Summary
Diese fettbedeckte Inseltransplantationsmethode eignet sich für den Nachweis von eingepfropften Inseln in der intraperitonealen Höhle. Insbesondere erfordert es nicht die Verwendung von Biobindemitteln oder Naht.
Abstract
Die Inseltransplantation ist eine Zellersatztherapie bei schwerem Diabetes mellitus. Die intraperitoneale Höhle ist typischerweise die Transplantationsstelle für dieses Verfahren. Die intraperitoneale Inseltransplantation hat jedoch einige Einschränkungen, darunter eine schlechte Transplantationswirksamkeit, eine schwierige Transplantaterkennung und einen Mangel an Graftektomiefähigkeit für die Analyse nach der Transplantation. In diesem Artikel wird die "fettbedeckte Inseltransplantation", eine intraperitoneale Inseltransplantationsmethode, die epididymales weißes Fettgewebe verwendet, verwendet, um die therapeutischen Wirkungen von biotechnologisch hergestellten Inseln zu bewerten. Die Einfachheit der Methode liegt in der Aussaat von Inseln auf epididymales weißes Fettgewebe und die Verwendung des Gewebes zur Abdeckung der Inseln. Während diese Methode als intraperitoneale Inseltransplantationstechnik kategorisiert werden kann, teilt sie Merkmale mit der Transplantation von Injektionsinseln innerhalb des Fettgewebes. Die fettbedeckte Inseltransplantationsmethode zeigt jedoch robustere therapeutische Wirkungen als die Inseltransplantation im intrafetten Gewebe, einschließlich der Verbesserung des Blutzucker- und Plasmainsulinspiegels und des Potenzials zur Entfernung von Transplantaten. Wir empfehlen die Anwendung dieser Methode zur Beurteilung der Mechanismen der Inseltransplantation in weißes Fettgewebe und der therapeutischen Wirkungen von biotechnologisch hergestellten Inseln.
Introduction
Die Inseltransplantation ist eine Zellersatztherapie für Patienten mit schwerem Diabetes mellitus. Jüngste Berichte haben gezeigt, dass sich die Insulinunabhängigkeitsraten drei Jahre nach der Transplantation auf bis zu 44 %1 verbessern und dass etwa 80 % der Empfänger, die insgesamt mehr als 600.000 Inseläquivalente erhalten, eine Insulinunabhängigkeit erreichen2. Darüber hinaus wurde im jüngsten Bericht des Collaborative Islet Transplant Registry festgestellt, dass der Nüchternblutzuckerspiegel bei über einen Zeitraum von 5 Jahren bei über 70% der Patienten, die sich einer Inseltransplantation unterzogen hatten, über einen Zeitraum von 5 Jahren bei 60-140 mg / dl gehalten wurde. Die Studie ergab auch, dass etwa 90% der Patienten, die nach einer Nierentransplantation nur eine Inseltransplantation oder eine Inseltransplantation erhielten, über 5 Jahre lang keine schweren hypoglykämischen Ereignisse entwickelten3.
Obwohl sich die klinischen Ergebnisse dieser Behandlung verbessert haben, müssen noch einige Einschränkungen angegangen werden, einschließlich der Notwendigkeit, eine optimale Transplantationsstelle zu etablieren. Die Leber ist eine typische Transplantationsstelle für die klinische Inseltransplantation, da sie das größte Organ ist, das ein hohes Volumen an Inseln aufnehmen kann. Bei einigen Patienten ist jedoch die Leber nicht verfügbar (z. B. aufgrund von portaler Hypertonie, Hepatitis und/oder Zirrhose4) und daher andere Stellen, einschließlich des renalen subkapsulären Raums5,6, des omentalen Beutels 7,8,9,10, des Mesenteriums 11, des Magen-Darm-Trakts 12, der Skelettmuskulatur 13, des Unterhautgewebes 13, des Knochenmarks 14 und der Milz 15 ,16,17, wurden als alternative Transplantationsstellen in Betracht gezogen.
Obwohl die intraperitoneale Inseltransplantation leicht unter örtlicher Betäubung durchgeführt werden kann, was die intraperitoneale Höhle zu einem attraktiven Ort für die klinische Inseltransplantation macht, sind die Inseln nach der Transplantation über die gesamte intraperitoneale Höhle verteilt, was die Inseltransplantationserkennung und die erfolgreiche Bestätigung der Anpflanzung erschwert. Daher ist die intraperitoneale Höhle nicht allgemein als ideale klinische Transplantationsstelle anerkannt. Stattdessen wird es häufig als Kontrollmodell für präklinische Studien verwendet, um die Wirksamkeit von transplantierten eingekapselten18 und biotechnologisch hergestellten Inselnzu untersuchen 19. Ein genauer Vergleich zwischen biotechnologisch hergestellten und Kontrollinseln ist jedoch aufgrund der Herausforderungen bei der Durchführung einer genauen Engraftment-Bewertung schwer zu erreichen.
Im Gegensatz dazu wurde die Verwendung von intraperitonealem weißem Fettgewebe im omentalen Beutel8, Mesenterium und anderen extrahepatischen Stellen gut berichtet 10,20,21,22,23 und viele der Studien, die die Funktion von biotechnologisch hergestellten Inseln untersuchten, die mit weißem Fettgewebe transplantiert wurden, konnten vielversprechende therapeutische Ergebnisse berichten20,24,25, 26. Da die Verwendung von Nebenhodenfettgewebe den Nachweis transplantierter Inseln erleichtert, wurde die "fettbedeckte Inseltransplantationsmethode" entwickelt, bei der epididymales Fettgewebe verwendet wird, um die Einschränkungen der intraperitonealen Inseltransplantation zu überwinden. In dieser Arbeit wird die fettbedeckte Inseltransplantation mit Nebenhodenfettgewebe beschrieben.
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Protocol
Das folgende Verfahren wird in drei Schritten durchgeführt. Der erste Schritt umfasst die Induktion von Diabetes bei den Empfängermäusen und die Isolierung von Spenderinseln. Der zweite Schritt beinhaltet die Vorbereitung von Inselchen vor der Transplantation. Im dritten Schritt wird die Inseltransplantation auf Nebenhodenfettgewebe und die Abdeckung der Inseln mit dem Fettgewebe durchgeführt. Danach wurden die therapeutischen Wirkungen bewertet. Der Umgang mit den Mäusen und die in dieser Studie durchgeführten experimentellen Verfahren entsprechen den ''Principles of Laboratory Animal Care'' (Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren, National Institutes of Health Publikation 8. Auflage, 2011), und das Versuchsprotokoll wurde vom Animal Care and Use Committee der Fukuoka University genehmigt (Zulassungsnummer: 186018).
1. Chirurgische Vorbereitung
- Induktion von Diabetes: Induzieren Sie Diabetes in 20-25 g Körpergewicht, 8-12 Wochen alten männlichen Empfängermäusen durch intravenöse Injektion von 18 mg / ml Streptozotocinlösung, die in 0,1 Mio. Citratpuffer (180 mg / kg Körpergewicht) hergestellt wurde. Mäuse mit einem Blutzuckerspiegel von mehr als 400 mg / dl gelten als Diabetiker. Verwenden Sie diabetische Mäuse innerhalb von 1 Woche nach Diabetes-Induktion vor übermäßiger Atrophie des epididymalen weißen Fettgewebes zur Abdeckung der Inseln.
- Inselisolierung: Führen Sie einen Tag vor der Transplantation eine murine Inselisolierung nach Gotohs Methode27 zur Inselisolierung durch.
- Kurz gesagt, verdauen Sie Pankreasgewebe mit Kollagenaselösung. Isolieren Sie Inseln durch Dichtegradientenzentrifugation unter Verwendung einer geeigneten Zelltrennlösung. Dann kultivieren Sie Inselchen über Nacht in einem Inkubator bei 22 °C und 5%CO2 (Kultur bei <37 °C wurde berichtet, um den Inseltod zu verhindern 28,29,30,31).
HINWEIS: Behandeln Sie die gereinigten Inselkulturen in einer Sicherheitswerkbank. Filtersterilisieren Sie alle Lösungen, die für die Inselisolierung und -kultur verwendet werden, mit einem 0,22-μm-Filter.
2. Vorbereitung von Inselchen für die Transplantation
- Sammeln Sie die geeigneten Instrumente und Materialien, wie in Abbildung 1A dargestellt.
- Da Verdauungsenzyme wie Amylase und Lipase zu einer Verletzung der isolierten und transplantierten Inseln führen können und ein Verlust von Inseln auftreten kann, wenn sie in kontaminierendem fibrösem Gewebe innerhalb der Kulturschale eingeschlossen sind, verwenden Sie vor der Transplantation eine Pinzette, um alle Komponenten der zusätzlichen Insel aus der Bauchspeicheldrüse, einschließlich Azinus und Fasergewebe, von Hand auszuwählen (Abbildung 1B). unter einem Seziermikroskop. Verwenden Sie nach der Ernte ein Zellsieb, um einzelne Azinuszellen herauszufiltern.
- Die gefilterten Inseln werden in eine neue Kulturschale überführt, die ein geeignetes Kulturmedium oder eine geeignete Pufferlösung (z. B. DMEM mit niedrigem Glucosegehalt, RPMI1640, CMRL1066 oder HBSS) enthält, ergänzt mit Rinderserum oder Albumin, um eine Anhaftung der Insel an Kunststoff zu verhindern, und die Schale schwenken, um die Inseln in der Mitte der Schale zu positionieren (Abbildung 1C). Entnehmen Sie die einzelnen Inseln mit einer P200-Mikropipette und dem Mikroskop in ein geeignetes Sammelröhrchen (Abbildung 1D).
- Setzen Sie ein neues, 40-μm-Zellsieb auf ein 50-ml-Kunststoffröhrchen (Abbildung 1E links und Mitte) und waschen Sie den Filter mit frischem Medium (Abbildung 1E rechts).
- Verwenden Sie eine 1000-μL-Pipette, um die Inseln in das Sieb zu geben, um die Inseln und einzelnen Azinuszellen zu trennen (Abbildung 1 F1 und Abbildung 1F2).
HINWEIS: Die gereinigten Inseln auf dem Zellsieb sind ungefähr 100% rein. - Verwenden Sie eine Pinzette, um das Sieb auf einer neuen, 60 oder 100 mm großen, unbehandelten Kulturschale umzudrehen, die Kulturmedium oder eine geeignete Pufferlösung enthält, die mit Rinderserum oder Albumin ergänzt wird (Abbildung 1 F3 und Abbildung 1F4). Verwenden Sie frisches Medium/Puffer, um die Inseln in eine neue Kulturschale zu spülen. Fügen Sie dann genügend Medium/Puffer in die Kulturschale ein, um ein Gesamtvolumen von ca. 20 ml zu erreichen.
- Zählen Sie die Inseln unter einem Mikroskop und teilen Sie die Anzahl der Inseln gleichmäßig auf einzelne 1,5-ml-Kunststoffzentrifugenröhrchen entsprechend der Anzahl der Spendertiere auf (Abbildung 1G). Zum Beispiel würden zweihundert 100-200 μm Inseläquivalente (IEQ) von zwei Mäusen zu jeder von zwei Röhrchen hinzugefügt.
- Zentrifugieren Sie die Inseln bei 2.100 x g innerhalb von 1 Minute bei Raumtemperatur und entsorgen Sie den Überstand. Etwa 20-30 μL Restlösung verbleiben typischerweise im Röhrchen (Abbildung 1H).
3. Inseltransplantation auf Nebenhodenfettgewebe und Abdeckung mit epididymalem weißem Fettgewebe
- Sammeln Sie vor der Operation ein Anästhesiegerät für Kleintiere, Stereomikroskop, Lichtquelle, 50-200 μL Mikropipette mit 200 μL Mikropipettenspitzen, Wattestäbchen, ein 4-0-Nahtset und desinfizierte chirurgische Instrumente (Abbildung 2A). Autoklavieren Sie die Cooper-Schere, die Augenschere, die Erbsenzange, die Pinzette und die Nadelhalter. Nach dem Autoklavieren tauchen Sie das Gerät in eine 1%ige Povidon-Jod-Lösung (Abbildung 2A). Verwenden Sie Wattestäbchen zur Mobilisierung des Nebenhoden-Fettgewebes und zur Hämostase bei Blutungen. Verwenden Sie eine Mikropipette mit 50-200 μL Spitzen für die Inseltransplantation.
- Verabreichung der Anästhesie an die diabetische Empfängermaus mit einem inhalativen Anästhetikum (2% Isofluran in Sauerstoff). Tragen Sie Augengleitmittel auf beide Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern. Legen Sie dann die Maus in Rückenlage (Abbildung 2B links) und entfernen Sie die Haare aus dem Bauch, um eine Infektion mit Haarschneidemaschine und/oder Enthaarungscreme zu verhindern. Desinfizieren Sie den Bauch und die Leistengegend mit mindestens drei abwechselnden Runden einer Povidon-Jod-Lösung, gefolgt von 70% Ethanol (Abbildung 2B rechts). Bestätigen Sie vor der Operation die Anästhesietiefe durch das Fehlen eines Zehenklemmreflexes. Bieten Sie intraoperative thermische Unterstützung mit einem Heizkissen und verwenden Sie einen chirurgischen Vorhang, um den sterilen chirurgischen Bereich zu sichern.
- Schneiden Sie die Haut im unteren Mittelbereich ein (Abbildung 2C links). Ein Hautschnitt von ca. 2 cm Länge wird empfohlen. Klemmen Sie die linke Bauchdecke mit der Pean-Pinzette (auch eine schonende Pinzette oder ein Retraktor können verwendet werden) und ziehen Sie das Gewebe auf die linke Seite der Maus, um das Operationsfeld zu sichern (Abbildung 2C rechts). Verringern Sie nach der Laparotomie den Prozentsatz von Isofluran auf 1,0-1,5% zur Aufrechterhaltung der Anästhesie.
- Verwenden Sie ein Wattestäbchen, um den Dünn- und Dickdarm auf der rechten Seite der Maus (dh der linken Seite des Bedieners) zu mobilisieren. Das linke Nebenhoden-weiße Fettgewebe in der Bauchhöhle befindet sich im linken Leistenbereich. Mobilisieren Sie das epididymale weiße Fettgewebe und den linken Hoden nach außen (Abbildung 2D links) und strecken Sie das Gewebe aus (2D rechts).
- Verwenden Sie eine P200-Mikropipette mit einer 200-μL-Pipettenspitze, um das gesamte Volumen der Inseln aus einem 1,5-ml-Röhrchen mit sanftem Pipettieren zu erfassen (Abbildung 2E links), wobei darauf zu achten ist, dass bei der Entnahme keine Inseln im Röhrchen verbleiben. Lassen Sie die gesammelten Inseln durch die Schwerkraft an der Spitze der Pipette absetzen (Abbildung 2E rechts).
- Legen Sie die Mikropipettenspitze leicht auf das aufgeblähte Fettgewebe. Achten Sie darauf, ein übermäßiges Ausspülen des Mediums/Puffers in der Spitze zu vermeiden, und säen Sie die Inseln vorsichtig auf das Gewebe (Abbildung 2F links). Bestätigen Sie nach der Aussaat eine korrekte Platzierung der Inseln unter einem Seziermikroskop (Abbildung 2F rechts).
- Bedecken Sie die Inseln mit dem epididymalen weißen Fettgewebe (Abbildung 2G). Die Verwendung von Nähten oder Biobindemitteln ist nicht erforderlich.
- Legen Sie den linken Hoden unter das epididymale weiße Fettgewebe und führen Sie das Gewebe in die intraperitoneale Höhle zurück (Abbildung 2H). Schließen Sie die Haut in zwei Schichten (Peritoneum, dann Muskel und Haut) mit einer 4-0-Naht (alle Nähte wie Nylon oder resorbierbare Nähte können verwendet werden) (Abbildung 2I). Acetylsalicylsäure (300 mg/kg; SQ) in der Nähe der Wunde für postoperative Analgesie. Legen Sie dann die Maus unter eine Wärmelampe und überwachen Sie sie bis zur vollständigen Genesung.
4. Überwachung nach Inseltransplantation (Zusammenfassung)
- Beurteilung der therapeutischen Wirkungen der Inseltransplantation durch Überwachung des Blutzuckers, des Glukosetoleranztests und der histologischen Beurteilung am postoperativen Tag (POD) 28.
- Überwachen Sie den Blutzucker, einschließlich der Messungen des Blutzuckers beim Glukosetoleranztest, mit einem kleinen Blutzuckermessgerät.
- Sammeln Sie die Blutproben (ein wenig Mikroliter) aus der Schwanzvene. In Bezug auf die histologische Beurteilung wurden murines Insulin (zum Nachweis von transplantierten Inseln) und der von-Willebrand-Faktor (zum Nachweis von Gefäßen, was ein Beweis für Inseltransplantation ist) in transplantierten Inseln im wiedergewonnenen Nebenhodenfettgewebe durch Immunhistochemie nachgewiesen.
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Representative Results
Um die Transplantationswirksamkeit der fettbedeckten Inseltransplantation mit der nach intraperitonealer Inseltransplantation zu vergleichen, wurde die gleiche Anzahl von Inseln auf das Peritoneum im linken parakolischen Raum von Kontrollempfänger-Diabetikern implantiert. Es wurde beobachtet, dass der Blutzuckerspiegel von Mäusen mit fettbedeckter Inseltransplantation im Vergleich zu intraperitonealen Inseltransplantatmäusen allmählich und signifikant abnahm (p = 0,0023; Abbildung 3A). Einen Monat nach der Transplantation wurde der Blutzucker bei Mäusen mit fettbedeckter Inseltransplantation auf einem niedrigeren Niveau gehalten als bei intraperitonealen Inseltransplantatmäusen, wie durch intraperitoneale Glukosetoleranztests beurteilt (p = 0,0046; Abbildung 3B). Darüber hinaus haben wir, wie bereits berichtet, berichtet, dass sich der Plasmainsulinspiegel auch nach einer fettbedeckten Inseltransplantation verbesserte. Eine erneute Erhöhung des Blutzuckerspiegels wurde ebenfalls bestätigt. Diese Daten zeigen, dass eine intraperitoneale fettbedeckte Inseltransplantation mit 200 IEQs die diabetischen Bedingungen der Empfängermäuse signifikant verbessern kann.
Eine histologische Untersuchung wurde auch durchgeführt, um die Inseltransplantation in das epididymale weiße Fettgewebe zu beurteilen. Bei fettbedeckten Inseltransplantat-Empfängertieren zeigt die Hämatoxylin-Eosin-Färbung das Vorhandensein von Inseln im Nebenhoden-Fettgewebe (Abbildung 3C, oberes Bild). Darüber hinaus erleichterte die fluoreszenzkonjugierte Antikörperfärbung insulinpositiver Inseln den Nachweis von von-Willebrand-Faktor-positiven Mikrogefäßen im Nebenhoden-weißen Fettgewebe aller Empfängermäuse (n = 6; Abbildung 3C). Im Gegensatz dazu wurden bei intraperitonealen Inseltransplantatmäusen weder im Nebenhoden-weißen Fettgewebe noch in der Bauchdecke eingepfropfte Inseln beobachtet (Daten nicht gezeigt).
Abbildung 1-ABC. Vorbereitung von Inseln für die Transplantation auf Nebenhodenfettgewebe und Abdeckung mit epididymalem weißem Fettgewebe. (A) Herstellung von Instrumenten: a. Pipettenhilfsmittel, b. 10 mL Pipettenspitzen, ca. 50 mL Kunststoffröhrchen, d. 15 ml Kunststoffröhrchen, e. 50-200 μL (links) und 200-1000 μL (rechts) Mikropipetten, f. 1,5 mL Kunststoffzentrifugenröhrchen, g. 200 und 1000 μL Mikropipettenspitzen, h. Medium oder Puffer enthaltendes Albumin oder fetales Rinderserum (d. h. DMEM mit niedriger Glukose, das 10% fetales Rinderserum und 100 U/ml Penicillin + 100 U/ml Streptomycinlösung enthält), und i. 40 μm Zellsieb. (B) Isolierte Inseln mit Azinus (links: durch Pfeil gekennzeichnet) und fibrösem Gewebe (rechts). Maßstabsbalken = 200 μm. (C) Gesammelte Inseln im Kunststoffrohr. Linke, verstreute Inseln in Kulturschale. In der Mitte werden Inseln in der Mitte der Kulturschale durch Wirbeln gesammelt. Rechts, gesammelte Inseln in der Mitte der Schale. Maßstabsbalken = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 1-DEF. Vorbereitung von Inseln für die Transplantation auf Nebenhodenfettgewebe und Abdeckung mit epididymalem weißem Fettgewebe. (D) Die gesammelten Inseln (links) werden in 15-ml-Kunststoffröhrchen (rechts) umgefüllt. (E) Das 40-μm-Zellsieb wird auf das 50-ml-Kunststoffrohr (links und in der Mitte) gesetzt. Vorbereitetes Medium/Puffer zu einem anderen 50-ml-Kunststoffrohr hinzugefügt, um Inseln auf dem Zellsieb in eine neue Kulturschale zu spülen (rechts). f) 1. Inselchen, die mit einer 200-1000 μL Mikropipette gesammelt werden. 2. Inselchen in das Zellsieb gegossen. 3 und 4. Medium/Puffer, der verwendet wird, um Inseln auf Sieb in eine neue Kulturschale zu spülen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 1-GH. Vorbereitung von Inseln für die Transplantation auf Nebenhodenfettgewebe und Abdeckung mit epididymalem weißem Fettgewebe. (G) Inselchen, aufgeteilt in 1,5 ml Kunststoffzentrifugenröhrchen entsprechend der Anzahl der Empfängermäuse. Hier wurden zweihundert 100-200 μm Inseläquivalent (IEQ) gleichmäßig in jedes Röhrchen aufgeteilt. (H) Inselchen, die vor der Zentrifugation gleichmäßig in 1,5-ml-Röhrchen aufgeteilt sind (links). Inselchen zentrifugiert, um sich am Rohrboden (Mitte) zu sammeln. 20-30 μL Überstand verbleiben im Röhrchen, nachdem überschüssige Lösung verworfen wurde (rechts). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2-ABC. Das Verfahren der Inseltransplantation auf Nebenhodenfettgewebe und Abdeckung mit epididymalem weißem Fettgewebe. (A) Herstellung von Instrumenten: a. Anästhesiegerät für Kleintiere, b. Stereomikroskop, c. Lichtquelle, d. desinfizierte chirurgische Instrumente, e. geteilte Inseln in 1,5 ml Kunststoffröhrchen, f. 50-200 μL Mikropipetten, g. 200 μL Mikropipettenspitzen und h. 4-0 Nähte. (B) Diabetiker-Empfängermaus in Rückenlage unter Vollnarkose von 2% Isofluran (links). Der Bauch und die Leistengegend werden mit 70% Ethanol desinfiziert und mit einem Labortuch aus Papier abgedeckt (rechts). (C) Die Haut ist in der unteren Medianposition eingeschnitten (links). Die linke Bauchdecke wird mit einer Pean-Pinzette geklemmt und zur linken Seite der Maus gezogen, um das Operationsfeld zu sichern (rechts). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2-DEF. Das Verfahren der Inseltransplantation auf Nebenhodenfettgewebe und Abdeckung mit epididymalem weißem Fettgewebe. (D) Das linke Nebenhoden-Fettgewebe und der linke Hoden werden außerhalb des Abdomens mobilisiert (links) und aufgebläht (rechts). Maßstabsbalken = 1 cm. (E) Inseln in 1,5 ml Kunststoffröhrchen werden mit einer Mikropipette mit 200 μL Pipettenspitze (links) vollständig gesammelt. Gesammelte Inseln (durch Pfeil gekennzeichnet), die durch die Schwerkraft zur Pipettenspitze (rechts) vollständig sinken können. (F) Mikropipettenspitze leicht auf das aufgeblähte Fettgewebe gelegt (links). Inselaussaat (gepunkteter Kreis) auf das Gewebe durch das Seziermikroskop bestätigt (rechts). Maßstabsbalken = 1 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: WHI. Das Verfahren der Inseltransplantation auf Nebenhodenfettgewebe und Abdeckung mit epididymalem weißem Fettgewebe. (G) Inselchen sind mit epididymalem weißem Fettgewebe bedeckt. (H) Linker Hoden und Nebenhoden, weißes Fettgewebe, das in die intraperitoneale Höhle zurückgeführt wurde. (I) Bild nach dem Verschluss des Abdomens. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3. Die therapeutische Wirkung der fettbedeckten Inseltransplantation. (A) Blutzuckerspiegel. Blaue Linie: fettbedeckte Inseltransplantation (n = 6); Orange Linie: intraperitoneale Inseltransplantation (n = 6) Die statistische Analyse wurde unter Verwendung einer Varianzanalyse mit wiederholten Messungen durchgeführt und ein signifikanter Unterschied wurde als p < 0,05 definiert. (B) Blutzuckerspiegel aus Glukosetoleranztest einen Monat nach der Transplantation. Blaue Linie: fettbedeckte Inseltransplantation (n = 6); Orange Linie: intraperitoneale Inseltransplantation (n = 6). Die statistische Analyse wurde unter Verwendung einer Varianzanalyse mit wiederholten Messungen durchgeführt und eine signifikante Differenz wurde als p < 0,05 definiert. (C) Histologisches Bild der eingepfropften Inseln einen Monat nach der Transplantation. Bild oben: Hämatoxylin-Eosin-Färbung; Bild unten: Immunhistofärbung für murines Insulin (grün) und von-Willebrand-Faktor (vWF: rot, markiert durch weißen Pfeil). Maßstabsbalken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die fettbedeckte Inseltransplantationsmethode umfasst Techniken aus zwei verschiedenen Transplantationstechniken: intraperitoneale Inseltransplantation und intraadipöse Gewebeinseltransplantation. Da die Oberflächenmembran des epididymalen weißen Fettgewebes als das weiße Fettgewebe angesehen wird, das vom Peritoneum bedeckt ist und an den Nebenhoden befestigt ist, kann die fettbedeckte Inseltransplantationsmethode anatomisch als eine Art intraperitoneale Inseltransplantation kategorisiert werden. Die Technik, mit der die Inseln an das Empfängertier geliefert werden, ähnelt jedoch eher denen, die bei der Transplantation von Innerfettgewebeinseln verwendet werden. Unsere Daten zeigen, dass die therapeutische Wirkung der fettbedeckten Inseltransplantationsmethode der intraperitonealen Inseltransplantation überlegen ist. Unsere frühere Studie zeigte auch, dass die Transplantationswirksamkeit dieser Methode fast der der renalen subkapsulären Inseltransplantation entspricht, einer Methode der Inseltransplantation mit einer höchsten Transplantationswirksamkeit23. Es wird spekuliert, dass die Nützlichkeit dieser Methode auf die Adhäsionsmoleküle zurückzuführen sein könnte, die in weißen Fettgeweben und Adipozytokinen vorhanden sind und von denen angenommen wird, dass sie zur Inseltransplantation beitragen10,23.
Die Größe des epididymalen weißen Fettgewebes ermöglicht es, ein großes Volumen an Inseln unterzubringen. Im Gegensatz dazu ist das Omentum des Nagetiers zu klein, um viele Inseln leicht einzudämmen und zugänglich zu machen. Die einzige physikalische Einschränkung des epididymalen weißen Fettgewebes als potenzielle experimentelle Inseltransplantationsstelle besteht darin, dass es keine pfortare Zirkulation von Insulin10 bietet.
Die Methode ist einzigartig, da die Inseln mit Fettgewebe bedeckt sind, anstatt direkt in das Gewebe infundiert zu werden. Intra-Fettgewebe-transplantierte Inseln können unter dem Einfluss von Lipotoxizität leiden, da die beeinträchtigte Insulinfunktion bei Diabetikern zu überschüssigen freien Fettsäuren führen kann32. Diese Methode erfordert auch keine Biobondmittel oder Nähte, um den Verlust implantierter Inseln zu verhindern. Wie in Abbildung 3C beobachtet, bleiben die Inseln bis zu 1 Monat nach der Transplantation erfolgreich im Fettgewebe eingepfropft und die Aufrechterhaltung des Blutzuckerspiegels wurde nach der Graftektomiebestätigt 23. Dieses Phänomen kann auf die Fähigkeit des Fettgewebes zurückzuführen sein, die Inseln einzufangen, die schwer abzuziehen sind.
Die Vorteile dieser Methode sind, dass sie technisch einfach durchzuführen ist, eine metabolische und histologische Beurteilung der therapeutischen Wirkungen der Inseln ermöglicht und die Beurteilung der Inselgen- und/oder Proteinexpression nach der Graftektomie erleichtert. Im Vergleich zu früheren Studien ist die Wirksamkeit dieser Methode der Inseltransplantation in epididymales weißes Fettgewebe 10,33,34,35,36 nicht unterlegen. Es ist wichtig zu beachten, dass eine präzise Aussaat der Inseln auf das epididymale weiße Fettgewebe ohne Inselverlust für eine erfolgreiche Anpflanzung notwendig ist. Um den Erfolg zu gewährleisten, muss das gesamte Inselvolumen vorsichtig aus dem 1,5-ml-Kunststoffrohr in die Mikropipettenspitze abgesaugt werden, da raues und schnelles Pipettieren zu einer Haftung der Insel an den Wänden des Kunststoffrohrs führen kann, was das Dosieren erschwert. Die Inseladhäsion ist ein Hauptgrund für eine unzureichende Inselaussaat. Nachdem sich die Inseln an der Spitze der Mikropipettenspitze abgesetzt haben, müssen die Inseln ohne Spülung in das Nebenhodenfettgewebe implantiert werden. Es ist wichtig, das Absenken des Kolbenknopfes beim Ansaugen und Dosieren der Inseln zu minimieren, um eine übermäßige Mediums- / Pufferspülung des Fettgewebes zu verhindern. Daher ist es wichtig zu warten, bis sich die Inseln an der Spitze der Mikropipettenspitze vollständig aggregiert haben, bevor der Kolbenknopf der Mikropipette für die Implantation gedrückt wird. Es genügt, die Spitze leicht auf das Fettgewebe zu legen und die Aussaat von Inseln auf das Gewebe durch Lichtmikroskopie zu bestätigen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Methode sehr einfach ist, obwohl mehrere kritische Schritte für ihren Erfolg erforderlich sind. Wir hoffen auf die breite Anwendung dieser Methode, um die Inseltransplantation auf weißem Fettgewebe weiter zu erleichtern und die therapeutischen Wirkungen von biotechnologisch hergestellten Inseln weiter zu bewerten.
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Disclosures
Wir haben keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Diese Studie wurde durch einen Zuschuss für wissenschaftliche Forschung (C) (19K09839, NS) des japanischen Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 Nylon | Alfresa | ER2004NA45-KF2 | Closing abdomen |
| Alexa 488-conjugated donkey anti-guinea pig | Jackson Immunoresearch | 706-546-148 | Secondary antibody for insulin antibody |
| Alexa 647-conjugated donkey anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-606-152 | Secondary antibody for von Willebrand factor antibody |
| DMEM, low glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11885084 | Culturing islets, transplanting islets |
| Eosin | Fujifilm Wako Chemicals | 051-06515 | Using for staining tissue by eosin |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Collecting islets |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352095 | Collecting islets |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Using for separating islets from other pancreatic tissue |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | Discarding excessive medium/buffer |
| Guinea pig anti-insulin | Agilent Technologies Japan, Ltd. (Dako) | IR002 | Primary antibody for murine insulin |
| Hematoxylin | Muto Pure Chemicals Co., Ltd. | 30002 | Using for staining tissue by hematoxylin |
| Isodine solution 10% | Shionogi&Co., Ltd. | no catalog number | Using for disinfection |
| Isoflurane | Fujifilm Wako Chemicals | 095-06573 | Using for anesthesia |
| Labcon 1000 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips | Labcon | 1177-965-008 | Using for separating islets from other pancreatic tissue |
| Labcon 200 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips | Labcon | 1179-965-008 | Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue |
| Mintsensor | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co. Ltd., | 8AEB02E | Using for monitoring blood glucose |
| Pipetteman P-1000 | Gilson | F123602 | Using for separating islets from other pancreatic tissue |
| Pipetteman P-200 | Gilson | F123601 | Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue |
| Rabbit anti-vWF | Abcam | ab6994 | Primary antibody for murine von Willebrand factor |
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