Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Функциональная оценка кишечной проницаемости и трансэпителиальной миграции нейтрофилов у мышей с использованием стандартизированной модели кишечной петли

Published: February 11, 2021 doi: 10.3791/62093
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pathology, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Дисрегулируемая функция кишечного эпителиального барьера и иммунные реакции являются отличительными признаками воспалительных заболеваний кишечника, которые остаются плохо изученными из-за отсутствия физиологических моделей. Здесь мы описываем модель кишечной петли мыши, которая использует хорошо васкуляризованный и экстериоризованный сегмент кишечника для изучения проницаемости слизистой оболочки и рекрутации лейкоцитов in vivo.

Abstract

Слизистая оболочка кишечника выстлена одним слоем эпителиальных клеток, который образует динамический барьер, позволяющий параклеточный транспорт питательных веществ и воды, одновременно предотвращая прохождение просветных бактерий и экзогенных веществ. Нарушение этого слоя приводит к увеличению проницаемости для просветного содержимого и рекрутирования иммунных клеток, которые являются отличительными признаками патологических состояний в кишечнике, включая воспалительное заболевание кишечника (ВЗК).

Механизмы, регулирующие эпителиальную барьерную функцию и трансэпителиальную миграцию (TEpM) полиморфноядерных нейтрофилов (PMN), изучены не полностью из-за отсутствия экспериментальных методов in vivo, позволяющих проводить количественный анализ. Здесь мы описываем надежную экспериментальную модель мышечных животных, которая использует экстериоризованный кишечный сегмент подвздошной или проксимальной кишки. Экстериоризированная кишечная петля (iLoop) полностью васкуляризирована и предлагает физиологические преимущества по сравнению с подходами на основе камер ex vivo, обычно используемыми для изучения проницаемости и миграции PMN через монослои эпителиальных клеток.

Мы подробно демонстрируем два применения этой модели: (1) количественное измерение кишечной проницаемости путем обнаружения флуоресцентно меченого декстрана в сыворотке крови после внутрипросветной инъекции, (2) количественная оценка мигрировавших ПМН через эпителий кишечника в просвет кишечника после внутрипросветного введения хемоатрактантов. Мы демонстрируем осуществимость этой модели и предоставляем результаты с использованием iLoop у мышей, у которых отсутствует эпителиальный плотный соединительный связанный белок JAM-A по сравнению с контрольной частью. Было показано, что JAM-A регулирует функцию эпителиального барьера, а также PMN TEpM во время воспалительных реакций. Наши результаты с использованием iLoop подтверждают предыдущие исследования и подчеркивают важность JAM-A в регуляции кишечной проницаемости и PMN TEpM in vivo во время гомеостаза и заболевания.

Модель iLoop обеспечивает высоко стандартизированный метод воспроизводимых in vivo исследований кишечного гомеостаза и воспаления и значительно улучшит понимание кишечной барьерной функции и воспаления слизистой оболочки при таких заболеваниях, как ВЗК.

Introduction

Слизистая оболочка кишечника включает в себя один слой столбчатых эпителиальных клеток кишечника (IIC), лежащих в основе иммунных клеток lamina propria и слизистых мышц. Помимо своей роли в поглощении питательных веществ, эпителий кишечника является физическим барьером, который защищает внутреннюю часть организма от просветных комменсальных бактерий, патогенов и диетических антигенов. Кроме того, ИЭК и иммунные клетки lamina propria координируют иммунный ответ, вызывая либо толерантность, либо реакцию в зависимости от контекста и стимулов. Сообщалось, что нарушение эпителиального барьера может предшествовать возникновению патологического воспаления слизистой оболочки и способствовать воспалительным заболеваниям кишечника (ВЗК), охватывающим как язвенныйколит,так и болезнь Крона1,2,3,4,5,6,7. Лица с язвенным колитом представляют чрезмерную трансэпителиальную миграцию (TEpM) полиморфноядерных нейтрофилов (PMN), образующих абсцессы крипты, что было связано с тяжестью заболевания8,9. Хотя нарушенная эпителиальная барьерная функция и чрезмерные иммунные реакции являются отличительными признаками ВЗК, отсутствуют экспериментальные анализы in vivo для выполнения количественных оценок проницаемости кишечника и рекрутации иммунных клеток в слизистую оболочку кишечника.

Наиболее распространенные методы, используемые для исследования проницаемости эпителия кишечника и PMN TEpM, используют подходы на основе камер ex vivo с использованием монослоев МЭК, культивируемых на полупроницаемых пористых мембранных вставках10,11,12. Целостность эпителиального барьера контролируется либо измерениями трансэпителиального электрического сопротивления (TEER), либо параклеточного потока флуоресцеина изотиоцианата (FITC), меченого декстраном от апикального до базального компартмента13,14,15. Аналогичным образом, PMN TEpM обычно изучается в ответ на хемоатрактант, который добавляют в нижнюю камеру16. ПМН помещают в верхнюю камеру, и после инкубационного периода ПМН, которые мигрировали в базальный отсек, собирают и количественно оценивают. Хотя эти методы полезны, просты в исполнении и очень воспроизводимы, они, очевидно, являются редукционистскими подходами и не обязательно представляют собой точное отражение условий in vivo.

У мышей распространенным анализом для изучения кишечной параклеточной проницаемости является пероральный прием FITC-декстрана и последующее измерение появления FITC-декстрана в сыворотке крови13,17. Недостатком этого анализа является то, что он представляет собой оценку общей барьерной целостности желудочно-кишечного тракта, а не регионального кишечного вклада. Кроме того, синий Эванс обычно используется для оценки сосудистой утечки in vivo18, а также был использован для оценки проницаемости слизистой оболочки кишечника у мышей и крыс19,20,21. Количественная оценка синего цвета Эванса в слизистой оболочке кишечника требует извлечения из ткани с использованием инкубации в формамиде в течение ночи. Поэтому одну и ту же ткань нельзя использовать для изучения проницаемости эпителия кишечника и нейтрофильной инфильтрации.

Здесь мы выделяем простой протокол, который уменьшает количество животных, необходимых для сбора воспроизводимых данных о проницаемости слизистой оболочки толстой кишки и трансэпителиальной миграции лейкоцитов in vivo. Поэтому мы рекомендуем использовать FITC-декстранс, которые легко обнаруживаются в сыворотке крови без ущерба для целостности кишечных петель, которые могут быть собраны для дальнейшего анализа. Следует отметить, что кишечные лигированные петли использовались у различных видов (включая мышь, крысу, кролика, теленка) для изучения бактериальной инфекции (такой как Salmonella, Listeria monocytogenes и Escherichia coli)22,23,24,25, а также кишечной проницаемости26; однако, насколько нам известно, нет исследований, изучающих механизмы PMN TEpM в определенных областях кишечника, таких как подвздошная кишка или толстая кишка, которые обычно участвуют в ВЗК.

Здесь мы описываем модель кишечной петли мыши (iLoop), которая является надежным и надежным микрохирургическим методом in vivo, который использует хорошо васкуляризованный и экстериоризованный кишечный сегмент подвздошной или проксимальной толстой кишки. Модель iLoop физиологически актуальна и позволяет оценить целостность кишечного барьера и PMN TEpM на живых мышах под наркозом. Мы демонстрируем два применения: 1) количественная оценка сывороточных уровней 4 кДа FITC-декстрана после внутрипросветного введения в iLoop 2) количественная оценка трансмигрированного PMN в просвете iLoop после внутрипросветного введения мощного хемоттрактанта Лейкотриена B4 (LTB4)27. Кроме того, использование модели iLoop с мышами Jam-a-null или мышами, переносимыми селективную потерю JAM-A на IIC(Villin-cre; Jam-a fl/fl) по сравнению с контрольными мышами, мы можем подтвердить предыдущие исследования, в которых сообщалось о значительном вкладе в плотное соединение-ассоциированный белок JAM-A в проницаемость кишечника и трансмиграцию нейтрофилов15,28,29,30,31.

Модель iLoop является высокофункциональным и физиологическим методом, который может быть использован для подтверждения анализов in vitro. Кроме того, это универсальная экспериментальная модель, которая позволяет изучать различные реагенты, которые могут быть введены в просвет петли, включая хемокины, цитокины, бактериальные патогены, токсины, антитела и терапевтические средства.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с руководящими принципами и политикой Национальных институтов здравоохранения и одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных в Мичиганском университете.

1. Предоперационная подготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод был получен с использованием взрослых мышей с генетическим фоном C57BL/6 в возрасте от 8 до 12 недель. Все мыши содержались в строгих специфических условиях, свободных от патогенов, с доступом ad libitum к нормальному чау и воде. Результаты были получены с использованием C57BL/6, Jam-a - нулевых мышей (Jam-a-/-) или мышей с селективной потерей JAM-A на IIC (Villin-cre; Jam-afl/fl) и помет jam-afl/fl controls, как описаноранее 30.

  1. Подготовка площадки
    1. Выполните операцию в чистой области. Модель кишечной петли, однако, является операцией без выживания, которая не требует асептической / стерильной техники. Соблюдайте ветеринарную санитарную практику и используйте очищенные хирургические инструменты (т.е. промывные с мылом, промываемые водой с последующим 70% этанолом).
    2. Включите хирургическую доску с контролируемой температурой (или грелки) и адаптированный источник света, чтобы удерживать животное от переохлаждения во время анестезии и операции.
    3. Подготовьте лигатуры, разрезав 6 см сегменты нерассасывающихся 4-0 шелковых хирургических швов.
    4. Приготовьте хлопчатобумажную марлю (5 см х 5 см), которая разрезается в центре по эллипсоидной форме. Они будут использоваться для покрытия лапаротомии средней линии и предотвращения прямого контакта между экстериоризованным iLoop и мехом животных. Замочите нарезанную марлю в теплом сбалансированном солевом растворе Хэнкса (HBSS) в контейнере для чашки Петри.
    5. Приготовьте влажные ватные тампоны, пропитанные теплым HBSS, которые будут использоваться для обработки органов и экстериоризированного iLoop.
    6. Подготовьте шприц 10 мл, наполненный теплым HBSS, и прикрепите к желтой питательной трубке. Этот шприц будет использоваться для увлажнения открытых тканей во время операции и для мягкого промывания iLoop от содержания фекалий.
  2. Подготовка животных
    1. Обезболить животное в соответствии с утвержденным протоколом для животных. В этом протоколе смесь изофлурана и кислорода вводится через испаритель анестезии. В соответствии с инструкциями производителя, отрегулируйте расход кислорода до 1 л/мин. Установите испаритель на 5% и предварительно зарядим индукционную камеру. Через 5 мин уменьшают испаритель изофлурана до 2% - 2,5%.
    2. Поместите животное в индукционную камеру на 3 мин - 5 мин, затем переложите животное на подогреваемую хирургическую доску и подключите анестезируйную носовую пробку. Удерживайте животное в положении лежа на спине четырьмя конечностями с помощью клейкой ленты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы анестезии смесь кетамина (80 мг/кг - 100 мг/кг) и ксилазина (5 мг/кг - 10 мг/кг), разведенная в физиологичном растворе (0,9% NaCl), может быть введена внутрибрюшинной инъекцией. Анестезия должна поддерживаться на протяжении всей операции путем внутримышечного введения кетамина/ксилазина (в 0,1 - 0,25 раза начальных доз) для обеспечения глубины анестезии. При наличии, настоятельно рекомендуется испаритель изофлурановой анестезии для обеспечения лучшей воспроизводимости, живучести и предотвращения боли животных.
    3. Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
    4. Выполните физический осмотр, который включает в себя частоту сердечных сокращений (около 500 ударов / мин) и ритм, цвет слизистой оболочки (розовый), время пополнения капилляров (< 2 с), частоту дыхания (не ниже 40 - 60 вдохов / мин) и температуру (36,5 ° C)32.
    5. Прежде чем перейти к следующим шагам, оцените глубину анестезии по рефлексу снятия педали. Используйте болезненный стимул (защемление) кожи между щапями и / или подушечками для щипок. Мышь будет реагировать, сжимая и удаляя ногу. Этот педальный рефлекс исчезает, когда животное глубоко обезболивается.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мониторинг жизненно важных веществ и педального рефлекса рекомендуется на протяжении всей анестезии не менее чем каждые 15 минут. Руководящие принципы Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) для оценки глубины анестезии рекомендуют мониторинг следующего: (а) цвет хвоста, стопы и слизистой оболочки (например, языка). Цвет розовый как нормальный и бледно-синий, как признак снижения перфузии крови или респираторного дистресса; b) оценка характера дыхания как регулярного по сравнению с нерегулярным дыханием. Ректальный температурный зонд, оксиметр грызунов и мониторы сердечного ритма могут использоваться для оценки температуры тела, частоты сердечных сокращений и дыхания соответственно.

2. Генерация подвздошной петли

  1. Подготовка кожи: Скрабировать мех брюшной средней линии спиртовыми тампонами или марлевой губкой, пропитанной 70% этанолом. Не смачивайте широкий участок меха спиртом для предотвращения переохлаждения.
  2. С помощью ножниц выполните лапаротомию средней линии. Сделайте вертикальный разрез посередине живота (около 2 см в длину) и обнажите брюшину. Будьте осторожны, чтобы не травмировать внутрибрюшные органы.
  3. Поместите предварительно нарезанную влажную ватную марлю на открытую внутрибрюшную полость.
  4. Используйте влажные ватные тампоны для мобилизации и экстериоризации цапли. Аккуратно поместите цалевую кишки на мокрую ватную марлю.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Цая киша локализуется в левом каудальном квадранте брюшной полости у большинства мышей независимо от пола животного.
  5. Используйте влажные ватные тампоны для мобилизации и мягкой экстериоризации подвздошной кишки, концевая часть которой (дистальный конец) прикреплена к голени(рисунок 1B).
  6. Разверните не менее 6 см терминальной подвздошной кишки на влажной ватной марле без нарушения работы брыжеечных сосудов и кровоснабжения. Кровоснабжение сохраняется, если нет кровотечения и ткань сохраняет свой розовый цвет(рисунок 1В).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте пересыхания открытых тканей, поддерживая ткани влажными в любое время с помощью теплого HBSS (каждые 2 - 3 мин) с помощью шприца 10 мл, прикрепленного к желтой питательной трубке (шаг 1.1.6).
  7. Близко к голени определите основную артерию, снабжающую подвздошную кишечку в области жентерии. Затем найдите два участка перевязки в мезентерии, которые свободны от критических кровеносных сосудов.
  8. Используя тупые тканевые щипцы, крепко захватите терминальную подвздошную кищу (ближайшую к цапле, и с помощью тонких щипцов, фенестрируют мезентерию, избегая кровеносных сосудов. Наложите шелковый шов на перфорацию и завяжите хирургический узел, чтобы создать первую перевязку (дистальный конец петли).
  9. Используйте линейку для измерения 4 см от первой лигатуры и создания второй лигатуры (проксимального конца петли), как указано в шаге 2.8(рисунок 1C).
  10. Тонкими ножницами аккуратно разрезают рядом с каждой перевязкой, чтобы изолировать петлю подвздошной подвздошности 4 см, сохраняя неповрежденным кровоснабжение и брыжеечную оболочку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отрежьте оба конца экстериорализованного сегмента iLoop, затем осторожно промыть в качестве необходимого шага, который предотвращает вмешательство в просветное содержимое (фекалии), тем самым облегчая равномерное рассеивание FITC-декстрана или хемотаксических стимулов по всей длине изолированного сегмента, а также позволяя более точно количественно определять лейкоциты с помощью проточной цитометрии. Эта процедура также позволяет равномерно растянуть слизистую оболочку после инъекции указанных объемов реагента и улучшить воспроизводимость между животными.
  11. Осторожно промыть содержимое сегмента петли подвздошной кисти теплым HBSS с помощью гибкой желтой питательной трубки, прикрепленной к шприцу 10 мл (см. шаг 1.1.6).
  12. Обрежьте два обрезанных конца промытой подвздошной петли шелковым швом.
  13. Используйте шприц 1 мл с иглой 30 г для медленного введения 250 мкл реагента, такого как FITC-декстран (шаг 4.2) или хемоцин (шаг 5.3) в просвет кишечника. Петля подвздошной кисти будет надуваться, вызывая умеренное растяжение слизистой оболочки(рисунок 1D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ввести реагент в просвет петли на противоположной стороне брыжеечной артерии. Будьте осторожны, чтобы не вытащить петлю подвздошной кишки из животного во время инъекции, чтобы избежать разрыва кровеносных сосудов и кровотечения.
  14. С помощью влажных ватных тампонов аккуратно отложите петлю подвздошной кишки, проксимальную подвздошную кишечку и цаплю.
  15. Используйте держатель иглы, анатомические щипцы и 3,0 нерассасывающиеся шелковые швы с обратной режущей иглой, чтобы закрыть брюшную стенку.
  16. Поместите животное в анестезионную камеру с регулируемой температурой на инкубационный период.

3. Генерация проксимальной петли толстой кишки (pcLoop)

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации о мышах, которые использовались для генерации pcLoop, см. информацию, представленную в начале раздела протокола.

  1. Выполните шаги 2.1. - 2.4. как описано выше для подвздошной петли.
  2. Используя влажные ватные тампоны, экстериоризируйте всю подвздошную кишечник и поместите ее поверх влажной ватной марли. Выявляют проксимальный комплекс толстой кишки и кровоснабжение, расположенное в мезоколоне. Мобилизовать проксимальную обику и с помощью тонких щипцов создать первую лигатуру в области, свободной от сосудов в мезоколоне на глубине около 0,5 см от цапли(рисунок 2B).
  3. Измерьте 2 см от первой лигатуры и создайте вторую лигатуру в области, свободной от кровоснабжения вмезоколоне (рисунок 2C).
  4. С помощью мелких ножниц аккуратно разрезайте рядом с каждой перевязкой, чтобы выделить 2 см длиной pcLoop.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как упоминалось в примечании к шагу 2.10, важно отрезать оба конца, чтобы изолировать pcLoop, который мягко очищается от просветного содержимого. Тщательно разрезайте ткани толстой кишки и мезоколон, чтобы предотвратить кровотечение мелких сосудов в просвет кишечника. При необходимости используют термоужайство для ограничения кровотечения в месте разреза.
  5. Осторожно промыть pcLoop теплым HBSS для удаления фекалий с помощью гибкой желтой питательной трубки, прикрепленной к шприцу 10 мл (см. шаг 1.1.6).
  6. Обрежьте два разрезанных конца промытого pcLoop с помощью шелкового шва.
  7. Используйте шприц 1 мл с иглой 30G для медленного введения 200 мкл реагента, такого как FITC-декстран (шаг 4.2) или хемоцин (шаг 5.3) в просвет кишечника. PcLoop будет раздуваться, вызывая умеренное растяжение слизистой оболочки(рисунок 2D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ввести реагент в просвет pcLoop на противоположной стороне брыжеечного сустава. Обеспечьте согласованность между животными и создайте pcLoop длиной 2 см, чтобы обеспечить равное растяжение слизистой оболочки.
  8. Используйте влажные ватные тампоны, чтобы аккуратно поместить обратно лигированный pcLoop, подвздошную кисть и цаплицу в брюшную полость.
  9. Используйте держатель иглы, анатомические щипцы и 3,0 нерассасывающиеся шелковые швы с обратной режущей иглой, чтобы закрыть брюшную стенку.
  10. Поместите животное в анестезионную камеру с регулируемой температурой на инкубационный период.

4. Количественная оценка кишечной проницаемости: 4 кДа FITC-декстрана

  1. Выполните подвздошную петлю или pcLoop (как описано выше).
  2. Используя шприц 1 мл с иглой 30 Г, вводят в просвет кишечника либо 250 мкл (подвздошная кишка - шаг 2,13), либо 200 мкл (толстая кишка - этап 3,7) 4 кДа раствора FITC-декстрана (1 мг/ мл в HBSS). Держите неиспользованный раствор FITC-декстрана защищенным от света, чтобы подготовить стандартную кривую после сбора сыворотки.
  3. Для петли подвздошной ки подвздошной подвздоши выполните шаги 2.14-2.16, для pcLoop шаги 3.8-3.10. Вкратце поместите органы и iLoop обратно на место в брюшную полость, закройте брюшную стенку.
  4. Поместите животное на 120 мин в нагретую анестезионную камеру.
  5. После инкубационного периода вскройте брюшную стенку, получите доступ к сердцу и выполните сердечную пункцию с помощью шприца 1 мл с иглой 25G для сбора крови. Перенесите кровь в 1,3 мл сывороточного активатора, аккуратно перемешайте и держите на льду защищенным от света. Соберите не менее 500 мкл крови на мышь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Животные подвергаются эвтаназии при нахождении под наркозом с использованием физического метода, такого как обезглавливание или вывих шейки матки, и в соответствии с утвержденным протоколом для животных.
  6. Трубка активатора сгустка сыворотки центрифуги в течение 5 мин при 10 000 х г при комнатной температуре в соответствии с рекомендациями производителя. Соберите сыворотку (супернатант) и переложите в центрифужную трубку 1,7 мл. Держите трубку на льду и защищаемую от света.
  7. Количественная оценка флуоресценции в сыворотке крови
    1. Подготовьте стандартную кривую FITC-декстрана 4 кДа в сыворотке контрольных мышей (физиологического раствора или HBSS является допустимой альтернативой). Создают двукратное последовательное разведение с начальной концентрацией 1 мг/мл FITC-декстрана. Концентрации FITC-декстрана 4 кДа, которые измеряются, варьируются от 0,25 мг/мл до 2 мкг/мл.
    2. Перенесите равный объем образца и эталоны на черную 96-скважинную пластину (с плоским дном) и измерите FITC в считывателе флуоресцентных пластин (возбуждение 490 нм, излучение 520 нм), согласно инструкциям производителя и опубликованным протоколам33. Рассчитать концентрацию FITC на основе стандартной кривой или существующих значений проницаемости в виде изменения складки, нормализованного для экспериментальной контрольной группы.

5. Количественная оценка мигрировавого ПМН в просвет кишечника после внутрипросветной стимуляции хемокинами

ПРИМЕЧАНИЕ: Очень немногие ПМН находятся в слизистой оболочке кишечника на исходном уровне. Предварительная обработка животных провоспалительными цитокинами приводит к воспалительной среде, которая облегчает рекрутинг ПМН из кровотока в слизистую оболочку кишечника.

  1. Используя шприц объемом 1 мл с иглой 30 г, выполните внутрибрюшинную (т.п.) инъекцию стерильного раствора 100 нг фактора некроза опухоли α (TNFα) и 100 нг интерферона-γ (INFγ) в 200 мкл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS).
  2. Через 4 - 24 ч предварительной обработки провоспалительными цитокинами выполняют подвздошную петлю или pcLoop (как описано выше).
  3. Используя шприц 1 мл с иглой 30 Г, вводят в просвет кишечника либо 250 мкл (подвздошная кишка - шаг 2,13), либо 200 мкл (толстая кишка - шаг 3,7) раствора химиоаттрактанта Лейкотриена B4 (LTB4)1 нМ в HBSS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лейкотриен B4 (LTB4)используется в этом протоколе в качестве мощного химиоатрактанта для PMN. Другие хемоаттрактанты, такие как N-формилметионил-лейцил-фенилаланин (fMLF) или хемокина (мотив C-X-C) лиганд 1 (CXCL1 / KC), также могут быть использованы для индуцирования значительного набора PMN в просвет толстой кишки30.
  4. Для подвздошного цикла выполните шаги с 2.14 по 2.16. Для pcLoop выполните шаги с 3.8 по 3.10. Вкратце поместите органы и iLoop обратно на место в брюшную полость, закройте брюшную стенку.
  5. Поместите животное на 60 мин в нагретую анестезионную камеру.
  6. Сбор содержимого кишечной петли
    1. Готовьте растворы и храните на льду: Для подвздошной петли и pcLoop подготовьте промывной буфер, содержащий 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 5 мМ дитиотрейтола (DTT) и 2% FBS в стерильном PBS без кальция и магния.
    2. После инкубационного периода и под наркозом вскрывает брюшную стенку и вытаскивает iLoop (подвздошная петля или pcLoop). Усыпляет животных, находясь под наркозом, используя физический метод, такой как обезглавливание или вывих шейки матки, и в соответствии с утвержденным протоколом для животных.
    3. Промойте петлю холодным PBS, чтобы удалить любые остаточные загрязнители крови и поглотить избыток PBS с помощью салфеток для тканей. Тщательно соберите содержимое петли в центрифужную трубку 1,7 мл (около 250 мкл для подвздошной петли и 200 мкл для pcLoop). Промыть петлю буфером холодной промывки 500 мкл и сразу после сбора поместить трубку на лед.
      ПРИМЕЧАНИЕ: DTT помогает растворять слизь. Если содержание люмина iLoop очень вязкое (в зависимости от генетического фона мыши), разбавьте его 1:2 или 1:3 моющим буфером, содержащим DTT.
    4. Пропустите раствор с содержанием просвета через фильтр нейлоновой сетки 35 мкм с помощью трубки круглого дна емкостью 5 мл с крышкой клеточного сетчатого фильтра. Этот шаг помогает удалить фрагменты тканей и клеточные агрегаты. Промыть клеточный ситечко 1 мл промывочного буфера.
    5. Центрифужная трубка при 400 х г в течение 5 мин при 4 °C. Откажитесь от супернатанта, промывайте гранулы 500 мкл - 1 мл промывочным буфером, затем центрифугой при 400 х г в течение 5 мин, 4 °С.
    6. Повторное суспендирование гранулы просветных клеток iLoop в 200 мкл проточная цитометрическая буферная (FCB), содержащая 2% FBS в стерильном PBS без кальция и магния. Клетки могут храниться в трубке или переноситься на 96-скважинную круглодонную пластину для окрашивания и анализа проточной цитометрии.
  7. Окрашивание и анализ проточной цитометрии
    1. Контроль компенсации: лейкоциты
      1. Приготовьте шприц 1 мл с иглой 25 г, предварительно заполненной стерильным 0,5 М ЭДТА (рН 8,0). 10% ЭДТА на ожидаемый объем крови (100 мкл ЭДТА на 1 мл крови).
      2. Собирать кровь под наркозом путем пункции сердца. Переложить кровь в пробирку 1,7 мл, затем центрифугу при 400 х г в течение 10 мин, 4 °C.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Пока мышь находится под наркозом, используйте физический метод для подтверждения смерти в соответствии с утвержденным протоколом животных (например, вывих шейки матки).
      3. Аспирировать супернатанта. Повторно суспендируют гранулы в 1 мл буфера лизиса аммония-хлорида-калия (ACK) для лизиса эритроцитов. Инкубировать 3 мин - 5 мин на льду. Центрифуга 400 х г в течение 5 мин, 4 °C. Если гранула все еще красная, повторяйте этот этап буфера лизиса ACK до тех пор, пока гранула не станет белой.
      4. Повторно суспендируют гранулу в 1 мл FCB и пластину 0,5 x 106- 1 x 106 ячеек на скважину. Подготовьте пять скважин из 96-скважинной круглодонной плиты. Поместите тарелку на лед.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ту же 96-скважинную пластину, которая содержит просветное содержимое петли (см. шаг 5.6.6).
    2. Окрашивание проточной цитометрией
      1. Центрифугировать 96-скважинную пластину в течение 5 мин при 400 х г,4 °C. Откажитесь от супернатанта и повторно суспендируйте гранулы с 50 мкл очищенного крысиного антимышеского CD16/CD32 в виде Fc-блока (1 мкг на 100 мкл FCB). Инкубировать 5 мин - 10 мин на льду.
      2. Иммуноокрашивание содержания люминалов iLoop: Приготовьте смесь, содержащую все фторхром-конъюгированные антитела (разведение 1:50 в FCB): анти-CD45-PerCP, анти-CD11b-PE и анти-Ly-6G-Alexa Fluor 647. Добавьте 50 мкл комбинации на скважину для конечного объема 100 мкл.
      3. Иммуноокрашивание белых кровяных клеток для компенсации (разведение 1:50 в FCB): Используйте 50 мкл только FCB (незапятнанный образец, хорошо 1), 50 мкл каждого отдельного фторхром-конъюгированного антитела (скважины 2 - 4), 50 мкл комбинации всех фторхром-конъюгированных антител (хорошо 5). Конечный объем 100 мкл.
      4. Инкубировать плиту в течение 30 мин на льду, защищенном от света.
      5. Центрифугировать пластину в течение 5 мин при 400 х г,4 °C. Откажитесь от супернатанта и промыть 200 мкл FCB. Повторите этот шаг стирки дважды.
      6. Добавьте FCB 150 мкл/хорошо к образцам крови.
      7. Добавьте 100 мкл/скважину FCB к образцу просветного содержания iLoop. Затем 50 мкл/скважина флуоресцентных счетных шариков.
    3. Анализ проточной цитометрии
      1. Затвор для положительных событий CD45 и для выражения Ly-6G-/Gr-1 и CD11b30.
      2. Используйте 100 мкл объема образца в качестве условия остановки.
      3. Рассчитайте абсолютное число PMN, которое мигрировало в просвет iLoop, следуя информации, предоставленной производителем флуоресцентных счетных шариков.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Данные могут быть представлены в виде (1) общего числа ПМН в просвете30,34,35,(2) числа ПМН на грамм ткани, а также (3) числа ПМН намм3 с использованием формулы для объема цилиндра: V= π(pi) r 2 ч (V для объема, r для радиуса и h для высоты).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Схематическое представление моделей петли подвздошной кисти и pcLoop изображено на рисунке 1 и рисунке 2соответственно. Анатомические снимки отображают критические этапы процедуры, включая экстериоризацию кишечного сегмента(Фиг.1В и Фиг.2В),идентификацию подходящего места для перевязок, что позволяет минимальное нарушение кровоснабжения(Фиг.1С и Фиг.2С)и очистку с последующим перевязкой срезанных концов iLoop, которые могут быть заполнены раствором реагента(Фиг.1D и Фиг.2D). Важно отметить, что модель iLoop сохраняет жизненно важное кровоснабжение и позволяет физиологически абсорбировать применяемые реагенты, такие как FITC-декстранс или мощный хемоатрактант PMN LTB4. В конце анализа iLoop должен быть надут (как показано на рисунках 1D и 2D)и отображать нормальную перфузию слизистой оболочки ярко-красными брыжеечными сосудами. В зависимости от анализа, кровь собирается для измерения FITC-декстрана в сыворотке или просветное содержимое iLoop обрабатывается для количественной оценки PMN TEpM перед эвтаназией животного.

С целью проверки точности модели iLoop для оценки кишечной проницаемости был проведен анализ FITC-dextran pcLoop для оценки роли TJ-ассоциированного белка JAM-A в регуляции кишечной барьерной функции in vivo. Следует отметить, что дефицит JAM-A приводит к увеличению проницаемости эпителиального кишечника in vitro28 и после перорального приема in vivo29. При этом, используя модель pcLoop, 2,5-кратное увеличение сывороточных уровней FITC-декстрана на 4 кДа было количественно определено у мышей Jam-a-null (Jam-a-/-) по сравнению с контрольной (Jam-a+ +)(Рисунок 3A)30. Кроме того, аналогичные результаты были получены на мышах, у кого была селективная потеря JAM-A на IIC(Villin-cre; Jam-a fl/fl) по сравнению с контролем помета (Jam-a fl / fl) (Рисунок 3B)30. Таким образом, модель pcLoop смогла подтвердить предыдущие исследования, в которых сообщалось о положительном вкладе JAM-A в кишечную барьерную функцию.

Затем модель pcLoop была использована для изучения рекрутации PMN в слизистую оболочку кишечника и последующего TEpM in vivo. Как показано на фиг.4А,количество ПМН в просветном содержимом pcLoop количественно оценивали методом анализа проточной цитометрии. PMN были определены как клетки, положительные для каждого из производителей клеточной поверхности CD45, CD11b и Ly6G36. Циркулирующие белые кровяные клетки использовались в качестве положительного контроля для стратегии гейтинга. Как и ожидалось, количество ПМН, присутствующего в сегменте проксимальной кишки, аналогичном pcLoop, было низким в физиологических условиях(рисунок 4B). Предварительная обработка провоспалительными цитокинами TNFα и IFNγ до операции привела к увеличению количества ПМН, набранных в просвете pcLoop. Введение химиоаттрактанта PMN LTB4 привело к резкому увеличению количества PMN, поддерживающего LTB4-зависимыйнабор PMN(рисунок 4B). Иммуногистохимическое окрашивание ПМН в слизистой оболочке толстой кишки подтверждает повышенный набор ПМН после стимуляции цитокинами и LTB4 по сравнению с лечением цитокинами без LTB4 (Рисунок 4C)30. Модель pcLoop была использована для изучения вклада JAM-A в PMN TEpM с использованием Villin-cre; Джем-а фл/фл мышей. Потеря эпителиального JAM-A привела к снижению количества трансмигрированных ПМН в просвете толстой кишки по сравнению с контрольной точки помета(Рисунок 4D)30. Эти результаты убедительно подтверждают роль JAM-A в облегчении миграции PMN через эпителий кишечника и обеспечивают дополнительную информацию к исследованиям, в которых сообщалось об участии JAM-A в миграции PMN через эндотелий сосудов в различных моделях воспаления31,37,38.

Figure 1
Рисунок 1:Модель подвздошной петли. (A) Схематический обзор модели подвздошной петли. Срединная лапаротомия проводится на мышах под наркозом и помещается на хирургический досок с контролируемой температурой. (B) Экстериоризация цалинеи (*), подвздошной кишки и брыжменого отдела. Определены два адекватных участка для лигирования (1,2). (C) Изолировать сегмент длиной 4 см: первая лигатура (1) помещается близко к илео-цекальному соединению, а вторая лигатура (2) помещается на 4 см от первой лигатуры. (D) В жентерии делаются два небольших разреза (1, 2) для создания подвздошной петли длиной 4 см. После удаления просветного содержимого и перевязки отрезанных концов в просвет могут вводиться реагенты, такие как флуоресцентные маркеры и химиоатрактанты. Петля подвздошной киницы хорошо васкуляризирована (черные наконечники стрел). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:Модель проксимальной петли толстой кишки. (A) Схематический обзор модели pcLoop. Срединная лапаротомия проводится на мышах под наркозом, помещенным на хирургический пансион с контролируемой температурой. (B) Экстериоризация цалинеи (*), проксимальной толстой кишки, мезоколона и подвздошной кишки. Определены два адекватных участка для лигирования (1,2). (C) Первая лигатура (1) помещается близко к голеной кише, а вторая лигатура (2) помещается на 2 см дно от первой лигатуры. (D) PcLoop экстериорализован, очищен от содержания люминалов и раздут реагентами, такими как флуоресцентные маркеры и хемоатрактанты. PcLoop представляет собой хорошо васкуляризованный 2-сантиметровый сегмент проксимальной ободки (черные наконечники стрел указывают на кровоснабжение). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3:JAM-A регулирует проницаемость кишечника in vivo. (A)Дефицит JAM-A (Jam-a-/-) привел к увеличению проницаемости толстой кишки до 4 кДа FITC-декстрана. Jam-a-/- (13x животных; черные точки) сравнивали с элементами управления Jam-a+/+ (12x животных; белые точки). 4 кДа FITC-декстрана (1 мг/мл) в HBSS вводили в просвет pcLoop. Флуоресценцию измеряли в сыворотке крови после 120-минутного инкубационного периода. Данные выражаются в виде средств ± SEM; n = 3 независимых эксперимента. P < 0,0001; Тест Манна-Уитни U. (B)Повышенная проницаемость толстой кишки до 4 кДа FITC-декстрана в Виллин-кре; Jam-afl/fl (18x животных, черные точки) по сравнению с контрольной(Jam-afl/fl,12x животных, белые точки). Данные являются средствами ± SEM; n = 4 независимых эксперимента. P < 0,0001; Тест Манна-Уитни U. Эта цифра была изменена по сравнению с Flemming S, Luissint AC et al.30. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4:JAM-A способствует LTB4-зависимомунабору PMN в просвет pcLoop. (A)Стратегия определения количественной оценки PMN (CD45+,CD11b+, и Ly-6G / Gr1+ клеток) в просветном содержании с помощью проточной цитометрии с флуоресцентными счетными шариками. Лейкоциты из образцов крови использовались в качестве положительного контроля для стратегии гейтинга. (B)Количество ПМН, набранных в просвет pcLoop после обработки цитокином (TNFα+IFNγ, 100нг каждый) (10x животных; белые точки) или после комбинации цитокинов и 1 нМ LTB4 (10x животных; черные точки). Черные квадраты представляют собой количество ПМН на исходном уровне, оцененное в интактном сегменте толстой кишки, идентичном по длине pcLoop, который не подвергался какой-либо операции или лечению провоспалительными цитокинами и LTB4 (9x животных). Данные представляют собой среднее ± SEM(n = 3 независимых эксперимента), тест Крускала-Уоллиса с множественным сравнительным тестом Данна. *P < 0,05, ****P < 0,0001. (C)Иммуногистохимическое окрашивание PMN (антитело против Ly6G/Gr1) в эпителии pcLoop после обработки только цитокинами (левая панель, TNFα+IFNγ) или комбинацией цитокинов и LTB4 (правая панель). Количество ПМН, набранных в pcLoop, увеличивается при наличии LTB4 (черные наконечники стрел). Шкала бара: 100 мкм. (D) Количество ПМН, набранных в просвете pcLoop в Филлин-кре; Jam-afl/fl мышей (11x животных; черные точки) по сравнению с мышами Jam-afl/fl (10x животных; белые точки) в ответ на 1 nM LTB4. Данные являются средствами ± SEM; n = 3 независимых эксперимента. *P < 0,05; 2-хвостатый студенческий тест t. Эта цифра была изменена по сравнению с Flemming S, Luissint AC et al.30. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Механизмы, ответственные за дисрегуляцию кишечной барьерной функции и рекрутирование иммунных клеток в патологических условиях, таких как ВЗК, изучены не полностью. Здесь мы подробно описываем надежную модель мышениц in vivo, которая использует хорошо васкуляризованный экстериоризованный сегмент кишечника подвздошной или проксимальной кишки и позволяет оценить проницаемость кишечника, исследования миграции нейтрофилов, а также другие приложения.

iLoop - это операция без восстановления, которая выполняется на живых животных. Анестезия должна постоянно контролироваться в течение эксперимента, и оценка глубины седации является обязательной. Наиболее важные этапы включают (1) выделение iLoop, (2) перевязку срезанных концов и (3) инфляцию iLoop путем внутрипросветного введения раствора реагента. На каждом из этих этапов может произойти кровотечение, ставя под угрозу кровоснабжение iLoop и влияя на точность результатов. Следует отметить, что в редких случаях внутрипросветного кровотечения во время анализа PMN TEpM представленная здесь стратегия проточной цитометрии поможет отличить трансмигрированный PMN от PMN, происходящий непосредственно из кровотока (немигрированный PMN). Трансмигрированный PMN, собранный в просвете iLoop, экспрессирует высокие уровни поверхностного маркера CD11b10 по сравнению с циркулирующим PMN(рисунок 4D).

Учитывая, что iLoop позволяет проводить количественные анализы кишечной проницаемости и миграции ПМН крови в просвет кишечника, важно стандартизировать размер абсорбирующей области слизистой оболочки и кровоснабжение. Чтобы обеспечить согласованность между животными, важно, чтобы правильная длина кишечного сегмента была экстериоризирована. iLoop должен составлять 4 см для подвздошной петли и 2 см для pcLoop и быть перфузирован сопоставимым кровоснабжением. Несоответствие этих параметров также приведет к неравному растяжению iLoop после внутрипросветного введения реагентов и увеличит вариабельность между экспериментальными группами и между ними. Кроме того, чтобы избежать чрезмерного растяжения iLoop, мы рекомендуем вводить не более 250 мкл раствора реагента в просвет для подвздошной петли и 200 мкл для pcLoop, соответственно.

Существуют некоторые ограничения, присущие характеру процедуры. iLoop - это операция без восстановления, которая выполняется на живых животных. Это технически сложный микрохирургический метод; однако персонал может приобрести хирургические навыки на практике. Средняя продолжительность операции должна быть короткой (максимум 15 мин). Мы рекомендуем 120 мин в качестве идеального инкубационного времени для измерения кишечной проницаемости и 60 мин для PMN TEpM. Время инкубации может быть сокращено, но длительные временные точки могут повлиять на общее воспалительное состояние животного под наркозом. Кроме того, протокол от начала хирургической процедуры до сбора / анализа образца не может быть приостановлен.

Эта модель iLoop представляет ключевые преимущества по сравнению с существующими методами: (1) iLoop полностью васкуляризирован и является более физиологически значимым, (2) в отличие от метода пероральной гаважи, который оценивает общую целостность желудочно-кишечного тракта и зависит от моторики желудочно-кишечного тракта13,iLoop позволяет изучать свойства конкретных локализованных областей в кишечнике (терминальной подвздошной кишки или проксимальной кишки), которые обычно участвуют в ВЗК, (3) iLoop является первой моделью in vivo, которая позволяет количественно изучать PMN TEpM в просвете кишечника, а также в других частях слизистой оболочки кишечника, включая lamina propria и эпителиальные фракции30,35. Можно использовать высокомолекулярный декстранс с высокой и низкой молекулярной маркировкой FITC (от 4 до 150 кДа) для оценки как селективности размера, так и / или тяжести дефектов эпителиального барьера у нокаутированных / нокаутированных мышей или различных экспериментальных моделей, включая, но не ограничиваясь, воспаление кишечника. Кроме того, декстранс, меченый FITC, может быть количественно определен в других органах, таких как печень39, или в качестве нового подхода для исследований гематоэнцефаликого барьера, обеспечивающего понимание роли кишечной проницаемости в осях кишечник-печень и кишечник-мозг40,41,42. Кроме того, этот метод дает возможность выполнять две петли параллельно (подвздошная петля и pcLoop у одного и того же животного) и закапывать два разных флуоресцентных меченых зонда для анализа барьерных свойств в различных областях кишечника. Аналогичным образом, генерация двух петель параллельно может быть использована для конкретной оценки подвздошной кишки по сравнению с толстой кишкой на наличие различий или сходств в рекрутировании иммунных клеток в ответ на один и тот же реагент.

Здесь, используя pcLoop с Jam-a-null мышами или мышами, скрывающими селективную потерю JAM-A на IIC(Villin-cre; Jam-a fl/fl),мы подтверждаем результаты предыдущих исследований, в которых сообщалось о положительной роли TJ-ассоциированного белка JAM-A в кишечной проницаемости и PMN TEpM. Применение iLoop может быть расширено на различные реагенты, включая антитела, микробные патогены и терапевтические препараты30,34,35. Следует отметить, что мы использовали LTB4 (336,5 Da) для моделирования PMN TEpM, учитывая, что он является хорошо принятым мощным и физиологическим хемоаттрактантом PMN и его способностью индуцировать TEpM при низких концентрациях (1 нМ) в физиологическом диапазоне. Тем не менее, наша модель цикла адаптируется к другим соответствующим химиоаттрактантам. Мы сообщали об использовании бактериального пептида N-формил-метионил-лейцил-фенилаланин (fMLF) для индуцирования значительного набора PMN в просвет толстой кишки30. fMLF (437,5 Da) является хемоаттантантом с более низким сродством у мышей, который требует гораздо более высоких концентраций для эффективности (1 мкМ). Эта модель адаптируется для использования CXCL1 / KC, другого мощного физиологического химиоаттактанта, который мы успешно использовали, но CXCL1 / KC является дорогостоящей и относительно большой молекулой (11 кДа), которая менее эффективна при пересечении эпителиального барьера. Мы также продемонстрировали, что нейтрализующие антитела против лейкоцитарно-специфического интегрина CD11b/CD18 (αMβ2), которые вводились в просвет петли перед введением хемоаттрактанта LTB4, приводили к снижению PMN TEpM, подтверждающим результаты исследований in vitro10,30,35. Кроме того, pcLoop был недавно использован для изучения влияния PMN по сравнению с эпителиальными гликанами в контроле скорости PMN TEpM43. Реагенты вводили в просвет pcLoop перед введением хемоаттрактанта LTB4. Таким образом, благодаря широкому спектру применений, iLoop может дополнять и подтверждать результаты, полученные с помощью анализов in vitro. Лигированные кишечные петли также использовались другими для изучения бактериальной инфекции (такой как сальмонелла, L. monocytogenes и E. coli),поэтому мы считаем, что легкость в адаптивности этой модели iLoop может быть использована и для этих исследований.

После лечения провоспалительными иммунными медиаторами iLoop может быть использован в качестве острой модели воспаления кишечника. Кроме того, iLoop может позволить провести исследования, выясняющие связь между повышенной кишечной проницаемостью и рекрутированием иммунных клеток после воздействия внутрипросветных патогенов или в хронических воспалительных экспериментальных моделях. Следует отметить, что мы недавно наблюдали, используя модель pcLoop, что в ответ на высокую дозу провоспалительных цитокинов TNFα и IFNγ (1 мг каждого) кишечная параклеточная проницаемость до 4 кДа FITC-декстрана приводила к усилению рекрутирования ПМН в просвет pcLoop в ответ на LTB4 по сравнению с низкой дозой цитокинов (100 нг каждого)30. Интересно, что здесь мы показываем, что повышенная эпителиальная проницаемость, вторичная по отношению к дефициту Jam-a, не привела к усилению PMN TEpM, а уменьшила его. Все эти результаты свидетельствуют о том, что кишечная параклеточная проницаемость влияет на скорость PMN TEpM, но корреляция не является прямой и зависит от таких факторов, как экспрессия молекул адгезии (аналогично JAM-A), которые играют важную роль как в функции эпителиального барьера, так и в миграции лейкоцитов16. Будущие исследования необходимы для изучения тонкой настройки реакций иммунных клеток эпителием кишечника и вклада в патологические воспаления слизистой оболочки, такие как воспалительное заболевание кишечника.

В заключение, модель iLoop обеспечивает значительное улучшение существующих подходов к оценке кишечной проницаемости и PMN TEpM in vivo, что значительно поможет в понимании механизмов, лежащих в основе регуляции воспаления кишечника и ВЗК.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы благодарят доктора Свена Флемминга из Университета Вюрцбурга за его вклад в создание модели проксимальной петли толстой кишки, Шона Уотсона за управление колониями мышей и Читру К. Муралидхаран за помощь в приобретении изображений модели iLoop. Эта работа была поддержана Немецким исследовательским фондом/DFG (BO 5776/2-1) в KB, R01DK079392, R01DK072564 и R01DK061379 в C.A.P.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment and Material
BD Alcohol Swabs BD 326895
BD PrecisionGlide Needle, 25G X 5/8" BD 305122
BD PrecisionGlide Needle, 30G X 1/2" BD 305106
BD 1ml Tuberculin Syringe Without Needle BD 309659
15ml Centrifuge Tube Corning 14-959-53A
Corning 96-Well Solid Black Polystyrene Microplate FisherScientific 07-200-592
Corning Non-treated Culture Dish, 10cm MilliporeSigma CLS430588
Cotton Tip Applicator (cotton swab), 6", sterile FisherScientific 25806 2WC
Dynarex Cotton Filled Gauze Sponges, Non-Sterile, 2" x 2" Medex 3249-1
EZ-7000 anesthesia vaporizer (Classic System, including heating units) E-Z Systems EZ-7000
Falcon Centrifuge Tube 50ml  VWR 21008-940
Fisherbrand Colored Labeling Tape FisherScientific 15-901-10R
Halsey Needle Holder (needle holder)  FST 12001-13
Kimwipes, small (tissue wipe) FisherScientific 06-666
1.7ml Microcentrifuge Tubes  Thomas Scientific  c2170
Micro Tube 1.3ml Z (serum clot activator tube) Sarstedt  41.1501.105
Moria Fine Scissors FST 14370-22
5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap (35 µm nylon mesh) Falcon 352235
Puralube Vet Ointment, Sterile Ocular Lubricant Dechra 12920060
Ring Forceps (blunt tissue forceps) FST 11103-09
Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YD FisherScientific NC9452680
Semken Forceps (anatomical forceps) FST 1108-13
Sofsilk Nonabsorbable Coated Black Suture Braided Silk Size 3-0, 18", Needle 19mm length 3/8 circle reverse cutting  HenrySchein SS694
Student Fine Forceps, Angled FST 91110-10
10ml Syringe PP/PE without needle Millipore Sigma  Z248029
96 Well Cell Culture Plate Corning 3799
Yellow Feeding Tubes for Rodents 20G x 30 mm Instech FTP-20-30
Solutions and Buffers
Accugene 0.5M EDTA Lonza 51201
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer BioWhittaker 10-548E
Hanks' Balanced Salt Solution Corning 21-023-CV
Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium Corning 21-040-CV
Reagents
Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Antibody (1A8) BioLegend 127610
CD11b Monoclonal Antibody, PE, eBioscience (M1/70) ThermoFisher 12-0112-81
CountBright Absolute Counting Beads Invitrogen C36950
Dithiotreitol FisherScientific BP172-5
Fetal Bovine Serum, heat inactivated R&D Systems 511550
Fluorescein Isothiocyanate-Dextran, average molecular weight 4.000 Sigma 60842-46-8
Isoflurane Halocarbon 12164-002-25
Leukotriene B4 Millipore Sigma 71160-24-2
PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11) BD Pharmingen 557235
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD FC Block) BD Bioscience 553142
Recombinant Murine IFN-γ Peprotech 315-05
Recombinant Murine TNF-α Peprotech 315-01A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Olson, T. S., et al. The primary defect in experimental ileitis originates from a nonhematopoietic source. Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 541-552 (2006).
  2. Jump, R. L., Levine, A. D. Mechanisms of natural tolerance in the intestine: implications for inflammatory bowel disease. Inflammatory Bowel Diseases. 10 (4), 462-478 (2004).
  3. Peeters, M., et al. Clustering of increased small intestinal permeability in families with Crohn's disease. Gastroenterology. 113 (3), 802-807 (1997).
  4. Michielan, A., D'Inca, R. Intestinal permeability in inflammatory bowel disease: Pathogenesis, clinical evaluation, and therapy of leaky gut. Mediators of Inflammation. 2015, 628157 (2015).
  5. Chin, A. C., Parkos, C. A. Neutrophil transepithelial migration and epithelial barrier function in IBD: potential targets for inhibiting neutrophil trafficking. Annals of the New York Academy of Sciences. 1072, 276-287 (2006).
  6. Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn's disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
  7. Ordás, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Ulcerative colitis. Lancet. 380 (9853), 1606-1619 (2012).
  8. Muthas, D., et al. Neutrophils in ulcerative colitis: A review of selected biomarkers and their potential therapeutic implications. Scandanavian Journal of Gastroenterology. 52 (2), 125-135 (2017).
  9. Pai, R. K., et al. The emerging role of histologic disease activity assessment in ulcerative colitis. Gastrointestinal Endoscopy. 88 (6), 887-898 (2018).
  10. Parkos, C. A., Delp, C., Arnaout, M. A., Madara, J. L. Neutrophil migration across a cultured intestinal epithelium. Dependence on a CD11b/CD18-mediated event and enhanced efficiency in physiological direction. The Journal of Clinical Investigation. 88 (5), 1605-1612 (1991).
  11. Brazil, J. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil-epithelial interactions. Immunological Reviews. 273 (1), 94-111 (2016).
  12. Thomson, A., et al. The Ussing chamber system for measuring intestinal permeability in health and disease. BMC Gastroenterology. 19 (1), 98 (2019).
  13. Li, B. R., et al. In vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), e57032 (2018).
  14. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  15. Fan, S., et al. Role of JAM-A tyrosine phosphorylation in epithelial barrier dysfunction during intestinal inflammation. Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 566-578 (2019).
  16. Parkos, C. A. Neutrophil-epithelial interactions: A double-edged sword. American Journal of Pathology. 186 (6), 1404-1416 (2016).
  17. Volynets, V., et al. Assessment of the intestinal barrier with five different permeability tests in healthy C57BL/6J and BALB/cJ mice. Digital Diseases and Sciences. 61 (3), 737-746 (2016).
  18. Wick, M. J., Harral, J. W., Loomis, Z. L., Dempsey, E. C. An optimized evans blue protocol to assess vascular leak in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (139), e57037 (2018).
  19. Tateishi, H., Mitsuyama, K., Toyonaga, A., Tomoyose, M., Tanikawa, K. Role of cytokines in experimental colitis: relation to intestinal permeability. Digestion. 58 (3), 271-281 (1997).
  20. Mei, Q., Diao, L., Xu, J. M., Liu, X. C., Jin, J. A protective effect of melatonin on intestinal permeability is induced by diclofenac via regulation of mitochondrial function in mice. Acta Pharmacologica Sinica. 32 (4), 495-502 (2011).
  21. Vargas Robles, H., et al. Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis. Journal of Visualized Experiments. (119), e55095 (2017).
  22. Arques, J. L., et al. Salmonella induces flagellin- and MyD88-dependent migration of bacteria-capturing dendritic cells into the gut lumen. Gastroenterology. 137 (2), 579-587 (2009).
  23. Coombes, B. K., et al. Analysis of the contribution of Salmonella pathogenicity islands 1 and 2 to enteric disease progression using a novel bovine ileal loop model and a murine model of infectious enterocolitis. Infection and Immunity. 73 (11), 7161-7169 (2005).
  24. Everest, P., et al. Evaluation of Salmonella typhimurium mutants in a model of experimental gastroenteritis. Infection and Immunity. 67 (6), 2815-2821 (1999).
  25. Pron, B., et al. Comprehensive study of the intestinal stage of listeriosis in a rat ligated ileal loop system. Infection and Immunity. 66 (2), 747-755 (1998).
  26. Clayburgh, D. R., et al. Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo. The Journal of Clinical Investigation. 115 (10), 2702-2715 (2005).
  27. Palmblad, J., et al. Leukotriene B4 is a potent and stereospecific stimulator of neutrophil chemotaxis and adherence. Blood. 58 (3), 658-661 (1981).
  28. Mandell, K. J., Babbin, B. A., Nusrat, A., Parkos, C. A. Junctional adhesion molecule 1 regulates epithelial cell morphology through effects on beta1 integrins and Rap1 activity. The Journal of Biological Chemistry. 280 (12), 11665-11674 (2005).
  29. Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).
  30. Flemming, S., Luissint, A. C., Nusrat, A., Parkos, C. A. Analysis of leukocyte transepithelial migration using an in vivo murine colonic loop model. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (20), (2018).
  31. Luissint, A. C., Nusrat, A., Parkos, C. A. JAM-related proteins in mucosal homeostasis and inflammation. Seminars in Immunopathology. 36 (2), 211-226 (2014).
  32. Cesarovic, N., et al. Isoflurane and sevoflurane provide equally effective anaesthesia in laboratory mice. Lab Animal. 44 (4), 329-336 (2010).
  33. JoVE Science Education Database. Introduction to the Microplate Reader. Journal of Visualized Experiments. , JoVE, Cambridge, MA. e5024 (2020).
  34. Kelm, M., et al. Targeting epithelium-expressed sialyl Lewis glycans improves colonic mucosal wound healing and protects against colitis. Journal of Clinical Investigation Insight. 5 (12), (2020).
  35. Azcutia, V., et al. Neutrophil expressed CD47 regulates CD11b/CD18-dependent neutrophil transepithelial migration in the intestine in vivo. Mucosal Immunology. , (2020).
  36. Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PloS One. 11 (3), 0150606 (2016).
  37. Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series). Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).
  38. Ebnet, K. Junctional Adhesion Molecules (JAMs): Cell adhesion receptors with pleiotropic functions in cell physiology and development. Physiological Reviews. 97 (4), 1529-1554 (2017).
  39. Sorribas, M., et al. FXR modulates the gut-vascular barrier by regulating the entry sites for bacterial translocation in experimental cirrhosis. Journal of Hepatology. 71 (6), 1126-1140 (2019).
  40. Mazzucco, M. R., Vartanian, T., Linden, J. R. In vivo Blood-brain Barrier Permeability Assays Using Clostridium perfringens Epsilon Toxin. Bio-Protocol. 10 (15), 3709 (2020).
  41. Kelly, J. R., et al. Breaking down the barriers: the gut microbiome, intestinal permeability and stress-related psychiatric disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 392 (2015).
  42. Fiorentino, M., et al. Blood-brain barrier and intestinal epithelial barrier alterations in autism spectrum disorders. Molecular Autism. 7 (1), 49 (2016).
  43. Kelm, M., et al. Regulation of neutrophil function by selective targeting of glycan epitopes expressed on the integrin CD11b/CD18. FASEB Journal : An Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (2), 2326-2343 (2020).

Tags

Иммунология и инфекция выпуск 168 кишечная барьерная функция иммунология слизистой оболочки эпителий кишечника анализ проницаемости анализ миграции лейкоцитов трансэпителия подвздошная петля проксимальная петля толстой кишки флуоресцентный изотиоцианат (FITC)-декстран хемокин провоспалительный цитокин
Функциональная оценка кишечной проницаемости и трансэпителиальной миграции нейтрофилов у мышей с использованием стандартизированной модели кишечной петли
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boerner, K., Luissint, A. C.,… More

Boerner, K., Luissint, A. C., Parkos, C. A. Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model. J. Vis. Exp. (168), e62093, doi:10.3791/62093 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter