Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Funksjonell vurdering av intestinal permeabilitet og nøytrofil transepithelial migrasjon hos mus ved hjelp av en standardisert tarmsløyfemodell

Published: February 11, 2021 doi: 10.3791/62093
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pathology, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Dysregulert intestinal epitelial barrierefunksjon og immunresponser er kjennetegn på inflammatorisk tarmsykdom som forblir dårlig undersøkt på grunn av mangel på fysiologiske modeller. Her beskriver vi en mus intestinal loop modell som bruker en godt vaskulær og eksteriørisert tarmsegment for å studere slimhinne permeabilitet og leukocytt rekruttering in vivo.

Abstract

Tarmslimhinnen er foret av et enkelt lag av epitelceller som danner en dynamisk barriere som tillater paracellulær transport av næringsstoffer og vann samtidig som det forhindrer passasje av lysende bakterier og eksogene stoffer. Et brudd på dette laget resulterer i økt permeabilitet til lysende innhold og rekruttering av immunceller, som begge er kjennetegn på patologiske tilstander i tarmen, inkludert inflammatorisk tarmsykdom (IBD).

Mekanismer som regulerer epitelbarrierefunksjon og transepithelial migrasjon (TEpM) av polymorfoukære nøytrofiler (PMN) forstås ufullstendig på grunn av mangel på eksperimentelle in vivo-metoder som tillater kvantitative analyser. Her beskriver vi en robust murin eksperimentell modell som bruker et eksteriørisert tarmsegment av enten ileum eller proksimal kolon. Den eksteriøriserte tarmsløyfen (iLoop) er fullstendig vaskulær og gir fysiologiske fordeler i forhold til ex vivo kammerbaserte tilnærminger som vanligvis brukes til å studere permeabilitet og PMN-migrasjon på tvers av epitelcellemonolayere.

Vi demonstrerer to anvendelser av denne modellen i detalj: (1) kvantitativ måling av intestinal permeabilitet gjennom påvisning av fluorescensmerket dextrans i serum etter intraluminal injeksjon, (2) kvantitativ vurdering av migrert PMN over tarmepitelet i tarmlumen etter intraluminal innføring av kjemoattractants. Vi demonstrerer gjennomførbarhet av denne modellen og gir resultater ved hjelp av iLoop hos mus som mangler epitelialt tett kryss-assosiert protein JAM-A sammenlignet med kontroller. JAM-A har vist seg å regulere epitelial barrierefunksjon samt PMN TEpM under inflammatoriske responser. Våre resultater ved hjelp av iLoop bekrefter tidligere studier og fremhever viktigheten av JAM-A i regulering av intestinal permeabilitet og PMN TEpM in vivo under homeostase og sykdom.

iLoop-modellen gir en svært standardisert metode for reproduserbare in vivo-studier av intestinal homeostase og betennelse og vil forbedre forståelsen av tarmbarrierefunksjon og slimhinnebetennelse i sykdommer som IBD betydelig.

Introduction

Tarmslimhinnen omfatter et enkelt lag med kolonne intestinale epitelceller (IECer), underliggende lamina propria immunceller og muskelslimhinnen. Foruten sin rolle i absorpsjonen av næringsstoffer, er tarmepitelet en fysisk barriere som beskytter kroppsinteriøret mot lysende kommensale bakterier, patogener og diettantigener. I tillegg koordinerer IECer og lamina propria immunceller immunresponsen som induserer enten toleranse eller respons avhengig av kontekst og stimuli. Det har blitt rapportert at forstyrrelsen av epitelbarrieren kan komme før utbruddet av patologisk slimhinnebetennelse og bidra til inflammatorisk tarmsykdom (IBD) som omfatter både ulcerøs kolitt og Crohns sykdom1,2,3,4,5,6,7. Personer med ulcerøs kolitt presenterer overdreven transepithelial migrasjon (TEpM) av polymorfoukære nøytrofiler (PMN) som danner kryptabscesser, et funn som har vært forbundet med alvorlighetsgraden av sykdom8,9. Selv om kompromittert epitelial barrierefunksjon og overdreven immunrespons er kjennetegn på IBD, er det mangel på eksperimentelle in vivo-analyser for å utføre kvantitative vurderinger av tarmpermeabilitet og immuncellerekruttering i tarmslimhinnen.

De vanligste metodene som brukes til å studere intestinal epitelial permeabilitet og PMN TEpM bruker ex vivo kammerbaserte tilnærminger ved hjelp av IEC monolayers dyrket på halvgjennomtrengelige porøsemembraninnlegg 10,11,12. Epitelial barriereintegritet overvåkes enten ved målinger av transepithelial elektrisk motstand (TEER) eller den paracellulære fluxen til Fluorescein isothiocyanate (FITC)-merket dextran fra apikalt til basalrom13,14,15. På samme måte studeres PMN TEpM vanligvis som svar på et kjemoattractant som legges til i det nedrekammeret 16. PMN plasseres i det øvre kammeret, og etter en inkubasjonsperiode samles PMN som har migrert inn i basalrommet og kvantifiseres. Selv om disse metodene er nyttige, enkle å utføre og svært reproduserbare, er de åpenbart reduksjonistiske tilnærminger og representerer ikke nødvendigvis en nøyaktig refleksjon av in vivo-forhold.

Hos mus er en vanlig analyse for å studere intestinal paracellulær permeabilitet ved oral gavage av FITC-dextran og etterfølgende måling av FITC-dextran utseende i blodserumet13,17. Ulempen med denne analysen er at den representerer en vurdering av den generelle barriereintegriteten i mage-tarmkanalen i stedet for regionale tarmbidrag. I tillegg brukes Evans blå ofte til å evaluere vaskulær lekkasje i vivo18 og har også blitt brukt til å evaluere intestinal slimhinne permeabilitet hos mus og rotte19,20,21. Kvantifiseringen av Evans blå i tarmslimhinnen krever ekstraksjon fra vev som bruker inkubasjon i formamid over natten. Derfor kan det samme vevet ikke brukes til å studere intestinal epitelial permeabilitet og nøytrofil infiltrasjon.

Her fremhever vi en enkel protokoll som reduserer antall dyr som trengs for å samle inn reproduserbare data om kolonisk slimhinnegjennomtrengelighet og leukocytttransepithelial migrasjon in vivo. Vi anbefaler derfor bruk av FITC-dextrans som lett kan påvises i blodserum uten at det går på bekostning av integriteten til tarmløkker som kan høstes for videre analyse. Vær oppmerksom på at de tarmligalte løkkene har blitt brukt i ulike arter (inkludert mus, rotte, kanin, kalv) for å studere bakteriell infeksjon (som Salmonella, Listeria monocytogenes og Escherichia coli)22,23,24,25 samt intestinal permeabilitet26; Men så vidt vi vet er det ingen studier som undersøker mekanismer for PMN TEpM i bestemte regioner i tarmen som ileum eller kolon som ofte er involvert i IBD.

Her beskriver vi musens tarmsløyfe (iLoop) modell som er en robust og pålitelig mikrokirurgisk in vivo-metode som bruker et godt vaskulært og eksteriørisert tarmsegment av enten ileum eller proksimal kolon. iLoop-modellen er fysiologisk relevant og tillater vurdering av tarmbarriereintegritet og PMN TEpM på levende mus under anestesi. Vi demonstrerer to anvendelser: 1) kvantifisering av serumnivåer på 4 kDa FITC-dextran etter intraluminal administrering i iLoop 2) kvantifisering av transmigrert PMN i iLoop lumen etter intraluminal injeksjon av potent chemottractant Leukotriene B4 (LTB4)27. Videre bruker du iLoop-modellen med Jam-a-null mus eller mus som har selektivt tap av JAM-A på IECer (Villin-cre; Jam-a fl/fl) sammenlignet med kontrollmus, er vi i stand til å bekrefte tidligere studier som har rapportert et stort bidrag for tett koblingsrelatert protein JAM-A til intestinal permeabilitet og nøytrofiltransmigrasjon15,28,29,30,31.

iLoop-modellen er en svært funksjonell og fysiologisk metode som kan brukes til å bekrefte in vitro-analyser. Videre er dette en allsidig eksperimentell modell som tillater studiet av ulike reagenser som kan injiseres i sløyfelumen, inkludert kjemokiner, cytokiner, bakterielle patogener, toksiner, antistoffer og terapeutiske midler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med retningslinjene og retningslinjene til National Institutes of Health og godkjent av Institutional Animal Care &Use Committee ved University of Michigan.

1. Preoperativ forberedelse

MERK: Denne metoden ble generert ved hjelp av voksne mus fra C57BL / 6 genetisk bakgrunn, i alderen 8 - 12 uker. Alle mus ble holdt under strenge spesifikke patogenfrie forhold med ad libitum tilgang til normal chow og vann. Resultatene ble oppnådd ved hjelp av C57BL/6, Jam-a - nullmus (Jam-a-/-) eller mus som hadde selektivt tap av JAM-A på IECer (Villin-cre; Jam-afl/fl) og kullkamerat Jam-afl/fl-kontroller som tidligere beskrevet30.

  1. Forberedelse av område
    1. Utfør kirurgi i rent område. Intestinal Loop-modellen er imidlertid en ikke-overlevelseskirurgi som ikke krever aseptisk / steril teknikk. Følg veterinær sanitærpraksis og bruk rensede kirurgiske instrumenter (dvs. skrubbet med såpe, skyllet med vann etterfulgt av 70% etanol).
    2. Slå på et temperaturkontrollert kirurgisk brett (eller varmeputer) og tilpasset lyskilde for å holde dyret fra hypotermi under anestesi og kirurgi.
    3. Forbered ligaturer ved å kutte 6 cm segmenter av ikke-absorberbare 4-0 silkekirurgiske suturer.
    4. Forbered bomullsgasser (5 cm x 5 cm) som er kuttet i midten etter en ellipsoid form. Disse vil bli brukt til å dekke midtlinjen laparotomi og forhindre direkte kontakt mellom den eksteriøriserte iLoop og dyrepels. Bløtlegg de kuttede gasbindene i varm Hanks balansert saltoppløsning (HBSS) i en petriskålbeholder.
    5. Forbered våte bomullspinne gjennomvåt i varm HBSS som vil bli brukt til å håndtere organer og eksteriørisert iLoop.
    6. Forbered 10 ml sprøyte fylt med varm HBSS og fest til et gult fôringsrør. Denne sprøyten vil bli brukt til fuktighetsgivende eksponert vev under operasjonen og for å forsiktig skylle iLoop av fekalt innhold.
  2. Dyreforberedelse
    1. Bedøv dyret i samsvar med den godkjente dyreprotokollen. I denne protokollen administreres en blanding av isofluran og oksygen gjennom en anestesi fordamper. I henhold til produsentens instruksjoner justerer du oksygenmengden til 1 l/min. Sett fordamperen på 5% og forhåndslad induksjonskammeret. Etter 5 min, reduser isofluran fordamper til 2% - 2,5%.
    2. Plasser dyret i induksjonskammeret i 3 min - 5 min, overfør deretter dyret til et oppvarmet operasjonsbrett og koble en anestesi neseplugg. Hold dyret i liggende stilling av de fire lemmer ved hjelp av tape.
      MERK: Som anestesialternativ kan en blanding av ketamin (80 mg/kg - 100 mg/kg) og xylazin (5 mg/kg - 10 mg/kg) fortynnet i saltoppløsning (0,9 % NaCl) administreres ved intraperitoneal injeksjon. Anestesi bør opprettholdes gjennom hele operasjonen ved intramuskulær administrering av ketamin/xylazin (ved 0,1 - 0,25 ganger innledende doser) for å sikre bedøvelsesdybde. Hvis tilgjengelig, anbefales en isofluran anestesi fordamper på det sterkeste for å sikre bedre reproduserbarhet, overlevelse og forhindre dyresmerter.
    3. Påfør oftalmisk salve på begge øynene for å forhindre hornhinnetørking.
    4. Utfør en fysisk eksamen som inkluderer hjertefrekvens (rundt 500 slag/min) og rytme, slimhinnefarge (rosa), kapillær påfyllingstid (< 2 s), respirasjonsfrekvens (ikke lavere enn 40 - 60 pust/min) og temperatur (36,5 °C)32.
    5. Før du går videre til de neste trinnene, må du vurdere bedøvelsesdybden ved å tråkkuttakets refleks. Bruk en smertefull stimulus (klemme) av huden mellom tærne og/ eller tåputene. Musen vil reagere ved å trekke seg sammen og fjerne benet. Denne pedalrefleksen forsvinner når dyret bedøves dypt.
      MERK: Overvåking av vitale stoffer og pedalrefleks anbefales gjennom anestesi minst hvert 15. Institusjonell dyrepleie- og brukskomité (IACUC) retningslinjer for evaluering av bedøvelsesdybde anbefaler overvåking av følgende: (a) farge på hale, fot og slimhinne (som tunge). Farge rosa som normal og blek eller blå som en indikasjon på redusert blodperfusjon eller respiratorisk nød; (b) evaluering av pustemønsteret som regelmessige versus uregelmessige pust. En rektal temperatursonde, gnageroksymeter og pulsmålere kan brukes til vurdering av henholdsvis kroppstemperatur, hjerte- og åndedrettsfrekvens.

2. Generering av ileal sløyfen

  1. Hudforberedelse: Skrubb pelsen i bukens midtlinje med alkoholpinner eller gasbindsvamp gjennomvåt med 70% etanol. Ikke våt et bredt område av pels med alkohol for å forhindre hypotermi.
  2. Bruk saks, utfør en midline laparotomy. Lag et vertikalt snitt i midten av magen (ca. 2 cm i lengde) og eksponer bukhinnen. Vær forsiktig så du ikke skader intra-abdominale organer.
  3. Plasser forhåndskuttet våt bomullsgass over det eksponerte intra-bukhulen.
  4. Bruk våte bomullspinne for å mobilisere og eksteriørisere caecum. Plasser forsiktig caecum på den våte bomullsgassen.
    MERK: Caecum er lokalisert i venstre kaudale kvadrant i bukhulen i et flertall mus uavhengig av dyrets kjønn.
  5. Bruk våte bomullspinne til å mobilisere og forsiktig eksteriørere ileumet som klemmedelen (distal ende) er festet til caecum (Figur 1B).
  6. Distribuer minst 6 cm terminal ileum på den våte bomullsgassen uten forstyrrelse av mesenteriske kar og blodtilførsel. Blodtilførselen opprettholdes hvis det ikke er blødning og vevet opprettholder sin rosa farge (Figur 1B).
    MERK: Unngå tørking av eksponert vev ved å opprettholde vev fuktig til enhver tid med varm HBSS (hver 2 - 3 min) ved hjelp av 10 ml sprøyte festet til et gult materør (trinn 1.1.6).
  7. I nærheten av kaecum, identifisere hovedpulsåren som forsyner ileum i mesenteriet. Finn deretter to ligation steder i mesenteriet som er fri for kritiske blodårer.
  8. Bruk stumpe vevs tang, ta godt tak i terminal ileum (nærmest caecum) og bruk fine spiss tang, fenestrate mesentery unngå blodårene. Plasser silke sutur over perforering og knytte en kirurgisk knute for å skape den første ligation (distal enden av løkken).
  9. Bruk linjalen til å måle 4 cm fra den første ligaturen og opprette den andre ligaturen (den proksimale enden av løkken) som nevnt i trinn 2.8 (Figur 1C).
  10. Med fin saks forsiktig kuttet ved siden av hver ligation for å isolere 4 cm ileal sløyfe, holde intakt blodtilførsel og mesenterisk membran.
    MERK: Klipp av begge ender av det eksterierte segmentet av iLoop, skyll deretter forsiktig som et nødvendig trinn som forhindrer interferens med lystetthet (fekal materie), og dermed lette jevn spredning av FITC-dextrans eller kjemoaktiske stimuli over hele lengden av det isolerte segmentet, samt muliggjør mer nøyaktig kvantifisering av leukocytter ved strømningscytometri. Denne prosedyren tillater også jevn distensjon av slimhinnen etter injeksjon av spesifiserte mengder reagens og bedre reproduserbarhet mellom dyr.
  11. Skyll forsiktig innholdet i det ileale sløyfesegmentet med varm HBSS ved hjelp av et fleksibelt gult materør festet til en 10 ml sprøyte (se trinn 1.1.6).
  12. Ligate de to kuttede endene av den skyllede ileal sløyfen ved hjelp av silke sutur.
  13. Bruk en 1 ml sprøyte med 30 G kanyle for langsomt å injisere 250 μL reagens som FITC-dextrans (trinn 4.2) eller kjemokin (trinn 5.3) i tarmlumen. Ilealløkken vil blåse opp og forårsake en moderat distensjon av slimhinnen (figur 1D).
    MERK: Injiser reagenset i sløyfelumen på motsatt side av den mesenteriske arterien. Vær forsiktig så du ikke trekker ut ileal sløyfen fra dyret mens du injiserer for å unngå å rive blodårene og indusere blødning.
  14. Bruk våte bomullspinne, legg forsiktig tilbake ilealløkken, proksimal ileum og caecum.
  15. Bruk en nåleholder, anatomiske tang og 3,0 ikke-absorberbare silke suturer med omvendt skjærenål for å lukke bukveggen.
  16. Plasser dyret i et temperaturregulert anestesikammer for inkubasjonsperioden.

3. Generering av den proksimale kolonløkken (pcLoop)

MERK: For detaljer om mus som ble brukt til generering av pcLoop, se informasjonen som er gitt i begynnelsen av protokolldelen.

  1. Utfør trinn 2.1. - 2.4. som beskrevet ovenfor for ileal sløyfen.
  2. Bruk våte bomullspinne, eksteriør hele ileum og legg den på toppen av en våt bomullsgass. Identifiser den proksimale tykktarmen og blodtilførselen som ligger i mesocolonen. Mobiliser den proksimale kolon og ved å bruke fine spiss tang skape den første ligaturen i et område fri for fartøy i mesocolon på ca 0,5 cm distal fra caecum (Figur 2B).
  3. Mål 2 cm fra den første ligaturen og lag en ny ligatur i et område uten blodtilførsel i mesocolon (figur 2C).
  4. Bruk fin saks forsiktig kuttet ved siden av hver ligation for å isolere en 2 cm lang pcLoop.
    MERK: Som nevnt i notatet under trinn 2.10, er det viktig å kutte av begge ender for å isolere en pcLoop som rengjøres forsiktig av lysende innhold. Klipp forsiktig gjennom det koloniale vevet og mesocolon for å forhindre at små kar blør inn i tarmlumen. Bruk om nødvendig termisk cautery for å begrense blødningen på snittstedet.
  5. Skyll pcLoop forsiktig med varm HBSS for å fjerne avføring ved hjelp av et fleksibelt gult materør festet til 10 ml sprøyte (se trinn 1.1.6).
  6. Ligate de to kuttede endene av den spylte pcLoop ved hjelp av silke sutur.
  7. Bruk en 1 ml sprøyte med 30 G kanyle for langsomt å injisere 200 μL reagens som FITC-dextrans (trinn 4.2) eller kjemokin (trinn 5.3) i tarmlumen. PcLoop vil blåse opp forårsaker en moderat distensjon av slimhinnen (Figur 2D).
    MERK: Injiser reagenset i pcLoop lumen på motsatt side av den mesenteriske arterien. Sikre konsistens mellom dyr og lag en 2 cm lang pcLoop for å sikre lik distensjon av slimhinnen.
  8. Bruk våte bomullspinne for å forsiktig plassere tilbake den ligaterte pcLoop, ileum og caecum i bukhulen.
  9. Bruk en nåleholder, anatomiske tang og 3,0 ikke-absorberbare silke suturer med omvendt skjærenål for å lukke bukveggen.
  10. Plasser dyret i et temperaturregulert anestesikammer for inkubasjonsperioden.

4. Kvantitativ vurdering av intestinal permeabilitet: 4 kDa FITC-dextran analyse

  1. Utfør en ileal sløyfe eller pcLoop (som beskrevet ovenfor).
  2. Bruk en 1 ml sprøyte med 30 G nål, injiser i tarmlumen enten 250 μL (ileum - trinn 2,13) eller 200 μL (kolon - trinn 3,7) av 4 kDa FITC-dextranoppløsning (1 mg / ml i HBSS). Hold den ubrukte FITC-dextran-løsningen beskyttet mot lys for å klargjøre standardkurven etter serumoppsamling.
  3. For ileal-sløyfen følger du trinn 2.14 til 2.16, for pcLoop trinn 3.8 til 3.10. Kort sagt, sett organer og iLoop tilbake på plass i bukhulen, lukk bukveggen.
  4. Plasser dyret i 120 min i et oppvarmet anestesikammer.
  5. Etter inkubasjonsperioden åpne bukveggen, få tilgang til hjertet og utfør hjerte punktering ved hjelp av en 1 ml sprøyte med 25G nål for å samle blodet. Overfør blod til et 1,3 ml serumproppaktivatorrør, bland forsiktig og hold isen beskyttet mot lys. Samle minst 500 μL blod per mus.
    MERK: Dyr avlives når de er under anestesi ved hjelp av en fysisk metode som halshugging eller livmorhalsdislokasjon, og i samsvar med den godkjente dyreprotokollen.
  6. Sentrifuge serum clot aktivatorrør i 5 min ved 10.000 x g ved romtemperatur i henhold til produsentens anbefalinger. Samle serumet (supernatant) og overfør til et 1,7 ml sentrifugerør. Hold røret på is og beskyttet mot lys.
  7. Kvantifisering av fluorescens i blodserum
    1. Forbered en standardkurve av FITC-dextran 4 kDa i serum av kontrollmus (saltvann eller HBSS er et gyldig alternativ). Lag en todelt seriell fortynning med en startkonsentrasjon på 1 mg/ml FITC-dextran. FITC-dextran 4 kDa konsentrasjoner som måles varierer mellom 0,25 mg/ml og 2 μg/ml.
    2. Overfør like store mengder av prøven og standardene til en svart 96-brønnsplate (flat bunn) og mål FITC i en fluorescensplateleser (Excitation 490 nm, Emission 520 nm), i henhold til produsentens instruksjoner og publiserte protokoller33. Beregn FITC-konsentrasjonen basert på standardkurven eller nåværende permeabilitetsverdier som foldeendring normalisert til den eksperimentelle kontrollgruppen.

5. Kvantitativ vurdering av migrert PMN i tarmlumen etter intraluminal stimulering med kjemokiner

MERK: Svært få PMN bor i tarmslimhinnen på baseline-nivå. Forbehandling av dyr med proinflammatoriske cytokiner resulterer i et inflammatorisk miljø som letter PMN-rekruttering fra blodstrøm til tarmslimhinnen.

  1. Bruk en 1 ml sprøyte med 30 G nål, utfør intraperitoneal (i.p.) injeksjon av en steril oppløsning på 100 ng tumornekrosefaktor-α (TNFα) og 100 ng interferon-γ (INFγ) i 200 μL fosfatbufret saltvann (PBS).
  2. Etter 4 - 24 timers forbehandling med proinflammatoriske cytokiner, utfør en ileal sløyfe eller pcLoop (som beskrevet ovenfor).
  3. Bruk en 1 ml sprøyte med 30 G nål, injiser i tarmlumen enten 250 μL (ileum - trinn 2,13) eller 200 μL (kolon - trinn 3,7) av kjemoattractant løsning Leukotriene B4 (LTB4) 1 nM i HBSS.
    MERK: Leukotriene B4 (LTB4) brukes i denne protokollen som et potent kjemoattractant for PMN. Andre kjemoattractants som N-Formylmethionyl-leucyl-fenylalanine (fMLF) eller kjemokin (C-X-C motiv) ligand 1 (CXCL1/KC) kan også brukes til å indusere betydelig rekruttering av PMN i koloni lumen30.
  4. For ileal sløyfen følger du trinn 2.14 til 2.16. For pcLoop følger du trinn 3.8 til 3.10. Kort sagt, sett organer og iLoop tilbake på plass i bukhulen, lukk bukveggen.
  5. Plasser dyret i 60 min i et oppvarmet anestesikammer.
  6. Innsamling av tarmsløyfeinnholdet
    1. Forbered løsninger og oppbevar på is: For ileal loop og pcLoop, lag en vaskebuffer som inneholder 2 mM Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 5 mM Dithiothreitol (DTT) og 2% FBS i steril PBS uten kalsium og magnesium.
    2. Etter inkubasjonsperioden og under anestesivedlikehold, åpne bukveggen og trekk ut iLoop (ileal sløyfe eller pcLoop). Avlive dyr når de er under anestesi ved hjelp av en fysisk metode som halshugging eller livmorhalsdislokasjon, og i samsvar med den godkjente dyreprotokollen.
    3. Skyll sløyfen med kald PBS for å fjerne eventuell gjenværende blodforurensning og absorbere overskudd av PBS med vevsservietter. Samle forsiktig sløyfeinnholdet i et 1,7 ml sentrifugerør (ca. 250 μL for ileal sløyfe og 200 μL for pcLoop). Skyll løkken med 500 μL kaldvaskbuffer og plasser røret på is umiddelbart etter oppsamling.
      MERK: DTT bidrar til å oppløse slim. Hvis iLoop luminal innhold er veldig viskøs (avhengig av musen genetisk bakgrunn), fortynn det 1:2 eller 1:3 med vaskebuffer som inneholder DTT.
    4. Før den lysende innholdsløsningen gjennom et 35 μm nylonnettfilter ved hjelp av et 5 ml rundbunnsrør med cellesilhette. Dette trinnet bidrar til å fjerne vevsfragmenter og cellemengder. Skyll cellesilen med 1 ml vaskebuffer.
    5. Sentrifugerør ved 400 x g i 5 min ved 4 °C. Kast supernatant, skyll pellets med 500 μL - 1 ml vaskebuffer, og sentrifuger deretter ved 400 x g i 5 min, 4 °C.
    6. Resuspend iLoop lysende cellepellet i 200 μL strømning cytometribuffer (FCB) som inneholder 2% FBS i steril PBS uten kalsium og magnesium. Celler kan holdes i et rør eller overføres til en 96-brønns rund bunnplate for strømningscytometrifarging og analyse.
  7. Flow Cytometry farging og analyse
    1. Kompensasjonskontroller: hvite blodlegemer
      1. Forbered en 1 ml sprøyte med 25 G kanyle ferdigfylt med steril 0,5 M EDTA (pH 8,0). 10 % EDTA per forventet blodvolum (100 μL EDTA for 1 ml blod).
      2. Samle blod under anestesi ved hjerte punktering. Overfør blod til et 1,7 ml rør, deretter sentrifuger ved 400 x g i 10 min, 4 °C.
        MERK: Mens musen er under anestesi, bruk en fysisk metode for å bekrefte døden i samsvar med den godkjente dyreprotokollen (for eksempel cervical dislokasjon).
      3. Aspirer supernatanten. Resuspend pellet i 1 ml Ammonium-Klorid-kalium (ACK) lysisbuffer for lysis av røde blodlegemer. Inkuber i 3 min - 5 min på is. Sentrifuge 400 x g i 5 min, 4 °C. Hvis pelletsen fortsatt er rød, gjentar du dette ACK lysisbuffertrinnet til pelletsen blir hvit.
      4. Resuspend pellet i 1 ml FCB og plate 0,5 x 106- 1 x 106 av celler per brønn. Forbered fem brønner av en 96-brønns rundbunnsplate. Plasser platen på isen.
        MERK: Bruk den samme 96-brønnsplaten som inneholder sløyfelysinnholdet (se trinn 5.6.6).
    2. Strømning cytometri farging
      1. Sentrifuger 96-brønnsplaten i 5 min ved 400 x g, 4 °C. Kast supernatanten og resuspend pellets med 50 μL renset rotte antimus CD16/ CD32 som en Fc-blokk (1 μg per 100 μL FCB). Inkuber i 5 min - 10 min på is.
      2. Immunostaining av iLoop luminal innhold: Forbered en blanding som inneholder alle fluorokrom-konjugerte antistoffer (1:50 fortynning i FCB): anti-CD45-PerCP, anti-CD11b-PE og anti-Ly-6G-Alexa Fluor 647. Tilsett 50 μL av kombinasjonen per brønn, for et sluttvolum på 100 μL.
      3. Immunostaining av de hvite blodcellene for kompensasjoner (1:50 fortynning i FCB): Bruk 50 μL FCB alene (unstained sample, brønn 1), 50 μL av hver enkelt fluorokrom-konjugert antistoff (brønn 2 - 4), 50 μL av kombinasjonen av alle fluorokromkonjugerte antistoffer (brønn 5). Endelig volum på 100 μL.
      4. Inkuber platen i 30 min på is beskyttet mot lys.
      5. Sentrifuger platen i 5 min ved 400 x g, 4 °C. Kast supernatanten og vask med 200 μL FCB. Gjenta dette vasketrinnet to ganger.
      6. Tilsett FCB 150 μL/brønn i blodprøvene.
      7. Legg til 100 μL/brønn FCB i iLoop luminal innholdsprøve. Deretter 50 μL / brønn av fluorescerende telleperler.
    3. Analyse av strømningscytometri
      1. Gate for CD45 positive hendelser og for uttrykket av Ly-6G-/Gr-1 og CD11b30.
      2. Bruk 100 μL av prøvevolumet som en stoppbetingelse.
      3. Beregn det absolutte antallet PMN som har migrert inn i iLoop lumen etter informasjonen fra produsenten av fluorescerende telleperler.
        MERK: Data kan presenteres som (1) totalt antall PMN i lumen30,34,35, (2) antall PMN per gram vev samt (3) antall PMN per mm3 ved å bruke formelen for volum av en sylinder: V = π(pi) r 2 t (V for volum, r for radius og t for høyde).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En skjematisk representasjon av ileal loop- og pcLoop-modellene er avbildet i henholdsvis figur 1 og figur 2. De anatomiske bildene viser de kritiske trinnene i prosedyren, inkludert eksteriørisering av tarmsegmentet (figur 1B og figur 2B), identifisering av et passende sted for ligasjoner som tillater minimal forstyrrelse av blodtilførselen (figur 1C og figur 2C) og rengjøring etterfulgt av ligasjon av kuttendene av iLoop som kan fylles med reagensløsning ( figur1D og figur 2D). Det er viktig at iLoop-modellen bevarer vital blodtilførsel og tillater fysiologisk absorpsjon av påførte reagenser som FITC-dextrans eller den potente PMN-kjemoattractant LTB4. På slutten av analysen skal iLoop blåses opp (som vist i figur 1D og figur 2D) og vise normal slimhinneperfusjon med knallrøde mesenteriske kar. Avhengig av analysen samles blod for å måle FITC-dextran i serum eller iLoop lysinnhold behandles for kvantifisering av PMN TEpM før euthanizing dyret.

For å verifisere nøyaktigheten av iLoop-modellen for vurdering av intestinal permeabilitet, ble det utført en FITC-dextran pcLoop-analyse for å evaluere rollen til TJ-assosiert protein JAM-A i reguleringen av tarmbarrierefunksjonen in vivo. Vær oppmerksom på at det har blitt rapportert at JAM-A-mangel fører til økt epitelial intestinal permeabilitet i vitro28 og etter oral gavage in vivo29. Heri, ved hjelp av pcLoop-modellen, ble en 2,5 ganger økning i 4 kDa FITC-dextran serumnivåer kvantifisert i Jam-a-null mus (Jam-a-/-) sammenlignet med kontroller (Jam-a+/+) (Figur 3A)30. Videre ble lignende resultater oppnådd med mus som hadde selektivt tap av JAM-A på IECer (Villin-cre; Jam-a fl/fl) sammenlignet med kullkontroller (Jam-a fl/fl) (Figur 3B)30. Derfor var pcLoop-modellen i stand til å bekrefte tidligere studier som har rapportert et positivt bidrag for JAM-A til tarmbarrierefunksjonen.

Deretter ble pcLoop-modellen brukt til å studere PMN-rekruttering til tarmslimhinnen og påfølgende TEpM in vivo. Som vist i figur 4Able antall PMN i lysinnholdet i pcLoop kvantifisert ved strømningscytometrianalyse. PMN ble definert som celler som var positive for hver av celleoverflateprodusentene CD45, CD11b og Ly6G36. Sirkulerende hvite blodlegemer ble brukt som positiv kontroll for gating strategi. Som forventet var antall PMN tilstede i et segment av proksimal kolon lik pcLoop lav under fysiologiske forhold (Figur 4B). Forbehandling med proinflammatoriske cytokiner TNFα og IFNγ før operasjonen resulterte i utvidet antall PMN rekruttert i pcLoop lumen. Administrasjonen av PMN-kjemoattractant LTB4 førte til en dramatisk økning i PMN-tellinger som støttet en LTB4-avhengigPMN-rekruttering (figur 4B). Immunhiistokjemisk farging av PMN i den koloniske slimhinnen bekrefter den forhøyede rekrutteringen av PMN etter stimulering med cytokiner og LTB4 sammenlignet med cytokinbehandling uten LTB4 (figur 4C)30. PcLoop-modellen ble brukt til å studere bidraget fra JAM-A til PMN TEpM ved å bruke Villin-cre; Jam-a fl/fl mus. Tap av epitelial JAM-A førte til et redusert antall transmigrerte PMN i den koloniske lumen sammenlignet med kullmatkontroller (Figur 4D)30. Disse funnene støtter sterkt en rolle for JAM-A i å legge til rette for PMN-migrasjon over tarmepitelet og gi komplementær innsikt til studier som har rapportert involvering av JAM-A i PMN-migrasjon over vaskulært endotel i ulike modeller av betennelse31,37,38.

Figure 1
Figur 1: Ileal loop-modellen. (A) Skjematisk oversikt over ileal loop-modellen. Median laparotomi utføres på mus under anestesi og plasseres på et temperaturkontrollert operasjonsbrett. (B) Eksteriør av caecum (*), ileum og mesenteri. To tilstrekkelige steder for ligasjon er identifisert (1,2). (C) Isoler et segment på 4 cm lengde: Den første ligaturen (1) plasseres nær ileo-caecal-krysset og en annen ligatur (2) plasseres 4 cm fra den første ligaturen. (D) To små snitt er laget i mesenteriet (1, 2) for å skape en 4 cm lang ileal sløyfe. Etter fjerning av lysende innhold og ligasjon av cut-ends, kan reagenser som fluorescerende markører og kjemoattractants injiseres i lumen. Ileal sløyfen er godt vaskulær (svarte pilspisser). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Den proksimale kolonløkkemodellen. (A) Skjematisk oversikt over pcLoop-modellen. Median laparotomi utføres på mus under anestesi plassert på et temperaturkontrollert kirurgibrett. (B) Eksteriør av caecum (*), proksimal kolon, mesocolon og ileum. To tilstrekkelige steder for ligasjon er identifisert (1,2). (C) Den første ligaturen (1) plasseres nær kaecum og en annen ligatur (2) plasseres 2 cm mer distal fra den første ligaturen. (D) PcLoop er eksteriørisert, rengjort av lysende innhold og oppblåst med reagenser som fluorescerende markører og kjemoattractants. PcLoop er et godt vaskulært 2 cm segment av proksimal kolon (svarte pilspisser indikerer blodtilførsel). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: JAM-A regulerer tarmgjennomtrengelighet in vivo. (A) JAM-A-mangel (Jam-a-/-) førte til økt kolon permeabilitet til 4 kDa FITC-dextran. Jam-a-/- (13x dyr; svarte prikker) ble sammenlignet med Jam-a+/+ kontroller (12x dyr; hvite prikker). 4 kDa FITC-dextran (1 mg/ml) i HBSS ble injisert i pcLoop lumen. Fluorescens ble målt i blodserum etter en inkubasjonsperiode på 120 minutter. Data uttrykkes som midler ± SEM; n = 3 uavhengige eksperimenter. ****P < 0,0001; Mann-Whitney U-test. (B) Økt kolon permeabilitet til 4 kDa FITC-dextran i Villin-cre; Jam-afl/fl (18x dyr, svarte prikker) sammenlignet med kontroller (Jam-afl/fl, 12x dyr, hvite prikker). Data er midler ± SEM; n = 4 uavhengige eksperimenter. ****P < 0,0001; Mann-Whitney U-test. Denne figuren er endret fra Flemming S, Luissint AC et al.30. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: JAM-A fremmer LTB4-avhengig rekruttering av PMN til lumen på pcLoop. (A) Gating strategi for å kvantifisere PMN (CD45+, CD11b+, og Ly-6G / Gr1+ celler) i lysende innhold ved flow cytometri med fluorescerende telleperler. Leukocytter fra blodprøver ble brukt som en positiv kontroll for gating strategien. (B) Antall PMN rekruttert til pcLoop lumen etter cytokin (TNFα+IFNγ, 100ng hver) behandling (10x dyr; hvite prikker) eller etter en kombinasjon av cytokiner og 1 nM LTB4 (10x dyr; svarte prikker). Svarte firkanter representerer antall PMN ved baseline som vurdert i et intakt kolonisk segment identisk i lengden til pcLoop som ikke ble utsatt for noen kirurgi eller behandling med proinflammatoriske cytokiner og LTB4 (9x dyr). Data er gjennomsnittet ± SEM (n = 3 uavhengige eksperimenter), Kruskal-Wallis test med Dunns multippel sammenligningstest. *P < 0,05, ****P < 0,0001. (C) Immunhiistokjemisk farging av PMN (anti-Ly6G/Gr1 antistoff) i epitelet i pcLoop etter behandling med cytokiner alene (venstre panel, TNFα+IFNγ) eller en kombinasjon av cytokiner og LTB4 (høyre panel). Antall PMN rekruttert i pcLoop økes i nærvær av LTB4 (svarte pilspisser). Skala bar: 100 μm. (D) Antall PMN rekruttert i pcLoop lumen i Villin-cre; Jam-afl/fl mus (11x dyr; svarte prikker) sammenlignet med Jam-afl/fl mus (10x dyr; hvite prikker) som svar på 1 nM LTB4. Data er midler ± SEM; n = 3 uavhengige eksperimenter. *P < 0,05; 2-tailed Student's t test. Denne figuren er endret fra Flemming S, Luissint AC et al.30. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mekanismene som er ansvarlige for dysregulering av tarmbarrierefunksjon og immuncellerekruttering under patologiske forhold som IBD, forstås ufullstendig. Her beskriver vi en robust in vivo murine modell som bruker et godt vaskulært eksteriørisert tarmsegment av enten ileum eller proksimal kolon og tillater vurdering av tarmpermeabilitet, nøytrofil migrasjonsstudier samt andre applikasjoner.

ILoop er en ikke-gjenopprettingsoperasjon som utføres på levende dyr. Anestesi må kontinuerlig overvåkes i løpet av eksperimentet, og evaluering av sedasjonsdybde er obligatorisk. De mest kritiske trinnene inkluderer (1) isolering av iLoop, (2) ligasjon av kuttendene og, (3) inflasjonen av iLoop ved intraluminal injeksjon av reagensoppløsning. I hvert av disse trinnene kan blødning oppstå, kompromittere blodtilførselen til iLoop og påvirke nøyaktigheten av resultatene. Vær oppmerksom på at i sjeldne tilfeller av intraluminal blødning under PMN TEpM-analysen, vil strømningscytometri-gating-strategien som presenteres her, bidra til å skille transmigrert PMN fra PMN som stammer direkte fra blodet (ikke-migrert PMN). Transmigrert PMN samlet inn i iLoop lumen uttrykker høye nivåer av overflatemarkør CD11b10 sammenlignet med sirkulerende PMN (Figur 4D).

Gitt at iLoop tillater kvantitative analyser av intestinal permeabilitet og migrasjon av blod PMN i tarmlumen, er det viktig å standardisere størrelsen på det absorberende slimhinnen og blodtilførselen. For å sikre konsistens mellom dyr, er det viktig at en riktig lengde på tarmsegmentet eksteriøriseres. ILoop skal være 4 cm for ileal sløyfen og 2 cm for pcLoop og bli perfused av sammenlignbar blodtilførsel. Inkonsekvens i disse parametrene vil også resultere i ulik distensjon av iLoop etter intraluminal injeksjon av reagenser og økt variasjon mellom og mellom eksperimentelle grupper. Videre, for å unngå over-distensjon av iLoop, anbefaler vi at ikke mer enn 250 μL reagensoppløsning injiseres i lumen for henholdsvis ilealløkken og 200 μL for henholdsvis pcLoop.

Det er noen begrensninger som er forbundet med prosedyrens natur. ILoop er en ikke-gjenopprettingsoperasjon som utføres på levende dyr. Dette er en teknisk utfordrende mikrokirurgisk metode; Personell kan imidlertid tilegne seg kirurgiske ferdigheter gjennom praksis. Den gjennomsnittlige varigheten av operasjonen bør være kort (maksimalt 15 min). Vi anbefaler 120 min som en ideell inkubasjonstid for måling av intestinal permeabilitet og 60 min for PMN TEpM. Inkubasjonstider kan reduseres, men lengre tidspunkter kan påvirke dyrets generelle inflammatoriske tilstand under anestesi. I tillegg kan protokollen fra starten av den kirurgiske prosedyren til prøveinnsamling / analyse ikke settes på pause.

Denne iLoop-modellen presenterer viktige fordeler med hensyn til eksisterende metoder: (1) iLoop er fullt vaskulær og er mer fysiologisk relevant, (2) i motsetning til oral gavage-metoden som vurderer den generelle mage-tarmkanalens integritet og avhenger av gastrointestinal motilitet13, iLoop gjør det mulig å studere egenskapene til bestemte lokaliserte områder i tarmen (terminal ileum eller proksimal kolon) som vanligvis er involvert i IB, som vanligvis er involvert i IB, (3) iLoop er den første in vivo-modellen som tillater kvantitativ studie av PMN TEpM i tarmlumen så vel som andre deler av tarmslimhinnen, inkludert lamina propria og epitelfraksjoner30,35. Det er mulig å bruke høy versus lav molekylvekt FITC-merket dextrans (4 til 150 kDa) for å evaluere både størrelsesvalg og / eller alvorlighetsgrad av epitelbarrierefeil i knockout / knock-in mus eller ulike eksperimentelle modeller, inkludert, men ikke begrenset til, tarmbetennelse. I tillegg kan FITC-merket dextrans kvantifiseres i andre organer som leveren39 eller som en ny tilnærming for studier av blodhjernebarrieren som gir innsikt i rollen som tarmpermeabilitet i tarm-lever og tarm-hjerneakser40,41,42. Videre gir denne metoden muligheten til å utføre to løkker parallelt (ileal loop og pcLoop i samme dyr) og innpode to forskjellige fluorescerende merkede sonder for analyser av barriereegenskaper i forskjellige områder i tarmen. Langs lignende linjer kan generering av to løkker parallelt brukes til å spesifikt evaluere ileum versus kolon for forskjeller eller likheter i rekruttering av immunceller som svar på samme reagens.

Her, ved å bruke pcLoop med Jam-a-null mus eller mus som har selektivt tap av JAM-A på IECer (Villin-cre; Jam-a fl/fl), bekrefter vi funn fra tidligere studier som har rapportert en positiv rolle for TJ-assosiert protein JAM-A i intestinal permeabilitet og PMN TEpM. Anvendelsen av iLoop kan utvides til ulike reagenser, inkludert antistoffer, mikrobielle patogener og terapeutiske legemidler30,34,35. Vær oppmerksom på at vi brukte LTB4 (336.5 Da) til å modellere PMN TEpM gitt at det er en godt akseptert potent og fysiolog PMN kjemoattractant og dens evne til å indusere TEpM ved lave konsentrasjoner (1 nM) i det fysiologiske området. Vår sløyfemodell er imidlertid tilpasningsdyktig til andre relevante kjemoattractants. Vi har rapportert bruk av bakteriell peptid N-formyl-methionyl-leucyl-fenylalanin (fMLF) for å indusere betydelig rekruttering av PMN til den koloniske lumen30. fMLF (437,5 Da) er et lavere affinitets chemoattractant hos mus som krever mye høyere konsentrasjoner for å være effektive (1μM). Denne modellen er tilpasningsdyktig for bruk av CXCL1 /KC, et annet potent fysiologt kjemoattractant som vi har brukt, men CXCL1 / KC er dyrt og et relativt stort molekyl (11 kDa) som er mindre effektivt for å krysse epitelbarrieren. Vi har også vist at nøytraliserende antistoffer mot leukocyttspesifikk integrinsk CD11b/CD18 (αMβ2) som ble injisert i løkkelumen før administrering av kjemoattractant LTB4 resulterte i redusert PMN TEpM-bekreftende resultater fra in vitro-studier10,30,35. Videre ble pcLoop nylig ansatt for å studere effekten av PMN versus epitelale glykaner i å kontrollere frekvensen av PMN TEpM43. Reagenser ble injisert i pcLoop lumen før administrering av kjemoattractant LTB4. Derfor, med sitt brede spekter av applikasjoner, kan iLoop utfylle og bekrefte funn oppnådd via in vitro-analyser. Ligated intestinale løkker har også blitt brukt av andre til å studere bakteriell infeksjon (som Salmonella, L. monocytogenes og E. coli), derfor tror vi at den enkle tilpasningsevnen til denne iLoop-modellen også kan brukes til disse studiene.

Etter behandling med proinflammatoriske immunmeglere kan iLoop brukes som en akutt modell for tarmbetennelse. Videre kan iLoop muliggjøre studier som belyser sammenhengen mellom økt tarmpermeabilitet og immuncellerekruttering etter eksponering for intraluminale patogener eller i kroniske inflammatoriske eksperimentelle modeller. Vær oppmerksom på at vi nylig har observert ved å bruke pcLoop-modellen at som svar på høy dose proinflammatoriske cytokiner TNFα og IFNγ (1 mg av hver) intestinal paracellulær permeabilitet til 4 kDa FITC-dextran resulterte i forbedret PMN-rekruttering til pcLoop lumen som svar på LTB4 i forhold til lavdose cytokiner (100 ng av hver)30. Interessant nok viser vi at økt epitelpermeabilitet sekundært til Jam-a mangel ikke førte til forbedret PMN TEpM, men reduserte den. Alt i alt tyder disse resultatene på at intestinal paracellulær permeabilitet påvirker graden av PMN TEpM, men korrelasjonen er ikke direkte og avhenger av faktorer som uttrykk for adhesjonsmolekyler (lik JAM-A) som spiller en viktig rolle i både epitelbarrierefunksjon og leukocyttmigrasjon16. Fremtidige studier er nødvendig for å undersøke finjustering av immuncelleresponser fra tarmepitelet, og bidrag til patologisk slimhinnebetennelse som inflammatorisk tarmsykdom.

Til slutt gir iLoop-modellen en stor forbedring av eksisterende tilnærminger for vurdering av intestinal permeabilitet og PMN TEpM in vivo som vil bidra betydelig til å forstå mekanismer som ligger til grunn for regulering av tarmbetennelse og IBD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Dr. Sven Flemming ved Universitetet i Wuerzburg for hans bidrag til etableringen av den proksimale kolonløkkemodellen, Sean Watson for styringen av musekoloniene og Chithra K. Muraleedharan for å hjelpe til med oppkjøpet av bildene av iLoop-modellen. Dette arbeidet ble støttet av den tyske forskningsstiftelsen/DFG (BO 5776/2-1) til KB, R01DK079392, R01DK072564 og R01DK061379 til C.A.P.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment and Material
BD Alcohol Swabs BD 326895
BD PrecisionGlide Needle, 25G X 5/8" BD 305122
BD PrecisionGlide Needle, 30G X 1/2" BD 305106
BD 1ml Tuberculin Syringe Without Needle BD 309659
15ml Centrifuge Tube Corning 14-959-53A
Corning 96-Well Solid Black Polystyrene Microplate FisherScientific 07-200-592
Corning Non-treated Culture Dish, 10cm MilliporeSigma CLS430588
Cotton Tip Applicator (cotton swab), 6", sterile FisherScientific 25806 2WC
Dynarex Cotton Filled Gauze Sponges, Non-Sterile, 2" x 2" Medex 3249-1
EZ-7000 anesthesia vaporizer (Classic System, including heating units) E-Z Systems EZ-7000
Falcon Centrifuge Tube 50ml  VWR 21008-940
Fisherbrand Colored Labeling Tape FisherScientific 15-901-10R
Halsey Needle Holder (needle holder)  FST 12001-13
Kimwipes, small (tissue wipe) FisherScientific 06-666
1.7ml Microcentrifuge Tubes  Thomas Scientific  c2170
Micro Tube 1.3ml Z (serum clot activator tube) Sarstedt  41.1501.105
Moria Fine Scissors FST 14370-22
5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap (35 µm nylon mesh) Falcon 352235
Puralube Vet Ointment, Sterile Ocular Lubricant Dechra 12920060
Ring Forceps (blunt tissue forceps) FST 11103-09
Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YD FisherScientific NC9452680
Semken Forceps (anatomical forceps) FST 1108-13
Sofsilk Nonabsorbable Coated Black Suture Braided Silk Size 3-0, 18", Needle 19mm length 3/8 circle reverse cutting  HenrySchein SS694
Student Fine Forceps, Angled FST 91110-10
10ml Syringe PP/PE without needle Millipore Sigma  Z248029
96 Well Cell Culture Plate Corning 3799
Yellow Feeding Tubes for Rodents 20G x 30 mm Instech FTP-20-30
Solutions and Buffers
Accugene 0.5M EDTA Lonza 51201
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer BioWhittaker 10-548E
Hanks' Balanced Salt Solution Corning 21-023-CV
Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium Corning 21-040-CV
Reagents
Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Antibody (1A8) BioLegend 127610
CD11b Monoclonal Antibody, PE, eBioscience (M1/70) ThermoFisher 12-0112-81
CountBright Absolute Counting Beads Invitrogen C36950
Dithiotreitol FisherScientific BP172-5
Fetal Bovine Serum, heat inactivated R&D Systems 511550
Fluorescein Isothiocyanate-Dextran, average molecular weight 4.000 Sigma 60842-46-8
Isoflurane Halocarbon 12164-002-25
Leukotriene B4 Millipore Sigma 71160-24-2
PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11) BD Pharmingen 557235
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD FC Block) BD Bioscience 553142
Recombinant Murine IFN-γ Peprotech 315-05
Recombinant Murine TNF-α Peprotech 315-01A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Olson, T. S., et al. The primary defect in experimental ileitis originates from a nonhematopoietic source. Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 541-552 (2006).
  2. Jump, R. L., Levine, A. D. Mechanisms of natural tolerance in the intestine: implications for inflammatory bowel disease. Inflammatory Bowel Diseases. 10 (4), 462-478 (2004).
  3. Peeters, M., et al. Clustering of increased small intestinal permeability in families with Crohn's disease. Gastroenterology. 113 (3), 802-807 (1997).
  4. Michielan, A., D'Inca, R. Intestinal permeability in inflammatory bowel disease: Pathogenesis, clinical evaluation, and therapy of leaky gut. Mediators of Inflammation. 2015, 628157 (2015).
  5. Chin, A. C., Parkos, C. A. Neutrophil transepithelial migration and epithelial barrier function in IBD: potential targets for inhibiting neutrophil trafficking. Annals of the New York Academy of Sciences. 1072, 276-287 (2006).
  6. Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn's disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
  7. Ordás, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Ulcerative colitis. Lancet. 380 (9853), 1606-1619 (2012).
  8. Muthas, D., et al. Neutrophils in ulcerative colitis: A review of selected biomarkers and their potential therapeutic implications. Scandanavian Journal of Gastroenterology. 52 (2), 125-135 (2017).
  9. Pai, R. K., et al. The emerging role of histologic disease activity assessment in ulcerative colitis. Gastrointestinal Endoscopy. 88 (6), 887-898 (2018).
  10. Parkos, C. A., Delp, C., Arnaout, M. A., Madara, J. L. Neutrophil migration across a cultured intestinal epithelium. Dependence on a CD11b/CD18-mediated event and enhanced efficiency in physiological direction. The Journal of Clinical Investigation. 88 (5), 1605-1612 (1991).
  11. Brazil, J. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil-epithelial interactions. Immunological Reviews. 273 (1), 94-111 (2016).
  12. Thomson, A., et al. The Ussing chamber system for measuring intestinal permeability in health and disease. BMC Gastroenterology. 19 (1), 98 (2019).
  13. Li, B. R., et al. In vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), e57032 (2018).
  14. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  15. Fan, S., et al. Role of JAM-A tyrosine phosphorylation in epithelial barrier dysfunction during intestinal inflammation. Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 566-578 (2019).
  16. Parkos, C. A. Neutrophil-epithelial interactions: A double-edged sword. American Journal of Pathology. 186 (6), 1404-1416 (2016).
  17. Volynets, V., et al. Assessment of the intestinal barrier with five different permeability tests in healthy C57BL/6J and BALB/cJ mice. Digital Diseases and Sciences. 61 (3), 737-746 (2016).
  18. Wick, M. J., Harral, J. W., Loomis, Z. L., Dempsey, E. C. An optimized evans blue protocol to assess vascular leak in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (139), e57037 (2018).
  19. Tateishi, H., Mitsuyama, K., Toyonaga, A., Tomoyose, M., Tanikawa, K. Role of cytokines in experimental colitis: relation to intestinal permeability. Digestion. 58 (3), 271-281 (1997).
  20. Mei, Q., Diao, L., Xu, J. M., Liu, X. C., Jin, J. A protective effect of melatonin on intestinal permeability is induced by diclofenac via regulation of mitochondrial function in mice. Acta Pharmacologica Sinica. 32 (4), 495-502 (2011).
  21. Vargas Robles, H., et al. Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis. Journal of Visualized Experiments. (119), e55095 (2017).
  22. Arques, J. L., et al. Salmonella induces flagellin- and MyD88-dependent migration of bacteria-capturing dendritic cells into the gut lumen. Gastroenterology. 137 (2), 579-587 (2009).
  23. Coombes, B. K., et al. Analysis of the contribution of Salmonella pathogenicity islands 1 and 2 to enteric disease progression using a novel bovine ileal loop model and a murine model of infectious enterocolitis. Infection and Immunity. 73 (11), 7161-7169 (2005).
  24. Everest, P., et al. Evaluation of Salmonella typhimurium mutants in a model of experimental gastroenteritis. Infection and Immunity. 67 (6), 2815-2821 (1999).
  25. Pron, B., et al. Comprehensive study of the intestinal stage of listeriosis in a rat ligated ileal loop system. Infection and Immunity. 66 (2), 747-755 (1998).
  26. Clayburgh, D. R., et al. Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo. The Journal of Clinical Investigation. 115 (10), 2702-2715 (2005).
  27. Palmblad, J., et al. Leukotriene B4 is a potent and stereospecific stimulator of neutrophil chemotaxis and adherence. Blood. 58 (3), 658-661 (1981).
  28. Mandell, K. J., Babbin, B. A., Nusrat, A., Parkos, C. A. Junctional adhesion molecule 1 regulates epithelial cell morphology through effects on beta1 integrins and Rap1 activity. The Journal of Biological Chemistry. 280 (12), 11665-11674 (2005).
  29. Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).
  30. Flemming, S., Luissint, A. C., Nusrat, A., Parkos, C. A. Analysis of leukocyte transepithelial migration using an in vivo murine colonic loop model. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (20), (2018).
  31. Luissint, A. C., Nusrat, A., Parkos, C. A. JAM-related proteins in mucosal homeostasis and inflammation. Seminars in Immunopathology. 36 (2), 211-226 (2014).
  32. Cesarovic, N., et al. Isoflurane and sevoflurane provide equally effective anaesthesia in laboratory mice. Lab Animal. 44 (4), 329-336 (2010).
  33. JoVE Science Education Database. Introduction to the Microplate Reader. Journal of Visualized Experiments. , JoVE, Cambridge, MA. e5024 (2020).
  34. Kelm, M., et al. Targeting epithelium-expressed sialyl Lewis glycans improves colonic mucosal wound healing and protects against colitis. Journal of Clinical Investigation Insight. 5 (12), (2020).
  35. Azcutia, V., et al. Neutrophil expressed CD47 regulates CD11b/CD18-dependent neutrophil transepithelial migration in the intestine in vivo. Mucosal Immunology. , (2020).
  36. Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PloS One. 11 (3), 0150606 (2016).
  37. Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series). Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).
  38. Ebnet, K. Junctional Adhesion Molecules (JAMs): Cell adhesion receptors with pleiotropic functions in cell physiology and development. Physiological Reviews. 97 (4), 1529-1554 (2017).
  39. Sorribas, M., et al. FXR modulates the gut-vascular barrier by regulating the entry sites for bacterial translocation in experimental cirrhosis. Journal of Hepatology. 71 (6), 1126-1140 (2019).
  40. Mazzucco, M. R., Vartanian, T., Linden, J. R. In vivo Blood-brain Barrier Permeability Assays Using Clostridium perfringens Epsilon Toxin. Bio-Protocol. 10 (15), 3709 (2020).
  41. Kelly, J. R., et al. Breaking down the barriers: the gut microbiome, intestinal permeability and stress-related psychiatric disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 392 (2015).
  42. Fiorentino, M., et al. Blood-brain barrier and intestinal epithelial barrier alterations in autism spectrum disorders. Molecular Autism. 7 (1), 49 (2016).
  43. Kelm, M., et al. Regulation of neutrophil function by selective targeting of glycan epitopes expressed on the integrin CD11b/CD18. FASEB Journal : An Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (2), 2326-2343 (2020).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 168 tarmbarrierefunksjon slimhinneimmunologi intestinal epitel permeabilitetsanalyse leukocytttransepithelial migrasjonsanalyse ileal sløyfe proksimal kolonløkke fluorescerende isotacyanat (FITC)-dextran kjemokin proinflammatorisk cytokin
Funksjonell vurdering av intestinal permeabilitet og nøytrofil transepithelial migrasjon hos mus ved hjelp av en standardisert tarmsløyfemodell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boerner, K., Luissint, A. C.,… More

Boerner, K., Luissint, A. C., Parkos, C. A. Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model. J. Vis. Exp. (168), e62093, doi:10.3791/62093 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter