Summary
Deze met vet bedekte eilandjestransplantatiemethode is geschikt voor de detectie van geënte eilandjes in de intraperitoneale holte. Met name vereist het niet het gebruik van biobindingsmiddelen of hechten.
Abstract
Eilandjestransplantatie is een cellulaire vervangingstherapie voor ernstige diabetes mellitus. De intraperitoneale holte is meestal de transplantatieplaats voor deze procedure. Intraperitoneale eilandjestransplantatie heeft echter enkele beperkingen, waaronder een slechte transplantatie-efficiëntie, moeilijk transplantaatdetectievermogen en een gebrek aan graftectomievermogen voor posttransplantatieanalyse. In dit artikel wordt "met vet bedekte eilandjestransplantatie", een intraperitoneale eilandjestransplantatiemethode die gebruik maakt van epididymaal wit vetweefsel, gebruikt om de therapeutische effecten van bio-technische eilandjes te beoordelen. De eenvoud van de methode ligt in het zaaien van eilandjes op epididymaal wit vetweefsel en het gebruik van het weefsel om de eilandjes te bedekken. Hoewel deze methode kan worden gecategoriseerd als een intraperitoneale eilandjestransplantatietechniek, deelt het kenmerken met intra-vetweefseleilandjestransplantatie. De met vet bedekte eilandjestransplantatiemethode toont echter robuustere therapeutische effecten dan intra-vetweefseleilandjestransplantatie, inclusief de verbetering van de bloedglucose- en plasma-insulinespiegels en het potentieel voor transplantaatverwijdering. Wij bevelen de toepassing van deze methode aan voor het beoordelen van de mechanismen van eilandjestransplantatie in wit vetweefsel en de therapeutische effecten van bio-technische eilandjes.
Introduction
Eilandjestransplantatie is een cellulaire vervangingstherapie voor patiënten met ernstige diabetes mellitus. Recente rapporten hebben aangetoond dat de percentages van insuline-onafhankelijkheid drie jaar na transplantatie verbeteren tot 44% 1 en dat ongeveer 80% van de ontvangers die meer dan 600.000 totale eilandjesequivalenten ontvangen, insuline-onafhankelijkheid bereiken2. Bovendien werd in het meest recente Collaborative Islet Transplant Registry-rapport onthuld dat nuchtere bloedglucosespiegels gedurende een periode van 5 jaar op 60-140 mg / dL werden gehandhaafd bij meer dan 70% van de patiënten die alleen eilandjestransplantatie ondergingen. De studie stelde ook vast dat ongeveer 90% van de patiënten die alleen eilandjestransplantatie of eilandjestransplantatie na niertransplantatie kregen, gedurende meer dan 5 jaar geen ernstige hypoglycemische voorvallen ontwikkelden3.
Hoewel de klinische resultaten van deze behandeling zijn verbeterd, moeten sommige beperkingen nog steeds worden aangepakt, waaronder de noodzaak om een optimale transplantatieplaats op te zetten. De lever is een typische transplantatieplaats voor klinische eilandjestransplantatie omdat het het grootste orgaan is dat een groot aantal eilandjes kan herbergen. Bij sommige patiënten is de lever echter niet beschikbaar (bijvoorbeeld vanwege portale hypertensie, hepatitis en/of cirrose4) en dus andere plaatsen, waaronder de renale subcapsulaire ruimte 5,6, omentaalzakje 7,8,9,10, mesenterium11, maagdarmkanaal12, skeletspieren13, onderhuids weefsel13, beenmerg14 en milt15 ,16,17, zijn beschouwd als alternatieve transplantatieplaatsen.
Hoewel intraperitoneale eilandjestransplantatie gemakkelijk kan worden uitgevoerd onder lokale anesthesie, waardoor de intraperitoneale holte een aantrekkelijke plaats is voor klinische eilandjestransplantatie, worden de eilandjes bij transplantatie verspreid over de gehele intraperitoneale holte, waardoor de detectie van eilandjestransplantatie en succesvolle engraftmentbevestiging moeilijk zijn. Daarom wordt de intraperitoneale holte niet algemeen erkend als een ideale klinische transplantatieplaats. In plaats daarvan wordt het vaak gebruikt als een controlemodel voor preklinische studies om de effectiviteit van getransplanteerde ingekapselde18 en bio-technische eilandjeste onderzoeken 19. Een exacte vergelijking tussen bio-engineering en controle-eilandjes is echter moeilijk te bereiken vanwege de uitdagingen bij het uitvoeren van een nauwkeurige engraftmentbeoordeling.
Daarentegen is het gebruik van intraperitoneaal wit vetweefsel in de omentalepouch 8, mesenterium en andere extrahepatische locaties goed gemeld 10,20,21,22,23 en veel van de studies die de functie van bio-technische eilandjes onderzochten getransplanteerd met wit vetweefsel waren in staat om veelbelovende therapeutische resultaten te melden 20,24,25, 26. Omdat het gebruik van epididymaal vetweefsel de detectie van getransplanteerde eilandjes vergemakkelijkt, werd de "met vet bedekte eilandjestransplantatiemethode", waarbij gebruik wordt gemaakt van epididymaal vetweefsel, ontwikkeld om de beperkingen van intraperitoneale eilandjestransplantatie te overwinnen. In dit artikel wordt met vet bedekte eilandjestransplantatie met behulp van epididymal vetweefsel beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De volgende procedure wordt uitgevoerd in drie stappen. De eerste stap omvat de inductie van diabetes bij de ontvangende muizen en de isolatie van donoreilandjes. De tweede stap omvat de voorbereiding van eilandjes vóór transplantatie. In de derde stap wordt eilandjestransplantatie op epididymaal vetweefsel en bedekking van de eilandjes met behulp van het vetweefsel uitgevoerd. Daarna werden de therapeutische effecten beoordeeld. De behandeling van de muizen en de experimentele procedures die in deze studie worden uitgevoerd, voldoen aan de ''Principles of Laboratory Animal Care'' (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, National Institutes of Health publicatie8e editie, 2011), en het experimentele protocol werd goedgekeurd door de Animal Care and Use Committee van Fukuoka University (goedkeuringsnummer: 186018).
1. Chirurgische voorbereiding
- Inductie van diabetes: Induceer diabetes bij 20-25 g lichaamsgewicht, 8-12 weken oude mannelijke muizen van de ontvanger door intraveneuze injectie van 18 mg / ml streptozotocine-oplossing bereid in 0,1 M citraatbuffer (180 mg / kg lichaamsgewicht). Muizen met bloedglucosespiegels van meer dan 400 mg / dL worden beschouwd als diabetisch. Gebruik diabetische muizen binnen 1 week na diabetesinductie vóór overmatige atrofie van het epididymale witte vetweefsel voor het bedekken van eilandjes.
- Eilandjesisolatie: Voer muizeneilandisolatie een dag voor transplantatie uit volgens Gotoh's methode27 voor eilandjesisolatie.
- Kortom, verteerbaar pancreasweefsel met behulp van collagenase-oplossing. Isoleer eilandjes door dichtheidsgradiëntcentrifugatie met behulp van een geschikte celscheidingsoplossing. Vervolgens kweek eilandjes 's nachts in een couveuse bij 22 °C en 5% CO2 (cultuur bij <37 °C is gemeld om eilandjessterfte te voorkomen 28,29,30,31).
OPMERKING: Behandel de gezuiverde eilandjesculturen in een veiligheidskast. Filter-steriliseer alle oplossingen die worden gebruikt voor eilandisolatie en -kweek met behulp van een filter van 0,22 μm.
2. Voorbereiding van eilandjes voor transplantatie
- Verzamel de juiste instrumenten en materialen zoals aangegeven in figuur 1A.
- Aangezien spijsverteringsenzymen zoals amylase en lipase kunnen leiden tot letsel aan de geïsoleerde en getransplanteerde eilandjes en een verlies van eilandjes kan optreden door vast te zitten in het besmetten van vezelige weefsels in de kweekschaal, gebruik voorafgaand aan transplantatie een tang om eventuele extra-eilandjescomponenten uit de pancreas, waaronder acinaire en vezelige weefsels, met de hand te kiezen (figuur 1B), onder een ontleedmicroscoop. Gebruik na het plukken een celzeef om enkele acinaire cellen eruit te filteren.
- Breng de gefilterde eilandjes over naar een nieuwe kweekschaal met een geschikt kweekmedium of bufferoplossing (bijv. DMEM met lage glucose, RPMI1640, CMRL1066 of HBSS) aangevuld met runderserum of albumine om te voorkomen dat eilandjes aan plastic worden gehecht en draai de schaal om de eilandjes in het midden van de schaal te plaatsen (figuur 1C). Kies met behulp van een P200-micropipette en de microscoop de afzonderlijke eilandjes in een geschikte verzamelbuis (figuur 1D).
- Plaats een nieuwe celzeef van 40 μm bovenop een plastic buis van 50 ml (figuur 1E links en midden) en was het filter met vers medium (figuur 1E rechts).
- Gebruik een pipet van 1000 μL om de eilandjes aan de zeef toe te voegen om de eilandjes en enkele acinaire cellen te scheiden (figuur 1F1 en figuur 1F2).
OPMERKING: De gezuiverde eilandjes op celzeef zullen ongeveer 100% zuiver zijn. - Gebruik een tang om de zeef om te keren op een nieuwe niet-behandelde kweekschaal van 60 of 100 mm met kweekmedium of een geschikte bufferoplossing aangevuld met runderserum of albumine (figuur 1F3 en figuur 1F4). Gebruik vers medium/buffer om de eilandjes door te spoelen tot een nieuwe kweekschaal. Voeg vervolgens voldoende medium/buffer toe aan de kweekschaal om een totaal volume van ongeveer 20 ml te bereiken.
- Tel de eilandjes onder een microscoop en verdeel het aantal eilandjes gelijkelijk over individuele plastic centrifugebuizen van 1,5 ml op basis van het aantal donordieren (figuur 1G). Bijvoorbeeld, tweehonderd, 100-200 μm eilandequivalenten (IEQ) van twee muizen zouden worden toegevoegd aan elk van de twee buizen.
- Centrifugeer de eilandjes bij 2.100 x g binnen 1 minuut bij kamertemperatuur en gooi het supernatant weg. Ongeveer 20-30 μL restoplossing blijft doorgaans in de buis achter (figuur 1H).
3. Eilandjestransplantatie op epididymaal vetweefsel en bedekken met epididymaal wit vetweefsel
- Verzamel vóór de operatie een anesthesieapparaat voor kleine dieren, stereomicroscoop, lichtbron, 50-200 μL micropipette met 200 μL micropipettetips, wattenstaafjes, een 4-0 hechtset en gedesinfecteerde chirurgische instrumenten (figuur 2A). Autoclaaf de cooperschaar, oogheelkundige schaar, Pean tang, pincet en naaldhouders. Dompel de apparatuur na het autoclaveren onder in een 1% povidon-jodiumoplossing (figuur 2A). Gebruik wattenstaafjes voor mobilisatie van het epididymale witte vetweefsel en voor hemostase in geval van bloeding. Gebruik een micropipette met een tip van 50-200 μL voor eilandjestransplantatie.
- Anesthesie toedienen aan de diabetische ontvangende muis met behulp van een geïnhaleerd anestheticum (2% isofluraan in zuurstof). Breng oogheelkundig glijmiddel aan op beide ogen om uitdroging te voorkomen. Plaats de muis vervolgens in rugligging (figuur 2B links) en verwijder het haar uit de buik om infectie te voorkomen met behulp van tondeuses en/of ontharingscrème. Desinfecteer de buik en het liesgebied met ten minste drie afwisselende rondes van een povidon-jodiumoplossing gevolgd door 70% ethanol (figuur 2B rechts). Bevestig vóór de operatie de anesthesiediepte via de afwezigheid van een teenknijflex. Bied intra-operatieve thermische ondersteuning met behulp van een verwarmingskussen en gebruik een chirurgisch gordijn om het steriele chirurgische gebied te beveiligen.
- Snijd de huid in het onderste mediane gebied (figuur 2C links). Een huidincisie van ongeveer 2 cm lang wordt aanbevolen. Klem de linker buikwand vast met de Pean-tang (atraumatische tang of retractor kan ook worden gebruikt) en trek het weefsel naar de linkerkant van de muis om het operatieveld vast te zetten (figuur 2C rechts). Verlaag na laparotomie het percentage isofluraan tot 1,0-1,5% voor anesthesieonderhoud.
- Gebruik een wattenstaafje om de dunne en dikke darm aan de rechterkant van de muis te mobiliseren (d.w.z. de linkerkant van de operator). Het linker epididymale witte vetweefsel in de buikholte bevindt zich in het linker liesgebied. Mobiliseer het epididymale witte vetweefsel en de linker testileer naar buiten de buik (figuur 2D links) en strek het weefsel uit (2D rechts).
- Gebruik een P200-micropipette uitgerust met een pipetpunt van 200 μL om het volledige volume eilandjes te verzamelen uit één buis van 1,5 ml met zachte pipettering (figuur 2E links), waarbij u ervoor moet zorgen dat er bij het verzamelen geen eilandjes in de buis achterblijven. Laat de verzamelde eilandjes door de zwaartekracht aan de punt van de pipet zakken (figuur 2E rechts).
- Plaats de punt van de micropipette lichtjes op het opgezwollen vetweefsel. Zorg ervoor dat overmatig blozen van het medium/de buffer in de punt wordt voorkomen en zaai de eilandjes voorzichtig op het weefsel (figuur 2F links). Bevestig na het zaaien een juiste plaatsing van de eilandjes onder een ontleedmicroscoop (figuur 2F rechts).
- Bedek de eilandjes met het epididymale witte vetweefsel (figuur 2G). Het gebruik van hechtingen of biobindende middelen is niet nodig.
- Plaats de linker testis onder het epididymale witte vetweefsel en breng de weefsels terug naar de intraperitoneale holte (figuur 2H). Sluit de huid in twee lagen (peritoneum, vervolgens spieren en huid) met behulp van een 4-0 hechtdraad (eventuele hechtingen zoals nylon of absorbeerbare hechtingen kunnen worden gebruikt) (figuur 2I). Injecteer acetylsalicylzuur (300 mg/kg; SQ) in de buurt van de wond voor postoperatieve analgesie. Plaats de muis vervolgens onder een warmtelamp en controleer tot volledig herstel.
4. Monitoring na eilandjestransplantatie (samenvatting)
- Beoordeel de therapeutische effecten van eilandjestransplantatie door bloedglucose, glucosetolerantietest en histologische beoordeling op postoperatieve dag (POD) te controleren 28.
- Controleer de bloedglucose, inclusief de metingen van de bloedglucose bij de glucosetolerantietest, met behulp van een kleine glucosemeter.
- Verzamel de bloedmonsters (een beetje microliter) uit de staartader. Wat histologische beoordeling betreft, werden murine-insuline (voor het detecteren van geënte eilandjes) en von Willebrand-factor (voor detectie van bloedvaten, wat een bewijs is voor eilandjestransplantatie) gedetecteerd in getransplanteerde eilandjes in het herstelde epididymale vetweefsel door immunohistochemie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de transplantatie-werkzaamheid van met vet bedekte eilandjestransplantatie te vergelijken met die na intraperitoneale eilandjestransplantatie, werd hetzelfde aantal eilandjes geïmplanteerd op het peritoneum in de linker paracolische ruimte van controleontvangers diabetische dieren. De bloedglucosespiegels van muizen met met vet bedekte eilandjestransplantatie werden waargenomen om geleidelijk en significant te dalen in vergelijking met intraperitoneale eilandjes getransplanteerde muizen (p = 0,0023; Figuur 3A). Een maand na transplantatie werd de bloedglucose bij muizen met met vet bedekte eilandjestransplantatie op lagere niveaus gehouden dan die waargenomen bij intraperitoneale eilandjes getransplanteerde muizen zoals beoordeeld door intraperitoneale glucosetolerantietests (p = 0,0046; Figuur 3B). Bovendien, zoals we eerder hebben gemeld, dat plasma-insulinespiegels ook verbeterden na vet-bedekte eilandjestransplantatie. Herverhoging van de bloedglucosespiegels werd ook bevestigd. Deze gegevens tonen aan dat intraperitoneale met vet bedekte eilandjestransplantatie met behulp van 200 IEP's de diabetische omstandigheden van ontvangende muizen aanzienlijk kan verbeteren.
Histologisch onderzoek werd ook uitgevoerd om de engraftatie van eilandjes in het epididymale witte vetweefsel te beoordelen. Bij met vet bedekte eilandjestransplantatie-ontvangende dieren onthult hematoxyline-eosinekleuring de aanwezigheid van eilandjes in het epididymale witte vetweefsel (figuur 3C, bovenste afbeelding). Bovendien vergemakkelijkte fluorescentie-geconjugeerde antilichaamkleuring van insulinepositieve eilandjes de detectie van von Willebrand-factorpositieve microvessels in het epididymale witte vetweefsel van alle ontvangende muizen (n = 6; Figuur 3C). Daarentegen werden bij intraperitoneale eilandjes getransplanteerde muizen geen getransplanteerde eilandjes waargenomen in het epididymale witte vetweefsel of de buikwand (gegevens niet getoond).
Figuur 1-ABC. Voorbereiding van eilandjes voor transplantatie op epididymaal vetweefsel en bedekken met epididymaal wit vetweefsel. (A) Bereiding van instrumenten: a. pipethulpmiddel, b. 10 ml pipetpunten, c. 50 ml plastic buizen, d. 15 ml plastic buizen, e. 50-200 μL (links) en 200-1000 μL (rechts) micropipettes, f. 1,5 ml plastic centrifugebuizen, g. 200 en 1000 μL micropipettepunten, h. medium of buffer bevattend albumine of foetaal runderserum (d.w.z. DMEM met lage glucose die 10% foetaal runderserum en 100 U/ml penicilline + 100 U/ml streptomycineoplossing bevat), en i. 40 μm celzeef. (B) Geïsoleerde eilandjes met acinaire (links: aangegeven met pijl) en vezelige weefsels (rechts). Schaalbalk = 200 μm. (C) Verzamelde eilandjes in de plastic buis. Links, verspreide eilandjes in cultuurschaal. Midden, eilandjes worden verzameld in het midden van de cultuurschotel door wervelen. Rechts, verzamelde eilandjes in het midden van de schotel. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 1-DEF. Voorbereiding van eilandjes voor transplantatie op epididymaal vetweefsel en bedekken met epididymaal wit vetweefsel. (D) Verzamelde eilandjes (links) worden overgebracht in plastic buizen van 15 ml (rechts). (E) De 40 μm celzeef wordt bovenop de 50 ml plastic buis geplaatst (links en midden). Bereid medium/buffer toegevoegd aan andere 50 ml plastic buis voor het spoelen van eilandjes op de celzeef in een nieuwe kweekschaal (rechts). f) 1. Eilandjes verzameld met behulp van een 200-1000 μL micropipette. 2. Eilandjes gegoten in de celzeef. 3 en 4. Medium/buffer gebruikt om eilandjes op zeef te spoelen tot nieuwe kweekschaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 1-GH. Voorbereiding van eilandjes voor transplantatie op epididymaal vetweefsel en bedekken met epididymaal wit vetweefsel. (G) Eilandjes verdeeld in 1,5 ml plastic centrifugebuis op basis van het aantal ontvangende muizen. Hier werden tweehonderd eilandjesequivalenten van 100-200 μm (IEQ) gelijkelijk in elke buis verdeeld. (H) Eilandjes gelijk verdeeld in buizen van 1,5 ml vóór centrifugatie (links). Eilandjes gecentrifugeerd om te verzamelen aan de onderkant van de buis (midden). 20-30 μL supernatant blijft in de buis achter na het weggooien van overtollige oplossing (rechts). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2-ABC. De procedure van eilandjestransplantatie op epididymaal vetweefsel en bedekken met behulp van epididymaal wit vetweefsel. (A) Voorbereiding van instrumenten: a. anesthesieapparaat voor kleine dieren, b. stereomicroscoop, c. lichtbron, d. gedesinfecteerde chirurgische instrumenten, e. verdeelde eilandjes in plastic buizen van 1,5 ml, f. 50-200 μL micropipettes, g. 200 μL micropipettepunten en h. 4-0 hechtingen. (B) Diabetische ontvangende muis in rugligging onder algemene anesthesie van 2% isofluraan (links). De buik en het liesgebied worden gedesinfecteerd met 70% ethanol en bedekt met een papieren laboratoriumdoekje (rechts). (C) De huid is ingesneden in de onderste mediane positie (links). De linker buikwand wordt geklemd door een Pean-tang en naar de linkerkant van de muis getrokken om het chirurgische veld te beveiligen (rechts). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2-DEF. De procedure van eilandjestransplantatie op epididymaal vetweefsel en bedekken met behulp van epididymaal wit vetweefsel. (D) Het linker epididymale witte vetweefsel en de linker testis worden buiten de buik gemobiliseerd (links) en opgezwollen (rechts). Schaalbalk = 1 cm. (E) Eilandjes in plastic buizen van 1,5 ml worden volledig verzameld met behulp van een micropipette met 200 μL pipetpunt (links). Verzamelde eilandjes (aangegeven met pijl) lieten volledig zinken door de zwaartekracht naar pipetpunt (rechts). (F) Micropipette tip licht geplaatst op het opgezwollen vetweefsel (links). Eilandjeszaaien (stippelcirkel) op het weefsel bevestigd door de ontleedmicroscoop (rechts). Schaalbalk = 1 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2-GHI. De procedure van eilandjestransplantatie op epididymaal vetweefsel en bedekken met behulp van epididymaal wit vetweefsel. (G) Eilandjes zijn bedekt met epididymaal wit vetweefsel. (H) Linker testis en epididymaal wit vetweefsel teruggekeerd naar de intraperitoneale holte. (I) Afbeelding na buiksluiting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Het therapeutische effect van met vet bedekte eilandjestransplantatie. (A) Bloedglucosespiegel. Blauwe lijn: met vet bedekte eilandjestransplantatie (n = 6); Oranje lijn: intraperitoneale eilandjestransplantatie (n = 6) Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van herhaalde metingen analyse van variantie en een significant verschil werd gedefinieerd als p < 0,05. (B) Bloedglucosespiegel van glucosetolerantietest een maand na transplantatie. Blauwe lijn: met vet bedekte eilandjestransplantatie (n = 6); Oranje lijn: intraperitoneale eilandjestransplantatie (n = 6). Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van herhaalde metingen analyse van variantie en een significant verschil werd gedefinieerd als p < 0,05. (C) Histologisch beeld van geënte eilandjes één maand na transplantatie. Bovenste afbeelding: hematoxyline-eosinekleuring; Onderste afbeelding: immunohistostaining voor muizeninsuline (groen) en von Willebrand-factor (vWF: rood, aangegeven met witte pijl). Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De met vet bedekte eilandjestransplantatiemethode omvat technieken van twee verschillende transplantatietechnieken: intraperitoneale eilandjestransplantatie en intra-vetweefseleilandjestransplantatie. Aangezien het oppervlaktemembraan van epididymaal wit vetweefsel wordt beschouwd als het witte vetweefsel dat wordt bedekt door het peritoneum en dat is bevestigd aan de bijbal, kan de met vet bedekte eilandjestransplantatiemethode anatomisch worden gecategoriseerd als een soort intraperitoneale eilandjestransplantatie. De techniek waarmee de eilandjes aan het ontvangende dier worden afgeleverd, lijkt echter meer op die welke worden gebruikt bij intra-vetweefseleilandjestransplantatie. Onze gegevens tonen aan dat het therapeutische effect van de met vet bedekte eilandjestransplantatiemethode superieur is aan dat van intraperitoneale eilandjestransplantatie. Onze eerdere studie toonde ook aan dat de transplantatie-werkzaamheid van deze methode bijna gelijk is aan die van renale subcapsulaire eilandjestransplantatie, een methode van eilandjestransplantatie met een superieure transplantatie-werkzaamheid23. Er wordt gespeculeerd dat het nut van deze methode te wijten kan zijn aan de adhesiemoleculen die aanwezig zijn in witte vetweefsels en adipocytokines en waarvan wordt gedacht dat ze bijdragen aan eilandjestransplantatie10,23.
De grootte van het epididymale witte vetweefsel maakt het mogelijk om een groot aantal eilandjes op te vangen. Daarentegen is het grotere omentum van het knaagdier te klein om gemakkelijk veel eilandjes te bevatten en te bereiken. De enige fysieke beperking van epididymaal wit vetweefsel als potentiële experimentele eilandjestransplantatieplaats is dat het geen portaalcirculatie van insuline10 biedt.
De methode is uniek omdat de eilandjes bedekt zijn met vetweefsels, in plaats van direct in het weefsel te worden toegediend. Intra-vetweefsel getransplanteerde eilandjes kunnen lijden aan de invloed van lipotoxiciteit, omdat de verminderde insulinefunctie bij diabetische dieren kan leiden tot overtollige vrije vetzuren32. Deze methode vereist ook geen biobondingsmiddelen of hechting om geïmplanteerd eilandjesverlies te voorkomen. Zoals waargenomen in figuur 3C, blijven eilandjes met succes geënt in het vetweefsel tot 1 maand na transplantatie en is het onderhoud van de bloedglucosespiegel bevestigd na graftectomie23. Dit fenomeen kan te wijten zijn aan het vermogen van vetweefsel om de eilandjes te vangen, die moeilijk af te pellen zijn.
De voordelen van deze methode zijn dat het technisch eenvoudig uit te voeren is, een metabole en histologische beoordeling van de therapeutische effecten van de eilandjes mogelijk maakt en de evaluatie van eilandjesgen- en / of eiwitexpressie na grafectomie vergemakkelijkt. Vergeleken met eerdere studies is de werkzaamheid van deze methode niet onderdoend voor die van eilandjestransplantatie in epididymaal wit vetweefsel 10,33,34,35,36. Het is belangrijk op te merken dat een nauwkeurige zaaiing van de eilandjes op het epididymale witte vetweefsel zonder verlies van eilandjes noodzakelijk is voor een succesvolle engraftment. Om succes te garanderen, moet het volledige volume eilandjes voorzichtig worden aangezogen in de micropipettepunt van de plastic buis van 1,5 ml, omdat ruw en snel pipetteren kan resulteren in een hechting van eilandjes aan de wanden van de plastic buis, waardoor doseren moeilijk wordt. De hechting van eilandjes is een belangrijke reden voor onvoldoende eilandjeszaaien. Nadat de eilandjes zich aan de punt van de micropipettepunt hebben laten bezinken, moeten de eilandjes op het epididymale vetweefsel worden geïmplanteerd zonder te spoelen. Het is belangrijk om de druk van de zuigerknop bij het aspirateren en doseren van de eilandjes te minimaliseren om overmatig medium / buffer spoelen van het vetweefsel te voorkomen. Daarom is het essentieel om te wachten tot de eilandjes volledig zijn samengevoegd aan de punt van de micropipettepunt voordat u de zuigerknop van de micropipette indrukt voor implantatie. Het is voldoende om de punt licht op het vetweefsel te plaatsen en het zaaien van eilandjes op het weefsel te bevestigen door middel van lichtmicroscopie.
Kortom, deze methode is heel eenvoudig, ondanks het feit dat er verschillende kritieke stappen nodig zijn voor het succes ervan. We hopen op de brede toepassing van deze methode om verder te helpen bij het vergemakkelijken van eilandjestransplantatie op wit vetweefsel en voor verdere evaluatie van de therapeutische effecten van bio-technische eilandjes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Deze studie werd gefinancierd door een Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (19K09839, NS) van het Ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie van Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 Nylon | Alfresa | ER2004NA45-KF2 | Closing abdomen |
| Alexa 488-conjugated donkey anti-guinea pig | Jackson Immunoresearch | 706-546-148 | Secondary antibody for insulin antibody |
| Alexa 647-conjugated donkey anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-606-152 | Secondary antibody for von Willebrand factor antibody |
| DMEM, low glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11885084 | Culturing islets, transplanting islets |
| Eosin | Fujifilm Wako Chemicals | 051-06515 | Using for staining tissue by eosin |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Collecting islets |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352095 | Collecting islets |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Using for separating islets from other pancreatic tissue |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | Discarding excessive medium/buffer |
| Guinea pig anti-insulin | Agilent Technologies Japan, Ltd. (Dako) | IR002 | Primary antibody for murine insulin |
| Hematoxylin | Muto Pure Chemicals Co., Ltd. | 30002 | Using for staining tissue by hematoxylin |
| Isodine solution 10% | Shionogi&Co., Ltd. | no catalog number | Using for disinfection |
| Isoflurane | Fujifilm Wako Chemicals | 095-06573 | Using for anesthesia |
| Labcon 1000 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips | Labcon | 1177-965-008 | Using for separating islets from other pancreatic tissue |
| Labcon 200 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips | Labcon | 1179-965-008 | Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue |
| Mintsensor | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co. Ltd., | 8AEB02E | Using for monitoring blood glucose |
| Pipetteman P-1000 | Gilson | F123602 | Using for separating islets from other pancreatic tissue |
| Pipetteman P-200 | Gilson | F123601 | Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue |
| Rabbit anti-vWF | Abcam | ab6994 | Primary antibody for murine von Willebrand factor |
References
- Barton, F. B., et al. Improvement in outcomes of clinical islet transplantation: 1999-2010. Diabetes Care. 35 (7), 1436-1445 (2012).
- Balamurugan, A. N., et al. Islet product characteristics and factors related to successful human islet transplantation from the Collaborative Islet Transplant Registry (CITR) 1999-2010. American Journal of Transplantation. 14 (11), 2595-2606 (2014).
- Collaborative Islet Transplant Registry. Collaborative Islet Transplant Registry. Annual Report. , (2017).
- Rajab, A., et al. Total Pancreatectomy and Islet Autotransplantation Following Treated Hepatitis C Infection. Cell Transplantation. 27 (10), 1569-1573 (2018).
- Mellgren, A., Schnell Landstrom, A. H., Petersson, B., Andersson, A. The renal subcapsular site offers better growth conditions for transplanted mouse pancreatic islet cells than the liver or spleen. Diabetologia. 29 (9), 670-672 (1986).
- Hiller, W. F., Klempnauer, J., Luck, R., Steiniger, B. Progressive deterioration of endocrine function after intraportal but not kidney subcapsular rat islet transplantation. Diabetes. 40 (1), 134-140 (1991).
- Yasunami, Y., Lacy, P. E., Finke, E. H. A new site for islet transplantation--a peritoneal-omental pouch. Transplantation. 36 (2), 181-182 (1983).
- Kin, T., Korbutt, G. S., Rajotte, R. V. Survival and metabolic function of syngeneic rat islet grafts transplanted in the omental pouch. American Journal of Transplantation. 3 (3), 281-285 (2003).
- Kasoju, N., et al. Bioengineering a pre-vascularized pouch for subsequent islet transplantation using VEGF-loaded polylactide capsules. Biomaterials Science. 8 (2), 631-647 (2020).
- Sakata, N., Yoshimatsu, G., Kodama, S. White Adipose Tissue as a Site for Islet Transplantation. Transplantology. 1 (2), 55-70 (2020).
- Osama Gaber, A., Chamsuddin, A., Fraga, D., Fisher, J., Lo, A. Insulin independence achieved using the transmesenteric approach to the portal vein for islet transplantation. Transplantation. 77 (2), 309-311 (2004).
- Fujita, M., et al. Technique of endoscopic biopsy of islet allografts transplanted into the gastric submucosal space in pigs. Cell Transplantation. 22 (12), 2335-2344 (2013).
- Sakata, N., et al. Strategy for clinical setting in intramuscular and subcutaneous islet transplantation. Diabetes/Metabolism Research and Reviews. 30 (1), 1-10 (2014).
- Cantarelli, E., et al. Transplant Site Influences the Immune Response After Islet Transplantation: Bone Marrow Versus Liver. Transplantation. 101 (5), 1046-1055 (2017).
- White, S. A., et al. The risks of total pancreatectomy and splenic islet autotransplantation. Cell Transplantation. 9 (1), 19-24 (2000).
- Itoh, T., Nishinakamura, H., Kumano, K., Takahashi, H., Kodama, S. The Spleen Is an Ideal Site for Inducing Transplanted Islet Graft Expansion in Mice. PLoS One. 12 (1), 0170899 (2017).
- Sakata, N., Yoshimatsu, G., Kodama, S. The Spleen as an Optimal Site for Islet Transplantation and a Source of Mesenchymal Stem Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), (2018).
- Sakata, N., et al. Effect of rat-to-mouse bioartificial pancreas xenotransplantation on diabetic renal damage and survival. Pancreas. 32 (3), 249-257 (2006).
- Nagaya, M., et al. Effectiveness of bioengineered islet cell sheets for the treatment of diabetes mellitus. Journal of Surgical Research. 227, 119-129 (2018).
- Weaver, J. D., et al. Vasculogenic hydrogel enhances islet survival, engraftment, and function in leading extrahepatic sites. Science Advances. 3 (6), 1700184 (2017).
- Dufour, J. M., et al. Development of an ectopic site for islet transplantation, using biodegradable scaffolds. Tissue Engineering. 11 (9-10), 1323-1331 (2005).
- Chen, X., et al. The epididymal fat pad as a transplant site for minimal islet mass. Transplantation. 84 (1), 122-125 (2007).
- Sakata, N., et al. Mechanism of Transplanted Islet Engraftment in Visceral White Adipose Tissue. Transplantation. 104 (12), 2516-2527 (2020).
- Navarro-Requena, C., et al. PEG hydrogel containing calcium-releasing particles and mesenchymal stromal cells promote vessel maturation. Acta Biomaterialia. 67, 53-65 (2018).
- Phelps, E. A., Headen, D. M., Taylor, W. R., Thule, P. M., Garcia, A. J. Vasculogenic bio-synthetic hydrogel for enhancement of pancreatic islet engraftment and function in type 1 diabetes. Biomaterials. 34 (19), 4602-4611 (2013).
- Manzoli, V., et al. Immunoisolation of murine islet allografts in vascularized sites through conformal coating with polyethylene glycol. American Journal of Transplantation. 18 (3), 590-603 (2018).
- Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. P. An improved method for isolation of mouse pancreatic islets. Transplantation. 40 (4), 437-438 (1985).
- Brandhorst, D., Brandhorst, H., Hering, B. J., Bretzel, R. G. Long-term survival, morphology and in vitro function of isolated pig islets under different culture conditions. Transplantation. 67 (12), 1533-1541 (1999).
- Noguchi, H., et al. Low-temperature preservation of isolated islets is superior to conventional islet culture before islet transplantation. Transplantation. 89 (1), 47-54 (2010).
- Itoh, T., et al. Low temperature condition prevents hypoxia-induced islet cell damage and HMGB1 release in a mouse model. Cell Transplantation. 21 (7), 1361-1370 (2012).
- Komatsu, H., et al. Optimizing Temperature and Oxygen Supports Long-term Culture of Human Islets. Transplantation. 103 (2), 299-306 (2019).
- Unger, R. H. Lipid overload and overflow: metabolic trauma and the metabolic syndrome. Trends in Endocrinology, Metabolism. 14 (9), 398-403 (2003).
- Mao, D., et al. A macroporous heparin-releasing silk fibroin scaffold improves islet transplantation outcome by promoting islet revascularisation and survival. Acta Biomaterialia. 59, 210-220 (2017).
- Wang, K., Wang, X., Han, C. S., Chen, L. Y., Luo, Y. Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice. Journal of Visualized Experiments. (125), e54995 (2017).
- Wang, X., Wang, K., Zhang, W., Qiang, M., Luo, Y. A bilaminated decellularized scaffold for islet transplantation: Structure, properties and functions in diabetic mice. Biomaterials. 138, 80-90 (2017).
- Rios, P. D., Zhang, X., Luo, X., Shea, L. D. Mold-casted non-degradable, islet macro-encapsulating hydrogel devices for restoration of normoglycemia in diabetic mice. Biotechnology and Bioengineering. 113 (11), 2485-2495 (2016).
