Summary
Этот метод трансплантации островков, покрытых жиром, подходит для обнаружения приживленных островков во внутрибрюшинной полости. Примечательно, что он не требует использования биосвязывающих агентов или наложения швов.
Abstract
Трансплантация островков – это клеточная заместительная терапия тяжелого сахарного диабета. Внутрибрюшинная полость обычно является местом трансплантации для этой процедуры. Тем не менее, внутрибрюшинная трансплантация островков имеет некоторые ограничения, включая низкую эффективность трансплантации, сложную способность обнаружения трансплантата и отсутствие возможности трансплантэктомии для посттрансплантационного анализа. В этой статье для оценки терапевтических эффектов биоинженерных островков используется «трансплантация островков, покрытых жиром», метод внутрибрюшинной трансплантации островков, который использует придаток яичка белого жира. Простота метода заключается в посеве островков на придаток яичка белого жирового волокна и использовании ткани для покрытия островков. Хотя этот метод можно классифицировать как метод внутрибрюшинной трансплантации островков, он имеет общие характеристики с трансплантацией островков внутри жировой ткани. Однако метод трансплантации островков, покрытых жиром, демонстрирует более надежные терапевтические эффекты, чем трансплантация островков внутри жировой ткани, включая улучшение уровня глюкозы в крови и инсулина в плазме и потенциал для удаления трансплантата. Мы рекомендуем принять этот метод для оценки механизмов приживления островков в белую жировую ткань и терапевтических эффектов биоинженерных островков.
Introduction
Трансплантация островков – это клеточная заместительная терапия для пациентов с тяжелым сахарным диабетом. Недавние отчеты показали, что показатели инсулинонезависимости через три года после трансплантации улучшаются до 44%1 и что примерно 80% реципиентов, которые получают более 600 000 общих эквивалентов островков, достигают независимости от инсулина2. Кроме того, в последнем отчете Collaborative Islet Transplant Registry было выявлено, что уровень глюкозы в крови натощак поддерживался на уровне 60-140 мг / дл в течение 5 лет у более чем 70% пациентов, перенесших трансплантацию островков в одиночку. Исследование также определило, что около 90% пациентов, которые получили трансплантацию островка в одиночку или трансплантацию островка после пересадки почки, не развивали каких-либо тяжелых гипогликемических событий в течение более 5 лет3.
Хотя клинические результаты этого лечения улучшаются, некоторые ограничения все еще должны быть устранены, включая необходимость создания оптимального места трансплантации. Печень является типичным местом трансплантации для клинической трансплантации островков, потому что это самый большой орган, который может вместить большой объем островков. Однако у некоторых пациентов печень недоступна (например, из-за портальной гипертензии, гепатита и/или циррозапечени 4) и, следовательно, другие участки, включая почечное субкапсулярное пространство 5,6, сальниковый мешочек 7,8,9,10, брыжейки11, желудочно-кишечный тракт12, скелетные мышцы13, подкожную клетчатку13, костный мозг14 и селезенку15 ,16,17, рассматривались в качестве альтернативных мест трансплантации.
Хотя внутрибрюшинная трансплантация островков может быть легко выполнена под местной анестезией, что делает внутрибрюшинную полость привлекательным местом для клинической трансплантации островков, при трансплантации островки рассеиваются по всей внутрибрюшинной полости, что затрудняет обнаружение приживления островков и успешное подтверждение приживления. Поэтому внутрибрюшинная полость не получила широкого признания в качестве идеального клинического места трансплантации. Вместо этого он часто используется в качестве контрольной модели для доклинических исследований для изучения эффективности трансплантированных инкапсулированных18 и биоинженерных островков19. Тем не менее, точное сравнение между биоинженерными и контрольными островками трудно достичь из-за проблем в выполнении точной оценки приживления.
Напротив, использование внутрибрюшинной белой жировой ткани в сальниковом мешочке8, брыжейке и других внепеченочных местах было хорошо зарегистрировано 10,20,21,22,23, и многие исследования, изучающие функцию биоинженерных островков, пересаженных с использованием белой жировой ткани, смогли сообщить о многообещающих терапевтических результатах 20,24,25, 26. Поскольку использование придатков яичка жировой ткани облегчает обнаружение трансплантированных островков, был разработан «метод трансплантации островков, покрытых жиром», использующий жировую ткань придатка яичка, для преодоления ограничений внутрибрюшинной трансплантации островков. В данной работе описана трансплантация покрытых жиром островков с использованием жировой ткани придатка яичка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Следующая процедура выполняется в три этапа. Первый шаг включает индукцию диабета у мышей-реципиентов и выделение донорских островков. Второй этап предполагает подготовку островков перед трансплантацией. На третьем этапе проводится трансплантация островков на жировую ткань придатка яичка и покрытие островков с использованием жировой ткани. После этого оценивали терапевтические эффекты. Обращение с мышами и экспериментальные процедуры, выполненные в этом исследовании, соответствуют «Принципам ухода за лабораторными животными» (Руководство по уходу и использованию лабораторных животных, публикация Национальных институтов здравоохранения,8-е издание, 2011 г.), а экспериментальный протокол был одобрен Комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Фукуока (номер одобрения: 186018).
1. Хирургическая подготовка
- Индукция диабета: Индуцирование диабета в 20-25 г массы тела, 8-12-недельных самцов мышей-реципиентов путем внутривенного введения раствора стрептозотоцина 18 мг/мл, приготовленного в 0,1М цитратного буфера (180 мг/кг массы тела). Мыши с уровнем глюкозы в крови, превышающим 400 мг/дл, считаются диабетиками. Используйте мышей с диабетом в течение 1 недели после индукции диабета до чрезмерной атрофии придатка яичка белой жировой ткани для покрытия островков.
- Изоляция островков: Выполните изоляцию островков мышей за день до трансплантации по методу27 Гото для изоляции островков.
- Короче говоря, переваривайте ткани поджелудочной железы с помощью раствора коллагеназы. Изолируйте островки путем центрифугирования с градиентом плотности с использованием соответствующего раствора для разделения клеток. Затем культивируют островки в течение ночи в инкубаторе при 22 °C и 5% CO2 (сообщалось, что культура при <37 °C предотвращает гибель островков 28,29,30,31).
ПРИМЕЧАНИЕ: Обрабатывайте очищенные островковые культуры в шкафу безопасности. Фильтруйте и стерилизуйте все растворы, используемые для изоляции и культивирования островков, используя фильтр 0,22 мкм.
2. Подготовка островков к трансплантации
- Соберите соответствующие приборы и материалы, как показано на рисунке 1А.
- Поскольку пищеварительные ферменты, такие как амилаза и липаза, могут привести к повреждению изолированных и пересаженных островков, и потеря островков может произойти из-за попадания в загрязняющие фиброзные ткани в чашке для культивирования, перед трансплантацией используйте щипцы для ручного отбора любых вне островковых компонентов из поджелудочной железы, включая ацинарные и волокнистые ткани (рисунок 1B), под рассекающим микроскопом. После сбора используйте клеточный ситечко, чтобы отфильтровать отдельные ацинарные клетки.
- Переложите отфильтрованные островки в новую чашку для культивирования, содержащую любую подходящую питательную среду или буферный раствор (например, DMEM с низким содержанием глюкозы, RPMI1640, CMRL1066 или HBSS), дополненную бычьей сывороткой или альбумином, чтобы предотвратить прикрепление островков к пластику, и закрутите тарелку, чтобы расположить островки в центре тарелки (рисунок 1C). Используя микропипетку P200 и микроскоп, выберите отдельные островки в соответствующую коллекционную трубку (рисунок 1D).
- Поместите новый клеточный сетчатый фильтр размером 40 мкм поверх пластиковой трубки объемом 50 мл (рисунок 1Е слева и в центре) и промыть фильтр свежей средой (рисунок 1Е справа).
- Используйте пипетку объемом 1000 мкл, чтобы добавить островки к ситечку для разделения островков и отдельных ацинарных клеток (рисунок 1F1 и рисунок 1F2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Очищенные островки на клеточном ситечке будут примерно на 100% чистыми. - Используйте щипцы для инвертирования ситечка на новой необработанной чашке размером 60 или 100 мм, содержащей культуральную среду или соответствующий буферный раствор, дополненный бычьей сывороткой или альбумином (фиг.1F3 и фиг.1F4). Используйте свежую среду/буфер, чтобы промыть островки в новую культурную посуду. Затем добавьте достаточное количество среды/буфера в чашку для культивирования, чтобы достичь общего объема около 20 мл.
- Подсчитайте островки под микроскопом и разделите количество островков поровну между отдельными пластиковыми центрифужными трубками объемом 1,5 мл в соответствии с количеством животных-доноров (рисунок 1G). Например, двести 100-200 мкм островковых эквивалентов (IEQ) от двух мышей будут добавлены к каждой из двух трубок.
- Центрифугируйте островки при 2 100 х г в течение 1 минуты при комнатной температуре и выбросьте супернатант. Около 20-30 мкл остаточного раствора обычно остается в пробирке (рисунок 1H).
3. Пересадка островков на жировую ткань придатка яичка и покрытие яичка белой жировой тканью
- Перед операцией соберите анестезиологический аппарат для мелких животных, стереомикроскоп, источник света, микропипетку 50-200 мкл с наконечниками микропипетки 200 мкл, ватные палочки, набор для наложения швов 4-0 и продезинфицированные хирургические инструменты (рисунок 2A). Автоклав медных ножниц, офтальмологических ножниц, щипцов pean, пинцета и держателей игл. После автоклавирования погружают оборудование в 1% повидон-йодный раствор (рисунок 2А). Используйте ватные тампоны для мобилизации придатка яичка белой жировой ткани и для гемостаза в случаях кровотечений. Используйте микропипетку с наконечниками 50-200 мкл для трансплантации островков.
- Доставьте анестезию диабетической мыши-реципиенту с использованием ингаляционного анестетика (2% изофлурана в кислороде). Нанесите офтальмологическую смазку на оба глаза, чтобы предотвратить высыхание. Затем поместите мышь в положение лежа на спине (рисунок 2B слева) и удалите волосы с живота, чтобы предотвратить инфекцию, используя машинки для уходу за волосами и / или крем для депиляции. Дезинфицируйте брюшную полость и паховую область, используя, по крайней мере, три чередующихся раунда раствора повидона-йода с последующим 70% этанолом (рисунок 2B справа). Перед операцией подтвердите глубину анестезии через отсутствие рефлекса защемления пальца ноги. Обеспечьте интраоперационную тепловую поддержку с помощью грелки и используйте хирургическую драпировку для закрепления стерильной хирургической области.
- Разрезайте кожу в нижней средней области (рисунок 2C слева). Рекомендуется разрез кожи длиной около 2 см. Зажмите левую брюшную стенку щипцами pean (также могут использоваться атравматические щипцы или втягиватель) и потяните ткань к левой стороне мыши, чтобы закрепить операционное поле (рисунок 2C справа). После лапаротомии уменьшают процентное содержание изофлурана до 1,0-1,5% для поддержания анестезии.
- Используйте ватный тампон для мобилизации тонкой и толстой кишки в правую сторону мыши (т. Е. Левую сторону оператора). Левая придатковая белая жировая ткань в брюшной полости расположена в левой паховой области. Мобилизовать придаток яичка белой жировой ткани и левого яичка наружу брюшной полости (рисунок 2D слева) и растянуть ткань (2D справа).
- Используйте микропипетку P200, оснащенную наконечником пипетки 200 мкл, чтобы собрать весь объем островков из одной трубки объемом 1,5 мл с мягкой пипеткой (рисунок 2E слева), заботясь о том, чтобы в трубке не осталось островков после сбора. Позвольте собранным островкам остепениться на кончике пипетки под действием силы тяжести (рисунок 2E справа).
- Поместите наконечник микропипетки слегка на растянутую жировую ткань. Заботясь о предотвращении чрезмерного промывания среды/буфера в кончике, осторожно посейте островки на ткань (рисунок 2F слева). После посева подтвердите правильное размещение островков под рассекающим микроскопом (рисунок 2F справа).
- Накройте островки придатком яичка белой жировой тканью (рисунок 2G). Использование швов или биосвязывающих средств не требуется.
- Поместите левое яичко под белую жировую ткань придатка яичка и верните ткани во внутрибрюшинную полость (рисунок 2Н). Закройте кожу двумя слоями (брюшина, затем мышцы и кожа) с помощью шва 4-0 (можно использовать любые швы, такие как нейлон или рассасывающиеся швы) (Рисунок 2I). Вводить ацетилсалициловую кислоту (300 мг/кг; SQ) рядом с раной для послеоперационного обезболивания. Затем поместите мышь под тепловую лампу и контролируйте до полного восстановления.
4. Мониторинг после трансплантации островков (Резюме)
- Оценить терапевтические эффекты трансплантации островков путем мониторинга уровня глюкозы в крови, глюкозотолерантного теста и гистологической оценки в послеоперационный день (POD) 28.
- Контролировать уровень глюкозы в крови, включая измерения глюкозы в крови при глюкозолерантном тесте, используя небольшой глюкометр.
- Соберите образцы крови (немного микролитров) из хвостовой вены. Что касается гистологической оценки, то мышиный инсулин (для обнаружения приживленных островков) и фактор фон Виллебранда (для обнаружения сосудов, что является доказательством приживления островков) были обнаружены в трансплантированных островках в восстановленной жировой ткани придатка яичка методом иммуногистохимии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы сравнить эффективность трансплантации покрытых жиром островков с таковой после внутрибрюшинной трансплантации островков, такое же количество островков было имплантировано на брюшину в левом параколическом пространстве контрольных животных-реципиентов с диабетом. Было отмечено, что уровень глюкозы в крови мышей с трансплантацией островков, покрытых жиром, постепенно и значительно снижался по сравнению с внутрибрюшинными островковыми трансплантированными мышами (p = 0,0023; Рисунок 3А). Через месяц после трансплантации уровень глюкозы в крови у мышей с трансплантацией островков, покрытых жиром, поддерживался на более низких уровнях, чем у мышей, пересаженных внутрибрюшинными островками, что оценивалось путем внутрибрюшинного тестирования толерантности к глюкозе (p = 0,0046; Рисунок 3B). Кроме того, как мы уже сообщали ранее, уровень инсулина в плазме также улучшился после трансплантации островков, покрытых жиром. Также было подтверждено повторное повышение уровня глюкозы в крови. Эти данные демонстрируют, что внутрибрюшинная трансплантация островков, покрытых жиром, с использованием 200 IIQ может значительно улучшить диабетические состояния мышей-реципиентов.
Гистологическое исследование также проводилось для оценки приживления островков в придатковую белую жировую ткань придатка яичка. У животных-реципиентов трансплантата, покрытых жиром, окрашивание гематоксилин-эозина выявляет присутствие островков в придатковой белой жировой ткани (рисунок 3C, верхнее изображение). Кроме того, флуоресцентно-конъюгированное окрашивание антителами инсулин-положительных островков облегчало обнаружение микрососудов с положительным фактором фон Виллебранда в придатковой белой жировой ткани всех мышей-реципиентов (n = 6; Рисунок 3C). Напротив, у внутрибрюшинных островковых трансплантированных мышей не наблюдалось приживленных островков ни в привитых придатках яичек белой жировой ткани, ни в брюшной стенке (данные не показаны).
Рисунок 1-ABC. Подготовка островков к трансплантации на жировую ткань придатка яичка и покрытие придатка яичка белой жировой тканью. (A) Подготовка инструментов: a. pipette aid, b. 10 ml pipette tips, c. 50 ml пластиковые трубки, d. 15 мл пластиковые трубки, e. 50-200 мкл (слева) и 200-1000 мкл (справа) микропипеты, f. 1,5 мл пластиковые центрифужные трубки, g. 200 и 1000 мкл микропипетки, h. среда или буфер, содержащий альбумин или фетальную бычью сыворотку (т.е. DMEM с низким содержанием глюкозы, содержащую 10% фетальной бычьей сыворотки и 100 ЕД /мл пенициллина + 100 Ед/мл раствора стрептомицина), и i. 40 мкм клеточный сетчатый фильтр. (Б) Изолированные островки с ацинарными (слева: обозначены стрелкой) и фиброзными тканями (справа). Шкала стержня = 200 мкм. (C) Собранные островки в пластиковой трубке. Слева, рассредоточены островки в культуре блюда. В центре островки собирают в центре культуры блюдо путем закручивания. Справа, собранные островки в центре блюда. Шкала бара = 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 1-DEF. Подготовка островков к трансплантации на жировую ткань придатка яичка и покрытие придатка яичка белой жировой тканью. (D) Собранные островки (слева) переносятся в пластиковые трубки объемом 15 мл (справа). (E) Клеточный сетчатый фильтр 40 мкм установлен поверх пластиковой трубки объемом 50 мл (слева и по центру). Приготовленную среду/буфер добавляют в другую пластиковую трубку объемом 50 мл для промывки островков на клеточном ситечке в новую чашку для культивирования (справа). ф) 1. Островки собирают с помощью микропипетки объемом 200-1000 мкл. 2. Островки заливают в клеточный ситечко. 3 и 4. Среда/буфер используется для промывки островков на ситечко в новую культуральную посуду. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 1-GH. Подготовка островков к трансплантации на жировую ткань придатка яичка и покрытие придатка яичка белой жировой тканью. (G) Островки, разделенные на пластиковую центрифужную трубку объемом 1,5 мл в зависимости от количества мышей-реципиентов. Здесь двести 100-200 мкм островковых эквивалентов (IEQ) были разделены поровну на каждую трубку. (H) Островки, разделенные поровну в трубках по 1,5 мл перед центрифугированием (слева). Островки центрифугируют для сбора на дне трубы (в центре). 20-30 мкл надосадочного вещества остаются в пробирке после отбрасывания лишнего раствора (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2-ABC. Процедура трансплантации островков на жировую ткань придатка яичка и покрытия с использованием придатка яичка белой жировой ткани. (A) Подготовка инструментов: a. анестезиологическая машина для мелких животных, b. стереомикроскоп, c. источник света, d. продезинфицированные хирургические инструменты, e. разделенные островки в пластиковых трубках 1,5 мл, f. 50-200 мкл микропипет, г. 200 мкл наконечники микропипетки и h. 4-0 швов. (B) Диабетическая мышь-реципиент в положении лежа на спине под общим наркозом 2% изофлурана (слева). Брюшную полость и паховую область дезинфицируют с использованием 70% этанола и покрывают бумажной лабораторной салфеткой (справа). (C) Кожа разрезается в нижнем среднем положении (слева). Левая брюшная стенка зажимается щипцами Пеана и подтягивается к левой стороне мыши для закрепления хирургического поля (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2-DEF. Процедура трансплантации островков на жировую ткань придатка яичка и покрытия с использованием придатка яичка белой жировой ткани. (D) Левая яичка белая жировая ткань и левое яичко мобилизованы за пределами брюшной полости (слева) и растянуты (справа). Шкала стержня = 1 см. (E) Островки в пластиковых трубках объемом 1,5 мл полностью собираются с помощью микропипетки с наконечником пипетки 200 мкл (слева). Собранные островки (обозначенные стрелкой) позволяли полностью погрузиться под действием силы тяжести к кончику пипетки (справа). (F) Наконечник микропипетки, слегка помещенный на растянутую жировую ткань (слева). Посев островков (пунктирный круг) на ткань подтверждается рассекающим микроскопом (справа). Шкала = 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2-GHI. Процедура трансплантации островков на жировую ткань придатка яичка и покрытия с использованием придатка яичка белой жировой ткани. (G) Островки покрыты придатковой белой жировой тканью. (H) Левое яичко и придаток яичка белая жировая ткань возвращаются во внутрибрюшинную полость. (I) Изображение после закрытия живота. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3. Лечебный эффект от трансплантации островков, покрытых жиром. (А) Уровень глюкозы в крови. Синяя линия: трансплантация островков, покрытых жиром (n = 6); Оранжевая линия: внутрибрюшинная трансплантация островков (n = 6) Статистический анализ проводили с использованием повторных измерений анализа дисперсии и значимую разницу определяли как p < 0,05. (B) Уровень глюкозы в крови из теста на толерантность к глюкозе через месяц после трансплантации. Синяя линия: трансплантация островков, покрытых жиром (n = 6); Оранжевая линия: внутрибрюшинная трансплантация островков (n = 6). Статистический анализ проводили с использованием повторных измерений анализа дисперсии и значимую разницу определяли как p < 0,05. (C) Гистологическое изображение приживленных островков через месяц после трансплантации. Верхнее изображение: окрашивание гематоксилин-эозин; Нижнее изображение: иммуноувлажнение мышиного инсулина (зеленый) и фактор фон Виллебранда (vWF: красный, обозначен белой стрелкой). Шкала = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод трансплантации островков, покрытых жиром, включает в себя методы из двух различных методов трансплантации: внутрибрюшинная трансплантация островков и трансплантация островков внутри жировой ткани. Поскольку поверхностная мембрана придатка яичка белой жировой ткани считается белой жировой тканью, которая покрыта брюшины и которая прикреплена к придатку яичка, метод трансплантации островков, покрытый жиром, может быть анатомически классифицирован как тип внутрибрюшинной трансплантации островков. Однако метод, с помощью которого островки доставляются животному-реципиенту, больше похож на те, которые используются при трансплантации островков внутри жировой ткани. Наши данные показывают, что терапевтический эффект метода трансплантации островков, покрытых жиром, превосходит терапевтический эффект внутрибрюшинной трансплантации островков. Наше предыдущее исследование также показало, что эффективность трансплантации этого метода почти равна эффективности трансплантации почечных субкапсулярных островков, метода трансплантации островков с высочайшей эффективностью трансплантации23. Предполагается, что полезность этого метода может быть обусловлена молекулами адгезии, присутствующими в белых жировых тканях и адипоцитокинах и которые, как полагают, способствуют приживлению островков 10,23.
Размер придатка яичка белой жировой ткани позволяет разместить большой объем островков. Напротив, большой сальник грызуна слишком мал, чтобы легко содержать и получать доступ ко многим островкам. Единственным физическим ограничением придатка яичка белой жировой ткани в качестве потенциального экспериментального места трансплантации островков является то, что она не обеспечивает портальную циркуляцию инсулина10.
Метод уникален тем, что островки покрыты жировыми тканями, а не непосредственно вливаются в ткани. Внутрижировая ткань пересаженных островков может страдать от влияния липотоксичности, так как нарушение функции инсулина у диабетических животных может привести к избытку свободных жирных кислот32. Этот метод также не требует биосвязывающих агентов или наложения швов для предотвращения имплантированной потери островков. Как показано на рисунке 3C, островки остаются успешно приживленными в жировой ткани в течение 1 месяца после трансплантации, и поддержание уровня глюкозы в крови было подтверждено после трансплантэктомии23. Это явление может быть связано со способностью жировой ткани захватывать островки, которые становится трудно отслаиваться.
Преимущества этого метода заключаются в том, что он технически прост в выполнении, позволяет провести метаболическую и гистологическую оценку терапевтических эффектов островков и облегчает оценку экспрессии гена островка и /или белка после трансплантэктомии. По сравнению с предыдущими исследованиями эффективность этого метода не уступает таковой при трансплантации островков в придаток яичка белой жировой ткани 10,33,34,35,36. Важно отметить, что для успешного приживления необходим точный посев островков на придатковую белую жировую ткань яичка без потери островков. Чтобы обеспечить успех, весь объем островков должен быть аккуратно аспирирован в наконечник микропипетки из пластиковой трубки объемом 1,5 мл, так как грубое и быстрое пипетка может привести к адгезии островков к стенкам пластиковой трубки, что затрудняет дозирование. Адгезия островков является основной причиной недостаточного посева островков. После того, как островки осядут на кончике кончика микропипетки, островки должны быть имплантированы в жировую ткань придатка яичка без промывки. Важно свести к минимуму депрессию кнопки плунжера при аспирации и дозировании островков, чтобы предотвратить чрезмерное промывание жировой ткани средой / буфером. Поэтому важно подождать, пока островки полностью не сгруппируются на кончике кончика микропипетки, прежде чем нажимать кнопку плунжера микропипетки для имплантации. Достаточно слегка поместить наконечник на жировую ткань и подтвердить посев островков на ткань с помощью световой микроскопии.
В заключение, этот метод очень прост, несмотря на то, что требует нескольких критических шагов для его успеха. Мы надеемся на широкое внедрение этого метода для дальнейшей помощи в облегчении приживления островков на белую жировую ткань и на дальнейшую оценку терапевтических эффектов биоинженерных островков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У нас нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Это исследование финансировалось грантом на научные исследования (C) (19K09839, NS) от Министерства образования, культуры, спорта, науки и техники Японии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 Nylon | Alfresa | ER2004NA45-KF2 | Closing abdomen |
| Alexa 488-conjugated donkey anti-guinea pig | Jackson Immunoresearch | 706-546-148 | Secondary antibody for insulin antibody |
| Alexa 647-conjugated donkey anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-606-152 | Secondary antibody for von Willebrand factor antibody |
| DMEM, low glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11885084 | Culturing islets, transplanting islets |
| Eosin | Fujifilm Wako Chemicals | 051-06515 | Using for staining tissue by eosin |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Collecting islets |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352095 | Collecting islets |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Using for separating islets from other pancreatic tissue |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | Discarding excessive medium/buffer |
| Guinea pig anti-insulin | Agilent Technologies Japan, Ltd. (Dako) | IR002 | Primary antibody for murine insulin |
| Hematoxylin | Muto Pure Chemicals Co., Ltd. | 30002 | Using for staining tissue by hematoxylin |
| Isodine solution 10% | Shionogi&Co., Ltd. | no catalog number | Using for disinfection |
| Isoflurane | Fujifilm Wako Chemicals | 095-06573 | Using for anesthesia |
| Labcon 1000 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips | Labcon | 1177-965-008 | Using for separating islets from other pancreatic tissue |
| Labcon 200 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips | Labcon | 1179-965-008 | Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue |
| Mintsensor | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co. Ltd., | 8AEB02E | Using for monitoring blood glucose |
| Pipetteman P-1000 | Gilson | F123602 | Using for separating islets from other pancreatic tissue |
| Pipetteman P-200 | Gilson | F123601 | Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue |
| Rabbit anti-vWF | Abcam | ab6994 | Primary antibody for murine von Willebrand factor |
References
- Barton, F. B., et al. Improvement in outcomes of clinical islet transplantation: 1999-2010. Diabetes Care. 35 (7), 1436-1445 (2012).
- Balamurugan, A. N., et al. Islet product characteristics and factors related to successful human islet transplantation from the Collaborative Islet Transplant Registry (CITR) 1999-2010. American Journal of Transplantation. 14 (11), 2595-2606 (2014).
- Collaborative Islet Transplant Registry. Collaborative Islet Transplant Registry. Annual Report. , (2017).
- Rajab, A., et al. Total Pancreatectomy and Islet Autotransplantation Following Treated Hepatitis C Infection. Cell Transplantation. 27 (10), 1569-1573 (2018).
- Mellgren, A., Schnell Landstrom, A. H., Petersson, B., Andersson, A. The renal subcapsular site offers better growth conditions for transplanted mouse pancreatic islet cells than the liver or spleen. Diabetologia. 29 (9), 670-672 (1986).
- Hiller, W. F., Klempnauer, J., Luck, R., Steiniger, B. Progressive deterioration of endocrine function after intraportal but not kidney subcapsular rat islet transplantation. Diabetes. 40 (1), 134-140 (1991).
- Yasunami, Y., Lacy, P. E., Finke, E. H. A new site for islet transplantation--a peritoneal-omental pouch. Transplantation. 36 (2), 181-182 (1983).
- Kin, T., Korbutt, G. S., Rajotte, R. V. Survival and metabolic function of syngeneic rat islet grafts transplanted in the omental pouch. American Journal of Transplantation. 3 (3), 281-285 (2003).
- Kasoju, N., et al. Bioengineering a pre-vascularized pouch for subsequent islet transplantation using VEGF-loaded polylactide capsules. Biomaterials Science. 8 (2), 631-647 (2020).
- Sakata, N., Yoshimatsu, G., Kodama, S. White Adipose Tissue as a Site for Islet Transplantation. Transplantology. 1 (2), 55-70 (2020).
- Osama Gaber, A., Chamsuddin, A., Fraga, D., Fisher, J., Lo, A. Insulin independence achieved using the transmesenteric approach to the portal vein for islet transplantation. Transplantation. 77 (2), 309-311 (2004).
- Fujita, M., et al. Technique of endoscopic biopsy of islet allografts transplanted into the gastric submucosal space in pigs. Cell Transplantation. 22 (12), 2335-2344 (2013).
- Sakata, N., et al. Strategy for clinical setting in intramuscular and subcutaneous islet transplantation. Diabetes/Metabolism Research and Reviews. 30 (1), 1-10 (2014).
- Cantarelli, E., et al. Transplant Site Influences the Immune Response After Islet Transplantation: Bone Marrow Versus Liver. Transplantation. 101 (5), 1046-1055 (2017).
- White, S. A., et al. The risks of total pancreatectomy and splenic islet autotransplantation. Cell Transplantation. 9 (1), 19-24 (2000).
- Itoh, T., Nishinakamura, H., Kumano, K., Takahashi, H., Kodama, S. The Spleen Is an Ideal Site for Inducing Transplanted Islet Graft Expansion in Mice. PLoS One. 12 (1), 0170899 (2017).
- Sakata, N., Yoshimatsu, G., Kodama, S. The Spleen as an Optimal Site for Islet Transplantation and a Source of Mesenchymal Stem Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), (2018).
- Sakata, N., et al. Effect of rat-to-mouse bioartificial pancreas xenotransplantation on diabetic renal damage and survival. Pancreas. 32 (3), 249-257 (2006).
- Nagaya, M., et al. Effectiveness of bioengineered islet cell sheets for the treatment of diabetes mellitus. Journal of Surgical Research. 227, 119-129 (2018).
- Weaver, J. D., et al. Vasculogenic hydrogel enhances islet survival, engraftment, and function in leading extrahepatic sites. Science Advances. 3 (6), 1700184 (2017).
- Dufour, J. M., et al. Development of an ectopic site for islet transplantation, using biodegradable scaffolds. Tissue Engineering. 11 (9-10), 1323-1331 (2005).
- Chen, X., et al. The epididymal fat pad as a transplant site for minimal islet mass. Transplantation. 84 (1), 122-125 (2007).
- Sakata, N., et al. Mechanism of Transplanted Islet Engraftment in Visceral White Adipose Tissue. Transplantation. 104 (12), 2516-2527 (2020).
- Navarro-Requena, C., et al. PEG hydrogel containing calcium-releasing particles and mesenchymal stromal cells promote vessel maturation. Acta Biomaterialia. 67, 53-65 (2018).
- Phelps, E. A., Headen, D. M., Taylor, W. R., Thule, P. M., Garcia, A. J. Vasculogenic bio-synthetic hydrogel for enhancement of pancreatic islet engraftment and function in type 1 diabetes. Biomaterials. 34 (19), 4602-4611 (2013).
- Manzoli, V., et al. Immunoisolation of murine islet allografts in vascularized sites through conformal coating with polyethylene glycol. American Journal of Transplantation. 18 (3), 590-603 (2018).
- Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. P. An improved method for isolation of mouse pancreatic islets. Transplantation. 40 (4), 437-438 (1985).
- Brandhorst, D., Brandhorst, H., Hering, B. J., Bretzel, R. G. Long-term survival, morphology and in vitro function of isolated pig islets under different culture conditions. Transplantation. 67 (12), 1533-1541 (1999).
- Noguchi, H., et al. Low-temperature preservation of isolated islets is superior to conventional islet culture before islet transplantation. Transplantation. 89 (1), 47-54 (2010).
- Itoh, T., et al. Low temperature condition prevents hypoxia-induced islet cell damage and HMGB1 release in a mouse model. Cell Transplantation. 21 (7), 1361-1370 (2012).
- Komatsu, H., et al. Optimizing Temperature and Oxygen Supports Long-term Culture of Human Islets. Transplantation. 103 (2), 299-306 (2019).
- Unger, R. H. Lipid overload and overflow: metabolic trauma and the metabolic syndrome. Trends in Endocrinology, Metabolism. 14 (9), 398-403 (2003).
- Mao, D., et al. A macroporous heparin-releasing silk fibroin scaffold improves islet transplantation outcome by promoting islet revascularisation and survival. Acta Biomaterialia. 59, 210-220 (2017).
- Wang, K., Wang, X., Han, C. S., Chen, L. Y., Luo, Y. Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice. Journal of Visualized Experiments. (125), e54995 (2017).
- Wang, X., Wang, K., Zhang, W., Qiang, M., Luo, Y. A bilaminated decellularized scaffold for islet transplantation: Structure, properties and functions in diabetic mice. Biomaterials. 138, 80-90 (2017).
- Rios, P. D., Zhang, X., Luo, X., Shea, L. D. Mold-casted non-degradable, islet macro-encapsulating hydrogel devices for restoration of normoglycemia in diabetic mice. Biotechnology and Bioengineering. 113 (11), 2485-2495 (2016).
