Summary
Denne fettdekkede holmetransplantasjonsmetoden er egnet for påvisning av podede øyer i det intraperitoneale hulrommet. Spesielt krever det ikke bruk av biobindende midler eller suturering.
Abstract
Holmetransplantasjon er en cellulær erstatningsterapi for alvorlig diabetes mellitus. Det intraperitoneale hulrommet er vanligvis transplantasjonsstedet for denne prosedyren. Imidlertid har intraperitoneal øytransplantasjon noen begrensninger, inkludert dårlig transplantasjonseffekt, vanskelig transplantatdeteksjonsevne og mangel på graftektomi-evne for analyse etter transplantasjon. I dette papiret brukes "fettdekket øytransplantasjon", en intraperitoneal øytransplantasjonsmetode som benytter epididymalt hvitt fettvev, til å vurdere de terapeutiske effektene av bioengineerte øyer. Enkelheten i metoden ligger i såing av holmer på epididymalt hvitt fettvev og bruk av vevet til å dekke holmene. Selv om denne metoden kan kategoriseres som en intraperitoneal øytransplantasjonsteknikk, deler den egenskaper med intra-fettvevsøytransplantasjon. Den fettdekkede holmetransplantasjonsmetoden viser imidlertid mer robuste terapeutiske effekter enn intrafettvevstransplantasjon, inkludert forbedring av blodsukker- og plasmainsulinnivåer og potensialet for fjerning av transplantat. Vi anbefaler å ta i bruk denne metoden for å vurdere mekanismene for holmetransplantasjon i hvitt fettvev og de terapeutiske effektene av bioengineerte øyer.
Introduction
Holmetransplantasjon er en cellulær erstatningsterapi for pasienter med alvorlig diabetes mellitus. Nylige rapporter har vist at frekvensen av insulinuavhengighet tre år etter transplantasjon forbedres opp til 44%1 , og at omtrent 80% av mottakerne som mottar mer enn 600 000 totale øyekvivalenter, oppnår insulinuavhengighet2. Videre ble det i den siste Collaborative Islet Transplant Registry-rapporten avslørt at fastende blodsukkernivåer ble opprettholdt på 60-140 mg / dL i over en periode på 5 år hos over 70% av pasientene som gjennomgikk holmetransplantasjon alene. Studien fastslo også at rundt 90% av pasientene som fikk øytransplantasjon alene eller øytransplantasjon etter nyretransplantasjon ikke utviklet noen alvorlige hypoglykemiske hendelser i over 5 år3.
Selv om de kliniske resultatene av denne behandlingen har blitt bedre, må noen begrensninger fortsatt tas opp, inkludert nødvendigheten av å etablere et optimalt transplantasjonssted. Leveren er et typisk transplantasjonssted for klinisk øytransplantasjon fordi det er det største organet som har plass til et høyt volum av øyer. Hos noen pasienter er imidlertid leveren utilgjengelig (f.eks. på grunn av portal hypertensjon, hepatitt og/eller cirrhose4) og derfor andre steder, inkludert det renale subkapsulære rommet 5,6, omental pose 7,8,9,10, mesenteri 11, gastrointestinaltraktus 12, skjelettmuskulatur 13, subkutant vev 13, benmarg14 og milt 15 ,16,17, har vært vurdert som alternative transplantasjonssteder.
Selv om intraperitoneal øytransplantasjon lett kan utføres under lokalbedøvelse, noe som gjør det intraperitoneale hulrommet til et tiltalende sted for klinisk øytransplantasjon, blir øyene ved transplantasjon spredt over hele intraperitonealhulen, noe som gjør det vanskelig å oppdage holmetransplantasjon og vellykket engraftmentbekreftelse. Derfor er det intraperitoneale hulrommet ikke allment anerkjent som et ideelt klinisk transplantasjonssted. I stedet brukes det ofte som en kontrollmodell for prekliniske studier for å undersøke effektiviteten av transplanterte innkapslede18 og bioengineerte øyer19. En nøyaktig sammenligning mellom bioengineered og control islets er imidlertid vanskelig å oppnå på grunn av utfordringene med å utføre en nøyaktig engraftment vurdering.
I motsetning til dette har bruken av intraperitonealt hvitt fettvev i omental pose8, mesenteri og andre ekstrahepatiske steder blitt godt rapportert 10,20,21,22,23, og mange av studiene som undersøkte funksjonen til bioengineerte øyer transplantert ved hjelp av hvitt fettvev, var i stand til å rapportere lovende terapeutiske resultater20,24,25, 26. Da bruken av epididymalt fettvev letter påvisning av transplanterte øyer, ble den "fettdekkede holmetransplantasjonsmetoden", ved bruk av epididymalt fettvev, utviklet for å overvinne begrensningene ved intraperitoneal øytransplantasjon. I denne artikkelen beskrives fettdekket øytransplantasjon ved bruk av epididymalt fettvev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende prosedyre utføres i tre trinn. Det første trinnet inkluderer induksjon av diabetes hos mottakermusene og isolering av donorøyer. Det andre trinnet innebærer fremstilling av øyer før transplantasjon. I tredje trinn utføres øytransplantasjon på epididymalt fettvev og tildekking av holmene ved bruk av fettvevet. Deretter ble de terapeutiske effektene vurdert. Håndteringen av musene og de eksperimentelle prosedyrene som ble utført i denne studien, er i samsvar med '' Principles of Laboratory Animal Care '' (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, National Institutes of Health publikasjon 8. utgave, 2011), og den eksperimentelle protokollen ble godkjent av Animal Care and Use Committee of Fukuoka University (godkjenningsnummer: 186018).
1. Kirurgisk forberedelse
- Induksjon av diabetes: Indusere diabetes i 20-25 g kroppsvekt, 8-12 uker gammel mottaker hannmus gjennom intravenøs injeksjon av 18 mg / ml streptozotocinoppløsning tilberedt i 0,1M citratbuffer (180 mg / kg kroppsvekt). Mus med blodsukkernivåer over 400 mg / dL anses å være diabetikere. Bruk diabetiske mus innen 1 uke etter diabetesinduksjon før overdreven atrofi av det epididymale hvite fettvevet for å dekke øyer.
- Holmeisolasjon: Utfør murine holmeisolasjon en dag før transplantasjon etter Gotohs metode27 for holmeisolasjon.
- Kort sagt, fordøye bukspyttkjertelvev ved hjelp av kollagenaseoppløsning. Isoler holmer ved tetthetsgradientsentrifugering ved hjelp av en passende celleseparasjonsløsning. Deretter er det rapportert kulturøyer over natten i en inkubator ved 22 °C og 5 % CO2 (dyrkning ved <37 °C for å forhindre øydød 28,29,30,31).
MERK: Håndter de rensede holmekulturene i et sikkerhetsskap. Filtersteriliser alle løsninger som brukes til holmeisolasjon og kultur ved hjelp av et 0,22 μm filter.
2. Klargjøring av øyer for transplantasjon
- Samle de riktige instrumentene og materialene som angitt i figur 1A.
- Siden fordøyelsesenzymer som amylase og lipase kan føre til skade på de isolerte og transplanterte øyene, og tap av øyer kan oppstå ved å bli fanget i forurensende fibrøst vev i kulturskålen, før transplantasjon, bruk tang for å håndplukke eventuelle ekstra øykomponenter fra bukspyttkjertelen, inkludert acinært og fibrøst vev (figur 1B), under et dissekeringsmikroskop. Etter plukking, bruk en celle sil for å filtrere ut enkelt acinar celler.
- Overfør de filtrerte holmene til en ny kulturskål som inneholder et passende kulturmedium eller bufferløsning (f.eks. DMEM med lav glukose, RPMI1640, CMRL1066 eller HBSS) supplert med storfeserum eller albumin for å forhindre at holmen festes til plast og virvle parabolen for å plassere holmene i midten av parabolen (figur 1C). Bruk en P200-mikropipette og mikroskopet til å plukke de enkelte holmene inn i et passende oppsamlingsrør (figur 1D).
- Plasser en ny cellesil på 40 μm oppå et 50 ml plastrør (figur 1E til venstre og i midten) og vask filteret med nytt medium (figur 1E til høyre).
- Bruk en 1000 μL pipette for å legge holmene til silen for å skille holmene og enkeltacinarcellene (figur 1 F1 og figur 1F2).
MERK: De rensede holmene på cellesilen vil være omtrent 100% rene. - Bruk tang til å invertere silen på en ny 60- eller 100 mm størrelse ikke-behandlet kulturskål som inneholder kulturmedium eller en passende bufferløsning supplert med storfeserum eller albumin (figur 1 F3 og figur 1F4). Bruk ferskt medium/buffer til å skylle holmene inn i en ny kulturrett. Tilsett deretter nok medium/buffer til kulturskålen til å nå et totalvolum på ca. 20 ml.
- Tell holmene under mikroskop og del antall holmer likt mellom individuelle 1,5 ml plastsentrifugerør etter antall donordyr (figur 1G). For eksempel vil to hundre, 100-200 μm holmekvivalenter (IEQ) fra to mus bli lagt til hver av to rør.
- Sentrifuger holmene på 2 100 x g innen 1 minutt ved romtemperatur og kast supernatanten. Rundt 20-30 μL restoppløsning vil typisk forbli i røret (figur 1H).
3. Øytransplantasjon på epididymalt fettvev og tildekking med epididymalt hvitt fettvev
- Før operasjonen, samle en anestesimaskin for små dyr, stereomikroskop, lyskilde, 50-200 μL mikropipette med 200 μL mikropipettespisser, bomullspinner, et 4-0 sutureringssett og desinfiserte kirurgiske instrumenter (figur 2A). Autoklav cooper saks, oftalmisk saks, Pean tang, pinsett og nåleholdere. Etter autoklavering, senk utstyret i en 1% povidon-jodløsning (figur 2A). Bruk bomullspinne for mobilisering av epididymalt hvitt fettvev og for hemostase i tilfeller av blødning. Bruk en mikropipette med 50-200 μL spisser for øytransplantasjon.
- Lever anestesi til diabetiker mottaker mus ved hjelp av et inhalert bedøvelsesmiddel (2% isofluran i oksygen). Påfør oftalmisk smøremiddel på begge øynene for å forhindre tørking. Plasser deretter musen i liggende stilling (figur 2B til venstre) og fjern håret fra magen for å forhindre infeksjon ved hjelp av hårklippere og / eller hårfjerningskrem. Desinfiser abdomen og lyskeregionen ved bruk av minst tre vekslende runder av en povidon-jodoppløsning etterfulgt av 70% etanol (figur 2B til høyre). Før operasjonen, bekrefte anestesi dybde via fravær av en tå klype refleks. Gi intraoperativ termisk støtte ved hjelp av en varmepute og bruk en kirurgisk drapering for å sikre det sterile kirurgiske området.
- Snitt i huden nederst i medianområdet (figur 2C til venstre). Et hudsnitt som er ca. 2 cm langt anbefales. Klem venstre bukvegg med Pean tang (atraumatic tang eller retractor kan også brukes) og trekk vevet til venstre side av musen for å sikre operasjonsfeltet (figur 2C høyre). Etter laparotomi, reduser prosentandelen isofluran til 1,0-1,5% for vedlikehold av anestesi.
- Bruk en bomullspinne for å mobilisere tynn- og tykktarmen til høyre side av musen (dvs. venstre side av operatøren). Venstre epididymale hvite fettvev i bukhulen ligger i venstre inngangsområde. Mobiliser det epididymale hvite fettvevet og venstre testis til utsiden av abdomen (figur 2D venstre) og strekk ut vevet (2D høyre).
- Bruk en P200 mikropipette utstyrt med en 200 μL pipettespiss for å samle hele volumet av holmer fra ett 1,5 ml rør med skånsom pipettering (figur 2E igjen), og pass på at ingen holmer blir igjen i røret ved oppsamling. La de oppsamlede holmene slå seg ned til pipettens spiss etter tyngdekraften (figur 2E til høyre).
- Plasser mikropipettespissen lett på det oppblåste fettvevet. Pass på å unngå overdreven spyling av mediet/bufferen i spissen, og frø holmene forsiktig på vevet (figur 2F til venstre). Etter såing, bekreft riktig plassering av holmene under et dissekeringsmikroskop (figur 2F til høyre).
- Dekk holmene med det epididymale hvite fettvevet (figur 2G). Bruk av suturer eller biobindende midler er ikke nødvendig.
- Plasser venstre testis under det epididymale hvite fettvevet og returner vevet til intraperitonealhulen (figur 2H). Lukk huden i to lag (bukhinne, deretter muskler og hud) med 4-0 sutur (suturer som nylon eller absorberbare suturer kan brukes) (figur 2I). Injiser acetylsalisylsyre (300 mg/kg; SQ) nær såret for postoperativ analgesi. Plasser deretter musen under en varmelampe og skjerm til full gjenoppretting.
4. Overvåking etter øytransplantasjon (Sammendrag)
- Vurdere terapeutiske effekter av øytransplantasjon ved å overvåke blodsukker, glukosetoleransetest og histologisk vurdering på postoperativ dag (POD) 28.
- Overvåk blodsukkeret, inkludert målinger av blodsukker ved glukosetoleransetest, ved hjelp av en liten glukosemåler.
- Samle blodprøvene (litt mikroliter) fra halevenen. Når det gjelder histologisk vurdering, ble murine insulin (for påvisning av transplanterte holmer) og von Willebrand faktor (for påvisning av kar, som er et bevis for holmetransplantasjon) påvist i transplanterte øyer i det gjenfunnede epididymale fettvevet ved immunhistokjemi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å sammenligne transplantasjonseffekten av fettdekket øytransplantasjon med transplantasjon etter intraperitoneal øytransplantasjon, ble samme antall øyer implantert på bukhinnen i venstre parakoliske rom hos kontrollmottakerens diabetiske dyr. Blodsukkernivået hos mus med fettdekket øytransplantasjon ble observert å gradvis og signifikant reduseres sammenlignet med intraperitoneale øytransplanterte mus (p = 0,0023; Figur 3A). En måned etter transplantasjonen ble blodsukkeret hos mus med fettdekket øytransplantasjon opprettholdt på lavere nivåer enn det som ble observert i intraperitoneal øytransplanterte mus vurdert ved intraperitoneal glukosetoleransetesting (p = 0,0046; Figur 3B). Videre, som vi tidligere har rapportert, rapporterte at plasmainsulinnivåene også ble bedre etter fettdekket øytransplantasjon. Re-forhøyning av blodsukkernivået ble også bekreftet. Disse dataene viser at intraperitoneal fettdekket øytransplantasjon ved bruk av 200 IEQs kan forbedre diabetiske tilstander hos mottakermus betydelig.
Histologisk undersøkelse ble også utført for å vurdere holmetransplantasjon i det epididymale hvite fettvevet. I fettdekkede øytransplantasjonsmottakerdyr avslører hematoksylin-eosinfarging tilstedeværelsen av øyer i det epididymale hvite fettvevet (figur 3C, toppbilde). I tillegg gjorde fluorescenskonjugert antistofffarging av insulinpositive øyer det mulig å påvise von Willebrands faktorpositive mikrokarer i det epididymale hvite fettvevet hos alle mottakermusene (n = 6; Figur 3C). I motsetning til dette, i intraperitoneale øytransplanterte mus, ble det ikke observert noen transplanterte øyer verken i det epididymale hvite fettvevet eller bukveggen (data ikke vist).
Figur 1-ABC. Klargjøring av øyer for transplantasjon på epididymalt fettvev og tildekking med epididymalt hvitt fettvev. (A) Fremstilling av instrumenter: a. pipettestøtte, b. 10 ml pipettespisser, c. 50 ml plastrør, d. 15 ml plastrør, e. 50-200 μL (venstre) og 200-1000 μL (høyre) mikropipetter, f. 1,5 ml plastsentrifugerør, g. 200 og 1000 μL mikropipettespisser, h. medium eller buffer som inneholder albumin eller føtalt bovint serum (dvs. DMEM med lav glukose som inneholder 10 % føtalt bovint serum og 100 U/ml penicillin + 100 U/ml streptomycinoppløsning), og i. 40 μm cellesil. (B) Isolerte øyer med acinar (venstre: indikert med pil) og fibrøst vev (høyre). Skalastang = 200 μm. (C) Innsamlede holmer i plastrøret. Venstre, spredte holmer i kulturrett. Senter, holmer samles i midten av kulturskålen ved å virvle. Høyre, samlet holmer i midten av parabolen. Skala bar = 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 1-DEF. Klargjøring av øyer for transplantasjon på epididymalt fettvev og tildekking med epididymalt hvitt fettvev. (D) Innsamlede holmer (venstre) overføres til 15 ml plastrør (høyre). (E) 40 μm cellesilen er satt på toppen av 50 ml plastrøret (venstre og senter). Klargjort medium/buffer tilsatt andre 50 ml plastrør for spyling av holmer på cellesilen til en ny kulturskål (høyre). (F) 1. Øyer samlet inn ved hjelp av en 200-1000 μL mikropipette. 2. Holmer helles i cellesilen. 3 og 4. Medium/buffer brukes til å skylle holmer på sil inn i ny kulturrett. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 1-GH. Klargjøring av øyer for transplantasjon på epididymalt fettvev og tildekking med epididymalt hvitt fettvev. (G) Øyer delt inn i 1,5 ml plast sentrifugerør i henhold til antall mottakermus. Her ble to hundre 100-200 μm holmeekvivalent (IEQ) delt likt inn i hvert rør. (H) Øyer delt likt i 1,5 ml rør før sentrifugering (venstre). Holmer sentrifugert for å samle seg i rørbunnen (midten). 20-30 μL supernatant forblir i røret etter kassering av overflødig løsning (høyre). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2-ABC. Prosedyren for øytransplantasjon på epididymalt fettvev og tildekking ved bruk av epididymalt hvitt fettvev. (A) Fremstilling av instrumenter: a. anestesimaskin for små dyr, b. stereomikroskop, c. lyskilde, d. desinfiserte kirurgiske instrumenter, e. delte øyer i 1,5 ml plastrør, f. 50-200 μL mikropipetter, g. 200 μL mikropipettespisser og h. 4-0 suturer. (B) Diabetisk mottakermus i liggende stilling under generell anestesi på 2 % isofluran (venstre). Magen og inngangsregionen desinfiseres med 70% etanol og dekkes av en papirlaboratorieserviett (høyre). (C) Huden skjæres inn ved lavere medianposisjon (til venstre). Venstre bukvegg klemmes av Pean tang og trekkes til venstre side av musen for å sikre kirurgisk felt (høyre). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2-DEF. Prosedyren for øytransplantasjon på epididymalt fettvev og tildekking ved bruk av epididymalt hvitt fettvev. (D) Venstre epididymale hvite fettvev og venstre testis mobiliseres utenfor abdomen (venstre) og distenderes (høyre). Skalastang = 1 cm. (E) Holmer i 1,5 ml plastrør samles helt opp ved hjelp av en mikropipette med 200 μL pipettespiss (til venstre). Oppsamlede holmer (indikert med pil) får synke helt av tyngdekraften til pipettespissen (høyre). (F) Mikropipettespiss lett plassert på det oppblåste fettvevet (venstre). Holmesåing (stiplet sirkel) på vevet bekreftet ved dissekering av mikroskop (høyre). Skala bar = 1 cm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2-GHI. Prosedyren for øytransplantasjon på epididymalt fettvev og tildekking ved bruk av epididymalt hvitt fettvev. (G) Holmer er dekket med epididymalt hvitt fettvev. (H) Venstre testis og epididymalt hvitt fettvev returnerte til intraperitonealhulen. (I) Bilde etter lukking av magen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Den terapeutiske effekten av fettdekket øytransplantasjon. (A) Blodsukkernivå. Blå linje: fettdekket holmetransplantasjon (n = 6); Oransje linje: intraperitoneal øytransplantasjon (n = 6) Statistisk analyse ble utført med gjentatte mål variansanalyse og signifikant forskjell ble definert som p < 0,05. (B) Blodsukkernivå fra glukosetoleranse test en måned etter transplantasjon. Blå linje: fettdekket holmetransplantasjon (n = 6); Oransje linje: intraperitoneal øytransplantasjon (n = 6). Statistisk analyse ble utført med gjentatte mål variansanalyse og signifikant forskjell ble definert som p < 0,05. (C) Histologisk bilde av innpodede øyer en måned etter transplantasjon. Toppbilde: hematoksylin-eosin farging; Nederste bilde: immunhistostaining for murine insulin (grønn) og von Willebrand faktor (vWF: rød, indikert med hvit pil). Skala bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den fettdekkede holmetransplantasjonsmetoden inkorporerer teknikker fra to forskjellige transplantasjonsteknikker: intraperitoneal øytransplantasjon og intrafettvevsøytransplantasjon. Siden overflatemembranen i epididymalt hvitt fettvev anses å være det hvite fettvevet som er dekket av bukhinnen og som er festet til bitestikkelen, kan den fettdekkede øytransplantasjonsmetoden anatomisk kategoriseres som en type intraperitoneal øytransplantasjon. Teknikken der holmene leveres til mottakerdyret, er imidlertid mer lik de som brukes i intrafettvevstransplantasjon. Våre data viser at den terapeutiske effekten av den fettdekkede holmetransplantasjonsmetoden er bedre enn ved intraperitoneal øytransplantasjon. Vår tidligere studie viste også at transplantasjonseffekten av denne metoden er tilnærmet lik effekten av renal subkapsulær øytransplantasjon, en metode for øytransplantasjon med høyeste transplantasjonseffekt23. Det spekuleres i at nytten av denne metoden kan skyldes adhesjonsmolekylene som er tilstede i hvitt fettvev og adipocytokiner, og som antas å bidra til holmetransplantasjon10,23.
Størrelsen på det epididymale hvite fettvevet gjør det mulig å innkvartere et stort volum holmer. I motsetning til dette er gnageren større omentum for liten til lett å inneholde og få tilgang til mange holmer. Den eneste fysiske begrensningen av epididymalt hvitt fettvev som et potensielt eksperimentelt øytransplantasjonssted er at det ikke gir en portalcirkulasjon av insulin10.
Metoden er unik fordi holmene er dekket med fettvev, i stedet for å bli direkte infundert i vevet. Intrafettvevstransplanterte øyer kan lide av påvirkning av lipotoksisitet, da nedsatt insulinfunksjon hos diabetiske dyr kan føre til overskytende frie fettsyrer32. Denne metoden krever heller ikke biobindemidler eller suturering for å forhindre implantert øytap. Som observert i figur 3C, forblir øyer vellykket transplantert i fettvevet opptil 1 måned etter transplantasjon, og vedlikehold av blodsukkernivået er bekreftet etter graftektomi23. Dette fenomenet kan skyldes fettvevets evne til å fange øyene, noe som blir vanskelig å skrelle av.
Fordelene med denne metoden er at den er teknisk enkel å utføre, tillater en metabolsk og histologisk vurdering av de terapeutiske effektene av øyene, og letter evalueringen av holmegenet og / eller proteinuttrykk etter graftektomi. Sammenlignet med tidligere studier er effekten av denne metoden ikke dårligere enn for øytransplantasjon i epididymalt hvitt fettvev 10,33,34,35,36. Det er viktig å merke seg at en presis såing av holmene på det epididymale hvite fettvevet uten holmetap er nødvendig for en vellykket innkapsling. For å sikre suksess må hele volumet av holmer aspireres forsiktig inn i mikropipettespissen fra plastrøret på 1,5 ml, da grov og rask pipettering kan føre til holmevedheft til veggene i plastrøret, noe som gjør dispensering vanskelig. Holmeadhesjon er en viktig årsak til utilstrekkelig holmesing. Etter å ha latt holmene slå seg ned på tuppen av mikropipettespissen, må holmene implanteres på det epididymale fettvevet uten spyling. Det er viktig å minimere depresjonen av stempelknappen ved aspirasjon og dispensering av holmene for å forhindre overdreven medium/bufferspyling av fettvevet. Derfor er det viktig å vente til holmene har samlet seg helt på tuppen av mikropipettespissen før du trykker ned stempelknappen på mikropipetten for implantasjon. Det er tilstrekkelig å plassere spissen lett på fettvevet og å bekrefte såing av øyer på vevet ved lysmikroskopi.
Avslutningsvis er denne metoden veldig enkel, til tross for at den krever flere kritiske trinn for å lykkes. Vi håper på bred adopsjon av denne metoden for ytterligere å hjelpe til med tilrettelegging av holmetransplantasjon på hvitt fettvev og for videre evaluering av terapeutiske effekter av bioengineerte øyer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne studien ble finansiert av en Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (19K09839, NS) fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 Nylon | Alfresa | ER2004NA45-KF2 | Closing abdomen |
| Alexa 488-conjugated donkey anti-guinea pig | Jackson Immunoresearch | 706-546-148 | Secondary antibody for insulin antibody |
| Alexa 647-conjugated donkey anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-606-152 | Secondary antibody for von Willebrand factor antibody |
| DMEM, low glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11885084 | Culturing islets, transplanting islets |
| Eosin | Fujifilm Wako Chemicals | 051-06515 | Using for staining tissue by eosin |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Collecting islets |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352095 | Collecting islets |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Using for separating islets from other pancreatic tissue |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | Discarding excessive medium/buffer |
| Guinea pig anti-insulin | Agilent Technologies Japan, Ltd. (Dako) | IR002 | Primary antibody for murine insulin |
| Hematoxylin | Muto Pure Chemicals Co., Ltd. | 30002 | Using for staining tissue by hematoxylin |
| Isodine solution 10% | Shionogi&Co., Ltd. | no catalog number | Using for disinfection |
| Isoflurane | Fujifilm Wako Chemicals | 095-06573 | Using for anesthesia |
| Labcon 1000 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips | Labcon | 1177-965-008 | Using for separating islets from other pancreatic tissue |
| Labcon 200 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips | Labcon | 1179-965-008 | Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue |
| Mintsensor | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co. Ltd., | 8AEB02E | Using for monitoring blood glucose |
| Pipetteman P-1000 | Gilson | F123602 | Using for separating islets from other pancreatic tissue |
| Pipetteman P-200 | Gilson | F123601 | Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue |
| Rabbit anti-vWF | Abcam | ab6994 | Primary antibody for murine von Willebrand factor |
References
- Barton, F. B., et al. Improvement in outcomes of clinical islet transplantation: 1999-2010. Diabetes Care. 35 (7), 1436-1445 (2012).
- Balamurugan, A. N., et al. Islet product characteristics and factors related to successful human islet transplantation from the Collaborative Islet Transplant Registry (CITR) 1999-2010. American Journal of Transplantation. 14 (11), 2595-2606 (2014).
- Collaborative Islet Transplant Registry. Collaborative Islet Transplant Registry. Annual Report. , (2017).
- Rajab, A., et al. Total Pancreatectomy and Islet Autotransplantation Following Treated Hepatitis C Infection. Cell Transplantation. 27 (10), 1569-1573 (2018).
- Mellgren, A., Schnell Landstrom, A. H., Petersson, B., Andersson, A. The renal subcapsular site offers better growth conditions for transplanted mouse pancreatic islet cells than the liver or spleen. Diabetologia. 29 (9), 670-672 (1986).
- Hiller, W. F., Klempnauer, J., Luck, R., Steiniger, B. Progressive deterioration of endocrine function after intraportal but not kidney subcapsular rat islet transplantation. Diabetes. 40 (1), 134-140 (1991).
- Yasunami, Y., Lacy, P. E., Finke, E. H. A new site for islet transplantation--a peritoneal-omental pouch. Transplantation. 36 (2), 181-182 (1983).
- Kin, T., Korbutt, G. S., Rajotte, R. V. Survival and metabolic function of syngeneic rat islet grafts transplanted in the omental pouch. American Journal of Transplantation. 3 (3), 281-285 (2003).
- Kasoju, N., et al. Bioengineering a pre-vascularized pouch for subsequent islet transplantation using VEGF-loaded polylactide capsules. Biomaterials Science. 8 (2), 631-647 (2020).
- Sakata, N., Yoshimatsu, G., Kodama, S. White Adipose Tissue as a Site for Islet Transplantation. Transplantology. 1 (2), 55-70 (2020).
- Osama Gaber, A., Chamsuddin, A., Fraga, D., Fisher, J., Lo, A. Insulin independence achieved using the transmesenteric approach to the portal vein for islet transplantation. Transplantation. 77 (2), 309-311 (2004).
- Fujita, M., et al. Technique of endoscopic biopsy of islet allografts transplanted into the gastric submucosal space in pigs. Cell Transplantation. 22 (12), 2335-2344 (2013).
- Sakata, N., et al. Strategy for clinical setting in intramuscular and subcutaneous islet transplantation. Diabetes/Metabolism Research and Reviews. 30 (1), 1-10 (2014).
- Cantarelli, E., et al. Transplant Site Influences the Immune Response After Islet Transplantation: Bone Marrow Versus Liver. Transplantation. 101 (5), 1046-1055 (2017).
- White, S. A., et al. The risks of total pancreatectomy and splenic islet autotransplantation. Cell Transplantation. 9 (1), 19-24 (2000).
- Itoh, T., Nishinakamura, H., Kumano, K., Takahashi, H., Kodama, S. The Spleen Is an Ideal Site for Inducing Transplanted Islet Graft Expansion in Mice. PLoS One. 12 (1), 0170899 (2017).
- Sakata, N., Yoshimatsu, G., Kodama, S. The Spleen as an Optimal Site for Islet Transplantation and a Source of Mesenchymal Stem Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), (2018).
- Sakata, N., et al. Effect of rat-to-mouse bioartificial pancreas xenotransplantation on diabetic renal damage and survival. Pancreas. 32 (3), 249-257 (2006).
- Nagaya, M., et al. Effectiveness of bioengineered islet cell sheets for the treatment of diabetes mellitus. Journal of Surgical Research. 227, 119-129 (2018).
- Weaver, J. D., et al. Vasculogenic hydrogel enhances islet survival, engraftment, and function in leading extrahepatic sites. Science Advances. 3 (6), 1700184 (2017).
- Dufour, J. M., et al. Development of an ectopic site for islet transplantation, using biodegradable scaffolds. Tissue Engineering. 11 (9-10), 1323-1331 (2005).
- Chen, X., et al. The epididymal fat pad as a transplant site for minimal islet mass. Transplantation. 84 (1), 122-125 (2007).
- Sakata, N., et al. Mechanism of Transplanted Islet Engraftment in Visceral White Adipose Tissue. Transplantation. 104 (12), 2516-2527 (2020).
- Navarro-Requena, C., et al. PEG hydrogel containing calcium-releasing particles and mesenchymal stromal cells promote vessel maturation. Acta Biomaterialia. 67, 53-65 (2018).
- Phelps, E. A., Headen, D. M., Taylor, W. R., Thule, P. M., Garcia, A. J. Vasculogenic bio-synthetic hydrogel for enhancement of pancreatic islet engraftment and function in type 1 diabetes. Biomaterials. 34 (19), 4602-4611 (2013).
- Manzoli, V., et al. Immunoisolation of murine islet allografts in vascularized sites through conformal coating with polyethylene glycol. American Journal of Transplantation. 18 (3), 590-603 (2018).
- Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. P. An improved method for isolation of mouse pancreatic islets. Transplantation. 40 (4), 437-438 (1985).
- Brandhorst, D., Brandhorst, H., Hering, B. J., Bretzel, R. G. Long-term survival, morphology and in vitro function of isolated pig islets under different culture conditions. Transplantation. 67 (12), 1533-1541 (1999).
- Noguchi, H., et al. Low-temperature preservation of isolated islets is superior to conventional islet culture before islet transplantation. Transplantation. 89 (1), 47-54 (2010).
- Itoh, T., et al. Low temperature condition prevents hypoxia-induced islet cell damage and HMGB1 release in a mouse model. Cell Transplantation. 21 (7), 1361-1370 (2012).
- Komatsu, H., et al. Optimizing Temperature and Oxygen Supports Long-term Culture of Human Islets. Transplantation. 103 (2), 299-306 (2019).
- Unger, R. H. Lipid overload and overflow: metabolic trauma and the metabolic syndrome. Trends in Endocrinology, Metabolism. 14 (9), 398-403 (2003).
- Mao, D., et al. A macroporous heparin-releasing silk fibroin scaffold improves islet transplantation outcome by promoting islet revascularisation and survival. Acta Biomaterialia. 59, 210-220 (2017).
- Wang, K., Wang, X., Han, C. S., Chen, L. Y., Luo, Y. Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice. Journal of Visualized Experiments. (125), e54995 (2017).
- Wang, X., Wang, K., Zhang, W., Qiang, M., Luo, Y. A bilaminated decellularized scaffold for islet transplantation: Structure, properties and functions in diabetic mice. Biomaterials. 138, 80-90 (2017).
- Rios, P. D., Zhang, X., Luo, X., Shea, L. D. Mold-casted non-degradable, islet macro-encapsulating hydrogel devices for restoration of normoglycemia in diabetic mice. Biotechnology and Bioengineering. 113 (11), 2485-2495 (2016).
