Summary
Denne fedtdækkede øtransplantationsmetode er egnet til påvisning af indpodede øer i intraperitonealhulen. Det kræver især ikke brug af biobindingsmidler eller suturering.
Abstract
Ø transplantation er en cellulær erstatningsterapi for svær diabetes mellitus. Intraperitonealhulen er typisk transplantationsstedet for denne procedure. Imidlertid har intraperitoneal øtransplantation nogle begrænsninger, herunder dårlig transplantationseffektivitet, vanskelig transplantatdetektionsevne og manglende graftektomikapacitet til analyse efter transplantation. I dette papir bruges "fedtdækket øtransplantation", en intraperitoneal øtransplantationsmetode, der anvender epididymalt hvidt fedtvæv, til at vurdere de terapeutiske virkninger af bioengineered holme. Metodens enkelhed ligger i såning af holme på epididymalt hvidt fedtvæv og brug af vævet til at dække øerne. Mens denne metode kan kategoriseres som en intraperitoneal øtransplantationsteknik, deler den egenskaber med intra-fedtvævsøtransplantation. Den fedtdækkede øtransplantationsmetode viser imidlertid mere robuste terapeutiske virkninger end intra-fedtvævsø-øtransplantation, herunder forbedring af blodsukker- og plasmainsulinniveauer og potentialet for transplantatfjernelse. Vi anbefaler vedtagelsen af denne metode til vurdering af mekanismerne for holmens indkapsling i hvidt fedtvæv og de terapeutiske virkninger af bioengineered holme.
Introduction
Hældningstransplantation er en cellulær erstatningsterapi til patienter med svær diabetes mellitus. Nylige rapporter har vist, at antallet af insulinuafhængighed tre år efter transplantation forbedres op til 44%1 , og at ca. 80% af modtagerne, der modtager mere end 600.000 samlede ø-ækvivalenter, opnår insulinuafhængighed2. Desuden blev det i den seneste Collaborative Islet Transplant Registry-rapport afsløret, at fastende blodsukkerniveauer blev opretholdt på 60-140 mg / dL i over en periode på 5 år hos over 70% af patienterne, der gennemgik øtransplantation alene. Undersøgelsen fastslog også, at omkring 90% af de patienter, der fik øtransplantation alene eller øtransplantation efter nyretransplantation, ikke udviklede nogen alvorlige hypoglykæmiske hændelser i over 5 år3.
Selvom de kliniske resultater af denne behandling er blevet bedre, skal der stadig tages fat på nogle begrænsninger, herunder nødvendigheden af at etablere et optimalt transplantationssted. Leveren er et typisk transplantationssted for klinisk øtransplantation, fordi det er det største organ, der kan rumme et stort volumen af holme. Hos nogle patienter er leveren imidlertid ikke tilgængelig (f.eks. på grund af portalhypertension, hepatitis og / eller cirrose4) og derfor andre steder, herunder det renale subkapsulære rum5,6, omental pose 7,8,9,10, mesentri 11, mave-tarmkanalen 12, skeletmuskulatur 13, subkutant væv 13, knoglemarv 14 og milt 15 ,16,17, er blevet betragtet som alternative transplantationssteder.
Selvom intraperitoneal øtransplantation let kan udføres under lokalbedøvelse, hvilket gør intraperitonealhulen til et tiltalende sted for klinisk øtransplantation, spredes øerne ved transplantation gennem hele intraperitonealhulen, hvilket gør ø-engraftmentdetektion og vellykket engraftmentbekræftelse vanskelig. Derfor er intraperitonealhulen ikke bredt anerkendt som et ideelt klinisk transplantationssted. I stedet bruges det ofte som en kontrolmodel til prækliniske undersøgelser for at undersøge effektiviteten af transplanterede indkapslede18 og bioengineered holme19. En nøjagtig sammenligning mellem bioengineered og kontroløer er imidlertid vanskelig at opnå på grund af udfordringerne med at udføre en nøjagtig engraftmentvurdering.
I modsætning hertil er brugen af intraperitonealt hvidt fedtvæv i omentalposen8, mesenteriet og andre ekstrahepatiske steder blevet godt rapporteret 10,20,21,22,23, og mange af de undersøgelser, der undersøgte funktionen af bioengineered holme transplanteret ved hjælp af hvidt fedtvæv, var i stand til at rapportere lovende terapeutiske resultater20,24,25, 26. Da brugen af epididymalt fedtvæv letter påvisning af transplanterede øer, blev den "fedtdækkede øtransplantationsmetode", der anvender epididymalt fedtvæv, udviklet til at overvinde begrænsningerne ved intraperitoneal øtransplantation. I dette papir beskrives fedtdækket øtransplantation ved hjælp af epididymalt fedtvæv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende procedure udføres i tre trin. Det første trin omfatter induktion af diabetes hos modtagermusene og isolering af donorøer. Det andet trin indebærer forberedelse af holme før transplantation. I det tredje trin udføres øtransplantation på epididymalt fedtvæv og dækning af øerne ved hjælp af fedtvævet. Derefter blev de terapeutiske virkninger vurderet. Håndteringen af musene og de eksperimentelle procedurer, der er udført i denne undersøgelse, er i overensstemmelse med '' Principper for laboratoriedyrpleje '' (Guide for pleje og brug af forsøgsdyr, National Institutes of Health publikation 8. udgave, 2011), og forsøgsprotokollen blev godkendt af Animal Care and Use Committee of Fukuoka University (godkendelsesnummer: 186018).
1. Kirurgisk forberedelse
- Induktion af diabetes: Inducer diabetes i 20-25 g legemsvægt, 8-12 uger gamle recipienthanmus ved intravenøs injektion af 18 mg/ml streptozotocinopløsning fremstillet i 0,1 mio. citratbuffer (180 mg/kg legemsvægt). Mus med blodsukkerniveauer på over 400 mg / dL anses for at være diabetiker. Brug diabetiske mus inden for 1 uge efter diabetesinduktion før overdreven atrofi af det epididymale hvide fedtvæv til dækning af holme.
- Ø isolation: Udfør murine islet isolation en dag før transplantation efter Gotohs metode27 til øisolering.
- Kort sagt, fordøje bugspytkirtelvæv ved hjælp af collagenaseopløsning. Øer isoleres ved centrifugering af densitetsgradient ved hjælp af en passende celleseparationsopløsning. Derefter er dyrkningsøer natten over i en inkubator ved 22 °C og 5% CO2 (kultur ved <37 °C rapporteret for at forhindre ødød 28,29,30,31).
BEMÆRK: Håndter de rensede holmkulturer i et sikkerhedsskab. Filtersteriliser alle opløsninger, der anvendes til isolering og dyrkning af holme, ved hjælp af et 0,22 μm filter.
2. Forberedelse af holme til transplantation
- Saml de relevante instrumenter og materialer som angivet i figur 1A.
- Da fordøjelsesenzymer såsom amylase og lipase kan resultere i skade på de isolerede og transplanterede øer, og der kan opstå tab af holme ved at blive fanget i forurenende fibrøst væv i kulturskålen, skal du før transplantation bruge tang til at håndplukke eventuelle ekstraøkomponenter fra bugspytkirtlen, herunder acinar og fibrøst væv (figur 1B), under et dissekerende mikroskop. Efter plukning skal du bruge en cellesi til at filtrere enkelte acinarceller ud.
- Overfør de filtrerede øer til en ny kulturskål, der indeholder et passende dyrkningsmedium eller bufferopløsning (f.eks. DMEM med lavt glukoseindhold, RPMI1640, CMRL1066 eller HBSS) suppleret med bovint serum eller albumin for at forhindre øfastgørelse til plast og hvirvle skålen for at placere holmene i midten af skålen (figur 1C). Ved hjælp af en P200-mikropipette og mikroskopet vælges de enkelte holme i et passende opsamlingsrør (figur 1D).
- Placer en ny 40 μm cellesi oven på et 50 ml plastrør (figur 1E til venstre og i midten) og vask filteret med frisk medium (figur 1E til højre).
- Brug en 1000 μL pipette til at tilføje holmene til silen for at adskille holmene og enkelte acinarceller (figur 1 F1 og figur 1F2).
BEMÆRK: De rensede holme på cellesi vil være ca. 100% rene. - Brug tang til at vende sien på en ny 60- eller 100 mm stor ikke-behandlet kulturskål indeholdende kulturmedium eller en passende bufferopløsning suppleret med bovint serum eller albumin (figur 1 F3 og figur 1F4). Brug frisk medium/buffer til at skylle holmene ind i en ny kulturret. Tilsæt derefter nok medium / buffer til dyrkningsskålen for at nå et samlet volumen på ca. 20 ml.
- Tæl holmene under et mikroskop og divider antallet af holme ligeligt mellem individuelle 1,5 ml plastcentrifugerør i henhold til antallet af donordyr (figur 1G). For eksempel vil to hundrede, 100-200 μm øækvivalenter (IEQ) fra to mus blive tilføjet til hvert af to rør.
- Øerne centrifugeres ved 2.100 x g inden for 1 minut ved stuetemperatur, og supernatanten kasseres. Omkring 20-30 μL restopløsning forbliver typisk i røret (figur 1H).
3. Hæltransplantation på epididymalt fedtvæv og dækker med epididymalt hvidt fedtvæv
- Før operationen samles en anæstesimaskine til små dyr, stereomikroskop, lyskilde, 50-200 μL mikropipette med 200 μL mikropipettespidser, vatpinde, et 4-0 sutureringssæt og desinficerede kirurgiske instrumenter (figur 2A). Autoklave bødkersaks, oftalmisk saks, ærtang, pincet og nåleholdere. Efter autoklavering nedsænkes udstyret i en 1% povidon-jodopløsning (figur 2A). Brug vatpinde til mobilisering af det epididymale hvide fedtvæv og til hæmostase i tilfælde af blødning. Brug en mikropipette med en 50-200 μL spidser til øtransplantation.
- Lever anæstesi til den diabetiske modtagermus ved hjælp af et inhaleret bedøvelsesmiddel (2% isofluran i ilt). Påfør oftalmisk smøremiddel på begge øjne for at forhindre tørring. Placer derefter musen i liggende stilling (figur 2B til venstre) og fjern håret fra maven for at forhindre infektion ved hjælp af hårklippere og / eller hårfjerningscreme. Desinficer maven og lyskeområdet ved hjælp af mindst tre skiftende runder af en povidon-jodopløsning efterfulgt af 70% ethanol (figur 2B til højre). Før operationen skal du bekræfte anæstesidybden via fraværet af en tåspidsrefleks. Giv intraoperativ termisk støtte ved hjælp af en varmepude, og brug en kirurgisk drapering til at sikre det sterile kirurgiske område.
- Skær huden i det nederste medianområde (figur 2C til venstre). Et hudsnit, der er ca. 2 cm langt, anbefales. Klem den venstre mavevæg med Pean-tangen (atraumatisk tang eller retraktor kan også bruges) og træk vævet til venstre side af musen for at sikre det kirurgiske felt (figur 2C højre). Efter laparotomi reduceres procentdelen af isofluran til 1,0-1,5% til vedligeholdelse af anæstesi.
- Brug en vatpind til at mobilisere tyndtarmen og tyktarmen til højre side af musen (dvs. venstre side af operatøren). Det venstre epididymale hvide fedtvæv i bukhulen er placeret i det venstre lyskeområde. Mobiliser det epididymale hvide fedtvæv og venstre testikler til ydersiden af maven (figur 2D venstre) og stræk vævet ud (2D højre).
- Brug en P200-mikropipette udstyret med en 200 μL pipettespids til at samle hele volumenet af holme fra et 1,5 ml rør med skånsom pipettering (figur 2E til venstre), og sørg for, at der ikke er nogen holme tilbage i røret ved opsamling. Lad de opsamlede holme sætte sig til spidsen af pipetten ved tyngdekraften (figur 2E til højre).
- Placer mikropipettespidsen let på det udspilede fedtvæv. Sørg for at forhindre overdreven skylning af mediet/bufferen i spidsen, og stil forsigtigt holmene på vævet (figur 2F til venstre). Efter såning bekræftes en korrekt placering af holmene under et dissekeringsmikroskop (figur 2F til højre).
- Dæk øerne med det epididymale hvide fedtvæv (figur 2G). Brug af suturer eller biobindingsmidler er ikke nødvendig.
- Placer venstre testikler under det epididymale hvide fedtvæv og returner vævene til intraperitonealhulen (figur 2H). Luk huden i to lag (peritoneum, derefter muskel og hud) ved hjælp af en 4-0 sutur (eventuelle suturer såsom nylon eller absorberbare suturer kan bruges) (figur 2I). Injicer acetylsalicylsyre (300 mg/kg; SQ) nær såret for postoperativ analgesi. Placer derefter musen under en varmelampe og overvåg indtil fuld genopretning.
4. Overvågning efter øtransplantation (resumé)
- Vurder de terapeutiske virkninger af øtransplantation ved at overvåge blodglukose, glukosetolerancetest og histologisk vurdering på postoperativ dag (POD) 28.
- Overvåg blodsukkeret, herunder målingerne af blodglukose ved glukosetolerancetest, ved hjælp af en lille glukosemåler.
- Saml blodprøverne (lidt mikroliter) fra halevenen. Med hensyn til histologisk vurdering blev murininsulin (til påvisning af indpodede holme) og von Willebrand-faktor (til påvisning af kar, hvilket er et bevis for ø-engraftment) påvist i transplanterede holme i det genvundne epididymale fedtvæv ved immunhistokemi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at sammenligne transplantationseffekten af fedtdækket øtransplantation med den efter intraperitoneal øtransplantation blev det samme antal holme implanteret på peritoneum i det venstre parakole rum af kontrolmodtagende diabetiske dyr. Blodglukoseniveauerne hos mus med fedtdækket øtransplantation blev observeret til gradvist og signifikant fald sammenlignet med intraperitoneale øtransplanterede mus (p = 0,0023; Figur 3A). En måned efter transplantationen blev blodglukosen hos mus med fedtdækket øtransplantation opretholdt på lavere niveauer end det, der blev observeret hos intraperitoneale øtransplanterede mus vurderet ved intraperitoneal glukosetolerancetest (p = 0,0046; Figur 3B). Desuden har vi, som vi tidligere har rapporteret, at plasmainsulinniveauet også blev forbedret efter fedtdækket øtransplantation. Re-elevation af blodsukkerniveauet blev også bekræftet. Disse data viser, at intraperitoneal fedtdækket øtransplantation ved hjælp af 200 IEQ'er kan forbedre de diabetiske tilstande hos modtagermus betydeligt.
Histologisk undersøgelse blev også udført for at vurdere holmens engraftment i det epididymale hvide fedtvæv. I fedtdækkede øtransplantationsrecipientdyr afslører hæmatoxylin-eosinfarvning tilstedeværelsen af holme i det epididymale hvide fedtvæv (figur 3C, øverste billede). Derudover lettede fluorescenskonjugeret antistoffarvning af insulinpositive øer påvisning af von Willebrand-faktorpositive mikrofartøjer i det epididymale hvide fedtvæv hos alle modtagermusene (n = 6; Figur 3C). I modsætning hertil blev der i intraperitoneale øtransplanterede mus ikke observeret indpodede øer i hverken det epididymale hvide fedtvæv eller mavevæggen (data ikke vist).
Figur 1-ABC. Forberedelse af holme til transplantation på epididymalt fedtvæv og dækker med epididymalt hvidt fedtvæv. (A) Forberedelse af instrumenter: a. pipettehjælp, b. 10 ml pipettespidser, ca. 50 ml plastrør, d. 15 ml plastrør, e. 50-200 μL (venstre) og 200-1000 μL (højre) mikropipetter, f. 1,5 ml plastcentrifugerør, g. 200 og 1000 μL mikropipettespidser, h. medium eller buffer indeholdende albumin eller føtalt bovint serum (dvs. DMEM med lavt glucoseindhold indeholdende 10% føtalt bovint serum og 100 U/ml penicillin + 100 U/ml streptomycinopløsning), og i. 40 μm cellesi. (B) Isolerede holme med acinar (venstre: angivet med pil) og fibrøst væv (højre). Skalastang = 200 μm. (C) Opsamlede holme i plastrøret. Til venstre, spredte holme i kulturret. Center, holme samles i midten af kulturskålen ved at hvirvle. Højre, indsamlede holme i midten af skålen. Skala bar = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 1-DEF. Forberedelse af holme til transplantation på epididymalt fedtvæv og dækker med epididymalt hvidt fedtvæv. (D) Indsamlede holme (venstre) overføres til 15 ml plastrør (højre). (E) 40 μm cellesilen er sat oven på 50 ml plastrøret (venstre og i midten). Tilberedt medium/buffer tilsat til andet 50 ml plastrør til skylning af holme på cellesilen til en ny kulturskål (til højre). (F) 1. Holme opsamlet ved hjælp af en 200-1000 μL mikropipette. 2. Øer hældes i cellesilen. 3 og 4. Medium /buffer bruges til at skylle holme på sil i ny kulturskål. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 1-GH. Forberedelse af holme til transplantation på epididymalt fedtvæv og dækker med epididymalt hvidt fedtvæv. (G) Holme opdelt i 1,5 ml plastcentrifugerør efter antal recipientmus. Her blev to hundrede 100-200 μm øækvivalent (IEQ) delt ligeligt i hvert rør. (H) Holme fordelt ligeligt i 1,5 ml rør før centrifugering (til venstre). Holme centrifugeret til opsamling i rørbunden (i midten). 20-30 μL supernatant forbliver i røret efter kassering af overskydende opløsning (højre). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2-ABC. Proceduren for øtransplantation på epididymalt fedtvæv og dækker ved hjælp af epididymalt hvidt fedtvæv. (A) Forberedelse af instrumenter: a. anæstesimaskine til små dyr, b. stereomikroskop, c. lyskilde, d. desinficerede kirurgiske instrumenter, e. opdelte holme i 1,5 ml plastrør, f. 50-200 μL mikropipetter, g. 200 μL mikropipettespidser og h. 4-0 suturer. (B) Diabetisk modtagermus i liggende stilling under generel anæstesi på 2% isofluran (til venstre). Maven og lyskeområdet desinficeres ved hjælp af 70% ethanol og dækkes af en papirlaboratorieserviet (højre). (C) Huden er indskåret i lavere medianposition (til venstre). Venstre bugvæg er fastspændt af Pean tang og trukket til venstre side af musen for at sikre kirurgisk felt (højre). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2-DEF. Proceduren for øtransplantation på epididymalt fedtvæv og dækker ved hjælp af epididymalt hvidt fedtvæv. (D) Det venstre epididymale hvide fedtvæv og venstre testikler mobiliseres uden for maven (venstre) og udspiles (højre). Skalastang = 1 cm. (E) Holme i 1,5 ml plastrør opsamles fuldstændigt ved hjælp af en mikropipette med 200 μL pipettespids (venstre). Indsamlede holme (angivet med pil) får lov til helt at synke ved tyngdekraften til pipettespidsen (højre). (F) Mikropipettespids let placeret på det udspilede fedtvæv (til venstre). Hældning (prikket cirkel) på vævet bekræftet ved dissekering af mikroskop (højre). Skalastang = 1 cm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2-GHI. Proceduren for øtransplantation på epididymalt fedtvæv og dækker ved hjælp af epididymalt hvidt fedtvæv. (G) Holme er dækket af epididymalt hvidt fedtvæv. (H) Venstre testikler og epididymalt hvidt fedtvæv returneret til intraperitonealhulen. (I) Billede efter lukning af maven. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3. Den terapeutiske virkning af fedtdækket øtransplantation. (A) Blodsukkerniveau. Blå linje: fedtdækket øtransplantation (n = 6); Orange linje: intraperitoneal øtransplantation (n = 6) Statistisk analyse blev udført ved hjælp af gentagne målinger af variansanalyse, og en signifikant forskel blev defineret som p < 0,05. (B) Blodglukoseniveau fra glukosetolerancetest en måned efter transplantation. Blå linje: fedtdækket øtransplantation (n = 6); Orange linje: intraperitoneal øtransplantation (n = 6). Statistisk analyse blev udført ved hjælp af gentagne målinger af varians, og en signifikant forskel blev defineret som p < 0,05. (C) Histologisk billede af indpodede holme en måned efter transplantationen. Topbillede: hæmatoxylin-eosin farvning; Nederste billede: immunohistostaining for murininsulin (grøn) og von Willebrand-faktor (vWF: rød, angivet med hvid pil). Skala bar = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den fedtdækkede øtransplantationsmetode inkorporerer teknikker fra to forskellige transplantationsteknikker: intraperitoneal øtransplantation og intrafedtvævsøtransplantation. Da overflademembranen af epididymalt hvidt fedtvæv anses for at være det hvide fedtvæv, der er dækket af peritoneum, og som er knyttet til epididymis, kan den fedtdækkede øtransplantationsmetode anatomisk kategoriseres som en type intraperitoneal øtransplantation. Teknikken, hvormed øerne leveres til modtagerdyret, ligner imidlertid mere dem, der anvendes til transplantation af intrafedtvævsøer. Vores data viser, at den terapeutiske virkning af den fedtdækkede øtransplantationsmetode er bedre end den intraperitoneale øtransplantation. Vores tidligere undersøgelse viste også, at transplantationseffekten af denne metode er næsten lig med den for renal subcapsular øtransplantation, en metode til øtransplantation med en højeste transplantationseffekt23. Det spekuleres i, at nytten af denne metode kan skyldes de vedhæftningsmolekyler, der findes i hvidt fedtvæv og adipocytokiner, og som menes at bidrage til holmens engraftment10,23.
Størrelsen af det epididymale hvide fedtvæv gør det muligt at rumme et stort volumen holme. I modsætning hertil er gnaverens større omentum for lille til let at indeholde og få adgang til mange holme. Den eneste fysiske begrænsning af epididymalt hvidt fedtvæv som et potentielt eksperimentelt øtransplantationssted er, at det ikke giver en portalcirkulation af insulin10.
Metoden er unik, fordi holmene er dækket af fedtvæv i stedet for at blive direkte infunderet i vævet. Intrafedtvævstransplanterede øer kan lide af påvirkning af lipotoksicitet, da den nedsatte insulinfunktion hos diabetiske dyr kan føre til overskydende frie fedtsyrer32. Denne metode kræver heller ikke biobindingsmidler eller suturering for at forhindre implanteret øtab. Som observeret i figur 3C forbliver holme med succes indpodet i fedtvævet op til 1 måned efter transplantation, og vedligeholdelse af blodsukkerniveauet er blevet bekræftet efter graftektomi23. Dette fænomen kan skyldes fedtvævets evne til at fange øerne, som bliver vanskelige at skrælle af.
Fordelene ved denne metode er, at den er teknisk let at udføre, muliggør en metabolisk og histologisk vurdering af øernes terapeutiske virkninger og letter evalueringen af øgen- og / eller proteinekspression efter graftektomi. Sammenlignet med tidligere undersøgelser er effekten af denne metode ikke ringere end effekten af øtransplantation i epididymalt hvidt fedtvæv 10,33,34,35,36. Det er vigtigt at bemærke, at en præcis såning af holmene på det epididymale hvide fedtvæv uden tab af holme er nødvendig for en vellykket engraftment. For at sikre succes skal hele mængden af holme aspireres forsigtigt ind i mikropipettespidsen fra 1,5 ml plastrøret, da ru og hurtig pipettering kan resultere i ø-vedhæftning til plastrørets vægge, hvilket gør dispensering vanskelig. Hældning er en væsentlig årsag til utilstrækkelig øsåning. Efter at have ladet øerne sætte sig ved spidsen af mikropipettespidsen, skal øerne implanteres på det epididymale fedtvæv uden at skylle. Det er vigtigt at minimere stempelknappens fordybning ved aspirering og dispensering af holmene for at forhindre overdreven skylning af fedtvævet mellem medium / buffer. Derfor er det vigtigt at vente, indtil holmene er samlet helt ved spidsen af mikropipettespidsen, før du trykker på stempelknappen på mikropipetten til implantation. Det er tilstrækkeligt at placere spidsen let på fedtvævet og bekræfte såning af holme på vævet ved lysmikroskopi.
Afslutningsvis er denne metode meget enkel, på trods af at den kræver flere kritiske trin for dens succes. Vi håber på en bred anvendelse af denne metode til yderligere støtte til at lette holmens indfangning på hvidt fedtvæv og til yderligere evaluering af de terapeutiske virkninger af bioengineered holme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev finansieret af et tilskud til videnskabelig forskning (C) (19K09839, NS) fra Japans ministerium for uddannelse, kultur, sport, videnskab og teknologi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 Nylon | Alfresa | ER2004NA45-KF2 | Closing abdomen |
| Alexa 488-conjugated donkey anti-guinea pig | Jackson Immunoresearch | 706-546-148 | Secondary antibody for insulin antibody |
| Alexa 647-conjugated donkey anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-606-152 | Secondary antibody for von Willebrand factor antibody |
| DMEM, low glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11885084 | Culturing islets, transplanting islets |
| Eosin | Fujifilm Wako Chemicals | 051-06515 | Using for staining tissue by eosin |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Collecting islets |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352095 | Collecting islets |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Using for separating islets from other pancreatic tissue |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | Discarding excessive medium/buffer |
| Guinea pig anti-insulin | Agilent Technologies Japan, Ltd. (Dako) | IR002 | Primary antibody for murine insulin |
| Hematoxylin | Muto Pure Chemicals Co., Ltd. | 30002 | Using for staining tissue by hematoxylin |
| Isodine solution 10% | Shionogi&Co., Ltd. | no catalog number | Using for disinfection |
| Isoflurane | Fujifilm Wako Chemicals | 095-06573 | Using for anesthesia |
| Labcon 1000 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips | Labcon | 1177-965-008 | Using for separating islets from other pancreatic tissue |
| Labcon 200 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips | Labcon | 1179-965-008 | Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue |
| Mintsensor | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co. Ltd., | 8AEB02E | Using for monitoring blood glucose |
| Pipetteman P-1000 | Gilson | F123602 | Using for separating islets from other pancreatic tissue |
| Pipetteman P-200 | Gilson | F123601 | Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue |
| Rabbit anti-vWF | Abcam | ab6994 | Primary antibody for murine von Willebrand factor |
References
- Barton, F. B., et al. Improvement in outcomes of clinical islet transplantation: 1999-2010. Diabetes Care. 35 (7), 1436-1445 (2012).
- Balamurugan, A. N., et al. Islet product characteristics and factors related to successful human islet transplantation from the Collaborative Islet Transplant Registry (CITR) 1999-2010. American Journal of Transplantation. 14 (11), 2595-2606 (2014).
- Collaborative Islet Transplant Registry. Collaborative Islet Transplant Registry. Annual Report. , (2017).
- Rajab, A., et al. Total Pancreatectomy and Islet Autotransplantation Following Treated Hepatitis C Infection. Cell Transplantation. 27 (10), 1569-1573 (2018).
- Mellgren, A., Schnell Landstrom, A. H., Petersson, B., Andersson, A. The renal subcapsular site offers better growth conditions for transplanted mouse pancreatic islet cells than the liver or spleen. Diabetologia. 29 (9), 670-672 (1986).
- Hiller, W. F., Klempnauer, J., Luck, R., Steiniger, B. Progressive deterioration of endocrine function after intraportal but not kidney subcapsular rat islet transplantation. Diabetes. 40 (1), 134-140 (1991).
- Yasunami, Y., Lacy, P. E., Finke, E. H. A new site for islet transplantation--a peritoneal-omental pouch. Transplantation. 36 (2), 181-182 (1983).
- Kin, T., Korbutt, G. S., Rajotte, R. V. Survival and metabolic function of syngeneic rat islet grafts transplanted in the omental pouch. American Journal of Transplantation. 3 (3), 281-285 (2003).
- Kasoju, N., et al. Bioengineering a pre-vascularized pouch for subsequent islet transplantation using VEGF-loaded polylactide capsules. Biomaterials Science. 8 (2), 631-647 (2020).
- Sakata, N., Yoshimatsu, G., Kodama, S. White Adipose Tissue as a Site for Islet Transplantation. Transplantology. 1 (2), 55-70 (2020).
- Osama Gaber, A., Chamsuddin, A., Fraga, D., Fisher, J., Lo, A. Insulin independence achieved using the transmesenteric approach to the portal vein for islet transplantation. Transplantation. 77 (2), 309-311 (2004).
- Fujita, M., et al. Technique of endoscopic biopsy of islet allografts transplanted into the gastric submucosal space in pigs. Cell Transplantation. 22 (12), 2335-2344 (2013).
- Sakata, N., et al. Strategy for clinical setting in intramuscular and subcutaneous islet transplantation. Diabetes/Metabolism Research and Reviews. 30 (1), 1-10 (2014).
- Cantarelli, E., et al. Transplant Site Influences the Immune Response After Islet Transplantation: Bone Marrow Versus Liver. Transplantation. 101 (5), 1046-1055 (2017).
- White, S. A., et al. The risks of total pancreatectomy and splenic islet autotransplantation. Cell Transplantation. 9 (1), 19-24 (2000).
- Itoh, T., Nishinakamura, H., Kumano, K., Takahashi, H., Kodama, S. The Spleen Is an Ideal Site for Inducing Transplanted Islet Graft Expansion in Mice. PLoS One. 12 (1), 0170899 (2017).
- Sakata, N., Yoshimatsu, G., Kodama, S. The Spleen as an Optimal Site for Islet Transplantation and a Source of Mesenchymal Stem Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), (2018).
- Sakata, N., et al. Effect of rat-to-mouse bioartificial pancreas xenotransplantation on diabetic renal damage and survival. Pancreas. 32 (3), 249-257 (2006).
- Nagaya, M., et al. Effectiveness of bioengineered islet cell sheets for the treatment of diabetes mellitus. Journal of Surgical Research. 227, 119-129 (2018).
- Weaver, J. D., et al. Vasculogenic hydrogel enhances islet survival, engraftment, and function in leading extrahepatic sites. Science Advances. 3 (6), 1700184 (2017).
- Dufour, J. M., et al. Development of an ectopic site for islet transplantation, using biodegradable scaffolds. Tissue Engineering. 11 (9-10), 1323-1331 (2005).
- Chen, X., et al. The epididymal fat pad as a transplant site for minimal islet mass. Transplantation. 84 (1), 122-125 (2007).
- Sakata, N., et al. Mechanism of Transplanted Islet Engraftment in Visceral White Adipose Tissue. Transplantation. 104 (12), 2516-2527 (2020).
- Navarro-Requena, C., et al. PEG hydrogel containing calcium-releasing particles and mesenchymal stromal cells promote vessel maturation. Acta Biomaterialia. 67, 53-65 (2018).
- Phelps, E. A., Headen, D. M., Taylor, W. R., Thule, P. M., Garcia, A. J. Vasculogenic bio-synthetic hydrogel for enhancement of pancreatic islet engraftment and function in type 1 diabetes. Biomaterials. 34 (19), 4602-4611 (2013).
- Manzoli, V., et al. Immunoisolation of murine islet allografts in vascularized sites through conformal coating with polyethylene glycol. American Journal of Transplantation. 18 (3), 590-603 (2018).
- Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. P. An improved method for isolation of mouse pancreatic islets. Transplantation. 40 (4), 437-438 (1985).
- Brandhorst, D., Brandhorst, H., Hering, B. J., Bretzel, R. G. Long-term survival, morphology and in vitro function of isolated pig islets under different culture conditions. Transplantation. 67 (12), 1533-1541 (1999).
- Noguchi, H., et al. Low-temperature preservation of isolated islets is superior to conventional islet culture before islet transplantation. Transplantation. 89 (1), 47-54 (2010).
- Itoh, T., et al. Low temperature condition prevents hypoxia-induced islet cell damage and HMGB1 release in a mouse model. Cell Transplantation. 21 (7), 1361-1370 (2012).
- Komatsu, H., et al. Optimizing Temperature and Oxygen Supports Long-term Culture of Human Islets. Transplantation. 103 (2), 299-306 (2019).
- Unger, R. H. Lipid overload and overflow: metabolic trauma and the metabolic syndrome. Trends in Endocrinology, Metabolism. 14 (9), 398-403 (2003).
- Mao, D., et al. A macroporous heparin-releasing silk fibroin scaffold improves islet transplantation outcome by promoting islet revascularisation and survival. Acta Biomaterialia. 59, 210-220 (2017).
- Wang, K., Wang, X., Han, C. S., Chen, L. Y., Luo, Y. Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice. Journal of Visualized Experiments. (125), e54995 (2017).
- Wang, X., Wang, K., Zhang, W., Qiang, M., Luo, Y. A bilaminated decellularized scaffold for islet transplantation: Structure, properties and functions in diabetic mice. Biomaterials. 138, 80-90 (2017).
- Rios, P. D., Zhang, X., Luo, X., Shea, L. D. Mold-casted non-degradable, islet macro-encapsulating hydrogel devices for restoration of normoglycemia in diabetic mice. Biotechnology and Bioengineering. 113 (11), 2485-2495 (2016).
