Summary
受管制的肠道上皮屏障功能和免疫反应是炎症性肠病的标志，由于缺乏生理模型，这些特征仍然调查不力。在这里，我们描述了一个鼠标肠道循环模型，它采用了血管化和外化良好的肠道部分，以研究粘膜渗透性和白细胞在体内的招募。
Abstract
肠道粘膜由一层上皮细胞排列，形成动态屏障，允许球细胞传输营养物质和水，同时防止发光细菌和外源物质的通过。这一层的破坏导致对发光成分的渗透性和免疫细胞的招募增加，这两者都是肠道病理状态的标志，包括炎症性肠病（IBD）。
由于缺乏允许定量分析的实验性体内方法，对多态核嗜中性粒细胞（PMN）上皮屏障功能和转位迁移（TEpM）的机制不完全了解。在这里，我们描述了一个强大的木质实验模型，它采用了外化肠道部分的肠或近结肠。外化肠道环 （iLoop） 完全血管化，与通常用于研究上皮细胞单层的渗透性和 PMN 迁移的前体内室方法相比，具有生理优势。
我们详细演示了该模型的两种应用：（1） 通过检测血清中的荧光标记的脱氧转体在血清中检测肠道渗透性（2） 在肠道上皮中引入化疗法后对迁移的 PMN 进行定量评估。我们证明了这个模型的可行性，并提供了利用iLoop在小鼠缺乏上皮紧密结相关蛋白质JAM-A相比对照的结果。JAM-A 已被证明在炎症反应期间调节上皮屏障功能以及 PMN TEPM。我们使用 iLoop 的结果证实了以前的研究，并强调了 JAM-A 在调节肠道渗透性和 PMN TEPM 在体温平衡和疾病期间在体内的重要性。
iLoop模型为肠道平衡和炎症的活体研究提供了高度标准化的方法，将显著提高对IBD等疾病中肠道屏障功能和粘膜炎症的认识。
Introduction
肠道粘膜包括单层柱状肠道上皮细胞（IECs）、底层拉米纳丙膜免疫细胞和肌肉粘膜。除了它在营养物质吸收中的作用外，肠道上皮是保护身体内部免受发光共生细菌、病原体和膳食抗原侵害的物理屏障。此外，IEC 和拉米纳丙膜免疫细胞协调免疫反应，根据上下文和刺激诱导耐受性或反应。据报道，上皮屏障的破坏可以先于病理粘膜炎症的发生，并导致炎症性肠病（IBD），包括溃疡性结肠炎和克罗恩病1，2，3，4，5，6，7。溃疡性结肠炎患者出现多态核嗜中性粒细胞（PMN）的过度转导（TEPM），形成隐秘脓肿，这一发现与疾病8、9的严重程度有关。虽然上皮屏障功能受损和免疫反应过度是IBD的标志，但缺乏对肠道渗透性和免疫细胞招募进行肠道粘膜的定量评估的体内检测实验。
最常见的方法用于研究肠道上皮渗透性和PMN TEPM采用前体内室为基础的方法，使用IEC单层培养的半渗透多孔膜插入10，11，12。上皮屏障的完整性通过测量转位电阻 （TEER） 或荧光素异氰酸素 （FITC） 标记的脱氧叶素的准细胞通量从尖顶到基底隔间13、14、15进行监测。同样，PMN TEPM 通常针对下腔16中添加的化疗吸引剂进行研究。PMN 被放置在上室，在潜伏期后，已迁移到基底舱的 PMN 被收集和量化。虽然这些方法是有用的，易于执行和非常可重复的，它们显然是减少的方法，并不一定代表在体内条件的准确反映。
在小鼠中，研究肠道准细胞渗透性的常见检测方法是通过对FITC-dextran的口服测定和随后对血清13、17中FITC-德克斯特兰外观的测量。这种检测的缺点是，它代表了对胃肠道整体屏障完整性的评估，而不是对区域肠道贡献的评估。此外，Evans Blue 常用于评估18号体内的血管渗漏，还用于评估小鼠和19、20、21的肠道粘膜渗透性。肠道粘膜中埃文斯蓝的量化需要从一夜之间在形态酰胺中孵化的组织中提取。因此，同一组织不能用于研究肠道上皮渗透和嗜中性粒细胞渗透。
在这里，我们强调一个简单的协议，减少动物的数量，需要收集可重复的数据，结肠粘膜渗透性和白细胞在体内的转世迁移。因此，我们建议使用在血清中易于检测到的FITC-dextrans，而不损害肠道循环的完整性，这些肠环可以收获作进一步分析。值得注意的是，肠道利口环已用于各种物种（包括老鼠，大鼠，兔子，小牛）研究细菌感染（如沙门氏菌，李斯特菌单细胞基因和大肠杆菌）22，23，24，25以及肠道渗透性26：然而，据我们所知，没有研究调查PMN TEPM在肠道的特定区域的机制，如伊利姆或结肠，通常涉及IBD。
在这里，我们描述了小鼠肠道循环（iLoop）模型，这是一个强大和可靠的显微外科活体方法，采用了良好的血管化和外化肠道部分的肠或近结肠。iLoop 模型在生理上相关，允许评估麻醉下活鼠的肠道屏障完整性和 PMN TEPM。我们演示了两个应用：1） 在 iLoop 2 的血清水平 4 kDa FITC-dextran 后，在 iLoop 2） 中对 iLoop 流明中转移的 PMN 进行量化，在注射强力化学微量微量剂 Leukotriene B4 （LTB4）27后进行。此外，利用iLoop模型与Jam-a-空小鼠或老鼠怀有选择性损失的JAM-A在IEC（维林克里：与对照小鼠相比，我们能够证实先前的研究，这些研究报告对紧结相关蛋白质JAM-A对肠道渗透性和嗜中性粒细胞转运有重大贡献，15、28、29、30、31。
iLoop 模型是一种功能和生理上非常全的方法，可用于证实体外测定。此外，这是一个多功能的实验模型，允许研究各种试剂，可以注射到循环流明，包括化疗因子，细胞因子，细菌病原体，毒素，抗体和治疗。
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Protocol
所有动物实验都是根据国家卫生研究院的指导方针和政策进行的，并经密歇根大学动物护理与使用机构委员会批准。
1. 术前准备
注：这种方法是利用C57BL/6遗传背景的成年小鼠产生的，年龄在8-12周。所有小鼠都处于严格的特定无病原体条件下，并可获得正常的周和水。结果使用C57BL/6，果酱-空小鼠（Jam-a-/-）或在IEC（维林-克里）上有选择性地丢失JAM-A的小鼠获得：果酱-一个fl/fl）和垃圾队友Jam-afl/fl控制如前所述30。
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区域准备
- 在清洁区域进行手术。然而，肠道循环模型是一种不需要无菌/无菌技术的非生存性手术。观察兽医卫生做法，使用清洁的手术器械（即用肥皂擦洗，用水冲洗，然后用70%乙醇冲洗）。
- 打开温度控制的手术板（或加热垫），并调整光源，以防止动物在麻醉和手术期间体温过低。
- 通过切割 6 厘米段的不可吸收的 4-0 丝绸手术缝合线来准备连结。
- 准备棉纱布（5厘米×5厘米），在中心切后，椭圆形。这些将用于覆盖中线腹腔切除术，并防止外部的iLoop和动物毛皮之间的直接接触。将切纱布浸泡在温暖的汉克斯平衡盐溶液 （HBSS） 中，放入培养皿容器中。
- 准备湿棉签浸泡在温暖的 HBSS，将用于处理器官和外部化 iLoop。
- 准备10 mL注射器，装满温暖的HBSS，并连接到黄色的喂食管。这种注射器将用于在手术过程中滋润暴露的组织，并轻轻地冲洗粪便含量的 iLoop。
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动物准备
- 按照批准的动物协议对动物进行麻醉。在这个协议中，异黄素和氧气的混合物通过麻醉蒸发器进行管理。根据制造商的说明，将氧气流量调整为 1 L/min。将蒸发器设置为 5%，并预充电感应室。5分钟后，将异黄素蒸发器降低到2%-2.5%。
- 将动物放在感应室3分钟-5分钟，然后将动物转移到加热手术板，并连接麻醉鼻锥塞。用胶带用四肢将动物控制在苏平位置。
注：作为麻醉替代品，氯胺酮（80毫克/千克 - 100毫克/千克）和二甲苯（5毫克/千克 - 10毫克/千克）在盐溶液中稀释的混合物（0.9%NaCl）可以通过腹内注射进行管理。在整个手术过程中，应通过对氯胺酮/西拉津（初始剂量的0.1-0.25倍）进行肌肉内管理，以确保麻醉深度。如果可用，强烈建议使用异黄素麻醉蒸发器，以确保更好的可重复性、生存能力和防止动物疼痛。 - 将眼科软膏涂在双眼上，以防止角膜干燥。
- 进行身体检查，包括心率（约500次/分钟）和节律，粘膜颜色（粉红色），毛细细<补充时间（<2秒），呼吸速率（不低于40-60呼吸/分钟），和温度（36.5°C）32。
- 在继续下一步之前，通过踏板退出反射评估麻醉深度。在脚趾和/或脚趾垫之间使用疼痛的刺激（捏）皮肤。鼠标会通过收缩和移除腿部来响应。当动物被深度麻醉时，这种踏板反射就会消失。
注：建议至少每15分钟对全身麻醉进行生命体征和踏板反射监测。机构动物护理和使用委员会（IACUC）评估麻醉深度的指南建议监测以下情况：（a） 尾部、足部和粘膜（如舌头）的颜色。颜色粉红色正常，苍白或蓝色，表示血液灌注或呼吸窘迫减少;（b） 定期呼吸与不规则呼吸的呼吸模式评估。直肠温度探针、啮齿动物氧计和心率监测器可分别用于体温、心脏和呼吸速率的评估。
2. 电路循环的生成
- 皮肤准备：用酒精拭子或纱布海绵用70%乙醇浸泡腹部中线擦洗毛皮。不要用酒精弄湿大面积的毛皮，以防止体温过低。
- 用剪刀，进行中线腹腔切除术。在腹部中间做一个垂直切口（约2厘米长），并暴露腹膜。小心不要伤害腹内器官。
- 将预切湿棉纱布放在暴露的腹腔上。
- 使用湿棉签来动员和外化 caecum。小心地将凯库姆放在湿棉纱布上。
注：Caecum 位于大多数小鼠腹腔的左腹腔象限中，与动物的性别无关。 - 使用湿棉签来动员和轻轻地将终端部分（端）附着在 caecum 上的 ileum（图 1B）外部化。
- 在湿棉纱布上部署至少 6 厘米的末梢 ileum，而不会中断血管和血液供应。如果没有出血，并且组织保持粉红色（图1B），血液供应就会保持。
注意：使用连接到黄色喂食管的 10 mL 注射器（步骤 1.1.6），使用温暖的 HBSS（每 2 - 3 分钟）保持组织始终湿润，避免干燥暴露的组织。 - 靠近腹腔，确定在腹腔中供应伊利姆的主要动脉。然后在没有关键血管的内分店找到两个连体位点。
- 使用钝组织钳，牢牢抓住末期的伊利姆（最接近caecum），并使用精细的尖端钳子，挡住血管。将丝绸缝合穿过穿孔，并系上手术结，以创建第一个结扎（环的外端）。
- 使用尺子测量距离第一个连结 4 厘米远的地方，并创建第 2.8 步（图 1C）中提到的第二个连字（环的近端）。
- 用细剪刀小心地切开每个粘合旁边，以隔离4厘米的环，保持完整的血液供应和间质膜。
注：切断 iLoop 外部部分的两端，然后轻轻冲洗，作为防止干扰发光物质（粪便物质）的必要步骤，从而促进 FITC-dextrans 或化学刺激在整个隔离段的整个长度的分散，以及允许通过流细胞学更准确地量化白细胞。此过程还允许在注射指定数量的试剂后均匀地分散粘膜，并改善动物之间的可重复性。 - 使用连接到 10 mL 注射器的柔性黄色喂食管，使用温暖的 HBSS 轻轻冲洗 ileal 环段的内容（参见步骤 1.1.6）。
- 使用丝绸缝合线将冲洗的伊莱尔环的两个切口平开。
- 使用1 mL注射器与30G针慢慢注射250微升的试剂，如FITC-dextrans（步骤4.2）或化疗（步骤5.3）到肠道流明。ileal 环会膨胀，导致粘膜的适度分散（图 1D）。
注：将试剂注入中性动脉对岸的循环流明。在注射时，小心不要从动物中取出肠环，以免撕裂血管并诱发出血。 - 使用湿棉签，轻轻地放回伊莱尔环，近膜和凯库姆。
- 使用针架、解剖钳和 3.0 不可吸收的丝绸缝合线与反向切割针关闭腹壁。
- 将动物置于温度调节的麻醉室中，供潜伏期。
3. 近似结肠循环的生成（pcLoop）
注：有关用于生成 pcLoop 的小鼠的详细信息，请参阅协议部分开头提供的信息。
- 执行步骤 2.1。- 2.4.如上所述，用于 ileal 循环。
- 使用湿棉签，将整个伊莱姆外化，并将其放在湿棉纱布的顶部。识别位于中子的近结肠和血液供应。调动近端结肠，并使用精细的尖端钳子在中子克隆中没有船只的区域创建第一个连结，距离舱骨约0.5厘米（图2B）。
- 测量2厘米从第一连结，并创建第二个连结在一个区域没有血液供应的中子（图2C）。
- 使用细剪刀小心地切割每个连体旁边，以隔离一个2厘米长的pcLoop。
注：如第 2.10 步下注释中所述，重要的是切断两端，以隔离轻轻清洁发光内容的 pcLoop。小心切开结肠组织和中子，防止小血管出血进入肠道流明。如有必要，使用热烧灼热来限制切口处的出血。 - 使用温暖的 HBSS 轻轻冲洗 pcLoop，使用连接到 10 mL 注射器的柔性黄色喂食管去除粪便（参见步骤 1.1.6）。
- 使用丝绸缝合线将冲洗 pcLoop 的两端唇踏。
- 使用带 30G 针头的 1 mL 注射器将 200 μL 的试剂（如 FITC-dextrans（第 4.2 步）或切莫金（第 5.3 步）慢慢注射到肠道流明中。pcLoop 会膨胀，导致粘膜的适度分散（图 2D）。
注：将试剂注射到中性动脉对侧的 pcLoop 流明中。确保动物之间的一致性，并创建一个2厘米长的pcLoop，以确保粘膜的平等分散。 - 使用湿棉签轻轻地将唇膏、伊利姆和凯库姆放回腹腔。
- 使用针架、解剖钳和 3.0 不可吸收的丝绸缝合线与反向切割针关闭腹壁。
- 将动物置于温度调节的麻醉室中，供潜伏期。
4. 肠道渗透性定量评估：4 kDa FITC-德克斯特拉测定
- 执行ileal循环或 pcLoop（如上文所述）。
- 使用 1 mL 注射器和 30 G 针头，注射到肠道流明 250 μL （ileum - 步骤 2.13） 或 200 μL （结肠 - 步骤 3.7） 4 kDa FITC-dextran 溶液 （1 毫克 / mL 在 HBSS）.。保持未使用的 FITC-dextran 溶液不受光线照射，以便在血清收集后准备标准曲线。
- 对于 ileal 循环遵循步骤 2.14 到 2.16，对于 pcLoop 步骤 3.8 到 3.10。简言之，将器官和 iLoop 放回腹腔，关闭腹壁。
- 将动物放在加热麻醉室120分钟。
- 潜伏期打开腹壁后，进入心脏，使用1mL注射器和25G针进行心脏穿刺，以收集血液。将血液输送到 1.3 mL 血清凝块激活管中，轻轻混合，并保持在不受光线照射的冰上。每只小鼠至少采集 500 μL 的血液。
注：动物在麻醉时，使用斩首或颈椎错位等物理方法，并按照批准的动物协议实施安乐死。 - 根据制造商的建议，离心血清血清凝块激活管在室温下在 10，000 x g 下工作 5 分钟。收集血清（超高）并转移到1.7mL离心机管。将管子放在冰上，防止光线照射。
- 血清中荧光的量化
- 在对照小鼠血清中准备FITC-dextran 4 kDa的标准曲线（盐水或HBSS是一种有效的替代方法）。创建双倍串行稀释，起始浓度为 1 毫克/mL FITC-dextran。FITC-dextran 4 kDa 浓度测量范围介于 0.25 毫克/mL 和 2 μg/mL 之间。
- 根据制造商的说明和发布的协议33，将等量的样品和标准转移到黑色 96 井板（平底），并在荧光板读取器（激发 490 nm，排放 520 nm）中测量 FITC。根据标准曲线或当前渗透值计算 FITC 浓度，作为与实验对照组正常化的折叠变化。
5. 用化疗刺激肠道内刺激后，对迁移的PMN进入肠道流明的定量评估
注：很少有PMN居住在基线水平的肠道粘膜中。用亲炎细胞因子对动物进行预处理，可在炎症环境中促进 PMN 从血液中招募到肠道粘膜中。
- 使用 1 mL 注射器和 30 G 针头，在 200 μL 磷酸盐缓冲盐 （PBS） 中注射 100 ng 肿瘤坏死因子α （TNF+） 和 100 ng 干扰素-γ （INF+） 的无菌溶液。
- 使用亲炎细胞因子进行 4 - 24 小时的预处理后，执行 ileal 循环或 pcLoop（如上所述）。
- 使用 1 mL 注射器与 30 G 针， 注射到肠道流明 250 μL （ileum - 步骤 2.13） 或 200 μL （结肠 - 步骤 3.7） 的化疗刺激溶液 Leukotriene B4 （LTB4） 1 nM 在 HBSS.
注：Leukotriene B4 （LTB4） 在本协议中用作 PMN 的强效化疗。其他化学诱因，如N-富美甲基-莱西-苯丙氨酸（fMLF）或切莫金（C-X-C图案）配体1（CXCL1/KC）也可用于诱导大量PMN进入结肠流明30。 - 对于 ileal 循环，请遵循步骤 2.14 到 2.16。对于 pcLoop，请遵循步骤 3.8 到 3.10。简言之，将器官和 iLoop 放回腹腔，关闭腹壁。
- 将动物放在加热麻醉室中60分钟。
- 肠道循环内容的集合
- 准备解决方案并储存在冰上：对于冰环和 pcLoop，准备一个洗涤缓冲器，其中含有 2 mM 乙酰胺乙酸 （EDTA）、5 mM 二乙二醇 （DTT） 和 2% FBS 的无菌 PBS，不含钙和镁。
- 潜伏期后，在麻醉维护下，打开腹壁，拉出iLoop（虹膜循环或 pcLoop）。根据批准的动物协议，使用斩首或颈椎错位等物理方法对麻醉动物实施安乐死。
- 用冷 PBS 冲洗循环，去除任何残留的血液污染物，并用组织湿巾吸收多余的 PBS。小心地将环内容收集到 1.7 mL 离心机管中（用于 ileal 环的大约 250 μL，用于 pcLoop 的 200 μL）。用 500 μL 冷洗缓冲器冲洗环，收集后立即将管子放在冰上。
注：DTT 有助于溶解粘液。如果 iLoop 的发光含量非常粘稠（取决于小鼠的遗传背景），则用含有 DTT 的洗涤缓冲器稀释 1：2 或 1：3。 - 使用带细胞过滤器盖的 5 mL 圆底管，通过 35 μm 尼龙网过滤器传递发光内容解决方案。此步骤有助于去除组织片段和细胞聚集物。用 1 mL 的洗涤缓冲器冲洗细胞过滤器。
- 离心管在 400 x g 5 分钟在 4 °C. 丢弃超高纳坦，用 500 μL - 1 mL 洗涤缓冲液冲洗颗粒，然后以 400 x g 离心机 5 分钟 4 °C 的速度离心机。
- 在 200 μL 的流动细胞缓冲 （FCB） 中，在没有钙和镁的无菌 PBS 中含有 2% FBS 的再恢复 iLoop 发光细胞颗粒。细胞可以保存在管子中或转移到96井圆底板，用于流细胞学染色和分析。
- 流细胞测量染色和分析
- 补偿控制：白血球
- 准备一个1mL注射器与25G针预填充无菌0.5M EDTA（pH 8.0）。10% EDTA 每预期血液量 （100 μL 的 EDTA 为 1 mL 血液）。
- 通过心脏穿刺在麻醉下采集血液。将血液输送到 1.7 mL 管中，然后以 400 x g 离心机输送 10 分钟 4 °C。
注：当鼠标处于麻醉状态时，使用物理方法根据批准的动物协议（如宫颈错位）确认死亡。 - 吸气超人。将颗粒重新悬浮在 1 mL 的氯化铵-钾 （ACK） 裂解缓冲器中，用于红血球的裂解。在冰上孵育3分钟-5分钟。离心机 400 x g 5 分钟，4 °C。 如果颗粒仍然是红色的，重复此 ACK 裂解缓冲步骤，直到颗粒变白。
- 将颗粒重新用于 1 mL FCB 和板 0.5 x 106- 1 x 106 每口井的细胞。准备五口96井圆底板井。把盘子放在冰上。
注：使用包含循环发光内容的相同 96 井板（参见步骤 5.6.6）。
- 流细胞测量染色
- 在 400 x g，4 °C 下将 96 井板离心 5 分钟。 丢弃超高音，用 50 μL 的纯化鼠防鼠 CD16/CD32 作为 Fc 块（每 100 μL FCB 1 μg）重新使用颗粒。在冰上孵育5分钟-10分钟。
- iLoop 发光含量的免疫染色：准备含有所有氟铬结合抗体（FCB 中的 1：50 稀释）的混合物：抗 CD45-PerCP、抗 CD11b-PE 和抗 Ly-6G-亚历克萨氟 647。每口井添加 50 μL 的组合，最终体积为 100 μL。
- 白血球的免疫性损害补偿（FCB中的1：50稀释）：仅使用50μL的FCB（未染色的样品，井1），每个单独的氟色素结合抗体的50微升（井2 -4），50μL的组合所有氟铬结合抗体（井5）。最终体积为 100 μL。
- 在不受光线照射的冰上孵育板30分钟。
- 在 400 x g，4 °C 下离心板 5 分钟。 丢弃超高纳特，用 200 μL 的 FCB 清洗。重复此洗涤步骤两次。
- 在血液样本中加入FCB 150 μL/井。
- 在 iLoop 发光内容示例中添加 100 μL/井 FCB。然后 50 μL/荧光计数珠。
- 流细胞学分析
- CD45积极事件和Ly-6G-/Gr-1和CD11b30的表达门。
- 使用样品体积的 100 μL 作为停止条件。
- 根据荧光计数珠制造商提供的信息，计算迁移到 iLoop 流明的 PMN 的绝对数量。
注：数据可以显示为 （1） 流明 30、34、35、（2） 每克组织 PMN 的 PMN 总数，以及 （3） PMN 每毫米3的编号，使用气缸体积公式：V= π（pi） r 2 h（体积 V 表示，r 表示半径，h 表示高度）。
- 补偿控制：白血球
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Representative Results
图1和图2分别描绘了ileal循环和pcLoop模型的示意图。 解剖图片显示了手术的关键步骤，包括肠道部分（图1B和图2B）的外部化，确定一个适当的位置，使血液供应的最小干扰（图1C和图2C）和清洁后，可以充满试剂溶液的iLoop切口结扎（图1D和图2D）。重要的是，iLoop模型保留了重要的血液供应，并允许物理吸收应用试剂，如FITC-dextrans或强大的PMN化疗剂LTB4。在检测结束时，iLoop 应膨胀（如图 1D和图 2D），并显示与鲜红色的间质血管的正常粘膜灌注。根据检测，采集血液以测量血清中的FITC-dextran，或在动物安乐死之前处理iLoop发光含量，以量化PMN TEpM。
为了验证iLoop模型评估肠道渗透性的准确性，进行了FITC-dextran pcLoop检测，以评估TJ相关蛋白质JAM-A在调节肠道屏障功能中的作用。值得注意的是，据报道，JAM-A缺乏导致上皮肠道渗透性增加体外28和后口腔咽部在体内29。其中，使用 pcLoop 模型，与对照组（Jam-a+/+） （图 3A ） 30相比，在 Jam-a-a-/- 小鼠中，4kDa FITC-dextran 血清水平增加了2.5倍。此外，在IEC（维林-克里）上有选择性地丢失JAM-A的小鼠也取得了类似的结果：果酱-a fl/fl） 相比垃圾伴侣控制 （果酱 - 一个fl /fl） （图 3B）30。因此，pcLoop模型能够证实先前的研究，这些研究报告了JAM-A对肠道屏障功能的积极贡献。
然后 pcloop 模型被雇用来研究 Pmn 招募肠道粘膜和随后的 Tepm 在体内。如图4A所示，PCLoop的发光含量中的PMN数是通过流细胞学分析来量化的。PMN被定义为每个细胞表面制造商CD45，CD11b和Ly6G36的细胞阳性。循环白血球被用作对鳄鱼策略的正控制。不出所料，在生理条件下，与 pcLoop 相似的近结肠段中的 PMN 数量较低（图4B）。手术前用亲炎细胞因子TNF®和IFN®进行预处理，结果在pcLoop流明中招募了更多的PMN。PMN 化疗性 LTB4的管理导致支持 LTB4依赖 PMN 招聘的 PMN 计数急剧增加 （图 4B）。与没有LTB4 （图4C）30的细胞因子治疗相比，结肠粘膜中PMN的免疫化学染色证实了在细胞因子和LTB4刺激后PMN的升高招募。使用 pcloop 模型来研究 JAM-A 对 PMN TEPM 的贡献，使用Villin-cre;果酱-一个fl/fl小鼠。上皮JAM-A的丧失导致结肠流明中移民的PMN数量减少，而垃圾控制（图4D）30。这些发现有力地支持了JAM-A在促进PMN迁移跨越肠道上皮的作用，并为报告JAM-A参与血管内皮在各种炎症模型31，37，38的PMN迁移的研究提供了补充的见解。
图1：ile循环模型。 （A） 以示对ileal循环模型的示意图概述。中位腹腔切除术在麻醉下对小鼠进行，并放置在温度控制手术板上。（B） 腹腔（*）、伊莱姆和梅塞的外化。确定了两个适当的连合地点（1，2）。（C） 隔离一段4厘米长：第一个连结（1）被放置在靠近伊莱奥-卡卡尔交界处，第二个连结（2）被放置在离第一个连结4厘米的地方。（D） 在夹膜（1，2）中制作了两个小切口，以创建一个4厘米长的ileal环。去除发光含量和切口结扎后，可将荧光标记和化疗tractants等试剂注入流明。卵体循环血管化良好（黑色箭头）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：近结肠环模型。 （A） pcLoop 模型的示意图概述。中位腹腔切除术在置于温度控制手术板上的麻醉下对小鼠进行。（B） 外化的caecum（*），近结肠，中子龙和伊利姆。确定了两个适当的连合地点（1，2）。（C） 第一个连体字 （1） 放置在靠近 cecum 的位置，第二个连字 （2） 放置在距离第一个连字多 2 厘米的地方。（D） pcLoop 是外部化的，清洁了发光含量，并加注了荧光标记和化疗剂等试剂。pcLoop 是近体结肠的血管化良好的 2 厘米段（黑色箭头表示血液供应）。请单击此处查看此图的较大版本。
图3： JAM-A调节体内肠道渗透性 。 （A） JAM-A缺乏症（Jam-a-/-）导致结肠渗透性增加至 4 kDa FITC-dextran。果酱-/-（13 倍动物;黑点）与Jam-a+/+ 对照（12倍动物;白点）进行比较。4 kda Fitc - dextran （1 毫克 / ml） 在 Hbss 被注射到 pcloop 流明。在120分钟的潜伏期后，在血清中测量荧光。数据表示为 SEM ±表示：n = 3 个独立实验。****P < 0.0001;曼 - 惠特尼 U 测试。（B） 将维林克里的结肠渗透性提高到4 kDa FITC-dextran： 果酱-a fl/fl （18 倍动物， 黑点） 相比对照 （果酱 - 一个fl / fl，12 倍动物， 白点） 。数据是 SEM ±手段：n = 4 个独立实验。****P < 0.0001;曼 - 惠特尼 U 测试。这个数字已经从弗莱明S，路易斯森AC等人修改。请单击此处查看此图的较大版本。
图4： JAM-A 促进 LTB4依赖 PMN 的招聘进入 pcLoop 的流明。（A）盖廷策略，通过带荧光计数珠的流动细胞测量在发光含量中量化PMN（CD45+、CD11b+和Ly-6G/Gr1+ 细胞）。血液样本中的白细胞被用作对鳄鱼策略的阳性控制。（B） 细胞因子（TNF+IFN+，每个100ng）治疗（10倍动物;白点）或细胞因子和1nM LTB 4（10倍动物;黑点）组合后，招募到pcLoop流明中的PMN数量。黑色方块表示基线下的 PMN 数量，在完整的结肠段中评估的长度与未接受任何手术或治疗的 pcLoop 的 pcLoop 相同，具有宣炎细胞因子和 LTB4 （9 倍动物）。数据是平均± SEM（n = 3独立实验）， 克鲁斯卡尔 - 瓦利斯测试与邓恩的多个比较测试。*P < 0.05， ****P < 0.0001。（C） 单单使用细胞因子（左面板、TNF®+IFN®）或细胞因子和LTB4（右面板）治疗后，PCLoop上皮中PMN（抗Ly6G/Gr1抗体）的免疫化学染色。在 LTB4（黑色箭头）的存在下，PCLoop 中招募的 PMN 数量有所增加。规模栏：100μm.（D） 在维林克里的 pcLoop 流明中招募的 PMN 数量;果酱-fl/fl小鼠（11倍动物;黑点）相比，果酱-fl/fl小鼠（10倍动物;白点）响应1nM LTB4。数据是 SEM ±手段：n = 3 个独立实验。*P < 0.05;双尾学生 t 测试。这个数字已经从弗莱明S，路易斯森AC等人修改。请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
对IBD等病理条件下肠道屏障功能调节不良和免疫细胞招募的机制不完全了解。在这里，我们详细介绍了一个强大的体内粘液模型，它采用了肠道或近端结肠的血管化外化肠道部分，并允许评估肠道渗透性、中性粒细胞迁移研究以及其他应用。
iLoop 是在活体动物身上进行的非恢复性手术。麻醉必须在实验过程中持续监测，并强制评估饱和深度。最关键的步骤包括 （1） iLoop 的隔离，（2） 切端的粘合，以及 （3） 通过试剂溶液的发光注射来膨胀 iLoop。在每一个步骤中，都可能发生出血，从而影响 iLoop 的血液供应并影响结果的准确性。值得注意的是，在 PMN TEPM 检测期间的罕见发光出血情况下，此处介绍的流细胞学测定策略将有助于区分直接来自血液（非迁移 PMN）的转移 PMN 和 PMN。与循环PMN（图4D）相比，在iLoop流明中收集的移位PMN表示高水平表面标记CD11b 10。
鉴于iLoop允许对肠道渗透性和血液PMN向肠道流明的迁移进行定量分析，因此必须标准化吸收粘膜面积和血液供应的大小。为了确保动物之间的一致性，肠道段的正确长度必须外化。iLoop 应该是 4 厘米的虹膜循环和 2 厘米的 pcLoop 和香水由可比的血液供应。这些参数的不一致也会导致试剂在发光注射后，在实验组之间和实验组之间增加变异性后，iLoop 的不平等分散。此外，为了避免 iLoop 的过度分散，我们建议在流明中分别注入不超过 250 μL 的试剂溶液，用于虹膜循环和 pcLoop 的 200 μL。
程序的性质有一些固有的局限性。iLoop 是在活体动物身上进行的非恢复性手术。这是一种技术上具有挑战性的显微外科方法：然而，人员可以通过实践获得手术技能。手术的平均持续时间应短（最长15分钟）。我们建议120分钟作为测量肠道渗透性的理想孵化时间，60分钟作为PMN TEPM。孵化时间可以缩短，但延长时间点可能会影响麻醉下动物的整体炎症状态。此外，从手术开始到样品采集/分析的协议不能暂停。
此 iLoop 模型在现有方法方面具有关键优势：（1） iLoop 完全血管化，在生理上更相关， （2） 与评估胃肠道整体完整性并依赖于胃肠道运动性13的口腔咽部法相比，iLoop 允许研究通常与 IBD 有关的肠道中特定局部区域（末端肠或近结肠）的特性， （3） iLoop是第一个体内模型，允许PMN TEPM进入肠道流明以及肠道粘膜的其他部分的定量研究，包括拉米纳丙烯和上皮派系30，35。可以采用高分子量和低分子量FITC标签的dextrans（4至150 kDa）来评估敲击/敲击小鼠或各种实验模型的上皮屏障缺陷的大小选择性和/或严重程度，包括但不限于肠道炎症。此外，FITC标签的脱氧行可以量化在其他器官，如肝脏39或作为研究血脑屏障的新方法，提供洞察肠道渗透性的作用，在肠道肝脏和肠道脑轴40，41，42。此外，这种方法提供了同时执行两个循环（同一动物的环和 pcLoop）并灌输两个不同的荧光标记探头以分析肠道中不同区域的屏障特性的可能性。沿着类似的思路，可以采用平行生成两个循环来专门评估伊利姆与结肠在招募免疫细胞时对同一试剂的差异或相似性。
在这里， 通过使用 pcloop 与Jam - a -空小鼠或老鼠怀有选择性损失的 Jam - a 在 Iecs （维林克里：Jam-a fl/fl），我们证实了先前研究的发现，这些研究报告了TJ相关蛋白质JAM-A在肠道渗透性和PMN TEPM中的积极作用。iLoop的应用可以扩展到各种试剂，包括抗体，微生物病原体和治疗药物30，34，35。值得注意的是，我们使用LTB4 （336.5 Da） 来模拟PMN TEPM，因为它是一种公认的有效和生理的PMN化疗剂，它能够在生理范围内以低浓度 （1 nM） 诱导 TEPM。但是，我们的循环模型可适应其他相关的化疗。我们已经报告了使用细菌肽N-甲基-甲基-莱西-苯丙氨酸（fMLF）诱导大量PMN进入结肠流明30。fMLF （437.5 Da） 是小鼠中一种较低的亲和力化学吸引剂，需要高得多的浓度才能有效 （1μM）。此模型适合使用 CXCL1/KC，这是我们成功使用的另一种强效物理化疗，但 CXCL1/KC 价格昂贵，分子相对较大（11 kDa），在跨越上皮屏障方面效率较低。我们还证明，中和抗体对白细胞特异性特异性丁香CD18 （+M+2） 被注射到循环流明前管理化疗微缩剂LTB4导致减少PMN TEpM佐证结果从体外研究10，30，35.此外，最近还利用pcLoop研究PMN与上皮甘油在控制PMN TEPM43速率方面的影响。试剂被注射到pcLoop流明前管理化疗性LTB4。因此，iLoop 具有广泛的应用范围，可以补充和确认通过体外检测获得的发现。利盖特肠道循环也已被其他人用于研究细菌感染（如沙门氏菌，单细胞基因和大肠杆菌），因此我们相信，这种iLoop模型的适应性容易也可用于这些研究。
在与亲炎症的免疫调解员治疗后，iLoop可用作肠道炎症的急性模型。此外，iLoop可能有助于研究，阐明在接触肠道内病原体或慢性炎症实验模型后，肠道渗透性增强与免疫细胞招募之间的联系。值得注意的是， 我们最近通过采用 pcLoop 模型观察到， 以响应高剂量的促炎细胞因子 TNF® 和 Ifné （每个 1 毫克） 肠道准细胞渗透 与低剂量细胞因子（每个100 ng）30相比，4 kDa FITC-dextran的可操作性导致PMN招募到pcLoop流明中，以响应LTB4。 有趣的是，在这里，我们表明，增加上皮渗透性次要的Jam-a缺乏并没有导致增强PMN TEPM，但减少了它。所有这些结果表明，肠道寄生虫渗透性影响PMN TEPM的速率，但相关性不是直接的，取决于粘附分子的表达（类似于JAM-A），在上皮屏障功能和白细胞迁移16中发挥重要作用的因素。需要进行未来的研究，以研究肠道上皮对免疫细胞反应的微调，以及炎症性肠病等病理粘膜炎症的贡献。
最后，iLoop 模型对现有肠道渗透性和 PMN TEPM 体内评估方法进行了重大改进，这将大大有助于理解肠道炎症和 IBD 调节机制的基础。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢维尔茨堡大学的斯文·弗莱明博士为建立近亲结肠循环模型做出了贡献，肖恩·沃森对老鼠群落的管理做出了贡献，奇特拉·穆拉利达兰帮助获取了iLoop模型的照片。这项工作得到了德国研究基金会/DFG（BO 5776/2-1）的支持，包括KB、R01DK079392、R01DK072564和R01DK061379到C.A.P.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and Material | |||
| BD Alcohol Swabs | BD | 326895 | |
| BD PrecisionGlide Needle, 25G X 5/8" | BD | 305122 | |
| BD PrecisionGlide Needle, 30G X 1/2" | BD | 305106 | |
| BD 1ml Tuberculin Syringe Without Needle | BD | 309659 | |
| 15ml Centrifuge Tube | Corning | 14-959-53A | |
| Corning 96-Well Solid Black Polystyrene Microplate | FisherScientific | 07-200-592 | |
| Corning Non-treated Culture Dish, 10cm | MilliporeSigma | CLS430588 | |
| Cotton Tip Applicator (cotton swab), 6", sterile | FisherScientific | 25806 2WC | |
| Dynarex Cotton Filled Gauze Sponges, Non-Sterile, 2" x 2" | Medex | 3249-1 | |
| EZ-7000 anesthesia vaporizer (Classic System, including heating units) | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Falcon Centrifuge Tube 50ml | VWR | 21008-940 | |
| Fisherbrand Colored Labeling Tape | FisherScientific | 15-901-10R | |
| Halsey Needle Holder (needle holder) | FST | 12001-13 | |
| Kimwipes, small (tissue wipe) | FisherScientific | 06-666 | |
| 1.7ml Microcentrifuge Tubes | Thomas Scientific | c2170 | |
| Micro Tube 1.3ml Z (serum clot activator tube) | Sarstedt | 41.1501.105 | |
| Moria Fine Scissors | FST | 14370-22 | |
| 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap (35 µm nylon mesh) | Falcon | 352235 | |
| Puralube Vet Ointment, Sterile Ocular Lubricant | Dechra | 12920060 | |
| Ring Forceps (blunt tissue forceps) | FST | 11103-09 | |
| Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YD | FisherScientific | NC9452680 | |
| Semken Forceps (anatomical forceps) | FST | 1108-13 | |
| Sofsilk Nonabsorbable Coated Black Suture Braided Silk Size 3-0, 18", Needle 19mm length 3/8 circle reverse cutting | HenrySchein | SS694 | |
| Student Fine Forceps, Angled | FST | 91110-10 | |
| 10ml Syringe PP/PE without needle | Millipore Sigma | Z248029 | |
| 96 Well Cell Culture Plate | Corning | 3799 | |
| Yellow Feeding Tubes for Rodents 20G x 30 mm | Instech | FTP-20-30 | |
| Solutions and Buffers | |||
| Accugene 0.5M EDTA | Lonza | 51201 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer | BioWhittaker | 10-548E | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Corning | 21-023-CV | |
| Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Antibody (1A8) | BioLegend | 127610 | |
| CD11b Monoclonal Antibody, PE, eBioscience (M1/70) | ThermoFisher | 12-0112-81 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Invitrogen | C36950 | |
| Dithiotreitol | FisherScientific | BP172-5 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | R&D Systems | 511550 | |
| Fluorescein Isothiocyanate-Dextran, average molecular weight 4.000 | Sigma | 60842-46-8 | |
| Isoflurane | Halocarbon | 12164-002-25 | |
| Leukotriene B4 | Millipore Sigma | 71160-24-2 | |
| PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11) | BD Pharmingen | 557235 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD FC Block) | BD Bioscience | 553142 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Peprotech | 315-05 | |
| Recombinant Murine TNF-α | Peprotech | 315-01A |
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