Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Funktionel vurdering af tarmgennemtrængelighed og neutrofil transepithelial migration hos mus ved hjælp af en standardiseret tarmsløjfemodel

Published: February 11, 2021 doi: 10.3791/62093
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pathology, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Dysreguleret tarmepitele barrierefunktion og immunrespons er kendetegnende for inflammatorisk tarmsygdom, der forbliver dårligt undersøgt på grund af mangel på fysiologiske modeller. Her beskriver vi en museintestinale loop-model, der anvender et godt vaskulært og eksteriøriseret tarmsegment til at studere slimhindegennemtrængelighed og leukocytrekruttering in vivo.

Abstract

Tarmslimhinden er foret med et enkelt lag epitelceller, der danner en dynamisk barriere, der tillader paracellulær transport af næringsstoffer og vand, samtidig med at passage af luminale bakterier og eksogene stoffer forhindres. Et brud på dette lag resulterer i øget permeabilitet til luminalt indhold og rekruttering af immunceller, som begge er kendetegnende for patologiske tilstande i tarmen, herunder inflammatorisk tarmsygdom (IBD).

Mekanismer, der regulerer epitelbarrierefunktion og transepithelial migration (TEpM) af polymorphonuclear neutrofiler (PMN), forstås ufuldstændigt på grund af manglen på eksperimentelle in vivo-metoder, der muliggør kvantitative analyser. Her beskriver vi en robust murine eksperimentel model, der anvender en udvendig tarmsegment af enten ileum eller proksimal tyktarm. Den eksektiserede tarmsløjfe (iLoop) er fuldt vaskulær og giver fysiologiske fordele i forhold til ex vivo kammerbaserede tilgange, der almindeligvis anvendes til at studere permeabilitet og PMN-migration på tværs af epitelcellemonomerer.

Vi demonstrerer to anvendelser af denne model i detaljer: (1) kvantitativ måling af tarmgennemtrængelighed gennem påvisning af fluorescensmærket dextrans i serum efter intraluminale injektioner, (2) kvantitativ vurdering af migreret PMN over tarmepitelet i tarmen efter intraluminale indførelse af kemoattratanter. Vi demonstrerer gennemførligheden af denne model og giver resultater ved hjælp af iLoop i mus, der mangler det epiteltheliale stramme krydsrelaterede protein JAM-A sammenlignet med kontroller. JAM-A har vist sig at regulere epitel barriere funktion samt PMN TEpM under inflammatoriske reaktioner. Vores resultater ved hjælp af iLoop bekræfter tidligere undersøgelser og fremhæver vigtigheden af JAM-A i reguleringen af tarm permeabilitet og PMN TEpM in vivo under homøostase og sygdom.

ILoop-modellen giver en meget standardiseret metode til reproducerbare in vivo-undersøgelser af tarmhomøostase og betændelse og vil forbedre forståelsen af tarmbarrierefunktion og slimhindebetændelse i sygdomme som IBD betydeligt.

Introduction

Tarmslimhinden omfatter et enkelt lag af columnar tarmepitele celler (IECs), underliggende lamina propria immunceller og muscularis slimhinden. Udover sin rolle i absorptionen af næringsstoffer er tarmepitelet en fysisk barriere, der beskytter kroppens indre mod lysmæssige commensale bakterier, patogener og diætantigener. Derudover koordinerer IIC'er og lamina propria immunceller immunresponset, der fremkalder enten tolerance eller respons afhængigt af konteksten og stimuli. Det er blevet rapporteret, at forstyrrelsen af epitelbarrieren kan gå forud for starten af patologisk slimhindebetændelse og bidrage til inflammatorisk tarmsygdom (IBD), der omfatter både colitis ulcerosa og Crohns sygdom1, 2,3,4,5,6,7. Personer med colitis ulcerosa udgør overdreven transepithelial migration (TEpM) af polymorphonuclear neutrofiler (PMN), der danner krypt abscesser, et fund, der har været forbundet med sværhedsgraden af sygdom8,9. Selv om kompromitteret epitel barriere funktion og overdreven immunrespons er kendetegnende for IBD, der er en mangel på eksperimentelle in vivo assays til at udføre kvantitative vurderinger af tarm permeabilitet og immuncelle rekruttering i tarmslimhinden.

De mest almindelige metoder til undersøgelse af tarmepitelet permeabilitet og PMN TEpM anvender ex vivo kammerbaserede metoder ved hjælp af IEC monolayers dyrket på semi-gennemtrængelige porøse membranindsatser10,11,12. Epitelbarrierens integritet overvåges enten ved målinger af transepithelial elektrisk modstand (TEER) eller fluorescein isothiocyanat (FITC) mærket dextran fra apikale til basale rum13,14,15. Tilsvarende er PMN TEpM typisk undersøgt som reaktion på en kemoattratant, der tilsættes i det nederste kammer16. PMN placeres i det øverste kammer, og efter en inkubationsperiode opsamles og kvantificeres PMN, der er migreret ind i det basale rum. Selv om disse metoder er nyttige, lette at udføre og meget reproducerbare, er de naturligvis reduktionistiske tilgange og repræsenterer ikke nødvendigvis en nøjagtig afspejling af in vivo-forholdene.

Hos mus er en almindelig analyse til undersøgelse af tarmparacellulær permeabilitet ved oral sonde af FITC-dextran og efterfølgende måling af FITC-dextran udseende i blodserummet13,17. Ulempen ved denne analyse er, at den repræsenterer en vurdering af gastrointestinale tarmkanalens overordnede barriereintegritet snarere end af regionale tarmbidrag. Derudover er Evans blå almindeligt anvendt til at evaluere vaskulær lækage in vivo18 og har også været ansat til at evaluere tarmslimhindepermeabilitet hos mus og rotte19,20,21. Kvantificeringen af Evans blå i tarmslimhinden kræver ekstraktion fra væv, der anvender inkubation i formamid natten over. Derfor kan det samme væv ikke bruges til at studere tarmepitelelengerbarhed og neutrofil infiltration.

Her fremhæver vi en simpel protokol, der reducerer antallet af dyr, der er nødvendige for at indsamle reproducerbare data om colon slimhindegennemtrængelighed og leukocyttransepithelial migration in vivo. Vi anbefaler derfor brugen af FITC-dextrans, der let kan påvises i blodserum uden at gå på kompromis med integriteten af tarmsløjfer, som kan høstes til yderligere analyse. Det skal bemærkes, at tarmlakerede sløjfer er blevet anvendt i forskellige arter (herunder mus, rotter, kaniner, kalve) til undersøgelse af bakteriel infektion (såsom Salmonella, Listeria monocytogenes og Escherichia coli)22,23,24,25 samt tarmgennemtrængelighed26; Men så vidt vi ved, er der ingen undersøgelser, der undersøger mekanismer af PMN TEpM i specifikke regioner i tarmen, såsom ileum eller tyktarm, der er almindeligt involveret i IBD.

Her beskriver vi musens tarmsløjfe (iLoop) model, der er en robust og pålidelig mikrokirurgisk in vivo-metode, der anvender et godt vaskulært og udvendigt tarmsegment af enten ileum eller proksimal tyktarm. iLoop-modellen er fysiologisk relevant og gør det muligt at vurdere tarmbarrierens integritet og PMN TEpM på levende mus under anæstesi. Vi demonstrerer to anvendelser: 1) kvantificering af serumniveauer på 4 kDa FITC-dextran efter intraluminale administration i iLoop 2) kvantificering af transmigreret PMN i iLoop lumen efter intraluminale injektion af potente chemottractant Leukotriene B4 (LTB4)27. Desuden udnytter iLoop-modellen med Jam-a-nullmus eller mus, der huser selektivt tab af JAM-A på IECs (Villin-cre; Jam-a fl/fl) sammenlignet med kontrolmus er vi i stand til at bekræfte tidligere undersøgelser, der har rapporteret et stort bidrag til stramt krydsrelateret protein JAM-A til tarmgennemtrængelighed og neutrofil transmigration15,28,29,30,31.

iLoop-modellen er en yderst funktionel og fysiologisk metode, der kan bruges til at bekræfte in vitro-assays. Desuden er dette en alsidig eksperimentel model, der gør det muligt at studere forskellige reagenser, der kan injiceres i løkken lumen, herunder kemokiner, cytokiner, bakterielle patogener, toksiner, antistoffer og terapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne og politikkerne fra National Institutes of Health og godkendt af Institutional Animal Care &use Committee ved University of Michigan.

1. Præoperativ forberedelse

BEMÆRK: Denne metode blev genereret beskæftiger voksne mus fra C57BL / 6 genetisk baggrund, i alderen 8 - 12 uger. Alle mus blev holdt under strenge specifikke patogenfrie forhold med ad libitum adgang til normal chow og vand. Resultaterne blev opnået ved hjælp af C57BL/6, Jam-a - null mus (Jam-a-/-) eller mus, der huser selektivt tab af JAM-A på IECs (Villin-cre; Jam-afl/fl) og littermate Jam-afl/fl controls som tidligere beskrevet30.

  1. Forberedelse af områder
    1. Udfør kirurgi i rent område. Tarm loop-modellen er imidlertid en ikke-overlevelsesoperation, der ikke kræver aseptisk / steril teknik. Overhold veterinær sanitetspraksis, og brug rensede kirurgiske instrumenter (dvs. skrubbes med sæbe, skylles med vand efterfulgt af 70% ethanol).
    2. Tænd en temperatur-kontrolleret kirurgisk bord (eller varmepuder) og tilpasset lyskilde til at holde dyret fra hypotermi under anæstesi og kirurgi.
    3. Forbered ligaturer ved at skære 6 cm segmenter af ikke-absorberbare 4-0 silke kirurgiske suturer.
    4. Forbered bomuldsgasser (5 cm x 5 cm), der skæres i midten efter en ellipsoidform. Disse vil blive brugt til at dække midline laparotomi og forhindre direkte kontakt mellem den eksteriøriserede iLoop og dyreskind. Skær gazerne i den varme Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) i en petriskålsbeholder.
    5. Forbered våde vatpinde gennemblødt i varm HBSS, der vil blive brugt til at håndtere organer og eksteriør iLoop.
    6. Forbered 10 mL sprøjte fyldt med varm HBSS og fastgøres til et gult fodringsrør. Denne sprøjte vil blive brugt til fugtgivende eksponerede væv under operationen og til forsigtigt at skylle iLoop af fækalt indhold.
  2. Tilberedning af dyr
    1. Bedøve dyret i overensstemmelse med den godkendte dyreprotokol. I denne protokol en blanding af isoflurane og ilt administreres gennem en anæstesi vaporizer. Ifølge producentens anvisninger skal iltstrømshastigheden justeres til 1 L/min. Indstil fordamperen til 5% og forudoplad induktionskammeret. Efter 5 min skal isoflurane vaporizer reduceres til 2% - 2,5%.
    2. Placer dyret i induktionskammeret i 3 min - 5 minutter, overfør derefter dyr til et opvarmet kirurgibræt og tilslut et anæstesi nosecone-stik. Restrain dyret i liggende stilling af de fire lemmer ved hjælp af tape.
      BEMÆRK: Som anæstesialternativ kan en blanding af ketamin (80 mg/kg - 100 mg/kg) og xylazin (5 mg/kg - 10 mg/kg) fortyndet i saltvandsopløsning (0,9% NaCl) administreres ved intraperitoneal injektion. Anæstesi bør opretholdes under hele operationen ved intramuskulær administration af ketamin/xylazin (ved 0,1 - 0,25 gange indledende doser) for at sikre bedøvelsesdybde. Hvis det er muligt, anbefales en isoflurane anæstesi vaporizer stærkt for at sikre bedre reproducerbarhed, overlevelsesevne og forhindre dyresmerter.
    3. Påfør oftalmisk salve på begge øjne for at forhindre hornhindeaftørring.
    4. Udfør en fysisk eksamen, der inkluderer puls (ca. 500 slag/min.) og rytme, slimhindefarve (pink), kapillærpåfyldningstid (< 2 s), åndedrætsfrekvens (ikke lavere end 40 - 60 vejrtrækninger/min. ) og temperatur (36,5 °C)32.
    5. Før du går videre til de næste trin, vurdere bedøvelsesdybden ved pedal tilbagetrækning refleks. Ansætte en smertefuld stimulus (knivspids) af huden mellem tæerne og / eller tå puder. Musen vil reagere ved at indgå kontrakter og fjerne sit ben. Denne pedalrefleks forsvinder, når dyret bedøves dybt.
      BEMÆRK: Overvågning af vitale og pedalrefleks anbefales i hele anæstesi på mindst hver 15 min. Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) retningslinjer for evaluering af anæstesi dybde anbefaler overvågning af følgende: (a) farve hale, fod og slimhinde (såsom tunge). Farve pink som normalt og bleg eller blå som tegn på nedsat blodtransfusion eller åndedrætsbesvær; b) vurdering af åndedrætsmønsteret som regelmæssige kontra uregelmæssige vejrtrækninger. En rektal temperatur sonde, gnaver oximeter og pulsmålere kan bruges til vurdering af kropstemperatur, hjerte og åndedrætsfrekvenser, hhv.

2. Generering af ileal-sløjfen

  1. Hud forberedelse: Scrub pels af abdominal midterlinjen med alkohol podninger eller gaze svamp gennemblødt med 70% ethanol. Våd ikke et stort område af pels med alkohol for at forhindre hypotermi.
  2. Brug saks, udføre en midline laparotomi. Lav et lodret snit i midten af maven (ca. 2 cm i længden) og udsæt peritoneum. Pas på ikke at skade intra-abdominal organer.
  3. Placer forskåret våd bomuldsgas over det udsatte intra-bughule.
  4. Brug våde vatpinde til at mobilisere og eksteriør caecum. Placer forsigtigt caecum på den våde bomuldsgas.
    BEMÆRK: Caecum er lokaliseret i venstre kaudale kvadrant af bughulen i et flertal af mus uafhængigt af dyrets køn.
  5. Brug våde vatpinde til at mobilisere og forsigtigt udvendiggøre det ileum, som terminalsektionen (distal ende) er fastgjort til caecum(Figur 1B).
  6. Der indsættes mindst 6 cm terminal ileum på den våde bomuldsgas uden afbrydelse af de mesenteriske kar og blodforsyningen. Blodforsyningen opretholdes, hvis der ikke er blødning, og vævet bevarer sin lyserøde farve(Figur 1B).
    BEMÆRK: Undgå tørring af eksponeret væv ved at opretholde væv, der til enhver tid er fugtige, med varm HBSS (hver 2- 3 min.) ved hjælp af 10 mL sprøjte fastgjort til et gult påføringsrør (trin 1.1.6).
  7. Tæt på caecum, identificere de store arterie leverer ileum i mesenteriet. Find derefter to ligationssteder i mesenteriet, der er fri for kritiske blodkar.
  8. Brug stumpe væv pincet, fast fat i terminalen ileum (tættest på caecum) og ved hjælp af fine spids pincet, fenestrate mesenteriet undgå blodkar. Placer silke sutur på tværs af perforering og binde en kirurgisk knude til at skabe den første ligation (distal ende af løkken).
  9. Brug linealen til at måle 4 cm væk fra den første ligatur og oprette den anden ligatur (proksimal ende af løkken) som nævnt i trin 2.8 (Figur 1C).
  10. Med fin saks skæres forsigtigt ved siden af hver ligation for at isolere den 4 cm ileal loop, holde intakt blodforsyning og mesenterisk membran.
    BEMÆRK: Afskær begge ender af det udvendige segment af iLoop, og skyl derefter forsigtigt som et nødvendigt skridt, der forhindrer interferens med lysstyrkeindhold (fækalt stof), hvilket letter jævn spredning af FITC-dextrans eller kemotaktiske stimuli over hele længden af det isolerede segment samt giver mulighed for mere præcis kvantificering af leukocytter ved flowcytometry. Denne procedure giver også mulighed for ensartet distension af slimhinden efter injektion af bestemte mængder reagens og bedre reproducerbarhed mellem dyr.
  11. Skyl forsigtigt indholdet af ileal loop-segmentet med varmt HBSS ved hjælp af et fleksibelt gult fodringsrør fastgjort til en 10 mL sprøjte (se trin 1.1.6).
  12. Ligate de to afskårne ender af den skyllede ileal loop ved hjælp af silke sutur.
  13. Brug en 1 mL sprøjte med 30 G nål til langsomt at injicere 250 μL reagens såsom FITC-dextrans (trin 4.2) eller kemokin (trin 5.3) i tarm lumen. Ileal-løkken pustes op, hvilket forårsager en moderat udspiling af slimhinden (Figur 1D).
    BEMÆRK: Injicer reagens i løkken lumen på den modsatte side af mesentere arterien. Pas på ikke at trække ilealsløjfen ud af dyret, mens du injicerer for at undgå at rive blodkarrene og fremkalde blødning.
  14. Brug våde vatpinde, forsigtigt sætte tilbage ileal loop, proksimal ileum og caecum.
  15. Brug en nåleholder, anatomiske pincet og 3,0 ikke-absorberbare silke suturer med omvendt skærenål til at lukke bugvæggen.
  16. Placer dyret i et temperaturreguleret anæstesikammer i inkubationsperioden.

3. Generering af den proksimale kolonsløjfe (pcLoop)

BEMÆRK: Du kan finde flere oplysninger om mus, der blev brugt til generering af pcLoop, i oplysningerne i begyndelsen af protokolafsnittet.

  1. Udfør trin 2.1. - 2.4. som beskrevet ovenfor for ileal loop.
  2. Brug våde vatpinde, eksteriør hele ileum og læg det på toppen af en våd bomuldsgas. Identificere den proksimale tyktarm og blodforsyningen placeret i mesocolon. Mobilisere proksimale kolon og ved hjælp af fine spids pincet skabe den første ligatur i et område fri for fartøjer i mesocolon på omkring 0,5 cm distal fra caecum (Figur 2B).
  3. Mål 2 cm fra den første ligatur, og skab en anden ligatur i et område uden blodforsyning i mesocolon(figur 2C).
  4. Brug fine saks omhyggeligt skåret ved siden af hver ligation til at isolere en 2 cm lang pcLoop.
    BEMÆRK: Som nævnt i noten under trin 2.10 er det vigtigt at afskære begge ender for at isolere en pcLoop, der forsigtigt rengøres af luminalt indhold. Skær forsigtigt gennem tyktarmsvævet og mesocolonen for at forhindre små fartøjer i at bløde ind i tarmens lumen. Hvis det er nødvendigt, skal du bruge termisk cautery at begrænse blødning på indsnit site.
  5. Skyl forsigtigt pcLoop med varm HBSS for at fjerne afføring ved hjælp af et fleksibelt gult fodringsrør fastgjort til 10 mL sprøjte (se trin 1.1.6).
  6. Ligate de to snit ender af skyllet pcLoop ved hjælp af silke sutur.
  7. Brug en 1 mL sprøjte med 30G-nål til langsomt at injicere 200 μL reagens, såsom FITC-dextrans (trin 4.2) eller kemokine (trin 5.3) i tarmslimen. PcLoop pustes op, hvilket medfører en moderat udspiling af slimhinden (Figur 2D).
    BEMÆRK: Indsprøjt reagenset i pcLoop lumen på den modsatte side af mesentere arterien. Sørg for konsistens mellem dyr og skabe en 2 cm lang pcLoop for at sikre lige distension af slimhinden.
  8. Udnyt våde vatpinde til forsigtigt at placere tilbage ligated pcLoop, ileum og caecum i bughulen.
  9. Brug en nåleholder, anatomiske pincet og 3,0 ikke-absorberbare silke suturer med omvendt skærenål til at lukke bugvæggen.
  10. Placer dyret i et temperaturreguleret anæstesikammer i inkubationsperioden.

4. Kvantitativ vurdering af tarmpermeabilitet: 4 kDa FITC-dextran assay

  1. Udfør en ileal loop eller pcLoop (som beskrevet ovenfor).
  2. Ved hjælp af en 1 ml sprøjte med 30 G kanyle indsprøjtes i tarmslimen enten 250 μL (ileum - trin 2.13) eller 200 μL (kolon - trin 3.7) på 4 kDa FITC-dextranopløsning (1 mg / ml i HBSS). Hold den ubrugte FITC-dextran-løsning beskyttet mod lys for at forberede standardkurven efter serumopsamlingen.
  3. For ileal loop følg trin 2.14 til 2.16, for pcLoop trin 3.8 til 3.10. Kort, sætte organer og iLoop tilbage på plads i bughulen, lukke bugvæggen.
  4. Placer dyret i 120 minutter i et opvarmet anæstesikammer.
  5. Når inkubationsperioden åbner bugvæggen, får du adgang til hjertet og udfører hjerte punktering ved hjælp af en 1 mL sprøjte med 25G nål til at indsamle blodet. Overfør blod til et 1,3 mL serumpropaktiveringsrør, bland forsigtigt, og hold isen beskyttet mod lys. Der indsamles mindst 500 μL blod pr. mus.
    BEMÆRK: Dyr aflives, når de er bedøvet ved hjælp af en fysisk metode som halshugning eller cervikal dislokation og i overensstemmelse med den godkendte dyreprotokol.
  6. Centrifuge serumprop aktivator rør i 5 min ved 10.000 x g ved stuetemperatur i henhold til producentens anbefalinger. Opsamling af serum (supernatant) og overfør det til et 1,7 mL centrifugerør. Hold røret på is og beskyttet mod lys.
  7. Kvantificering af fluorescens i blodserum
    1. Forbered en standardkurve på FITC-dextran 4 kDa i serum af kontrolmus (saltvand eller HBSS er et gyldigt alternativ). Der skal laves en dobbelt seriel fortynding med en startkoncentration på 1 mg/mL FITC-dextran. FITC-dextran 4 kDa-koncentrationer, der måles, ligger mellem 0,25 mg/mL og 2 μg/mL.
    2. Prøvens volumen og standarderne overføres ligeligt til en sort 96-brøndsplade (flad bund), og FITC måles i en lysstofpladelæser (Excitation 490 nm, Emission 520 nm) i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger og offentliggjorte protokol33. Fitc-koncentrationen beregnes ud fra standardkurven eller de nuværende permeabilitetsværdier, efterhånden som foldændring normaliseres til forsøgskontrolgruppen.

5. Kvantitativ vurdering af migreret PMN i tarmen lumen efter intraluminale stimulation med kemokiner

BEMÆRK: Meget få PMN bor i tarmslimhinden på basisniveau. Forbehandling af dyr med proinflammatoriske cytokiner resulterer i et inflammatorisk miljø, der letter PMN-rekruttering fra blodbanen ind i tarmslimhinden.

  1. Ved hjælp af en 1 ml sprøjte med 30 G nål skal der udføres intraperitoneal (i.p.) injektion af en steril opløsning på 100 ng tumornekrosefaktor-α (TNFα) og 100 ng Interferon-γ (INFγ) i 200 μL fosfat buffered Saline (PBS).
  2. Efter 4 - 24 timers forbehandling med proinflammatoriske cytokiner skal du udføre en ileal loop eller pcLoop (som beskrevet ovenfor).
  3. Ved hjælp af en 1 ml sprøjte med 30 G kanyle indsprøjtes i tarmslimen enten 250 μL (ileum - trin 2.13) eller 200 μL (kolon - trin 3.7) af kemoattratantopløsning Leukotriene B4 (LTB4) 1 nM i HBSS.
    BEMÆRK: Leukotriene B4 (LTB4) bruges i denne protokol som et potent kemoattratant for PMN. Andre kemoattratanter såsom N-Formylmethionyl-leucyl-phenylalanin (fMLF) eller kemokin (C-X-C motiv) ligand 1 (CXCL1/KC) kan også bruges til at fremkalde betydelig rekruttering af PMN til colon lumen30.
  4. For ileal loop følg trin 2.14 til 2.16. Følg trin 3.8 til 3.10 for pcLoop. Kort, sætte organer og iLoop tilbage på plads i bughulen, lukke bugvæggen.
  5. Placer dyret i 60 minutter i et opvarmet anæstesikammer.
  6. Indsamling af indholdet af tarmsløjfen
    1. Forbered opløsninger og opbevar på is: Til ileal loop og pcLoop fremstilles en vaskebuffer, der indeholder 2 mM Ethylendiaminetetraedikesyre (EDTA), 5 mM Dithiothreitol (DTT) og 2% FBS i steril PBS uden calcium og magnesium.
    2. Efter inkubationsperioden og under anæstesivedligeholdelse skal du åbne bugvæggen og trække iLoop (ileal loop eller pcLoop). Aflive dyr, når de er under anæstesi ved hjælp af en fysisk metode såsom halshugning eller livmoderhalskræft dislokation, og i overensstemmelse med den godkendte dyreprotokol.
    3. Skyl løkken med kold PBS for at fjerne eventuelle resterende blodforurenende stoffer og absorbere overskydende PBS med vævsservietter. Sløjfeindholdet opsamles forsigtigt i et 1,7 mL centrifugerør (ca. 250 μL for ileal loop og 200 μL for pcLoop). Sløjfen skylles med 500 μL koldvaskbuffer, og læg straks efter opsamlingen røret på is.
      BEMÆRK: DTT hjælper med at opløse slim. Hvis iLoop luminal indhold er meget tyktflydende (afhængigt af musens genetiske baggrund), fortyndes det 1:2 eller 1:3 med vaskebuffer, der indeholder DTT.
    4. Pass luminal indholdsopløsningen gennem et 35 μm nylonnetfilter ved hjælp af et 5 ml rundt bundrør med cellefumækselhætte. Dette trin hjælper med at fjerne vævsfragmenter og celleaggregater. Cellesien skylles med 1 mL vaskebuffer.
    5. Centrifugerør ved 400 x g i 5 min ved 4 °C. Supernatant kasseres, pellet skylles med 500 μL - 1 mL vaskebuffer, hvorefter der centrifuges ved 400 x g i 5 min. 4 °C.
    6. Resuspend iLoop luminal celle pellet i 200 μL flow cytometry buffer (FCB) indeholder 2% FBS i steril PBS uden calcium og magnesium. Celler kan opbevares i et rør eller overføres til en 96-godt rund bundplade til flow cytometri farvning og analyse.
  7. Flow Cytometry farvning og analyse
    1. Erstatningskontrol: Hvide blodlegemer
      1. Forbered en 1 mL sprøjte med 25 G nål forfyldt med steril 0,5 M EDTA (pH 8,0). 10% EDTA pr. forventet blodvolumen (100 μL EDTA for 1 mL blod).
      2. Saml blod under bedøvelse ved hjerte punktering. Blod overføres til et 1,7 mL rør, hvorefter det centrifuges ved 400 x g i 10 min.
        BEMÆRK: Mens musen er under anæstesi, skal du bruge en fysisk metode til at bekræfte døden i overensstemmelse med den godkendte dyreprotokol (f.eks. cervikal dislokation).
      3. Aspirate supernatant. Resuspend pellet i 1 mL af Ammonium-Chlorid-Kalium-Kalium (ACK) lysis buffer for lysis af røde blodlegemer. Inkuber i 3 minutter - 5 minutter på is. Centrifuge 400 x g i 5 min., 4 °C. Hvis pellet er stadig rød, gentage denne ACK lysis buffer trin, indtil pellet bliver hvid.
      4. Genbrug pellet i 1 mL FCB og plade 0,5 x 106- 1 x 106 af celler per brønd. Forbered fem brønde af en 96-godt rundbundet plade. Placer pladen på is.
        BEMÆRK: Brug den samme 96-brønds plade, der indeholder løkkens lysstyrke (se trin 5.6.6).
    2. Flow cytometri farvning
      1. Centrifuge 96-brøndspladen i 5 minutter ved 400 x g, 4 °C. Supernatanten kasseres, og pellets genbruges med 50 μL renset rotte antimus CD16/CD32 som fc-blok (1 μg pr. 100 μL FCB). Inkuber i 5 minutter - 10 minutter på is.
      2. Immunostaining af iLoop-lysstyrken: Forbered en blanding, der indeholder alle fluorkrome konjugerede antistoffer (1:50 fortynding i FCB): anti-CD45-PerCP, anti-CD11b-PE og anti-Ly-6G-Alexa Fluor 647. Der tilsættes 50 μL af kombinationen pr. brønd for et slutvolumen på 100 μL.
      3. Immunostaining af de hvide blodlegemer for kompensationer (1:50 fortynding i FCB): Brug 50 μL FCB alene (ikke-indgroet prøve, godt 1), 50 μL af hvert enkelt fluorochrom-konjugeret antistof (brønde 2 - 4), 50 μL af kombinationen af alle fluorochromekonjugerede antistoffer (godt 5). Endeligt volumen på 100 μL.
      4. Inkubat pladen i 30 minutter på is beskyttet mod lys.
      5. Pladen centrifuges i 5 min ved 400 x g, 4 °C. Supernatanten kasseres og vaskes med 200 μL FCB. Gentag dette vasketrin to gange.
      6. Der tilsættes FCB 150 μL/brønd til blodprøverne.
      7. Der tilsættes 100 μL/brønd FCB til iLoop luminal indholdsprøven. Derefter 50 μL/brønd fluorescerende tælle perler.
    3. Analyse af flowcytometry
      1. Gate for CD45 positive begivenheder og for udtrykket af Ly-6G-/Gr-1 og CD11b30.
      2. 100 μL af prøvevolumenet anvendes som stoptilstand.
      3. Det absolutte antal PMN, der er overflyttet til iLoop lumen, beregnes på grundlag af oplysningerne fra producenten af fluorescerende tælleperler.
        BEMÆRK: Data kan præsenteres som (1) samlet antal PMN i lumen30,34,35, (2) antal PMN pr gram væv samt (3) antal PMN pr mm3 ved hjælp af formlen for volumen af en cylinder: V = π (pi) r 2 h (V for volumen, r for radius og h for højden).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En skematisk gengivelse af ileal loop- og pcLoop-modellerne er afbildet i henholdsvis figur 1 og figur 2. De anatomiske billeder viser de kritiske trin i proceduren, herunder exterior af tarmsegmentet (Figur 1B og Figur 2B), identifikation af et passende sted for ligationer, der giver minimal forstyrrelse af blodforsyningen (Figur 1C og Figur 2C) og rengøring efterfulgt af ligation af afskårne ender af iLoop, der kan fyldes med reagensopløsning ( Figur1D og Figur 2D). Det er vigtigt, at iLoop-modellen bevarer vital blodforsyning og tillader fysiologisk absorption af påførte reagenser som FITC-dextrans eller det potente PMN-kemoattraktivt LTB4. I slutningen af analysen skal iLoop oppustes (som det ses i figur 1D og figur 2D)og vise normal slimhindeperfusion med lyserøde mesenteriske beholdere. Afhængigt af analysen opsamles blod for at måle FITC-dextran i serum eller iLoop luminal indhold behandles til kvantificering af PMN TEpM før aflivning af dyret.

For at kontrollere nøjagtigheden af iLoop-modellen til vurdering af tarmgennemtrængeligheden blev der udført en FITC-dextran pcLoop-analyse for at evaluere TJ-associeret protein JAM-A's rolle i reguleringen af tarmbarrierefunktionen in vivo. Det skal bemærkes, at JAM-A-mangel fører til øget epitelinær permeabilitet i vitro28 og efter oral sonde in vivo29. Heri blev der ved hjælp af pcLoop-modellen sat tal på en 2,5 gange stigning i 4 kDa FITC-dextran serumniveauer i Jam-a-null-mus (Jam-a-/-) sammenlignet med kontroller (Jam-a+/+) (Figur 3A) 30. Desuden blev der opnået lignende resultater med mus, der huser selektivt tab af JAM-A på IECs (Villin-cre; Jam-a fl/fl) sammenlignet med kuldkontroller(Jam-a fl/fl) (Figur 3B)30. Derfor var pcLoop-modellen i stand til at bekræfte tidligere undersøgelser, der har rapporteret et positivt bidrag til JAM-A til tarmbarrierefunktionen.

Derefter blev pcLoop-modellen ansat til at studere PMN-rekruttering i tarmslimhinden og efterfølgende TEpM in vivo. Som det fremgår af figur 4A, blev antallet af PMN i pcLoop's lysstyrke kvantificeret ved analyse af strømningscytometometri. PMN blev defineret som celler positive for hver af de celle-overflade beslutningstagere CD45, CD11b og Ly6G36. Cirkulerende hvide blodlegemer blev brugt som positiv kontrol for gating strategi. Som forventet var antallet af PMN til stede i et segment af proksimal tyktarm svarende til pcLoop lav under fysiologiske forhold (Figur 4B). Forbehandling med proinflammatoriske cytokiner TNFα og IFNγ før operationen resulterede i et øget antal PMN rekrutteret i pcLoop lumen. Administrationen af PMN-kemoattraktivt LTB4 førte til en dramatisk stigning i PMN-optællingerne til støtte for en LTB4-afhængigPMN-ansættelse (Figur 4B). Immunohistokemisk farvning af PMN i tyktarmsslimhinden bekræfter den forhøjede rekruttering af PMN efter stimulering med cytokiner og LTB4 sammenlignet med cytokinbehandling uden LTB4 (Figur 4C)30. PcLoop-modellen blev anvendt til at studere JAM-A's bidrag til PMN TEpM ved hjælp af Villin-cre; Jam-a fl/fl mus. Tab af epitel JAM-A førte til et reduceret antal transmigrerede PMN i de colon lumen sammenlignet med littermate kontrol (Figur 4D)30. Disse resultater støtter kraftigt en rolle for JAM-A med hensyn til at lette PMN-migration på tværs af tarmepitelet og give supplerende indsigt i undersøgelser , der har rapporteret om involvering af JAM-A i PMN-migration på tværs af vaskulær endotel i forskellige modeller afinflammation 31,37,38.

Figure 1
Figur 1: Ileal loop-modellen. (A) Skematisk oversigt over ileal loop-modellen. Median laparotomi udføres på mus under anæstesi og placeres på et temperaturstyret kirurgibræt. (B)Udvendiggørelse af caecum (*), ileum og mesentery. Der er udpeget to egnede lokaliteter til ligation (1,2). (C) Isoler et segment med en længde på 4 cm: Den første ligatur (1) placeres tæt på ileo-caecal krydset, og en anden ligatur (2) placeres 4 cm væk fra den første ligatur. (D) To små snit er lavet i mesenteriet (1, 2) for at skabe en 4 cm lang ileal løkke. Efter fjernelse af luminalt indhold og ligation af afskårne ender kan reagenser som fluorescerende markører og kemoattratanter injiceres i lumen. Ileal loop er godt vaskulær (sorte pilespidser). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Den proksimale kolonsløjfemodel. Median laparotomi udføres på mus under anæstesi placeret på et temperaturstyret kirurgibræt. (B) Udvendiggørelse af caecum (*), proksimal tyktarm, mesocolon og ileum. Der er udpeget to egnede lokaliteter til ligation (1,2). (C) Den første ligatur (1) er placeret tæt på caecum og en anden ligatur (2) er placeret 2 cm mere distal fra den første ligatur. (D) PcLoop er udvendigt, renset for luminalt indhold og oppustet med reagenser såsom fluorescerende markører og kemoattraktive stoffer. PcLoop er et godt vaskulært 2 cm segment af proksimalt kolon (sorte pilespidser indikerer blodforsyning). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: JAM-A regulerer tarmpermeabiliteten i vivo. (A) JAM-A-mangel (Jam-a-/-) førte til øget kolonsk permeabilitet til 4 kDa FITC-dextran. Jam-a-/- (13x dyr; sorte prikker) blev sammenlignet med Jam-a+/+ kontrol (12x dyr; hvide prikker). 4 kDa FITC-dextran (1 mg/mL) i HBSS blev injiceret i pcLoop lumen. Fluorescens blev målt i blodserum efter en 120 minutters inkubationsperiode. Data udtrykkes som midler ± SEM; n = 3 uafhængige forsøg. ****P < 0,0001; Mann-Whitney U-test. (B) Øget colon permeabilitet til 4 kDa FITC-dextran i Villin-cre; Jam-afl/fl (18x dyr, sorte prikker) sammenlignet med kontroller(Jam-afl/fl,12x dyr, hvide prikker). Data er midler ± SEM; n = 4 uafhængige forsøg. ****P < 0,0001; Mann-Whitney U-test. Dette tal er blevet ændret fra Flemming S, Luissint AC et al.30. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: JAM-A fremmer LTB4-afhængigrekruttering af PMN til pcLoop's lumen. (A) Gating-strategi for kvantificering af PMN (CD45+, CD11b+og Ly-6G/Gr1+ celler) i luminalt indhold ved strømningscytometrometri med fluorescerende tælleperler. Leukocytter fra blodprøver blev brugt som en positiv kontrol for gating-strategien. (B) Antal PMN, der rekrutteres til pcLoop lumen efter cytokin (TNFα+IFNγ, 100ng hver) behandling (10x dyr, hvide prikker) eller efter en kombination af cytokiner og 1 nM LTB4 (10x dyr; sorte prikker). Sorte firkanter repræsenterer antallet af PMN ved baseline som vurderet i et intakt kolonsk segment, der er identisk med længden af pcLoop, og som ikke blev opereret eller behandlet med proinflammatoriske cytokiner og LTB4 (9x dyr). Data er middelværdien ± SEM (n = 3 uafhængige eksperimenter), Kruskal-Wallis-test med Dunns multiple sammenligningstest. *P < 0,05, ****P < 0,0001. (C) Immunohistokemisk farvning af PMN (anti-Ly6G/Gr1 antistof) i epitelet på pcLoop efter behandling med cytokiner alene (venstre panel, TNFα+IFNγ) eller en kombination af cytokiner og LTB4 (højre panel). Antallet af PMN rekrutteret i pcLoop øges i nærværelse af LTB4 (sorte pilespidser). Skala bar: 100 μm. (D) Antal PMN rekrutteret i pcLoop lumen i Villin-cre; Jam-afl/fl mus (11x dyr; sorte prikker) sammenlignet med Jam-afl/fl mus (10x dyr; hvide prikker) som reaktion på 1 nM LTB4. Data er midler ± SEM; n = 3 uafhængige forsøg. *P < 0,05; 2-tailed Student's t test. Dette tal er blevet ændret fra Flemming S, Luissint AC et al.30. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De mekanismer, der er ansvarlige for dysregulering af tarmbarrierefunktion og immuncellerekruttering under patologiske tilstande som IBD, forstås ufuldstændigt. Her beskriver vi en robust in vivo murine-model, der anvender et godt vaskulært eksteriøriseret tarmsegment af enten ileum eller proksimal tyktarm og giver mulighed for vurdering af tarmgennemtrængelighed, neutrofile migrationsundersøgelser såvel som andre applikationer.

ILoop er en ikke-genopretningsoperation, der udføres på levende dyr. Anæstesi skal løbende overvåges i løbet af eksperimentet, og evaluering af dybden af sedation er obligatorisk. De mest kritiske skridt omfatter 1) isolering af iLoop, (2) ligation af afskårne ender og (3) inflationen i iLoop ved intraluminale injektion af reagensopløsning. I hvert af disse trin kan blødning forekomme, kompromittere blodforsyningen af iLoop og påvirke nøjagtigheden af resultaterne. Bemærk, at i sjældne tilfælde af intraluminale blødninger under PMN TEpM-analysen vil den her præsenterede flowcytometri-gatingstrategi bidrage til at skelne transmigreret PMN fra PMN, der stammer direkte fra blodbanen (ikke-migreret PMN). Transmigreret PMN indsamlet i iLoop lumen udtrykker høje niveauer af overflademarkør CD11b10 sammenlignet med cirkulerende PMN (Figur 4D).

Da iLoop tillader kvantitative analyser af tarmpermeabilitet og migration af blod PMN til tarmskummen, er det vigtigt at standardisere størrelsen af det absorberende slimhindeområde og blodforsyningen. For at sikre konsistens mellem dyr er det vigtigt, at en korrekt længde af tarmsegmentet eksteriseres. iLoop skal være 4 cm for ileal loop og 2 cm for pcLoop og være perfunderes af sammenlignelig blodforsyning. Inkonsekvens i disse parametre vil også resultere i ulige distension af iLoop efter intraluminale injektion af reagenser og augment variation mellem og mellem eksperimentelle grupper. For at undgå overopslutning af iLoop anbefaler vi desuden, at der ikke injiceres mere end 250 μL reagensopløsning i lumen til henholdsvis ilealsløjfen og 200 μL for pcLoop.

Der er nogle begrænsninger forbundet med procedurens art. ILoop er en ikke-genopretningsoperation, der udføres på levende dyr. Dette er en teknisk udfordrende mikrokirurgisk metode; Personalet kan dog tilegne sig kirurgiske færdigheder gennem praksis. Den gennemsnitlige varighed af operationen skal være kort (højst 15 min). Vi anbefaler 120 min som en ideel inkubationstid til måling af tarm permeabilitet og 60 min for PMN TEpM. Inkubationstider kan reduceres, men udvidede tidspunkter kan påvirke dyrets samlede inflammatoriske tilstand under anæstesi. Derudover kan protokollen fra starten af den kirurgiske procedure til prøveindsamling / analyse ikke sættes på pause.

Denne iLoop-model giver vigtige fordele med hensyn til eksisterende metoder: (1) iLoop er fuldt vaskulær og er mere fysiologisk relevant, (2) i modsætning til den orale sondemetode, der vurderer den samlede mave-tarmkanalens integritet og afhænger af gastrointestinale motilitet13, gør iLoop det muligt at studere egenskaberne af specifikke lokaliserede områder i tarmen (terminal ileum eller proksimal tyktarm), der almindeligvis er involveret i IBD, (3) iLoop er den første in vivo-model, der gør det muligt at foretage en kvantitativ undersøgelse af PMN TEpM i tarmen samt andre dele af tarmslimhinden, herunder lamina propria og epitelioner30,35. Det er muligt at anvende fitc-mærket dextrans med høj versus lav molekylvægt (4 til 150 kDa) for at evaluere både størrelse selektivitet og/eller sværhedsgraden af epitelbarrierefejl i knockout/knock-in mus eller forskellige eksperimentelle modeller, herunder, men ikke begrænset til, tarmbetændelse. Derudover kan FITC-mærket dextrans kvantificeres i andre organer såsom leveren39 eller som en ny tilgang til undersøgelser af blodhjernebarrieren , der giver indsigt i tarmgennemtrængelighedens rolle i tarmlever og tarmhjerneøkser40,41,42. Desuden giver denne metode mulighed for at udføre to sløjfer parallelt (ileal loop og pcLoop i samme dyr) og indgyde to forskellige fluorescerende mærkede sonder til analyser af barriereegenskaber i forskellige områder i tarmen. På samme måde kan der anvendes generation af to sløjfer parallelt til specifikt at evaluere ileum versus kolon for forskelle eller ligheder i rekrutteringen af immunceller som reaktion på det samme reagens.

Her ved hjælp af pcLoop med Jam-a-nullmus eller mus huser selektiv tab af JAM-A på IECs (Villin-cre; Jam-a fl/fl), bekræfter vi resultater fra tidligere undersøgelser, der har rapporteret en positiv rolle for det TJ-associerede protein JAM-A i tarm permeabilitet og PMN TEpM. ILoop's anvendelser kan udvides til forskellige reagenser, herunder antistoffer, mikrobielle patogener og terapeutiske lægemidler30,34,35. Bemærk, at vi brugte LTB4 (336,5 Da) til model PMN TEpM, da det er et godt accepteret potent og fysiologisk PMN kemoattratant og dets evne til at fremkalde TEpM ved lave koncentrationer (1 nM) i det fysiologiske område. Vores loop-model kan dog tilpasses andre relevante kemoattratanter. Vi har rapporteret brugen af bakteriel peptid N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanin (fMLF) til at fremkalde betydelig rekruttering af PMN i colon lumen30. fMLF (437,5 Da) er et lavere affinitets kemoattratant hos mus, hvilket kræver meget højere koncentrationer for at være effektive (1μM). Denne model kan tilpasses til brug af CXCL1/KC, et andet potent fysiologisk kemoattratant, som vi med succes har brugt, men CXCL1/KC er dyrt og et relativt stort molekyle (11 kDa), der er mindre effektivt til at krydse epitelbarrieren. Vi har også påvist, at neutralisering af antistoffer mod leukocyt-specifik integrin CD11b/CD18 (αMβ2), der blev injiceret i løkken lumen forudgående administration af kemoattractant LTB4 resulterede i reduceret PMN TEpM bekræftende resultater fra in vitro undersøgelser10,30,35. Desuden pcLoop blev for nylig ansat til at undersøge effekten af PMN versus epitel glycaner i at kontrollere satsen for PMN TEpM43. Reagenser blev sprøjtet ind i den tidligere indgift af kemoattratanten LTB4. Derfor kan iLoop med sit brede spektrum af applikationer supplere og bekræfte fund opnået via in vitro-assays. Ligated tarmsløjfer er også blevet brugt af andre til at studere bakteriel infektion (såsom Salmonella, L. monocytogenes og E. coli), derfor mener vi, at letheden i tilpasningsevnen af denne iLoop-model også kan bruges til disse undersøgelser.

Efter behandling med proinflammatoriske immunformidlere kan iLoop bruges som en akut model for tarmbetændelse. Desuden kan iLoop muliggøre undersøgelser, der belyser sammenhængen mellem øget tarmgennemtrængelighed og rekruttering af immunceller efter eksponering for intraluminale patogener eller i kroniske inflammatoriske eksperimentelle modeller. Bemærk, at vi har for nylig observeret ved at anvende pcLoop model, at som reaktion på høj dosis af proinflammatoriske cytokiner TNFα og IFNγ (1 mg af hver) tarm paracellulær permeabilitet til 4 kDa FITC-dextran resulterede i øget PMN rekruttering i pcLoop lumen som reaktion på LTB4 i forhold til lav dosis cytokiner (100 ng af hver)30. Interessant, her viser vi, at øget epitel permeabilitet sekundær til Jam-a mangel ikke førte til øget PMN TEpM, men mindsket det. Alt i alt tyder disse resultater på, at tarmparacellulær permeabilitet påvirker pmn TEpM-hastigheden, men korrelationen er ikke direkte og afhænger af faktorer som udtryk for vedhæftningsmolekyler (svarende til JAM-A), der spiller en vigtig rolle i både epitelbarrierefunktion og leukocytmigration16. Fremtidige undersøgelser er nødvendige for at undersøge finjustering af immuncelleresponser fra tarmepitelet og bidrag til patologisk slimhindebetændelse som inflammatorisk tarmsygdom.

Det kan konkluderes, at iLoop-modellen giver en væsentlig forbedring af de eksisterende tilgange til vurdering af tarmgennemtrængelighed og PMN TEpM in vivo, som i væsentlig grad vil støtte i forståelsesmekanismerne bag reguleringen af tarmbetændelse og IBD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Dr. Sven Flemming fra Universitetet i Wuerzburg for hans bidrag til etableringen af den proksimale kolon loop model, Sean Watson for forvaltningen af musen kolonier og Chithra K. Muraleedharan for at hjælpe med erhvervelsen af billeder af iLoop model. Dette arbejde blev støttet af den tyske Forskningsfond/DFG (BO 5776/2-1) til KB, R01DK079392, R01DK072564 og R01DK061379 til C.A.P.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment and Material
BD Alcohol Swabs BD 326895
BD PrecisionGlide Needle, 25G X 5/8" BD 305122
BD PrecisionGlide Needle, 30G X 1/2" BD 305106
BD 1ml Tuberculin Syringe Without Needle BD 309659
15ml Centrifuge Tube Corning 14-959-53A
Corning 96-Well Solid Black Polystyrene Microplate FisherScientific 07-200-592
Corning Non-treated Culture Dish, 10cm MilliporeSigma CLS430588
Cotton Tip Applicator (cotton swab), 6", sterile FisherScientific 25806 2WC
Dynarex Cotton Filled Gauze Sponges, Non-Sterile, 2" x 2" Medex 3249-1
EZ-7000 anesthesia vaporizer (Classic System, including heating units) E-Z Systems EZ-7000
Falcon Centrifuge Tube 50ml  VWR 21008-940
Fisherbrand Colored Labeling Tape FisherScientific 15-901-10R
Halsey Needle Holder (needle holder)  FST 12001-13
Kimwipes, small (tissue wipe) FisherScientific 06-666
1.7ml Microcentrifuge Tubes  Thomas Scientific  c2170
Micro Tube 1.3ml Z (serum clot activator tube) Sarstedt  41.1501.105
Moria Fine Scissors FST 14370-22
5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap (35 µm nylon mesh) Falcon 352235
Puralube Vet Ointment, Sterile Ocular Lubricant Dechra 12920060
Ring Forceps (blunt tissue forceps) FST 11103-09
Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YD FisherScientific NC9452680
Semken Forceps (anatomical forceps) FST 1108-13
Sofsilk Nonabsorbable Coated Black Suture Braided Silk Size 3-0, 18", Needle 19mm length 3/8 circle reverse cutting  HenrySchein SS694
Student Fine Forceps, Angled FST 91110-10
10ml Syringe PP/PE without needle Millipore Sigma  Z248029
96 Well Cell Culture Plate Corning 3799
Yellow Feeding Tubes for Rodents 20G x 30 mm Instech FTP-20-30
Solutions and Buffers
Accugene 0.5M EDTA Lonza 51201
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer BioWhittaker 10-548E
Hanks' Balanced Salt Solution Corning 21-023-CV
Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium Corning 21-040-CV
Reagents
Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Antibody (1A8) BioLegend 127610
CD11b Monoclonal Antibody, PE, eBioscience (M1/70) ThermoFisher 12-0112-81
CountBright Absolute Counting Beads Invitrogen C36950
Dithiotreitol FisherScientific BP172-5
Fetal Bovine Serum, heat inactivated R&D Systems 511550
Fluorescein Isothiocyanate-Dextran, average molecular weight 4.000 Sigma 60842-46-8
Isoflurane Halocarbon 12164-002-25
Leukotriene B4 Millipore Sigma 71160-24-2
PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11) BD Pharmingen 557235
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD FC Block) BD Bioscience 553142
Recombinant Murine IFN-γ Peprotech 315-05
Recombinant Murine TNF-α Peprotech 315-01A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Olson, T. S., et al. The primary defect in experimental ileitis originates from a nonhematopoietic source. Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 541-552 (2006).
  2. Jump, R. L., Levine, A. D. Mechanisms of natural tolerance in the intestine: implications for inflammatory bowel disease. Inflammatory Bowel Diseases. 10 (4), 462-478 (2004).
  3. Peeters, M., et al. Clustering of increased small intestinal permeability in families with Crohn's disease. Gastroenterology. 113 (3), 802-807 (1997).
  4. Michielan, A., D'Inca, R. Intestinal permeability in inflammatory bowel disease: Pathogenesis, clinical evaluation, and therapy of leaky gut. Mediators of Inflammation. 2015, 628157 (2015).
  5. Chin, A. C., Parkos, C. A. Neutrophil transepithelial migration and epithelial barrier function in IBD: potential targets for inhibiting neutrophil trafficking. Annals of the New York Academy of Sciences. 1072, 276-287 (2006).
  6. Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn's disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
  7. Ordás, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Ulcerative colitis. Lancet. 380 (9853), 1606-1619 (2012).
  8. Muthas, D., et al. Neutrophils in ulcerative colitis: A review of selected biomarkers and their potential therapeutic implications. Scandanavian Journal of Gastroenterology. 52 (2), 125-135 (2017).
  9. Pai, R. K., et al. The emerging role of histologic disease activity assessment in ulcerative colitis. Gastrointestinal Endoscopy. 88 (6), 887-898 (2018).
  10. Parkos, C. A., Delp, C., Arnaout, M. A., Madara, J. L. Neutrophil migration across a cultured intestinal epithelium. Dependence on a CD11b/CD18-mediated event and enhanced efficiency in physiological direction. The Journal of Clinical Investigation. 88 (5), 1605-1612 (1991).
  11. Brazil, J. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil-epithelial interactions. Immunological Reviews. 273 (1), 94-111 (2016).
  12. Thomson, A., et al. The Ussing chamber system for measuring intestinal permeability in health and disease. BMC Gastroenterology. 19 (1), 98 (2019).
  13. Li, B. R., et al. In vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), e57032 (2018).
  14. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  15. Fan, S., et al. Role of JAM-A tyrosine phosphorylation in epithelial barrier dysfunction during intestinal inflammation. Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 566-578 (2019).
  16. Parkos, C. A. Neutrophil-epithelial interactions: A double-edged sword. American Journal of Pathology. 186 (6), 1404-1416 (2016).
  17. Volynets, V., et al. Assessment of the intestinal barrier with five different permeability tests in healthy C57BL/6J and BALB/cJ mice. Digital Diseases and Sciences. 61 (3), 737-746 (2016).
  18. Wick, M. J., Harral, J. W., Loomis, Z. L., Dempsey, E. C. An optimized evans blue protocol to assess vascular leak in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (139), e57037 (2018).
  19. Tateishi, H., Mitsuyama, K., Toyonaga, A., Tomoyose, M., Tanikawa, K. Role of cytokines in experimental colitis: relation to intestinal permeability. Digestion. 58 (3), 271-281 (1997).
  20. Mei, Q., Diao, L., Xu, J. M., Liu, X. C., Jin, J. A protective effect of melatonin on intestinal permeability is induced by diclofenac via regulation of mitochondrial function in mice. Acta Pharmacologica Sinica. 32 (4), 495-502 (2011).
  21. Vargas Robles, H., et al. Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis. Journal of Visualized Experiments. (119), e55095 (2017).
  22. Arques, J. L., et al. Salmonella induces flagellin- and MyD88-dependent migration of bacteria-capturing dendritic cells into the gut lumen. Gastroenterology. 137 (2), 579-587 (2009).
  23. Coombes, B. K., et al. Analysis of the contribution of Salmonella pathogenicity islands 1 and 2 to enteric disease progression using a novel bovine ileal loop model and a murine model of infectious enterocolitis. Infection and Immunity. 73 (11), 7161-7169 (2005).
  24. Everest, P., et al. Evaluation of Salmonella typhimurium mutants in a model of experimental gastroenteritis. Infection and Immunity. 67 (6), 2815-2821 (1999).
  25. Pron, B., et al. Comprehensive study of the intestinal stage of listeriosis in a rat ligated ileal loop system. Infection and Immunity. 66 (2), 747-755 (1998).
  26. Clayburgh, D. R., et al. Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo. The Journal of Clinical Investigation. 115 (10), 2702-2715 (2005).
  27. Palmblad, J., et al. Leukotriene B4 is a potent and stereospecific stimulator of neutrophil chemotaxis and adherence. Blood. 58 (3), 658-661 (1981).
  28. Mandell, K. J., Babbin, B. A., Nusrat, A., Parkos, C. A. Junctional adhesion molecule 1 regulates epithelial cell morphology through effects on beta1 integrins and Rap1 activity. The Journal of Biological Chemistry. 280 (12), 11665-11674 (2005).
  29. Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).
  30. Flemming, S., Luissint, A. C., Nusrat, A., Parkos, C. A. Analysis of leukocyte transepithelial migration using an in vivo murine colonic loop model. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (20), (2018).
  31. Luissint, A. C., Nusrat, A., Parkos, C. A. JAM-related proteins in mucosal homeostasis and inflammation. Seminars in Immunopathology. 36 (2), 211-226 (2014).
  32. Cesarovic, N., et al. Isoflurane and sevoflurane provide equally effective anaesthesia in laboratory mice. Lab Animal. 44 (4), 329-336 (2010).
  33. JoVE Science Education Database. Introduction to the Microplate Reader. Journal of Visualized Experiments. , JoVE, Cambridge, MA. e5024 (2020).
  34. Kelm, M., et al. Targeting epithelium-expressed sialyl Lewis glycans improves colonic mucosal wound healing and protects against colitis. Journal of Clinical Investigation Insight. 5 (12), (2020).
  35. Azcutia, V., et al. Neutrophil expressed CD47 regulates CD11b/CD18-dependent neutrophil transepithelial migration in the intestine in vivo. Mucosal Immunology. , (2020).
  36. Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PloS One. 11 (3), 0150606 (2016).
  37. Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series). Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).
  38. Ebnet, K. Junctional Adhesion Molecules (JAMs): Cell adhesion receptors with pleiotropic functions in cell physiology and development. Physiological Reviews. 97 (4), 1529-1554 (2017).
  39. Sorribas, M., et al. FXR modulates the gut-vascular barrier by regulating the entry sites for bacterial translocation in experimental cirrhosis. Journal of Hepatology. 71 (6), 1126-1140 (2019).
  40. Mazzucco, M. R., Vartanian, T., Linden, J. R. In vivo Blood-brain Barrier Permeability Assays Using Clostridium perfringens Epsilon Toxin. Bio-Protocol. 10 (15), 3709 (2020).
  41. Kelly, J. R., et al. Breaking down the barriers: the gut microbiome, intestinal permeability and stress-related psychiatric disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 392 (2015).
  42. Fiorentino, M., et al. Blood-brain barrier and intestinal epithelial barrier alterations in autism spectrum disorders. Molecular Autism. 7 (1), 49 (2016).
  43. Kelm, M., et al. Regulation of neutrophil function by selective targeting of glycan epitopes expressed on the integrin CD11b/CD18. FASEB Journal : An Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (2), 2326-2343 (2020).

Tags

Immunologi og infektion Problem 168 tarmbarrierefunktion slimhindevaccinologi tarmepitelet permeabilitetsanalyse leukocyttransepithelial migrationsanalyse ileal loop proximal tyktarmssløjfe fluorescerende isothiocyanat (FITC)-dextran kemokine proinflammatorisk cytokin
Funktionel vurdering af tarmgennemtrængelighed og neutrofil transepithelial migration hos mus ved hjælp af en standardiseret tarmsløjfemodel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boerner, K., Luissint, A. C.,… More

Boerner, K., Luissint, A. C., Parkos, C. A. Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model. J. Vis. Exp. (168), e62093, doi:10.3791/62093 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter