met een hoog risico, vooral bij ouderen, en heeft de mortaliteit, die intrinsiek hoog was in deze populatie, drastisch verminderd4,5,6. Ondanks de veelbelovende resultaten van TAVR is verder onderzoek nodig om de PATHOfysiologie van CAVD te begrijpen om nieuwe vroege therapeutische doelen te identificeren7,8,9.
Eerder gedacht dat het een passief, degeneratief proces was, wordt CAVD nu erkend als een actieve progressieve ziekte, gekenmerkt door een osteoblastische fenotypeschakelaar van de interstitiële cellen van de aortaklep10. Deze ziekte omvat progressieve mineralisatie, fibrocalcische veranderingen en verminderde beweeglijkheid van de aortaklepblaadjes (sclerose), die uiteindelijk de bloedstroom belemmeren, wat leidt tot vernauwing (stenose) van de aortaklepopening11.
Ontsteking wordt beschouwd als een belangrijk proces in cavd pathofysiologie, vergelijkbaar met het proces van vasculaire atherosclerose. Endotheelbeschadiging maakt de afzetting en accumulatie van lipidesoorten mogelijk, met name geoxideerde lipoproteïnen in de aortaklep12. Deze geoxideerde lipoproteïnen veroorzaken een ontstekingsreactie, omdat ze cytotoxisch zijn, waarbij de ontstekingsactiviteit leidt tot mineralisatie. De rol van aangeboren en adaptieve immuniteit in de ontwikkeling van CAVD en ziekteprogressie is onlangs benadrukt13. De activering en klonale expansie van specifieke subsets van geheugen T-cellen zijn gedocumenteerd bij patiënten met CAVD en gemineraliseerde aortaklepblaadjes, zodat ontstekingsprocessen worden verondersteld op zijn minst betrokken te zijn bij de ontwikkeling van CAVD en vermoedelijk ook bij ziekteprogressie14. Hoewel antigeen-presenterende cellen en macrofagen aanwezig zijn in zowel de gezonde als de zieke klep, is de aanwezigheid van T-lymfocyten indicatief voor een verouderde en zieke aortaklep. Dit lymfocytische infiltraat samen met een toename van neovascularisatie en metaplasie zijn karakteristieke histologische tekenen van CAVD15.
We veronderstellen het bestaan van een interactie tussen de interstitiële cellen van de aortaklep en de activering van het immuunsysteem, wat mogelijk de initiatie van een chronisch ontstekingsproces in de aortaklep veroorzaakt. Het testen van T-cellen uit stenotisch aortaklepweefsel zou een efficiënte manier kunnen zijn om hun rol in de ontwikkeling van verkalking te verduidelijken, omdat het een nauwe weergave van de aortaklepcellen in vivo kan bieden. In het huidige werk, met behulp van aortaklepweefsel, isoleren we T-lymfocyten, kweken en klonen ze, en karakteriseren ze vervolgens met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Verse aortaklepmonsters werden weggesneden van CAVD-patiënten die chirurgische klepvervanging kregen voor ernstige aortastenose. Na de chirurgische excisie werd het verse klepmonster in kleine stukjes ontleed en werden de T-cellen gekweekt, gekloond en vervolgens geanalyseerd met behulp van flowcytometrie. De kleuringsprocedure is eenvoudig en de gekleurde buizen kunnen worden bevestigd met 0,5% paraformaldehyde en tot 15 dagen later worden geanalyseerd. De gegevens die door het kleuringspaneel worden gegenereerd, kunnen worden gebruikt om veranderingen in de distributie van T-lymfocyten in de loop van de tijd in relatie tot interventie te volgen en kunnen gemakkelijk verder worden ontwikkeld om activeringstoestanden van specifieke T-celsubsets van belang te beoordelen.
De extractie van verkalkt weefsel, de isolatie van leukocyten uit verkalkt weefsel en met name het gebruik van flowcytometrie op dit type weefsel kan een uitdaging zijn, vanwege problemen zoals autofluorescentie. Er bestaan weinig publicaties met protocollen voor dit specifieke doel16,17,18. Hierin presenteren we een protocol dat speciaal is ontworpen voor de directe isolatie en kweek van T-lymfocyten uit menselijke aortaklepmonsters. Klonale expansie van lymfocyten is een kenmerk van adaptieve immuniteit. Het bestuderen van dit proces in vitro levert inzichtelijke informatie op over het niveau van lymfocyten heterogeniteit19. Na een incubatietijd van drie weken zijn de T-celklonen klaar om te worden geëxplanteerd, omdat een voldoende hoeveelheid T-cellen van elke kloon werd verkregen, om de fenotypische en functionele studie mogelijk te maken. Vervolgens wordt het fenotype van T-klonen bestudeerd door cytofluorometrie.
Dit immunologische protocol is een aanpassing van een eerder door Amedei et al. ontwikkelde methode voor T-celisolatie en karakterisering uit menselijk weefsel, speciaal ontworpen voor verkalkt menselijk weefsel, zoals in CAVD20,21,22. Het protocol hier voor de isolatie van PBMC's (perifere bloedmononucleaire cellen) met behulp van bestraalde buffy coat beschrijft een effectieve manier om feedercellen (FC) te verkrijgen, specifiek aangepast voor de kloonfase van T-lymfocyten geïsoleerd uit klepinterstitiële cellen. De feederlaag bestaat uit in groei gestopte cellen, die nog levensvatbaar en bioactief zijn. De rol van feedercellen is belangrijk ter ondersteuning van in vitro overleving en groei van T-lymfocyten geïsoleerd uit klepinterstitiële cellen23. Om feedercelproliferatie in cultuur te voorkomen, moeten deze cellen een groeistop ondergaan. Dit kan op twee manieren worden bereikt: door fysische methoden zoals bestraling, of door behandeling met cytotoxische chemicaliën, zoals mitomycine C (MMC), een antitumoraal antibioticum dat rechtstreeks op het kweekoppervlak kan worden aangebracht24. Hier laten we zien dat de groei van de feedercel wordt gestopt door celbestraling.
Deze methode biedt een efficiënte, kosteneffectieve manier om T-cellen uit aortaklepweefsel te isoleren en te karakteriseren, wat bijdraagt aan het verbreden van het spectrum van immunologische methoden voor het verkennen van CAVD-pathofysiologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De studie werd uitgevoerd volgens het Statuut van de Charité voor het waarborgen van goede wetenschappelijke praktijken en de wettelijke richtlijnen en bepalingen inzake privacy en ethiek werden gerespecteerd. De ethische commissie keurde alle menselijke experimenten goed en de privacy en anonimiteit van de patiënten werden gehandhaafd in overeenstemming met de regels die op het ethische formulier werden gerapporteerd.
OPMERKING: Voor het hieronder beschreven protocol werden verse menselijke stenotische klepmonsters gebruikt.
1. Reagensvoorbereiding
- Bereid het verrijkte RPMI complete medium door rpmi 1640 medium toe te voegen: niet-essentiële aminozuren; Natriumpyruvaat, L-glutamine, ß-mercaptoethanol en penicilline-streptomycine (Pen/Strep). Filter het voor gebruik. Bewaren bij +4 °C en binnen twee maanden gebruiken.
- Bereid het celkweekmedium (CCM) voor op de kloonfase met behulp van het verrijkte RPMI 1640 complete medium met warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), HB-basaal medium, 50 U interleukine 2 (IL-2) en menselijk serum (HS). Filter en gebruik het binnen de dag. Niet bewaren.
- Bereid het celkweekmedium voor op de hervoedingsfase met behulp van het verrijkte RPMI 1640 complete medium met toegevoegde FBS, HB basaal medium, 30 U IL-2 en HS. Filter en gebruik het binnen de dag. Niet bewaren.
- Bereid de wasbuffer voor met 250 ml RPMI en 5 ml pen/streptokokken. Bewaren bij +4 °C, binnen twee maanden gebruiken.
2. Menselijke T-lymfocytenisolatie en -kweek in T-25-kolven
- Plaats het stenotische klepmonster in een steriele petrischaal gevuld met wasbuffer en zorg ervoor dat het volledige klepmonster ermee bedekt is. Laat 15 minuten staan.
- Snijd de stenotische klep in kleine stukjes met behulp van een scalpel en laat het opnieuw 10 minuten staan.
- Bereid het celkweekmedium voor met 50 U IL-2, zoals eerder beschreven, en filter het.
- Voeg de CCM toe in de T25-kolven en plaats met behulp van een steriele plastic tang de klepstukken in de kolven.
- Bewaar de kolven gedurende één week in een verticale positie in een CO2-incubator en let erop dat de status van de kolf onder de microscoop wordt geobserveerd. T-celklonen moeten ongeveer drie dagen na de kweekstap zichtbaar zijn; voor een betere waarneming is het raadzaam om de kolven gedurende 20 minuten vóór de microscopische analyse in horizontale positie te plaatsen.
OPMERKING: De hoeveelheid celkweekmedium is afhankelijk van de hoeveelheid monster die aanwezig is en van het aantal T25-kolven dat zal worden gebruikt. Aangezien elk stuk klep 10 ml CCM in een kolf vereist, is 25 ml CCM in een T25-kolf geschikt voor 3 stuks klep.
3. Kloonfase
OPMERKING: Voor de kloonfase van T-cellen is het noodzakelijk om te beginnen met de isolatie van feedercellen uit een bestraalde buffy coat (BC), volgens het PBMC-protocol.
- Open de BC-zak onder de laminaire stroomkap met behulp van de zakpen met naaldvrije klep en breng 50 ml bloed over in een T150-kolf. Voeg 70 ml PBS toe om het bloed in de kolf te verdunnen.
- Neem vier conische buizen van 50 ml en plaats er 20 ml dichtheidsgradiëntmedium in en leg er voorzichtig 30 ml bloed overheen.
- Centrifugeer gedurende 25 minuten bij 800 x g en 20 °C met de rem uit.
- Zuig het supernatant voorzichtig op en gooi het weg als afval. Verzamel de PBMC-ring in een nieuwe conische buis van 50 ml en voeg in de PBS-oplossing toe tot een volume van 50 ml.
- Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 400 x g en 20 °C.
- Gooi het supernatant weg en suspensie de pellet door het in de PBS-oplossing toe te voegen tot een volume van 50 ml. Herhaal de centrifugatiefase gedurende 10 minuten bij 400 x g en 20 °C.
- Gooi het supernatant weg en suspensie de FCs in 10 ml celkweekmedium.
- Neem een nieuwe opvangbuis en verdun de FCs met PBS 1:10 door 9,9 ml PBS en 100 μL uit de buis toe te voegen met FCs en celkweekmedium. Spoel goed af met een pipet en neem 7 μL uit deze verdunning en tel de cellen onder de microscoop.
- Bereid het celkweekmedium voor op de kloonfase: 70 ml met 50 U IL-2 en verdeel het vervolgens in twee conische buizen van 50 ml, elke buis bevat 25 ml celkweekmedium, zoals hieronder beschreven:
- Buis 1: 25 ml CCM + FCs + 0,6% fytohemagglutinine (PHA)
- Buis 2: 25 ml CCM + T-lymfocyten
OPMERKING: Het doel van de PMBC-methode is om 2 x 106 cellen voor elke ml te verkrijgen, dus de 25 ml CCM-bereide (buis 1) moet dienovereenkomstig worden berekend. De gebruikte algemene formule is: Aantal getelde cellen x 106: 1 ml = CCM x 106: X
4. T Lymfocyten cultuur in multiwell platen
- Verzamel met behulp van de elektronische pipet al het celkweekmedium in de kolven en breng het over in een conische buis van 50 ml. De lege kolven kunnen worden weggegooid.
- Pellet de cellen door centrifugeren gedurende 10 minuten bij 400 x g en 20 °C.
- Gooi het supernatant weg, suspensuspensie de pellet in 50 ml PBS en verzamel de cellen door centrifugeren gedurende 10 minuten bij 400 x g en 20 °C. Herhaal deze stap twee keer.
- Gooi het supernatant weg en suspensie de pellet in 1 ml CCM. Neem 7 μL van deze verdunning en tel de cellen onder de microscoop.
OPMERKING: Het aantal getelde cellen moet worden vermenigvuldigd voor het volume van de kamer en voor de toegepaste verdunning. - Ga verder met het verdunnen van de cellen geteld van 105 tot 103 in celkweekmedium en neem vervolgens 500 μL van 103 en plaats het in de buis 2.
- Giet het 25 ml celkweekmedium van buis 1 in een plastic petrischaaltje van 100 mm x 15 mm.
- Neem vier 96-U bottom multiwell platen en gebruik een meerkanaals pipet ingesteld op 100 μL zaad FCs in elke put.
- Neem de Tube 2 en giet het celkweekmedium in een petrischaaltje. Met behulp van een meerkanaalspipet ingesteld op 100 μL, zaad T-cellen in elke put.
- Bewaar de multiwell-platen gedurende een week in een CO2-incubator .
5. Eerste refeeding fase
- Gebruik een bestraalde buffy coat-zak om de PBMC-methode te gebruiken om VC's te verkrijgen zoals beschreven in de vorige methode.
- Bereid de geschikte hoeveelheid CCM voor zonder PHA en filtreer deze.
- Verwijder met behulp van een meerkanaalspipet 100 μL uit elke put en zorg ervoor dat u de bodem van de put niet raakt.
- Voeg 100 μL VC's toe in alle putten als voedingslaag om celkweekvoedingsstoffen te leveren en het medium te veranderen.
OPMERKING: Voor elke multiwell wordt geadviseerd om 6 ml CCM te overwegen, dus de aanbevolen hoeveelheid voor 4 multiwells is ongeveer 30 ml. PHA (0,4% van de totale CCM-hoeveelheid) moet eens in de twee weken aan de CCM worden toegevoegd.
6. Tweede hervoedingsfase
- Herhaal de hervoedingsfase na de hierboven beschreven passage. 0,4% PHA moet worden toegevoegd aan het celkweekmedium.
7. Eerste splijtfase van 1 put/monster naar 2 putten/monster
- Controleer alle vier de multiwells onder de microscoop en ga je gang met het splitsen van die putten met T-celklonen (TCC's).
- Volg het PBMC-protocol om feedercellen te isoleren uit een bestraalde buffy coat-zak.
- Bereid het celkweekmedium voor met 30 U IL-2. Voeg de FCs toe en neem een nieuwe 96-well multiwell plaat met U bodem.
- Gebruik een pipet van 100 μL, spoel goed in de putten van de geselecteerde monsters en verdeel de 200 μL volume in elke put in 2 nieuwe putten van de nieuwe multiwellplaat, om 100 μL volume te hebben voor elk van de nieuwe 2 putten.
- Voeg 100 μL FCs toe in alle nieuwe putten. Elke put moet een totaal volume van 200 μL bevatten.
- Stel de pipet in op 100 μL en voeg 100 μL toe in nog eens twee putten, die alleen FCs bevatten om als controle te dienen.
OPMERKING: Gebruik lichtmicroscopie om alle multiwell-platen te observeren om te bepalen welke putten met succes TCC hebben gekweekt. Om de selectie van klonen gemakkelijker te maken, kan een vergelijking worden gemaakt met de besturing (de twee putten bevatten alleen FCs), waarbij de kloon donkerder en groter lijkt in vergelijking met de besturing. De te selecteren putten zijn die met een grote, heldere, ronde kloon, met lymfocyten dicht op elkaar gepakt. Als er na twee weken refeeding geen TCC's aanwezig zijn, is het raadzaam om nog een week te wachten en een extra refeedingfase uit te voeren.
8. Tweede splitsingsfase van 2 putten/monster naar 4 putten/monster
- Stel de pipet in op 100 μL, spoel goed in de twee putjes van elk monster en zaai twee nieuwe putjes van 100 μL voor elk.
- Bereid het celkweekmedium voor met 30 U IL-2 en volg de PBMC-techniek om de FCs uit de buffy coat-zak te extraheren en de FCs in de CCM te plaatsen.
- Zet de pipet op 100 μL en zaai de FCs in alle putjes. Bewaar de multiwells een week in een CO2-incubator .
9. Derde splitsingsfase van 4 putten/monster naar 8 putten/monster:
- Gebruik een meerkanaalspipet van 100 μL, spoel goed in alle vier de putten van elk monster en zaai 100 μL in elk van de vier nieuwe putten in een nieuwe 96-putplaat.
- Bereid het celkweekmedium voor en volg de PBMC-techniek om de FCs uit een bestraalde buffy coat-zak te extraheren.
- Plaats de VC's in de CCM. Zet de pipet op 100 μL en zaai de FCs in alle putjes. Bewaar de multiwells een week in een CO2-incubator
10. Cytofluorimetrische analyse
- Neem de multiwellplaat met de oudste datum uit de CO2-incubator en identificeer de verzamelbuizen met de monsternummers om te analyseren.
- Gebruik een meerkanaalspipet van 200 μL met 2 tips om twee putten van hetzelfde monster grondig te spoelen en beide in dezelfde opvangbuis te plaatsen. Herhaal deze stap voor alle voorbeelden.
OPMERKING: De FCs-monsters worden niet geanalyseerd, omdat ze alleen als controles dienen.
11. Antilichaamkleuringspanel Voorbereiding voor cytofluorimetrische analyse
- Voeg 1 ml PBS-oplossing toe voor elke buis en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 400 x g en 20 °C.
- Gooi na de centrifugatiefase het supernatant weg.
OPMERKING: Het antilichaamkleuringspaneel is te vinden in tabel 1. Elke berekende antilichaamconcentratie is ongeveer 2 μL/monster. Het wordt aanbevolen om de antilichaambuizen kort te draaien voor gebruik. Om de fluorofoor-geconjugeerde antilichamen tegen licht te beschermen, moeten alle stappen in het donker worden uitgevoerd. - Bereid het antilichaammengsel in een buis van 1,5 ml en vortex het.
- Voeg de antilichamen in de monsters toe en laat de monsters gedurende 15 minuten in het donker bij kamertemperatuur incuberen.
- Voeg 1 ml PBS toe aan elk monster en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 400 x g en 20 °C.
- Gooi het supernatant weg en suspensie de pellet met 500 μL PBS-oplossing.
- Ga verder met de cytofluorimetrische analyse (FACS-analyse, tabel 1).
OPMERKING: De gekleurde monsters kunnen worden gefixeerd met behulp van 0,5% paraformaldehyde (PFA) verdund in PBS-oplossing en tot 15 dagen later geanalyseerd.
LET OP: PFA is giftig en moet zorgvuldig worden behandeld.
| Marker | Fluorofoor |
| cd3 | PE/Cy7 |
| cd4 | Alexa Fluor 488 |
| cd8 | Briljant violet 510 |
| cd14 | Briljant violet 421 |
| cd25 | PE |
| cd45 | Briljant violet 711 |
Tabel 1. Antilichaamkleuringspaneel om de T-lymfocytenpopulatie te detecteren bij verkalkingsaortaklepziekte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We gebruikten een eenvoudige en kosteneffectieve methode om de leukocytenpopulatie van verse aortaklepmonsters afgeleid van menselijke patiënten met ernstige aortaklepstenose te karakteriseren (zie protocol). De methode voor het isoleren van PBMC's is een essentiële stap in het verkrijgen van feedercellen, die in elke stap van het experiment worden gebruikt (kloon-, refeeding- en splitfasen) en die de detectie en karakterisering van infiltrerende leukocyten in aortaklepmonsters mogelijk maken. De belangrijkste stappen van deze methode worden weergegeven in figuur 1.
Figuur 1. FCs isolatie van buffy jas. (A) Bloed gelaagd over dichtheidsgradiënt medium (B) Witte bloedcellen ring verkregen na centrifugering (C) Witte bloedcellen verzameld en geresuspendeerd in PBS-oplossing (D) Witte bloedcellen waargenomen onder lichtmicroscopie Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Na twee weken incubatie hebben we met succes een T-celpopulatie gekloond en laten groeien, zoals te zien is in figuur 2.
Figuur 2. T-cel kloon na twee weken incubatie waargenomen met behulp van lichtmicroscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3 illustreert het gatingschema dat wordt gebruikt voor de analyse van T-celsubpopulaties bij patiënten met CAVD. Zoals blijkt uit het resultaat van de FACS-analyse, zijn er meer CD4+ T-cellen (43,032%) dan CD8+ T-cellen (1,079%).
Figuur 3. Gating-schema gebruikt voor T-cel-subpopulatieanalyse. (A) Er is een poort toegepast om de specifieke T-celpopulatie in een stenotische klep te identificeren. (B) CD14 negatieve lymfocyten en CD3 positieve lymfocyten. (C) CD3-lymfocyten zijn gated om CD4+ T-cellen te onderscheiden van CD8+ T-cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Om aan te tonen dat dezelfde T-celmarkers aanwezig zijn in zowel native klepmonsters als gekloonde monsters, hebben we FACS-analyse uitgevoerd zonder de kloonfase, zoals geïllustreerd in figuur 4.
Figuur 4. FACS-analyseresultaten van twee klepmonsters. We vergeleken de T-cellen verkregen uit een native klepmonster en een gekloond monster, waarbij we bevestigden dat de T-cellen in de native klep specifieke markers van de T-cellen in het uiteindelijke gekloonde product delen. (A) FACS-resultaten van een native klepmonster, zonder de kloonfase. B) FACS-resultaten van het klepmonster dat na de kloonfase is geanalyseerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De volledige workflow is samengevat in figuur 5, beginnend bij de dissectie van de menselijke aortaklep en voorafgaand aan de FACS-analyse. Alle stappen zijn vereist voor de analyse van één aortaklepmonster. Fase 1 toont de lymfocytenisolatie van stenotisch aortaklepweefsel. De klepmonsters moeten worden gesneden en in een petrischaaltje worden geplaatst dat is gevuld met wasbuffer. De klepstukken kunnen in een T25-kolf gevuld met CCM worden geplaatst en gedurende een week in een CO2-incubator worden bewaard. Fase 2 toont de kloonfase, die uit twee delen bestaat: 1) FCs isolatie van bestraalde buffy coat bag en 2) T-cellen kloonfase en culmineert in de celkweek in een 96-wells multiwell plaat, die gedurende een week in een CO2-incubator wordt bewaard. Fase 3 en 4 bestaan uit de refeedingfase met behulp van FCs uit bestraalde buffy coat; deze fase moet gedurende twee opeenvolgende weken worden herhaald. Fase 4, 5 en 6 tonen de splitsingsfase van T-celklonen; de eerste splitsingsfase is van 1 put/monster tot twee putten voor elk monster in een nieuwe meerbronplaat; de tweede splitsing is van 2 putten /monster tot 4 putten voor elk in dezelfde meerbronplaat; de derde en laatste splijtfase is van 4 putten/monster naar 8 in een nieuwe multiwellplaat. Fase 7 is de laatste fase, waarin de monsters worden geanalyseerd met behulp van FACS-analyse.
Figuur 5. CAVD Experimentele workflow. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Uit de voorlopige resultaten (figuur 2) kunnen we concluderen dat lymfocyten, samen met CD45+ leukocyten aanwezig zijn in verkalkte aortakleppen, wat aangeeft dat calcific aortaklepziekte verband houdt met activering van het immuunsysteem en ontstekingsactiviteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier presenteren we een methode om T-lymfocytensubpopulaties te karakteriseren die zijn geïsoleerd uit stenotische aortaklepmonsters, met behulp van flowcytometrie. Deze methode vereist het gebruik van bestraalde buffy coat om de PBMC's te isoleren. De stralingsfrequentie waaraan de buffy coat bags moeten worden blootgesteld is 9000 Rad/90 Gray (Gy) en het is een cruciale stap om de proliferatie van de feedercellen te stoppen. De rol van de cellen geïsoleerd uit de buffy coat bags is om alleen te fungeren als feeder cellen en voedingsstoffen te leveren voor de T-cellen geïsoleerd uit de kleppen. Het gebruik van een niet-gegolfde buffy jaszak zou de verspreiding van PBMC's in de cultuur bevorderen, zoals in het verleden is opgemerkt25. Een stralingsfrequentie onder 90 Gy toonde PBMC's proliferatie in cultuur, dus we raden aan om precies 90 Gy straling te gebruiken. Van belang is dat het raadzaam is om de buffy coat bestraald op dezelfde dag of hooguit de volgende dag te gebruiken, en deze op een apparaat te houden dat het constant in agitatie houdt. Een andere cruciale stap van deze methode zou kunnen worden vertegenwoordigd door de lymfocyten kloonfase, die kan worden beïnvloed door artefacten; om dit te voorkomen voeren we de FACS uit op verse aortaklepmonsters. De kloonfase van T-lymfocyten heeft het voordeel dat een groter aantal T-klonen (gemiddeld 15 T-cellen klonen voor elke klep) fenotypisch en functioneel moet worden geanalyseerd dan het aantal dat wordt verkregen uit de analyse van één vers monster. De kloontechniek wordt al vele jaren door deze onderzoeksgroep gebruikt en afhankelijk van het type weefsel dat werd geanalyseerd, was het lymfocytenprofiel anders21,26,27. De eerste passage van de methode betreft de T-celisolatie van een stenotische aortaklep. Alle beschreven stappen moeten worden uitgevoerd onder een laminaire stroomkap in steriele omstandigheden en het wordt sterk aanbevolen om alle materialen voor gebruik te desinfecteren. De tijd die nodig was om resultaten te verkrijgen was 6 weken en het gemiddelde van T-lymfocytencellen verkregen uit de kloonfase was 20 x 106 cellen. De monitoringfase van de multiwellplaten is erg belangrijk en mag niet over het hoofd worden gezien. Een verandering in de kleur van het medium naar geel kan bacteriële besmetting vertegenwoordigen, in welk geval alle gebruikte instrumenten moeten worden gesteriliseerd en de multiwell-platen moeten worden weggegooid.
Voordat FACS-analyse wordt uitgevoerd, is het belangrijk om een geschikte poort vast te stellen, om te controleren of er geen specifieke overlap is tussen de antilichaamkanalen. Dit maakt de optimale scheiding tussen positieve en negatieve poorten mogelijk. Het gebruik van dezelfde partijen antilichamen voor alle monsters die bij het onderzoek betrokken zijn, wordt aanbevolen om een homogeen resultaat te verkrijgen. Het is ook noodzakelijk om de fluorofoor-geconjugeerde antilichamen tegen licht te beschermen en alle stappen uit te voeren met het licht uit.
Deze methode is effectief in het opleveren van resultaten met een hoge reproduceerbaarheid en is niet duur. Een beperking van deze methode is de kleine steekproefomvang, vanwege de beperkte beschikbaarheid van de menselijke klepmonsters, evenals het ontbreken van een controlegroep.
De voorlopige resultaten ondersteunen de rol van adaptieve immuniteit als een cruciaal element in de ontwikkeling en progressie van calcific aortaklepziekte. Alle patiënten die deelnamen aan deze studie hadden de diagnose van ernstige symptomatische calcific aortastenose, met een gemiddelde leeftijd van 70 jaar, meestal mannelijk. Het bestaan van T-celpopulaties in de geanalyseerde aortakleppen levert bewijs voor de ontstekingsactiviteit van de zieke aortaklep als een controlepunt van immuuncelactivering. Een punt van toekomstig belang zou kunnen zijn om de functionaliteit van CAVD-infiltrerende T-cellen te analyseren en T-celspecificiteit te karakteriseren zoals eerder gemeld bij vergelijkbare ziekten, zoals bij atherosclerose28,29,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Alle buffy jaszakken die voor dit protocol werden gebruikt, werden bestraald dankzij de beschikbaarheid van Dr. Peter Rosenthal, Dr. Dirk Böhmer en het hele team van de afdeling Radiologie van Charité Benjamin Franklin. Beurshouder / Mary Roxana Christopher, dit werk wordt ondersteund door een beurs van de German Cardiac Society (DGK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL plastic syringes | Fisherbrand | 9000701 | |
| 96- well U- bottom Multiwell plates | Greiner Bio-One | 10638441 | |
| Bag Spike (needle free) | Sigma | P6148 | Dilute to 4% with PBS |
| CD14 Brilliant violet 421 | Biolegend | 560349 | |
| CD25 PE | Biolegend | 302621 | |
| CD3 PE/Cy7 | Biolegend | 300316 | |
| CD4 Alexa Fluor 488 | Biolegend | 317419 | |
| CD45 Brilliant violet 711 | Biolegend | 304137 | |
| CD8 Brilliant violet 510 | Biolegend | 301047 | |
| Eppendorf tube 1.5 mL | Eppendorf | 13094697 | |
| Eppendorf tube 0.5 mL | Thermo Scientific | AB0533 | |
| Falcon 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 10136120 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Falcon | 10788561 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | BD | 2300E | |
| Fast read 102 plastic counting chamber | KOVA INTERNATIONAL | 630-1893 | |
| Filters for culture medium 250 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 168-0045 | |
| Filters for culture medium 500 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| HB 101 Lyophilized Supplement | Irvine Scientific | T151 | |
| HB Basal Medium | Irvine Scientific | T000 | |
| Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum) | Euroclone | ECS0180L | |
| HS (Human serum) | Sigma Aldrich | H3667 | |
| Human IL-2 IS | Miltenyi Biotec | 130-097-744 | |
| L-Glutamine | Gibco | 11140050 | |
| Lymphoprep | Falcon | 352057 | |
| Non-essential amino acids solution | Sigma | 11082132001 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 10538931 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070063 | 10000 U/mL |
| PHA (phytohemagglutinin) | Stem Cell Technologies | 7811 | |
| Plastic Petri dishes | Thermo Scientific | R80115TS | 10 0mm x 15 mm |
| RPMI 1640 Media | HyClone | 15-040-CV | |
| Sodium pyruvate | Gibco by Life technologies | 11360070 | |
| Syringe Filters 0,45µl | Rotilabo-Spritzenfilter | P667.1 | |
| T-25 Cell culture flasks | InvitrogenThermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| T-75 Cell culture flask | Thermo Fisher Scientific | 10232771 | |
| β- Mercaptoethanol | Gibco | A2916801 |
References
- Nkomo, V. T., et al. Burden of valvular heart diseases: a population-based study. Lancet. 368 (9540), 1005-1011 (2006).
- Clavel, M. A., et al. Impact of aortic valve calcification, as measured by MDCT, on survival in patients with aortic stenosis: results of an international registry study. Journal of the American College of Cardiology. 64 (12), 1202-1213 (2014).
- Rosenhek, R., et al. Predictors of outcome in severe, asymptomatic aortic stenosis. The New England Journal of Medicine. 343 (9), 611-617 (2000).
- Alushi, B., et al. Pulmonary Hypertension in Patients With Severe Aortic Stenosis: Prognostic Impact After Transcatheter Aortic Valve Replacement: Pulmonary Hypertension in Patients Undergoing TAVR. JACC: Cardiovascular Imaging. 12 (4), 591-601 (2019).
- Figulla, H. R., Franz, M., Lauten, A. The History of Transcatheter Aortic Valve Implantation (TAVI)-A Personal View Over 25 Years of development. Cardiovascular Revascularization Medicine. 21 (3), 398-403 (2020).
- Lauten, A., et al. TAVI for low-flow, low-gradient severe aortic stenosis with preserved or reduced ejection fraction: a subgroup analysis from the German Aortic Valve Registry (GARY). Euro Intervention Journal. 10 (7), 850-859 (2014).
- Mirna, M., et al. Multi-biomarker analysis in patients after transcatheter aortic valve implantation (TAVI). Biomarkers. 23 (8), 773-780 (2018).
- Wernly, B., et al. Transcatheter aortic valve replacement for pure aortic valve regurgitation: "on-label" versus "off-label" use of TAVR devices. Clinical Research in Cardiology. 108 (8), 921-930 (2019).
- Wernly, B., et al. Transcatheter valve-in-valve implantation (VinV-TAVR) for failed surgical aortic bioprosthetic valves. Clinical Research in Cardiology. 108 (1), 83-92 (2019).
- Mathieu, P., Bouchareb, R., Boulanger, M. C. Innate and Adaptive Immunity in Calcific Aortic Valve Disease. Journal of Immunology Research. 2015, 851945 (2015).
- Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. Calcific Aortic Valve Disease: Molecular Mechanisms and Therapeutic Approaches. European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).
- Olsson, M., Thyberg, J., Nilsson, J. Presence of oxidized low density lipoprotein in nonrheumatic stenotic aortic valves. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 19 (5), 1218-1222 (1999).
- Mazzone, A., et al. T-lymphocyte infiltration, and heat shock protein-60 are biological hallmarks of an immunomediated inflammatory process in end-stage calcified aortic valve stenosis. Journal of the American College of Cardiology. 43 (9), 1670-1676 (2004).
- Wu, H. D., et al. The Lymphocytic Infiltration in Calcific Aortic Stenosis Predominantly Consists of Clonally Expanded T Cells. The Journal of Immunology. 178 (8), 5329-5339 (2007).
- Raddatz, M. A., Madhur, M. S., Merryman, W. D. Adaptive immune cells in calcific aortic valve disease. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 317 (1), 141-155 (2009).
- Galkina, E., et al. Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent. The Journal of Experimental Medicine. 203 (5), 1273-1282 (2006).
- Poursaleh, A., et al. Isolation of intimal endothelial cells from the human thoracic aorta: Study protocol. Medical journal of the Islamic Republic of Iran. 33, 51 (2019).
- Yun, T. J., Lee, J. S., Shim, D., Choi, J. H., Cheong, C. Isolation and Characterization of Aortic Dendritic Cells and Lymphocytes in Atherosclerosis. Methodsin Molecular Biology. 11559, 419-437 (2017).
- Adams, N. M., Grassmann, S., Sun, J. C. Clonal expansion of innate and adaptive lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 20 (11), 694-707 (2020).
- Amedei, A., et al. Characterization of tumor antigen peptide-specific T cells isolated from the neoplastic tissue of patients with gastric adenocarcinoma. Cancer Immunology & Immunotherapy. 58 (11), 1819-1830 (2009).
- Niccolai, E., et al. Intra-tumoral IFN-gamma-producing Th22 cells correlate with TNM staging and the worst outcomes in pancreatic cancer. Clinical Science (London). 130 (4), 247-258 (2016).
- Niccolai, E., et al. The Different Functional Distribution of "Not Effector" T Cells (Treg/Tnull) in Colorectal Cancer. Frontiers in Immunology. 8, 1900 (2017).
- Llames, S., Garcia-Perez, E., Meana, A., Larcher, F., del Rio, M. Feeder Layer Cell Actions and Applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 21 (4), 345-353 (2015).
- Ponchio, L., et al. Mitomycin C as an alternative to irradiation to inhibit the feeder layer growth in long-term culture assays. Cytotherapy. 2 (4), 281-286 (2000).
- Delso-Vallejo, M., Kollet, J., Koehl, U., Huppert, V. Influence of Irradiated Peripheral Blood Mononuclear Cells on Both Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells and Change in Cellular Property. Frontiers in Immunology. 8, 854 (2017).
- Amedei, A., et al. Molecular mimicry between Helicobacter pylori antigens and H+, K+ --adenosine triphosphatase in human gastric autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 198 (8), 1147-1156 (2003).
- Lienhardt, C., et al. Active tuberculosis in Africa is associated with reduced Th1 and increased Th2 activity in vivo. European Journal of Immunology. 32 (6), 1605-1613 (2002).
- Benagiano, M., et al. Chlamydophila pneumoniae phospholipase D (CpPLD) drives Th17 inflammation in human atherosclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1222-1227 (2012).
- Benagiano, M., et al. Human 60-kDa heat shock protein is a target autoantigen of T cells derived from atherosclerotic plaques. Journal of Immunology. 174 (10), 6509-6517 (2005).
- Benagiano, M., et al. T helper type 1 lymphocytes drive inflammation in human atherosclerotic lesions. Procceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6658-6663 (2003).
