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Immunology and Infection

मानकीकृत आंतों के लूप मॉडल का उपयोग करके चूहों में आंतों की पारगम्यता और न्यूट्रोफिल ट्रांसेपिथेलियल माइग्रेशन का कार्यात्मक मूल्यांकन

Published: February 11, 2021 doi: 10.3791/62093
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pathology, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

डिस्जेनिव आंतों के एपिथेलियल बैरियर फंक्शन और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं भड़काऊ आंत्र रोग की पहचान हैं जो शारीरिक मॉडलों की कमी के कारण खराब जांच करते रहते हैं। यहां, हम एक माउस आंतों के लूप मॉडल का वर्णन करते हैं जो वीवो में म्यूकोसल पारमेबिलिटी और ल्यूकोसिटे भर्ती का अध्ययन करने के लिए एक अच्छी तरह से संवहनी और बाहरी आंत्र खंड को नियोजित करता है।

Abstract

आंतों के म्यूकोसा को एपिथेलियल कोशिकाओं की एक परत से रेखांकित किया जाता है जो एक गतिशील बाधा बनाता है जो चमकदार बैक्टीरिया और बहिर्जात पदार्थों के पारित होने को रोकते हुए पोषक तत्वों और पानी के पैरासेलुलर परिवहन की अनुमति देता है। इस परत के उल्लंघन के परिणामस्वरूप चमकदार सामग्री और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती में पारमशीलता में वृद्धि होती है, जिनमें से दोनों भड़काऊ आंत्र रोग (आईबीडी) सहित आंत में रोगविज्ञानी राज्यों की पहचान हैं।

बहुरूपता न्यूक्लियर न्यूट्रोफिल (पीएमएन) के एपिथेलियल बैरियर फंक्शन और ट्रांसपेरियल माइग्रेशन (टीईपीएम) को विनियमित करने वाले तंत्र को मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति देने वाले वीवो विधियों में प्रायोगिक की कमी के कारण अधूरा समझ में आता है। यहां, हम एक मजबूत मुरीन प्रयोगात्मक मॉडल का वर्णन करते हैं जो इलियम या समीपस्थ पेट के बाहरी आंतों के खंड को नियोजित करता है। बाहरी आंतों का पाश (iLoop) पूरी तरह से संवहनी है और पूर्व वीवो चैंबर-आधारित दृष्टिकोणों पर शारीरिक लाभ प्रदान करता है जो आमतौर पर एपिथेलियल सेल मोनोलेयर में पारमेबिलिटी और पीएमएन माइग्रेशन का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाते हैं।

हम इस मॉडल के दो अनुप्रयोगों को विस्तार से प्रदर्शित करते हैं: (1) इंट्राल्यूमिनल इंजेक्शन के बाद सीरम में फ्लोरेसेंस-लेबल डेक्सट्रांस का पता लगाने के माध्यम से आंतों की पारगम्यता का मात्रात्मक माप, (2) केमोटाट्रेक्टा के इंट्राल्यूमिनल परिचय के बाद आंतों के एपिथेलियम में माइग्रेट पीएमएन का मात्रात्मक आकलन। हम इस मॉडल की व्यवहार्यता प्रदर्शित करते हैं और नियंत्रण की तुलना में एपिथेलियल टाइट जंक्शन-संबद्ध प्रोटीन जैम-ए की कमी वाले चूहों में iLoop का उपयोग करने वाले परिणाम प्रदान करते हैं। जाम-ए भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के दौरान एपिथेलियल बैरियर फ़ंक्शन के साथ-साथ पीएमएन टीईएम को विनियमित करने के लिए दिखाया गया है। iLoop का उपयोग करने वाले हमारे परिणाम पिछले अध्ययनों की पुष्टि करते हैं और होमोस्टेसिस और रोग के दौरान वीवो में आंतों की पारिम्यता और पीएमएन टीईपीएम के नियमन में जैम-ए के महत्व को उजागर करते हैं।

आईलूप मॉडल आंतों के होमोस्टेसिस और सूजन के वीवो अध्ययन में प्रजनन के लिए एक अत्यधिक मानकीकृत विधि प्रदान करता है और आईबीडी जैसे रोगों में आंतों के बाधा कार्य और म्यूकोसल सूजन की समझ में काफी वृद्धि करेगा।

Introduction

आंतों के म्यूकोसा में कॉलमर आंतों की एपिथेलियल कोशिकाओं (आईईसी), अंतर्निहित लैमिना प्रोप्रिया प्रतिरक्षा कोशिकाओं और मस्कुलरिस म्यूकोसे की एक परत शामिल है। पोषक तत्वों के अवशोषण में इसकी भूमिका के अलावा, आंतों के एपिथेलियम एक भौतिक बाधा है जो शरीर के इंटीरियर को ल्यूमिनल कॉमेंसल बैक्टीरिया, रोगजनकों और आहार एंटीजन से बचाता है। इसके अलावा, आईईसी और लैमिना प्रोप्रिया प्रतिरक्षा कोशिकाएं संदर्भ और उत्तेजनाओं के आधार पर सहिष्णुता या प्रतिक्रिया को प्रेरित करने वाली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का समन्वय करती हैं। यह सूचित किया गया है कि एपिथेलियल बैरियर का व्यवधान पैथोलॉजिक म्यूकोसल सूजन की शुरुआत से पहले हो सकता है और भड़काऊ आंत्र रोग (आईबीडी) में योगदान दे सकता है जिसमें अल्सर कोलाइटिस और क्रोन कीबीमारी1,2,3,4,5,6, 7शामिल हैं। अल्सर कोलाइटिस वाले व्यक्ति बहुरूपता न्यूक्लियर न्यूट्रोफिल (पीएमएन) के अत्यधिक ट्रांसेपिथेलियल माइग्रेशन (टीईएम) को क्रिप्ट फोड़े बनाते हैं, एक खोज जो रोग की गंभीरता से जुड़ी हुई है8,9। हालांकि समझौता एपीथेलियल बैरियर समारोह और अत्यधिक प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं IBD की पहचान कर रहे हैं, वहां वीवो परख में प्रयोगात्मक की कमी आंतों की पारिष्ठता और आंतों mucosa में प्रतिरक्षा कोशिका भर्ती के मात्रात्मक आकलन प्रदर्शन है ।

आंतों के एपिथेलियल पारीयता का अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाने वाली सबसे आम विधियां और पीएमएन टीईएम ने अर्ध-पारमीयछिद्रीय झिल्ली आवेषण10, 11,12पर सुसंस्कृत आईईसी मोनोलेयर्स का उपयोग करके पूर्व वीवो चैंबर-आधारित दृष्टिकोणों को नियोजित किया। एपिथेलियल बैरियर अखंडता की निगरानी या तो ट्रांसेपिथेलियल इलेक्ट्रिकल रेजिस्टेंस (टीईईआर) के माप या फ्लोरोसीन आइसोथियोसायनेट (फिटसी) के पैरासेलुलर फ्लक्स द्वारा की जाती है, जो एपिकल से बेसल डिब्बे13,14, 15के लिए डेक्सट्रान लेबल किया जाता है । इसी तरह, पीएमएन टीईपीएम का अध्ययन आमतौर पर निचले कक्ष16में जोड़े गए केमोएट्रेक्टेंट के जवाब में किया जाता है। पीएमएन को ऊपरी कक्ष में रखा जाता है और इनक्यूबेशन अवधि के बाद, बेसल डिब्बे में चले गए पीएमएन को एकत्र और मात्रा निर्धारित किया जाता है। हालांकि ये विधियां उपयोगी, प्रदर्शन करने में आसान और बहुत प्रजनन योग्य हैं, वे स्पष्ट रूप से न्यूनीकरणवादी दृष्टिकोण हैं और जरूरी नहीं कि वीवो स्थितियों में सटीक प्रतिबिंब का प्रतिनिधित्व करें।

चूहों में, आंतों की पैरासेलुलर पारिधि का अध्ययन करने के लिए एक आम परख फिटसी-डेक्सट्रान के मौखिक गैवरेज और रक्त सीरम13, 17में फिटसी-डेक्सट्रान उपस्थिति के बाद माप द्वारा है। इस परख का नुकसान यह है कि यह क्षेत्रीय आंतों के योगदान के बजाय गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट की समग्र बाधा अखंडता के आकलन का प्रतिनिधित्व करता है। इसके अलावा, इवांस ब्लू का उपयोग आमतौर पर वीवो 18 में संवहनी रिसाव का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है और माउस और चूहे19 , 20,21में आंतों के म्यूकोसल पारमेबिलिटी का मूल्यांकन करने के लिए भीनियोजितकिया गया है। आंतों म्यूकोसा में इवांस ब्लू के क्वांटिफिकेशन के लिए ऊतक से निष्कर्षण की आवश्यकता होती है जो रातभर फॉर्मामाइड में इनक्यूबेशन को नियोजित करता है। इसलिए, एक ही ऊतक का उपयोग आंतों के एपिथेलियल पारियटीयता और न्यूट्रोफिल घुसपैठ का अध्ययन करने के लिए नहीं किया जा सकता है।

यहां हम एक सरल प्रोटोकॉल को हाइलाइट करते हैं जो वीवो में कोलोनिक म्यूकोसल पारगम्यता और ल्यूकोसिटे ट्रांसेपिथेलियल माइग्रेशन पर प्रजनन योग्य डेटा एकत्र करने के लिए आवश्यक जानवरों की संख्या को कम करता है। इसलिए, हम फिटसी-डेक्सट्रांस के उपयोग की सलाह देते हैं जो आंतों के छोरों की अखंडता से समझौता किए बिना रक्त सीरम में आसानी से पता लगाया जा सकता है जिसे आगे के विश्लेषण के लिए काटा जा सकता है। ध्यान दें, आंतों के लिगाटेड लूप का उपयोग विभिन्न प्रजातियों (माउस, चूहा, खरगोश, बछड़े सहित) में बैक्टीरियल संक्रमण (जैसे साल्मोनेला, लिस्टेरिया मोनोसाइटोजीन और एस्चेरिचिया कोलाई)22,23, 24,25 के साथ-साथ आंतों की पारगम्यता26का अध्ययन करने के लिए किया गया है; हालांकि, हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए आंत में विशिष्ट क्षेत्रों में पीएमएन टीईपीएम के तंत्र की जांच करने वाला कोई अध्ययन नहीं है जैसे कि आमतौर पर आईबीडी में शामिल हैं।

यहां हम माउस आंतों के लूप (iLoop) मॉडल का वर्णन करते हैं जो वीवो विधि में एक मजबूत और विश्वसनीय माइक्रोसर्जिकल है जो इलियम या समीपस्थ कोलन के एक अच्छी तरह से संवहनी और बाहरी आंतों के खंड को नियोजित करता है। iLoop मॉडल शारीरिक रूप से प्रासंगिक है और संज्ञाहरण के तहत जीवित चूहों पर आंतों की बाधा अखंडता और पीएमएन टीईएम के आकलन की अनुमति देता है। हम दो अनुप्रयोगों को प्रदर्शित करते हैं: 1) आईलूप 2 में इंट्राल्यूमिनल प्रशासन के बाद 4 केडीए फिटसी-डेक्सट्रान के सीरम स्तर का मात्राकरण) शक्तिशाली केमोट्राक्टाल्ट लेउकोट्रिन बी4 (एलटीबी4)27के इंट्राल्यूमिनल इंजेक्शन के बाद आईलूप ल्यूमेन में ट्रांसलॉल्ड पीएमएन का मात्राकरण । इसके अलावा, जैम-ए-नलचूहों या चूहों के साथ आईलूप मॉडल का उपयोग आईईईसी (विल्लिन-क्रे) पर जाम-ए के चयनात्मक नुकसान को शरणदेते हैं; जाम-ए fl/fl)नियंत्रण चूहों की तुलना में, हम पिछले अध्ययनों की पुष्टि करने में सक्षम हैं जिन्होंने टाइट जंक्शन से जुड़े प्रोटीन जैम-ए से आंतों की पारगम्यता और न्यूट्रोफिल ट्रांसमिग्रेशन15,28, 29,30, 31के लिए एक प्रमुख योगदान की सूचना दी है ।

iLoop मॉडल एक अत्यधिक कार्यात्मक और शारीरिक विधि है जिसका उपयोग विट्रो परख की पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, यह एक बहुमुखी प्रयोगात्मक मॉडल है जो विभिन्न अभिकर्षकों के अध्ययन की अनुमति देता है जिन्हें लूप ल्यूमेन में इंजेक्ट किया जा सकता है, जिसमें केमोकिन, साइटोकिन्स, बैक्टीरियल रोगजनक, विषाक्त पदार्थ, एंटीबॉडी और चिकित्सीय शामिल हैं।

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Protocol

सभी पशु प्रयोग राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के दिशा-निर्देशों और नीतियों के अनुसार किए गए थे और मिशिगन विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किए गए थे ।

1. प्रीऑपरेटिव तैयारी

नोट: इस विधि C57BL/6 आनुवंशिक पृष्ठभूमि से वयस्क चूहों को रोजगार उत्पन्न किया गया था, 8 आयु वर्ग-12 सप्ताह । सभी चूहों को सामान्य चाउ और पानी तक विज्ञापन लिबिटम पहुंच के साथ सख्त विशिष्ट रोगजनक मुक्त परिस्थितियों में रखा गया था। परिणाम C57BL/6, जाम-ए-नल चूहों(जाम-ए-/-)या चूहों का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे जो आईईसीसी (विल्लिन-क्रे) पर जाम-ए के चयनात्मक नुकसान को शरण देते हैं; जाम-एकfl/fl)और लिटरमेट जाम-एकfl/fl नियंत्रण के रूप में पहले30वर्णित है ।

  1. क्षेत्र की तैयारी
    1. स्वच्छ क्षेत्र में सर्जरी करें। आंतों लूप मॉडल, हालांकि, एक गैर अस्तित्व सर्जरी है कि aseptic/बाँझ तकनीक की आवश्यकता नहीं है । पशु चिकित्सा स्वच्छता प्रथाओं का निरीक्षण करें और साफ सर्जिकल उपकरणों का उपयोग करें (यानी, साबुन के साथ रगड़, 70% इथेनॉल के बाद पानी के साथ धोया जाता है)।
    2. एनेस्थीसिया और सर्जरी के दौरान हाइपोथर्मिया से जानवर रखने के लिए तापमान नियंत्रित सर्जिकल बोर्ड (या हीटिंग पैड) और अनुकूलित प्रकाश स्रोत को चालू करें।
    3. गैर-अवशोषित 4-0 रेशम सर्जिकल टांके के 6 सेमी खंडों को काटकर लिगेचर तैयार करें।
    4. कपास की धुंध (5 सेमी x 5 सेमी) तैयार करें जो एक अंडाकार आकार के बाद केंद्र में काटे जाते हैं। इनका उपयोग मिडलाइन लेप्रोटॉमी को कवर करने और बाहरी iLoop और पशु फर के बीच सीधे संपर्क को रोकने के लिए किया जाएगा। एक पेट्री डिश कंटेनर में गर्म हैंक्स के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) में कट धुंध सोख लें।
    5. गर्म एचबीबीएस में भिगोए गए गीले सूती झाड़ू तैयार करें जिसका उपयोग अंगों और बाहरी iLoop को संभालने के लिए किया जाएगा।
    6. गर्म एचबीएसएस से भरी 10 एमएल सिरिंज तैयार करें और पीले रंग की फीडिंग ट्यूब से अटैच करें। इस सिरिंज का उपयोग सर्जरी के दौरान उजागर ऊतकों को मॉइस्चराइज करने और मल सामग्री के आईलूप को धीरे-धीरे फ्लश करने के लिए किया जाएगा।
  2. पशु तैयारी
    1. अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल के अनुसार जानवर को एनेस्थेटाइज करें। इस प्रोटोकॉल में आइसोफ्लुन और ऑक्सीजन का मिश्रण एनेस्थीसिया वाष्पीकरण के माध्यम से प्रशासित किया जाता है। निर्माता के निर्देशों के अनुसार, ऑक्सीजन प्रवाह दर को 1 एल/मिनट तक समायोजित करें । वाष्पीकरण को 5% तक सेट करें और इंडक्शन चैंबर को प्री-चार्ज करें। 5 मिनट के बाद, आइसोफ्लुएरेन वाष्पीकरण को 2% तक कम करें - 2.5%।
    2. जानवर को 3 मिनट - 5 मिनट के लिए इंडक्शन कक्ष में रखें, फिर जानवर को गर्म सर्जरी बोर्ड में स्थानांतरित करें और एक संज्ञाहरण नाक प्लग को कनेक्ट करें। चिपकने वाले टेप का उपयोग करके चार अंगों द्वारा रीढ़ की स्थिति में जानवर को नियंत्रित करें।
      नोट: एक संज्ञाहरण विकल्प के रूप में, केटामाइन (८० मिलीग्राम/किलो-१०० मिलीग्राम/किलो) और जाइलाज़ीन (5 मिलीग्राम/किलो-10 मिलीग्राम/किलो) नमकीन समाधान (०.९% NaCl) में पतला का मिश्रण इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा प्रशासित किया जा सकता है । संज्ञाहरण को एनेस्थेटिक गहराई सुनिश्चित करने के लिए केटामाइन/जाइलाज़ीन (प्रारंभिक खुराक के 0.1 - 0.25 गुना पर) के इंट्रामस्कुलर प्रशासन द्वारा सर्जरी के दौरान बनाए रखा जाना चाहिए। यदि उपलब्ध है, तो बेहतर प्रजनन, जीवितता और जानवरों के दर्द को रोकने के लिए एक आइसोफ्लुरेन एनेस्थीसिया वाष्पीकरण की अत्यधिक सिफारिश की जाती है।
    3. कॉर्नियल डिमिटेशन को रोकने के लिए दोनों आंखों पर नेत्र मरहम लगाएं।
    4. एक शारीरिक परीक्षा है कि दिल की दर (लगभग ५०० धड़कता है/मिनट) और ताल, श्लेष्म झिल्ली रंग (गुलाबी), केशिका रिफिल समय (2 एस <), श्वसन दर (४० से कम नहीं-६० सांस/मिनट), और तापमान (३६.५ डिग्री सेल्सियस)३२।
    5. अगले चरणों में आगे बढ़ने से पहले, पेडल निकासी पलटा द्वारा संवेदनाहारी गहराई का आकलन करें। पैर की उंगलियों और/ माउस अनुबंध और अपने पैर को हटाने के द्वारा जवाब देंगे। यह पेडल पलटा गायब हो जाता है जब जानवर गहराई से एनेस्थेटाइज्ड होता है।
      नोट: नब्ज और पेडल पलटा की निगरानी कम से कम हर 15 मिनट पर संज्ञाहरण भर में सिफारिश कर रहे हैं. संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) संज्ञाहरण गहराई के मूल्यांकन के लिए दिशा निर्देश निम्नलिखित की निगरानी की सिफारिश: (क) पूंछ, पैर और श्लेष्म झिल्ली का रंग (जैसे जीभ के रूप में) । कम रक्त परफ्यूजन या श्वसन संकट के संकेत के रूप में सामान्य और हल्के या नीले रंग के रूप में गुलाबी रंग; (ख) श्वास पद्धति का मूल्यांकन नियमित बनाम अनियमित श्वास के रूप में किया जाना । एक गुदा तापमान जांच, कृंतक ऑक्सीमीटर और हृदय गति पर नज़र रखता है क्रमशः शरीर के तापमान, दिल और श्वसन दरों के आकलन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

2. इलेल लूप की पीढ़ी

  1. त्वचा की तैयारी: 70% इथेनॉल से भिगोए गए अल्कोहल झाड़ू या धुंध स्पंज के साथ पेट के मिडलाइन के स्क्रब फर। हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए शराब के साथ फर के एक विस्तृत क्षेत्र गीला न करें।
  2. कैंची का उपयोग करना, एक मिडलाइन लेप्रोटॉमी प्रदर्शन करें। पेट के बीच में एक ऊर्ध्वाधर चीरा (लंबाई में लगभग 2 सेमी) बनाएं और पेरिटोनम का पर्दाफाश करें। इंट्रा पेट के अंगों को घायल न करने के लिए सावधान रहें।
  3. उजागर इंट्रा-पेट गुहा पर पूर्व-कट गीले कपास की धुंध रखें।
  4. कैटम को जुटाने और बाहरी बनाने के लिए गीले कॉटन झाड़ू का इस्तेमाल करें। सावधानी से गीले कपास की जाली पर कैकम रखें।
    नोट: Caecum जानवर के लिंग से स्वतंत्र चूहों के बहुमत में पेट गुहा के बाएं कौडल चतुर्भुज में स्थानीयकृत है।
  5. गीले कपास झाड़ू का उपयोग उस इलियम को जुटाने और धीरे-धीरे बाहरी बनाने के लिए करें जिसमें टर्मिनल सेक्शन (डिस्टल एंड) कैकम(चित्रा 1B)से जुड़ा हुआ है।
  6. मेसेंटेरिक वाहिकाओं और रक्त की आपूर्ति में बाधा के बिना गीले कपास धुंध पर टर्मिनल इलियम के कम से कम 6 सेमी तैनात करें। खून बहने पर रक्त की आपूर्ति को बनाए रखा जाता है और ऊतक अपना गुलाबी रंग(चित्रा 1B) बनाए रखता है।
    नोट: पीले भोजन ट्यूब (चरण 1.1.6) से जुड़ी 10 मिली सी सिरिंज का उपयोग करके गर्म एचबीबीएस (हर 2 - 3 मिनट) के साथ हर समय ऊतकों को नम बनाए रखकर उजागर ऊतकों को सुखाने से बचें।
  7. कैटम के करीब, मेसेंटरी में इलियम की आपूर्ति करने वाली प्रमुख धमनी की पहचान करें। फिर महत्वपूर्ण रक्त वाहिकाओं से मुक्त मेसेन्ट्री में दो लिगेशन साइटों का पता लगाएं।
  8. कुंद ऊतक संदंश का उपयोग करना, दृढ़ता से टर्मिनल इलियम (caecum के निकटतम) हड़पने और ठीक टिप संदंश का उपयोग कर, रक्त वाहिकाओं से परहेज mesentery fenestrate । छिद्र के पार रेशम सीवन रखें और पहली लिगाशन (लूप का डिस्टल एंड) बनाने के लिए एक सर्जिकल गाँठ बांधें।
  9. पहले लिगेचर से 4 सेमी दूर मापने के लिए शासक का उपयोग करें और दूसरा लिगेचर (लूप का समीपस्थ अंत) बनाएं जैसा कि चरण 2.8(चित्रा 1C)में उल्लेख किया गया है।
  10. ठीक कैंची के साथ ध्यान से 4 सेमी ileal पाश अलग करने के लिए प्रत्येक बंधन के बगल में कटौती, बरकरार रक्त की आपूर्ति और mesenteric झिल्ली रखते हुए ।
    नोट: आईलूप के बाहरी खंड के दोनों सिरों को काट लें, फिर एक आवश्यक कदम के रूप में धीरे-धीरे फ्लश करें जो ल्यूमिनल सामग्री (मल पदार्थ) के साथ हस्तक्षेप को रोकता है, इस प्रकार अलग-थलग सेगमेंट की पूरी लंबाई में फिटसी-डेक्सट्रांस या केमोटेक्टिक उत्तेजनाओं के फैलाव को भी सुविधाजनक बनाता है और साथ ही प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा ल्यूकोक्टाइट्स के अधिक सटीक मात्राकरण की अनुमति देता है। यह प्रक्रिया जानवरों के बीच अभियुक्त मात्रा और बेहतर प्रजनन क्षमता के इंजेक्शन के बाद म्यूकोसा के एक समान तनाव की भी अनुमति देती है।
  11. धीरे-धीरे 10 एमएल सिरिंज से जुड़ी एक लचीली पीले भोजन ट्यूब का उपयोग करके गर्म एचबीबीएस के साथ इलियल लूप सेगमेंट की सामग्री को फ्लश करें (चरण 1.1.6 देखें)।
  12. रेशम सीवन का उपयोग कर फ्लश इलेल लूप के दो कट सिरों को लिगेट करें।
  13. आंतों के लुमेन में फिटसी-डेक्सट्रांस (चरण 4.2) या केमोकिन (चरण 5.3) जैसे 250 माइक्रोन को धीरे-धीरे इंजेक्ट करने के लिए 30 जी सुई के साथ 1 मिलील सिरिंज का उपयोग करें। इलियल लूप म्यूकोसा(चित्रा 1D)के मध्यम विघटन के कारण बढ़ जाएगा।
    नोट: मेसेनटेरिक धमनी के विपरीत तरफ लूप ल्यूमेन में रिएजेंट इंजेक्ट करें। रक्त वाहिकाओं को फाड़ने से बचने और रक्तस्राव को प्रेरित करने के लिए इंजेक्शन देते समय जानवर से इलियल लूप को बाहर न निकालने के लिए सावधान रहें।
  14. गीले सूती झाड़ू का उपयोग करके, धीरे-धीरे इलियल लूप, समीपस्थ इलियम और कैकम को वापस रखें।
  15. पेट की दीवार को बंद करने के लिए रिवर्स कटिंग सुई के साथ सुई धारक, शारीरिक संदंश और 3.0 गैर-अवशोषित रेशम टांके का उपयोग करें।
  16. इनक्यूबेशन अवधि के लिए एक तापमान विनियमित संज्ञाहरण कक्ष में जानवर रखें।

3. समीपस्थ कोलन लूप (पीसीलूप) का उत्पादन

नोट: पीसीलूप की पीढ़ी के लिए उपयोग किए जाने वाले चूहों के बारे में विवरण के लिए, प्रोटोकॉल अनुभाग की शुरुआत में प्रदान की गई जानकारी देखें।

  1. चरण 2.1 करें। - 2.4. जैसा कि इलियल लूप के लिए ऊपर वर्णित है।
  2. गीले सूती झाड़ू का उपयोग करके, पूरे इलियम को बाहरी करें और इसे गीले कपास की धुंध के शीर्ष पर रखें। समीपस्थ पेट और मेसोकोलन में स्थित रक्त की आपूर्ति की पहचान करें। समीपस्थ पेट को जुटाने और ठीक टिप संदंश का उपयोग करके एक मेसोकोलन में जहाजों से मुक्त क्षेत्र में पहली लिगाचर बनाने के बारे में ०.५ सेमी डिस्टल पर caecum(चित्रा 2B)से ।
  3. पहले लिगेचर से 2 सेमी मापें और मेसोकोलोन(चित्रा 2 सी)में रक्त आपूर्ति से मुक्त क्षेत्र में दूसरा लिगामेंट बनाएं।
  4. ठीक कैंची का उपयोग ध्यान से एक 2 सेमी लंबे पीसीलूप को अलग करने के लिए प्रत्येक बंधन के बगल में कटौती ।
    नोट: जैसा कि चरण 2.10 के तहत नोट में उल्लेख किया गया है, एक पीसीलूप को अलग करने के लिए दोनों सिरों को काटना महत्वपूर्ण है जो धीरे-धीरे चमकदार सामग्री से साफ होता है। छोटे जहाजों को आंतों के ल्यूमेन में रक्तस्राव से रोकने के लिए कॉलोनिक ऊतक और मेसोकोलन के माध्यम से सावधानी से काटें। यदि आवश्यक हो, तो चीरा साइट पर रक्तस्राव को सीमित करने के लिए थर्मल कॉटरी का उपयोग करें।
  5. 10 एमएल सिरिंज से जुड़ी एक लचीली पीली फीडिंग ट्यूब का उपयोग करके मल को हटाने के लिए गर्म एचबीबीएस के साथ पीसीलूप को धीरे-धीरे फ्लश करें (चरण 1.1.6 देखें)।
  6. रेशम सीवन का उपयोग कर फ्लश पीसीलूप के दो कट सिरों को लिगेट करें।
  7. आंतों के लुमेन में फिटसी-डेक्सट्रांस (चरण 4.2) या केमोकिन (चरण 5.3) जैसे 200 माइक्रोन को धीरे-धीरे इंजेक्ट करने के लिए 30 ग्राम सुई के साथ 1 मिलील सिरिंज का उपयोग करें। पीसीलूप म्यूकोसा(चित्रा 2डी)के मध्यम विघटन के कारण बढ़ जाएगा।
    नोट: मेसेनटेरिक धमनी के विपरीत तरफ पीसीलूप ल्यूमेन में रिएजेंट इंजेक्ट करें। जानवरों के बीच स्थिरता सुनिश्चित करें और म्यूकोसा के समान तनाव सुनिश्चित करने के लिए 2 सेमी लंबा पीसीलूप बनाएं।
  8. गीले सूती झाड़ू का उपयोग धीरे से पेट गुहा में लिटेड पीसीलूप, इलियम और कैकम को वापस रखने के लिए करें।
  9. पेट की दीवार को बंद करने के लिए रिवर्स कटिंग सुई के साथ सुई धारक, शारीरिक संदंश और 3.0 गैर-अवशोषित रेशम टांके का उपयोग करें।
  10. इनक्यूबेशन अवधि के लिए एक तापमान विनियमित संज्ञाहरण कक्ष में जानवर रखें।

4. आंतों की पारगम्यता का मात्रात्मक आकलन: 4 केडीए फिटसी-डेक्सट्रान परख

  1. एक इलियल लूप या पीसीलूप (जैसा कि ऊपर वर्णित है) करें।
  2. 30 जी सुई के साथ एक 1 मिलीएल सिरिंज का उपयोग करना, आंतों के ल्यूमेन में इंजेक्ट करें या तो 250 माइक्रोन (इलियम - चरण 2.13) या 200 माइक्रोन (पेट - चरण 3.7) 4 केडीए फिटसी-डेक्सटरान समाधान (एचबीबीएस में 1 मिलीग्राम / सीरम संग्रह के बाद मानक वक्र तैयार करने के लिए अप्रयुक्त फिटसी-डेक्सट्रान समाधान को प्रकाश से सुरक्षित रखें।
  3. ileal लूप के लिए पीसीलूप चरण 3.8 से 3.10 के लिए, 2.14 से 2.16 चरणों का पालन करें। संक्षेप में, अंगों और आईलूप को पेट की गुहा में वापस रखें, पेट की दीवार को बंद करें।
  4. एक गर्म संज्ञाहरण कक्ष में 120 मिनट के लिए जानवर रखें।
  5. इनक्यूबेशन अवधि के बाद पेट की दीवार को खोलें, दिल तक पहुंच प्राप्त करें और रक्त एकत्र करने के लिए 25G सुई के साथ 1 मिलील सिरिंज का उपयोग करके हृदय पंचर करें। रक्त को 1.3 एमएल सीरम क्लॉट एक्टिवेटर ट्यूब में स्थानांतरित करें, धीरे-धीरे मिलाएं, और प्रकाश से सुरक्षित बर्फ पर रखें। माउस प्रति रक्त के कम से कम 500 माइक्रोन ले लीजिए।
    नोट: पशुओं को एनेस्थीसिया के तहत होने पर डेपुटेशन या सर्वाइकल अव्यवस्था जैसी भौतिक विधि का उपयोग करके, और अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल के अनुसार इच्छामृत्यु दी जाती है।
  6. निर्माता की सिफारिशों के अनुसार कमरे के तापमान पर 10,000 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए सेंट्रलाइज सीरम क्लॉट एक्टिवेटर ट्यूब। सीरम (सुपरनेट) को इकट्ठा करें और 1.7 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें। ट्यूब को बर्फ पर रखें और प्रकाश से सुरक्षित रखें।
  7. रक्त सीरम में फ्लोरेसेंस का मात्राकरण
    1. नियंत्रण चूहों के सीरम में फिटसी-डेक्सट्रान 4 केडीए का एक मानक वक्र तैयार करें (खारा या एचबीएसएस एक वैध विकल्प है)। 1 मिलीग्राम/एमएल फिटसी-डेक्सट्रान की शुरुआती एकाग्रता के साथ दो गुना सीरियल कमजोर पड़ने का निर्माण करें । फिटसी-डेक्सट्रान 4 केडीए सांद्रता जो 0.25 मिलीग्राम/एमएल और 2 माइक्रोग्राम/एमएल के बीच मापी जाती है।
    2. निर्माता के निर्देशों और प्रकाशित प्रोटोकॉल33के अनुसार, नमूने और मानकों की समान मात्रा को काले 96-वेल प्लेट (फ्लैट बॉटम) में स्थानांतरित करें और एक फ्लोरेसेंस प्लेट रीडर (एक्सिटेशन 490 एनएम, उत्सर्जन 520 एनएम) में फिटसी को मापें। प्रयोगात्मक नियंत्रण समूह को सामान्य रूप से गुना-परिवर्तन के रूप में मानक वक्र या वर्तमान पारमशीलता मूल्यों के आधार पर फिटसी एकाग्रता की गणना करें।

5. केमोकिन के साथ इंट्राल्यूमिनल उत्तेजना के बाद आंतों के लुमेन में माइग्रेट पीएमएन का मात्रात्मक आकलन

नोट: बहुत कम PMN बेसलाइन स्तर पर आंतों म्यूकोसा में रहते हैं । प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स वाले जानवरों का पूर्व उपचार एक भड़काऊ वातावरण में परिणाम देता है जो रक्तधारा से आंतों के म्यूकोसा में पीएमएन भर्ती की सुविधा प्रदान करता है।

  1. 30 जी सुई के साथ एक 1 मिलीएल सिरिंज का उपयोग करना, ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-α (TNFα) के १०० एनजी के एक बाँझ समाधान के इंट्रापेरिटोनियल (पीआई) इंजेक्शन और फॉस्फेट बफर खारा (PBS) के २०० μL में इंटरफेरॉन-γ (INFγ) के १०० एनजी प्रदर्शन करते हैं ।
  2. 4 - 24 एच के बाद प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स के साथ प्रीट्रीटमेंट के बाद, एक इलियल लूप या पीसीलूप (जैसा कि ऊपर वर्णित है)।
  3. 30 जी सुई के साथ 1 मिली सी सिरिंज का उपयोग करके, एचबीबीएस में केमोटाट्रेक्ट सॉल्यूशन ल्यूकोट्री बी 4 (एलटीबी4)1 एनएम के आंतों के ल्यूमेन या तो 250 माइक्रोन (इलियम - स्टेप 2.13) या 200 माइक्रोन (कोलन - चरण 3.7) में इंजेक्ट करें।
    नोट: Leukotriene B4 (LTB4)पीएमएन के लिए एक शक्तिशाली रसायन के रूप में इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है। एन-फॉर्माइलमेथियोनिल-ल्यूकिल-फेनिलैनिन (एफएमएल) या केमोकाइन (सी-एक्स-सी मोटिफ) लिगांड 1 (CXCL1/KC) जैसे अन्य रसायनों का भी इस्तेमाल कोलोनिक ल्यूमेन30में पीएमएन की महत्वपूर्ण भर्ती को प्रेरित करने के लिए किया जा सकता है ।
  4. ileal लूप के लिए चरण 2.14 से 2.16 का पालन करें। पीसीलूप के लिए चरण 3.8 से 3.10 का पालन करें। संक्षेप में, अंगों और आईलूप को पेट की गुहा में वापस रखें, पेट की दीवार को बंद करें।
  5. एक गर्म संज्ञाहरण कक्ष में 60 मिनट के लिए जानवर रखें।
  6. आंतों के लूप सामग्री का संग्रह
    1. समाधान तैयार करें और बर्फ पर स्टोर करें: इलियल लूप और पीसीलूप के लिए, कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना बाँझ पीबीएस में 2 एमएम एथिलेंडियामाइमेटेटिक एसिड (ईडीटीए), 5 एमएल डिथिओथ्रेइटॉल (डीटीटी) और 2% एफबीएस युक्त वॉश बफर तैयार करें।
    2. इनक्यूबेशन अवधि के बाद और संज्ञाहरण रखरखाव के तहत, पेट की दीवार को खोलें और iLoop (ileal लूप या पीसीलूप) को बाहर निकालें। डेपुटेशन या सर्वाइकल अव्यवस्था जैसी भौतिक विधि का उपयोग करके और अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल के अनुसार, संज्ञाहरण के तहत होने पर जानवरों को इच्छामृत्यु दें।
    3. किसी भी अवशिष्ट रक्त संदूषक को हटाने और ऊतक पोंछे के साथ पीबीएस की अधिकता को अवशोषित करने के लिए ठंड पीबीएस के साथ लूप कुल्ला। लूप सामग्री को 1.7 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब (इलियल लूप के लिए लगभग 250 माइक्रोन और पीसीलूप के लिए 200 माइक्रोन) में सावधानी से एकत्र करें। 500 माइक्रोन कोल्ड वॉश बफर के साथ लूप फ्लश करें और, संग्रह के तुरंत बाद, ट्यूब को बर्फ पर रखें।
      नोट: डीटीटी बलगम को भंग करने में मदद करता है। यदि iLoop चमकदार सामग्री बहुत चिपचिपा है (माउस आनुवंशिक पृष्ठभूमि के आधार पर), यह डीटीटी युक्त धोने बफर के साथ 1:2 या 1:3 पतला ।
    4. सेल छलनी टोपी के साथ 5 एमएल राउंड-बॉटम ट्यूब का उपयोग करके 35 माइक्रोन नायलॉन मेश फिल्टर के माध्यम से चमकदार सामग्री समाधान पास करें। यह चरण ऊतक के टुकड़ों और कोशिका समुच्चय को हटाने में मदद करता है। वॉश बफर के 1 एमएल के साथ सेल छन्नी कुल्ला।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर सेंट्रलाइज ट्यूब। सुपरनैंट को छोड़ें, 500 माइक्रोन के साथ गोली कुल्ला करें - 1 एमएल वॉश बफर, फिर 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 400 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें।
    6. कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना बाँझ पीबीएस में 2% एफबीएस युक्त प्रवाह साइटोमेट्री बफर (एफसीबी) के 200 माइक्रोन में iLoop ल्यूमिनल सेल गोली को फिर से पेंड करें। कोशिकाओं को एक ट्यूब में रखा जा सकता है या प्रवाह साइटोमेट्री धुंधला और विश्लेषण के लिए 96-अच्छी तरह से गोल नीचे प्लेट में स्थानांतरित किया जा सकता है।
  7. फ्लो साइटोमेट्री धुंधला और विश्लेषण
    1. मुआवजा नियंत्रण: सफेद रक्त कोशिकाओं
      1. 25 जी सुई के साथ एक 1 मिली सी सिरिंज तैयार पूर्व बाँझ 0.5 एम EDTA (पीएच 8.0) के साथ भरा। 10% ईडीटीए प्रति अपेक्षित रक्त की मात्रा (1 मिलियन रक्त के लिए ईडीटीए का 100 माइक्रोन) ।
      2. कार्डियक पंचर द्वारा संज्ञाहरण के तहत रक्त एकत्र करें। रक्त को 1.7 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, फिर 10 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 400 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें।
        नोट: जबकि माउस संज्ञाहरण के तहत है अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल (जैसे गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था) के अनुसार मौत की पुष्टि करने के लिए एक भौतिक विधि का उपयोग करें ।
      3. सुपरनेट को एस्पिरेट करें। लाल रक्त कोशिकाओं के लाइसिस के लिए अमोनियम-क्लोराइड-पोटेशियम (ACK) लाइसिस बफर के 1 एमसीएल में गोली को फिर से रीसल्पेंड करें। 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट - बर्फ पर 5 मिनट। सेंट्रलाइज 5 मिनट के लिए 400 एक्स ग्राम, 4 डिग्री सेल्सियस। यदि गोली अभी भी लाल है, तो इस ACK लाइसिस बफर चरण को तब तक दोहराएं जब तक कि गोली सफेद न हो जाए।
      4. 1 मिलीएल एफसीबी और प्लेट में गोली को फिर से खर्च करें 0.5 x 106- 1 x 10 6 कोशिकाओं की अच्छीतरह से। एक ९६-अच्छी तरह से गोल नीचे की थाली के पांच कुओं तैयार करें । थाली को बर्फ पर रखें।
        नोट: उसी 96-अच्छी प्लेट का उपयोग करें जिसमें लूप ल्यूमिनल सामग्री शामिल है (चरण 5.6.6 देखें)।
    2. फ्लो साइटोमेट्री धुंधला
      1. 400 x g,4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 96-वेल प्लेट को सेंट्रलाइज करें। सुपरनैट को त्यागें और एक एफसी-ब्लॉक (एफसीबी के प्रति 100 माइक्रोन) के रूप में शुद्ध चूहा एंटी-माउस सीडी 16/सीडी32 के 50 माइक्रोन के साथ छर्रों को फिर से खर्च करें। 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट - बर्फ पर 10 मिनट।
      2. iLoop चमकदार सामग्री का इम्यूनोस्टेटिंग: सभी फ्लोरोक्रोम-कंजूग्ड एंटीबॉडी (एफसीबी में 1:50 कमजोर पड़ने) युक्त मिश्रण तैयार करें: एंटी-सीडी 45-परसीपी, एंटी-सीडी 11बी-पीई और एंटी-एलवाई-6जी-एलेक्सा फ्लोर 647। 100 माइक्रोन की अंतिम मात्रा के लिए, प्रति अच्छी तरह से संयोजन के 50 माइक्रोल जोड़ें।
      3. मुआवजे के लिए सफेद रक्त कोशिकाओं का इम्यूनोस्टेटिंग (एफसीबी में 1:50 कमजोर पड़ने): अकेले एफसीबी के 50 माइक्रोन का उपयोग करें (अन दागदार नमूना, अच्छी तरह से 1), प्रत्येक व्यक्ति फ्लोरोक्रोम-कंजूग्ड एंटीबॉडी (वेल्स 2 - 4), सभी फ्लोरोक्रोम-कंजूगेटेड एंटीबॉडी (अच्छी तरह से 5) के संयोजन का 50 माइक्रोन का उपयोग करें। 100 माइक्रोन की अंतिम मात्रा।
      4. प्रकाश से संरक्षित बर्फ पर 30 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
      5. 400 x g,4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए प्लेट को सेंट्रलाइज करें। सुपरनेट को त्यागें और एफसीबी के 200 माइक्रोन के साथ धोएं। इस वाशिंग स्टेप को दो बार दोहराएं।
      6. रक्त के नमूनों में एफसीबी 150 माइक्रोन/वेल जोड़ें।
      7. iLoop ल्यूमिनल कंटेंट सैंपल में 100 μL/well FCB जोड़ें। फिर 50 μL/फ्लोरोसेंट गिनती मोती के कुएं ।
    3. फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण
      1. CD45 सकारात्मक घटनाओं के लिए गेट और Ly-6G की अभिव्यक्ति के लिए-/जीआर-1 और CD11b30।
      2. एक स्टॉप कंडीशन के रूप में नमूना मात्रा के 100 माइक्रोन का उपयोग करें।
      3. फ्लोरोसेंट गिनती मोतियों के निर्माता द्वारा प्रदान की गई जानकारी के बाद iLoop lumen में चले गए है कि पीएमएन की पूर्ण संख्या की गणना करें।
        नोट: डेटा (1) ल्यूमेन30, 34, 35,(2) पीएमएन प्रति ग्राम ऊतक के साथ-साथ (3) प्रति मिमी3 की संख्या में पीएमएन की कुल संख्या के रूप में प्रस्तुत किया जा सकता है, एक सिलेंडर की मात्रा के लिए सूत्र का उपयोग करके: V= π (पीआई) आर 2 एच (वी मात्रा के लिए, त्रिज्या के लिए आर और ऊंचाई के लिए एच)।

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Representative Results

इलियल लूप और पीसीलूप मॉडल का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व क्रमशः चित्र 1 और चित्रा 2 में चित्रित किया गया है। शारीरिक चित्र आंतों के खंड(चित्रा 1 बी और चित्रा 2 बी)के बाहरीकरण सहित प्रक्रिया के महत्वपूर्ण चरणों को प्रदर्शित करते हैं, जो लिगामेंट्स के लिए एक उपयुक्त स्थान की पहचान करते हैं जो रक्त आपूर्ति की न्यूनतम अशांति(चित्र 1C और चित्रा 2C)की अनुमति देता है और इसके बाद iLoop के कट सिरों की लिगेशन की सफाई होती है जिसे रीएजेंट सॉल्यूशन(चित्र 1D और फिगर 2D)से भरा जा सकता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि आईलूप मॉडल महत्वपूर्ण रक्त आपूर्ति को बरकरार रखता है और फिटसी-डेक्सट्रांस या शक्तिशाली पीएमएन केमोएट्रेक्टेंट एलटीबी4जैसे एप्लाइड रिएजेंट्स के शारीरिक अवशोषण की अनुमति देता है। परख के अंत में, आईलूप को फुलाया जाना चाहिए (जैसा कि चित्रा 1D और चित्रा 2Dमें देखा गया है) और उज्ज्वल-लाल मेसेन्टरिक जहाजों के साथ सामान्य म्यूकोसल परफ्यूजन प्रदर्शित करें। परख के आधार पर, सीरम या आईलूप ल्यूमिनल सामग्री में फिटसी-डेक्सट्रान को मापने के लिए रक्त एकत्र किया जाता है, जानवर को इच्छामृत्यु से पहले पीएमएन टीईएम के मात्राकरण के लिए संसाधित किया जाता है।

आंतों की पारिग्रह के मूल्यांकन के लिए आईलूप मॉडल की सटीकता को सत्यापित करने के लिए, वीवो में आंतों के बैरियर फ़ंक्शन के नियमन में टीजे-संबद्ध प्रोटीन जैम-ए की भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए एक फिटसी-डेक्सट्रान पीसीलूप परख का प्रदर्शन किया गया था। ध्यान दें, यह बताया गया है कि जाम-ए की कमी से विट्रो28 में और वीवो29में मौखिक गैवरेज के बाद एपिथेलियल आंतों की पारफलता बढ़ जाती है । इसके साथ ही, पीसीलूप मॉडल का उपयोग करते हुए, 4 केडीए फिटसी-डेक्सट्रान सीरम के स्तर में 2.5 गुना वृद्धि को नियंत्रण (जैम-ए+/+)(चित्रा 3 ए)30की तुलना मेंजाम-ए-नल चूहों (जैम-ए-/-)में निर्धारित किया गया था। इसके अलावा, इसी तरह के परिणाम चूहों के साथ प्राप्त किए गए थे जो आईईटीसी (विल्लिन-क्रे) पर जाम-ए के चयनात्मक नुकसान को शरणदेते थे; जाम-ए fl/fl)लिटरमेट कंट्रोल्स(जैम-ए एफएल/fl)(चित्रा 3B)30की तुलना में । इसलिए, पीसीलूप मॉडल पिछले अध्ययनों की पुष्टि करने में सक्षम था जिसने आंतों के बाधा समारोह में जेएम-ए के लिए सकारात्मक योगदान की सूचना दी है।

फिर पीसीलूप मॉडल को आंतों के म्यूकोसा में पीएमएन भर्ती और बाद में वीवो में टीईपीएम का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया था। जैसा कि चित्रा 4 एमें दिखाया गया है, पीसीलूप की चमकदार सामग्री में पीएमएन की संख्या प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण द्वारा निर्धारित की गई थी। पीएमएन को कोशिका-सतह निर्माताओं CD45, CD11b और Ly6G36में से प्रत्येक के लिए सकारात्मक कोशिकाओं के रूप में परिभाषित किया गया था । परिसंचारी सफेद रक्त कोशिकाओं को गेटिंग रणनीति के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। जैसा कि उम्मीद थी, पीसीलूप के समान समीपस्थ कोलन के एक खंड में मौजूद पीएमएन की संख्या शारीरिक परिस्थितियों(चित्रा 4B) केतहत कम थी। सर्जरी से पहले समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स टीएनएफ α और IFNγ के साथ प्रीट्रीटमेंट के परिणामस्वरूप पीसीलूप ल्यूमेन में भर्ती किए गए पीएमएन की संवर्धित संख्या हुई। पीएमएन केमोएट्रेक्ट एलटीबी4 के प्रशासन ने एलटीबी4-निर्भरपीएमएन भर्ती(चित्रा 4B)का समर्थन करते हुए पीएमएन काउंट में नाटकीय वृद्धि की । कोलोनिक म्यूकोसा में पीएमएन की इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला होने से एलटीबी 4(चित्र 4सी)30के बिना साइटोकिन उपचार की तुलना में साइटोकिन और एलटीबी4 के साथ उत्तेजना के बाद पीएमएन की श्रेष्ठ भर्ती की पुष्टि होती है । पीसीलूप मॉडल को विललिन-क्रे का उपयोग करके पीएमएन टीईएम में जैम-ए के योगदान का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया था; जाम-एक fl/fl चूहों । एपिथेलियल जैम-ए के नुकसान के कारण लिटरमेट कंट्रोल्स(चित्रा 4D)30की तुलना में कोलोनिक ल्यूमेन में ट्रांसल माइग्रेट पीएमएन की संख्या कम हो गई । ये निष्कर्ष आंतों के एपिथेलियम में पीएमएन माइग्रेशन को सुविधाजनक बनाने में जैम-ए की भूमिका का पुरजोर समर्थन करते हैं और उन अध्ययनों को पूरक अंतर्दृष्टि प्रदानकरते हैं जिन्होंने सूजन31, 37,38के विभिन्न मॉडलों में वैस्कुलर एंडोथेलियम में पीएमएन माइग्रेशन में जैम-ए की भागीदारी की सूचना दी है।

Figure 1
चित्रा 1:इलेल लूप मॉडल। (A)इलेल लूप मॉडल का योजनाबद्ध अवलोकन। औसत लेप्रोटॉमी संज्ञाहरण के तहत चूहों पर किया जाता है और तापमान नियंत्रित सर्जरी बोर्ड पर रखा जाता है। (ख)कैटम (*), इलियम और मेसेंडरी का बाहरीकरण । लिगेशन के लिए दो पर्याप्त साइटों की पहचान की जाती है (1,2)। (ग)4 सेमी लंबाई के एक खंड को अलग करें: पहला लिगेचर (1) इलियो-कैलल जंक्शन के करीब रखा गया है और एक दूसरा लिगेचर (2) को पहले लिगेचर से 4 सेमी दूर रखा गया है। (घ)4 सेमी लंबाई का इलेल लूप बनाने के लिए मेसेंट्री (1, 2) में दो छोटे चीरे बनाए जाते हैं। ल्यूमिनल कंटेंट को हटाने और कट-एंड्स के लिगेशन के बाद, फ्लोरोसेंट मार्कर और केमोएट्रेक्ट्स जैसे रिएजेंट्स को ल्यूमेन में इंजेक्ट किया जा सकता है। इलियल लूप अच्छी तरह से संवहनी (काले तीर सिर) है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:समीपस्थ कोलन लूप मॉडल। (A)पीसीलूप मॉडल का योजनाबद्ध अवलोकन। औसत लेप्रोटॉमी एक तापमान नियंत्रित सर्जरी बोर्ड पर रखा संज्ञाहरण के तहत चूहों पर किया जाता है। (ख)कैकम (*), समीपस्थ कोलन, मेसोकोलोन और इलियम का बाहरीकरण। लिगेशन के लिए दो पर्याप्त साइटों की पहचान की जाती है (1,2)। (ग)पहला लिगेचर (1) कैटम के करीब रखा जाता है और एक दूसरा लिगामेंट (2) पहले लिगेचर से 2 सेमी अधिक डिस्टल रखा जाता है । (घ)पीसीलूप बाहरी, चमकदार सामग्री से साफ है और फ्लोरोसेंट मार्कर और केमोएट्रेक्टेंट जैसे अभिवातियों के साथ फुलाया जाता है। पीसीलूप समीपस्थ पेट का एक अच्छी तरह से संवहनी 2 सेमी खंड है (काले तीर सिर रक्त की आपूर्ति का संकेत देते हैं)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:जाम-ए वीवो में आंतों की पारगम्यता को नियंत्रित करता है। (ए)जाम-ए की कमी(जाम-ए-/-)के कारण 4 केडीए फिटसी-डेक्सट्रान में कोलोनिक पारगम्यता बढ़ गई । जैम-ए-/-(13x जानवर; ब्लैक डॉट्स) की तुलना जैम-ए+/+ कंट्रोल्स (12x जानवरों; वाइट डॉट्स) से की गई । एचबीएसएस में 4 केडीए फिटसी-डेक्सट्रान (1 मिलीग्राम/एमएल) को पीसीलूप ल्यूमेन में इंजेक्ट किया गया । फ्लोरेसेंस को १२० मिनट इनक्यूबेशन अवधि के बाद रक्त सीरम में मापा गया था । डेटा एसईएम के साधन के रूप में व्यक्त ± हैं; n = 3 स्वतंत्र प्रयोग। ****P < 0.0001; मान-व्हिटनी यू टेस्ट । (ख)विललिन-क्रे में 4 केडीए फिटसी-डेक्सटरन में कॉलोनिक पारगम्यता में वृद्धि; जाम-एfl/fl (18x जानवर, काले डॉट्स) नियंत्रण की तुलना में(जाम-एकfl/fl,12x जानवरों, सफेद डॉट्स) । डेटा एसईएम ± मतलब है; n = 4 स्वतंत्र प्रयोग। ****P < 0.0001; मान-व्हिटनी यू टेस्ट । इस आंकड़े को फ्लेमिंग एस, लुइसिंट एसी एट अल30से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:जाम-ए पीसीलूप के ल्यूमेन में पीएमएन की एलटीबी4-निर्भर भर्ती को बढ़ावा देता है। (A)फ्लोरोसेंट काउंटिंग मोतियों के साथ फ्लो साइटोमेट्री द्वारा ल्यूमिनल कंटेंट में पीएमएन (सीडी 45+, सीडी 11बी+, और एलवाई-6जी/जीआर1+ सेल्स) की मात्रा निर्धारित करने के लिए गेटिंग स्ट्रैटजी । रक्त के नमूनों से ल्यूकोसाइट्स का उपयोग गेटिंग रणनीति के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जाता था। (ख)साइटोकिन (TNfα+IFNγ, 100ng प्रत्येक) उपचार (10x पशु; सफेद डॉट्स) या साइटोकिन्स और 1 एनएम एलटीबी4 (10x जानवरों; काले डॉट्स) के संयोजन के बाद पीसीलूप ल्यूमेन में भर्ती पीएमएन की संख्या । काले वर्ग बेसलाइन पर पीएमएन की संख्या का प्रतिनिधित्व करते हैं जैसा कि पीसीलूप के लिए लंबाई में समान एक अक्षुण्ण उपनिवेश खंड में मूल्यांकन किया जाता है जो प्रोइनफ्लेमेटरी साइटोकिन्स और एलटीबी4 (9x जानवरों) के साथ किसी भी सर्जरी या उपचार के अधीन नहीं था। डेटा का मतलब है ± एसईएम(एन = 3 स्वतंत्र प्रयोग), डन के कई तुलना परीक्षण के साथ क्रुस्कल-वालिस परीक्षण। * पी < 0.05, *****P < 0.0001. (C)अकेले साइटोकिन्स (बाएं पैनल, TNFα + IFNγ) या साइटोकिन्स और एलटीबी 4 (दाएं पैनल) के संयोजन के साथ उपचार के बाद पीसीलूप के एपिथेलियम में पीएमएन (एंटी-Ly6G/Gr1 एंटीबॉडी) का इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला । पीसीलूप में भर्ती होने वाले पीएमएन की संख्या एलटीबी4 (ब्लैक एरोहेड) की मौजूदगी में बढ़ाई जाती है। स्केल बार: 100 माइक्रोन(D)विललिन-क्रे में पीसीलूप ल्यूमेन में भर्ती किए गए पीएमएन की संख्या; 1 एनएम एलटीबी4के जवाब में जैम-ए एफएल/एफएल चूहों (11x जानवर; ब्लैक डॉट्स) की तुलना में जैम-एएफएल/एफएल चूहों (10x जानवर; सफेद डॉट्स) की तुलना में । डेटा एसईएम ± मतलब है; n = 3 स्वतंत्र प्रयोग। * पी < 0.05; 2-पूंछ छात्र टी परीक्षण । इस आंकड़े को फ्लेमिंग एस, लुइसिंट एसी एट अल30से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

आईबीडी जैसी रोगजनक परिस्थितियों में आंतों के बैरियर फंक्शन और प्रतिरक्षा सेल भर्ती के डिस्रेगुलेशन के लिए जिम्मेदार तंत्र को अधूरा समझ में आ जाता है। यहां, हम वीवो मुरीन मॉडल में एक मजबूत विस्तार करते हैं जो इलियम या समीपस्थ पेट के एक अच्छी तरह से संवहनी बाहरी आंतों के खंड को नियोजित करता है और आंतों की पारिरोधीता, न्यूट्रोफिल माइग्रेशन अध्ययनों के साथ-साथ अन्य अनुप्रयोगों के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है।

iLoop एक गैर-वसूली सर्जरी है जो जीवित जानवरों पर की जाती है। एनेस्थीसिया लगातार प्रयोग के दौरान निगरानी की जानी चाहिए और sedation की गहराई का मूल्यांकन अनिवार्य है। सबसे महत्वपूर्ण चरणों में (1) iLoop के अलगाव, (2) कटौती समाप्त होता है और, (3) अभिकर्षक समाधान के इंट्राल्यूमिनल इंजेक्शन द्वारा iLoop की मुद्रास्फीति शामिल हैं । इन चरणों में से प्रत्येक में, रक्तस्राव हो सकता है, iLoop की रक्त आपूर्ति से समझौता और परिणामों की सटीकता को प्रभावित कर सकता है। ध्यान दें, पीएमएन टीईएम परख के दौरान इंट्राल्यूमिनल रक्तस्राव के दुर्लभ उदाहरणों में, यहां प्रस्तुत प्रवाह साइटोमेट्री गेटिंग रणनीति रक्त प्रवाह (गैर-माइग्रेट पीएमएन) से सीधे उत्पन्न होने वाले पीएमएन से स्थानांतरित पीएमएन को अलग करने में मदद करेगी। आईलूप ल्यूमेन में एकत्र किए गए ट्रांसल माइग्रेट पीएमएन ने पीएमएन(चित्रा 4डी)की तुलना में सतह मार्कर सीडी11बी 10 के उच्च स्तर को व्यक्त किया।

यह देखते हुए कि iLoop आंतों की पारियता और आंतों के ल्यूमेन में रक्त पीएमएन के प्रवास के मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है, अवशोषित म्यूकोसल क्षेत्र और रक्त की आपूर्ति के आकार को मानकीकृत करना महत्वपूर्ण है। जानवरों के बीच स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए, यह आवश्यक है कि आंतों के खंड की सही लंबाई बाहरी है। आईलूप इलियल लूप के लिए 4 सेमी और पीसीलूप के लिए 2 सेमी होना चाहिए और तुलनीय रक्त आपूर्ति से परफ्यूज होना चाहिए। इन मापदंडों में विसंगति के परिणामस्वरूप अभिकर्षकों के इंट्राल्यूमिनल इंजेक्शन के बाद आईलूप का असमान विघटन होगा और परिवर्तनशीलता अंतर और प्रायोगिक समूहों के बीच वृद्धि होगी । इसके अलावा, आईलूप के अधिक तनाव से बचने के लिए, हम अनुशंसा करते हैं कि इलियल लूप के लिए ल्यूमेन में 250 से अधिक μL और पीसीलूप के लिए क्रमशः 200 माइक्रोन इंजेक्शन नहीं दिया जाए।

प्रक्रिया की प्रकृति के साथ निहित कुछ सीमाएं हैं। iLoop एक गैर-वसूली सर्जरी है जो जीवित जानवरों पर की जाती है। यह एक तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण माइक्रोसर्जिकल विधि है; हालांकि, कार्मिक अभ्यास के माध्यम से शल्य चिकित्सा कौशल प्राप्त कर सकते हैं। सर्जरी की औसत अवधि कम (अधिकतम 15 मिनट) होनी चाहिए। हम आंतों की पारिम्यता को मापने के लिए एक आदर्श इनक्यूबेशन समय के रूप में 120 मिनट और पीएमएन टीईएम के लिए 60 मिनट की सलाह देते हैं। इनक्यूबेशन समय को कम किया जा सकता है, लेकिन विस्तारित टाइमपॉइंट संज्ञाहरण के तहत जानवर की समग्र भड़काऊ स्थिति को प्रभावित कर सकते हैं। इसके अलावा, शल्य चिकित्सा प्रक्रिया की शुरुआत से नमूना संग्रह/विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल को रोका नहीं जा सकता है ।

यह iLoop मॉडल मौजूदा तरीकों के संबंध में महत्वपूर्ण लाभ प्रस्तुत करता है: (1) iLoop पूरी तरह से संवहनी है और अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक है, (2) मौखिक गैवेज विधि के विपरीत जो समग्र गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट अखंडता का आकलन करता है और गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल मोटिविटी13पर निर्भर करता है, आईलूप आंत में विशिष्ट स्थानीयकृत क्षेत्रों के गुणों का अध्ययन करने की अनुमति देता है (टर्मिनल इलियम या समीपस्थ कोलन) जो आमतौर पर आईबीडी में शामिल होते हैं, (3) आईलूप वीवो मॉडल में पहला है जो पीएमएन टीईएम के मात्रात्मक अध्ययन को आंत ल्यूमेन के साथ-साथ आंतों के म्यूकोसा के अन्य हिस्सों में अनुमति देता है, जिसमें लैमिना प्रोप्रिया और एपिथेलियल गुट30,35शामिल हैं। उच्च बनाम कम आणविक वजन फिटक-लेबल डेक्सट्रांस (4 से 150 केडीए) को नियोजित करना संभव है ताकि नॉकआउट/नॉकआउट में चूहों या विभिन्न प्रायोगिक मॉडलों में एपिथेलियल बैरियर दोषों की गंभीरता दोनों का मूल्यांकन किया जा सके, लेकिन आंतों की सूजन तक सीमित नहीं है । इसके अलावा फिटसी-लेबल वाले डेक्सट्रांस को अन्य अंगों जैसे यकृत39 में या रक्त मस्तिष्क बाधा के अध्ययन के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण के रूप में निर्धारित किया जा सकता है जो आंत-यकृत और आंत-मस्तिष्क कुल्हाड़ियों40,41, 42में आंतों की पारगम्यता की भूमिका में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। इसके अलावा, यह विधि समानांतर (एक ही जानवर में इलियल लूप और पीसीलूप) में दो छोरों का प्रदर्शन करने की संभावना प्रदान करती है और आंत में अलग-अलग क्षेत्रों में बाधा गुणों के विश्लेषण के लिए दो अलग-अलग फ्लोरोसेंट लेबल वाली जांच पैदा करती है। इसी तरह की लाइनों के साथ, समानांतर में दो छोरों की पीढ़ी को विशेष रूप से एक ही अभिकर्मक के जवाब में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती में मतभेदों या समानताओं के लिए ileum बनाम पेट का मूल्यांकन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है ।

यहां, जैम-ए-नलचूहों या चूहों के साथ पीसीलूप का उपयोग करके आईईटीसी (विललिन-क्रे) पर जाम-ए के चयनात्मक नुकसान को शरणदेकर; जाम-ए fl/fl),हम पिछले अध्ययनों से निष्कर्षों की पुष्टि करते हैं जिन्होंने आंतों की पारिम्यता और पीएमएन टीईएम में टीजे से जुड़े प्रोटीन जैम-ए के लिए सकारात्मक भूमिका की सूचना दी है । आईलूप के अनुप्रयोगों को एंटीबॉडी, माइक्रोबियल रोगजनकों और चिकित्सीय दवाओं30, 34,35सहित विभिन्न अभिकर्षकों में विस्तारित किया जा सकता है। ध्यान दें, हमने एलटीबी4 (336.5 डीए) का उपयोग पीएमएन ईपीएम मॉडल के लिए किया, यह देखते हुए कि यह एक अच्छी तरह से स्वीकार्य शक्तिशाली और शारीरिक पीएमएन कीमोएट्रेक्ट है और फिजियोलॉजिकल रेंज में कम सांद्रता (1 एनएम) पर टीईएम को प्रेरित करने की क्षमता है। हालांकि, हमारा लूप मॉडल अन्य प्रासंगिक केमोएट्रेक्टास्ट्स के अनुकूल है। हमने कॉलोनिक ल्यूमेन30में पीएमएन की महत्वपूर्ण भर्ती को प्रेरित करने के लिए बैक्टीरियल पेप्टाइड एन-फॉर्माइल-मिथियोनाइल-ल्यूकिल-फेनिलैनिन (एफएमएलएफ) के उपयोग की सूचना दी है । टीएमएलएफ (437.5 डीए) चूहों में एक कम आत्मीयता रसायन है जिसके लिए प्रभावी (1μM) होने के लिए बहुत अधिक सांद्रता की आवश्यकता होती है। यह मॉडल CXCL1/KC के उपयोग के लिए अनुकूलनीय है, एक और शक्तिशाली फिजियोलॉजिकल रसायनोएट्रेक्ट्ट जिसे हमने सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया है, फिर भी CXCL1/KC महंगा है और एक अपेक्षाकृत बड़ा अणु (11 केडीए) जो एपिथेलियल बैरियर को पार करने में कम कुशल है । हमने यह भी प्रदर्शित किया है कि ल्यूकोसाइट-विशिष्ट इंटीग्रिन CD11b/CD18 (αMο2) के खिलाफ एंटीबॉडी को बेअसर करना जो केमोएट्रेक्टेंट एलटीबी4 के लूप ल्यूमेन पूर्व प्रशासन में इंजेक्ट किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप विट्रो अध्ययन10, 30,35से पीएमएन टीईपीएम पुष्टि परिणाम कम हो गए। इसके अलावा, पीसीलूप को हाल ही में पीएमएन टीईपीएम43की दर को नियंत्रित करने में पीएमएन बनाम एपिथेलिल ग्लाइकन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया था। केमोटाक्ट्रेटेंट एलटीबी4के पूर्व प्रशासन पीसीलूप ल्यूमेन में रिएजेंट्स इंजेक्ट किए गए थे। इसलिए, अनुप्रयोगों के अपने व्यापक स्पेक्ट्रम के साथ, iLoop पूरक और इन विट्रो परख के माध्यम से प्राप्त निष्कर्षों की पुष्टि कर सकते हैं । लिलेटेड आंतों के लूप का उपयोग दूसरों द्वारा बैक्टीरियल संक्रमण (जैसे साल्मोनेला, एल मोनोसाइटोजीन और ई कोलाई)का अध्ययन करने के लिए भी किया गया है, इसलिए हम मानते हैं कि इस iLoop मॉडल की अनुकूलनशीलता में आसानी का उपयोग इन अध्ययनों के लिए भी किया जा सकता है।

समर्थक भड़काऊ प्रतिरक्षा मध्यस्थों के साथ उपचार के बाद, iLoop आंतों की सूजन के एक तीव्र मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, आईलूप इंट्राल्यूमिनल रोगजनकों के संपर्क में आने के बाद या पुरानी भड़काऊ प्रयोगात्मक मॉडल में बढ़ी हुई आंतों की पारगम्यता और प्रतिरक्षा कोशिका भर्ती के बीच लिंक को स्पष्ट करने वाले अध्ययनों को सक्षम कर सकता है। नोट की, हमने हाल ही में पीसीलूप मॉडल को नियोजित करके देखा है कि प्रोइनफ्लेमेटरी साइटोकिन्स टीएनएफवाई और IFNγ (प्रत्येक का 1 मिलीग्राम) आंतों की पैरासेलुलर पारगम्यता 4 केडीए एफटीसी-डेक्सट्रान की उच्च खुराक के जवाबमें कम खुराक (100 3 के 100 ng) की तुलना में एलटीबी4 के जवाब में पीसीलूप ल्यूमेन में पीएमएन भर्ती हुई। दिलचस्प बात यह है कि यहां हम बताते हैं कि जाम के लिए माध्यमिक पारफल पारंथीयता में वृद्धि-एक कमी बढ़ी हुई PMN TEpM के लिए नेतृत्व नहीं किया, लेकिन यह कम । इन परिणामों से पता चलता है कि आंतों की पैरासेलुलर पारिधि पीएमएन टीईएमएम की दर को प्रभावित करती है लेकिन सहसंबंध प्रत्यक्ष नहीं है और आसंजन अणुओं की अभिव्यक्ति (जैम-ए के समान) जैसे कारकों पर निर्भर करता है जो एपिथेलियल बैरियर फंक्शन और ल्यूकोसिट माइग्रेशन16दोनों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । आंतों के एपिथेलियम द्वारा प्रतिरक्षा कोशिका प्रतिक्रियाओं की ठीक ट्यूनिंग की जांच करने के लिए भविष्य के अध्ययनों की आवश्यकता होती है, और भड़काऊ आंत्र रोग जैसे पैथोलॉजिक म्यूकोसल सूजन में योगदान होता है।

अंत में, iLoop मॉडल वीवो में आंतों की पारिम्यता और पीएमएन टीईएम के आकलन के लिए मौजूदा दृष्टिकोणों में एक बड़ा सुधार प्रदान करता है जो आंतों की सूजन और आईबीडी के नियमन में अंतर्निहित तंत्र को समझने में काफी सहायता करेगा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों ने वूर्जबर्ग विश्वविद्यालय के डॉ स्वेन फ्लेमिंग को समीपस्थ पेट लूप मॉडल की स्थापना में उनके योगदान के लिए धन्यवाद दिया, माउस उपनिवेशों के प्रबंधन के लिए शॉन वाटसन और चिथरा के मुरम्लेधरन ने आईलूप मॉडल के चित्रों के अधिग्रहण में मदद करने के लिए । इस काम को जर्मन रिसर्च फाउंडेशन/डीएफजी (बीओ 5776/2-1) से केबी, R01DK079392, R01DK072564, और R01DK061379 से C.A.P.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment and Material
BD Alcohol Swabs BD 326895
BD PrecisionGlide Needle, 25G X 5/8" BD 305122
BD PrecisionGlide Needle, 30G X 1/2" BD 305106
BD 1ml Tuberculin Syringe Without Needle BD 309659
15ml Centrifuge Tube Corning 14-959-53A
Corning 96-Well Solid Black Polystyrene Microplate FisherScientific 07-200-592
Corning Non-treated Culture Dish, 10cm MilliporeSigma CLS430588
Cotton Tip Applicator (cotton swab), 6", sterile FisherScientific 25806 2WC
Dynarex Cotton Filled Gauze Sponges, Non-Sterile, 2" x 2" Medex 3249-1
EZ-7000 anesthesia vaporizer (Classic System, including heating units) E-Z Systems EZ-7000
Falcon Centrifuge Tube 50ml  VWR 21008-940
Fisherbrand Colored Labeling Tape FisherScientific 15-901-10R
Halsey Needle Holder (needle holder)  FST 12001-13
Kimwipes, small (tissue wipe) FisherScientific 06-666
1.7ml Microcentrifuge Tubes  Thomas Scientific  c2170
Micro Tube 1.3ml Z (serum clot activator tube) Sarstedt  41.1501.105
Moria Fine Scissors FST 14370-22
5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap (35 µm nylon mesh) Falcon 352235
Puralube Vet Ointment, Sterile Ocular Lubricant Dechra 12920060
Ring Forceps (blunt tissue forceps) FST 11103-09
Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YD FisherScientific NC9452680
Semken Forceps (anatomical forceps) FST 1108-13
Sofsilk Nonabsorbable Coated Black Suture Braided Silk Size 3-0, 18", Needle 19mm length 3/8 circle reverse cutting  HenrySchein SS694
Student Fine Forceps, Angled FST 91110-10
10ml Syringe PP/PE without needle Millipore Sigma  Z248029
96 Well Cell Culture Plate Corning 3799
Yellow Feeding Tubes for Rodents 20G x 30 mm Instech FTP-20-30
Solutions and Buffers
Accugene 0.5M EDTA Lonza 51201
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer BioWhittaker 10-548E
Hanks' Balanced Salt Solution Corning 21-023-CV
Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium Corning 21-040-CV
Reagents
Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Antibody (1A8) BioLegend 127610
CD11b Monoclonal Antibody, PE, eBioscience (M1/70) ThermoFisher 12-0112-81
CountBright Absolute Counting Beads Invitrogen C36950
Dithiotreitol FisherScientific BP172-5
Fetal Bovine Serum, heat inactivated R&D Systems 511550
Fluorescein Isothiocyanate-Dextran, average molecular weight 4.000 Sigma 60842-46-8
Isoflurane Halocarbon 12164-002-25
Leukotriene B4 Millipore Sigma 71160-24-2
PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11) BD Pharmingen 557235
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD FC Block) BD Bioscience 553142
Recombinant Murine IFN-γ Peprotech 315-05
Recombinant Murine TNF-α Peprotech 315-01A

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Boerner, K., Luissint, A. C., Parkos, C. A. Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model. J. Vis. Exp. (168), e62093, doi:10.3791/62093 (2021).

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