Summary
Questo metodo di trapianto di isole ricoperte di grasso è adatto per il rilevamento di isole innestate nella cavità intraperitoneale. In particolare, non richiede l'uso di agenti bioleganti o sutura.
Abstract
Il trapianto di isole è una terapia cellulare sostitutiva per il diabete mellito grave. La cavità intraperitoneale è tipicamente il sito di trapianto per questa procedura. Tuttavia, il trapianto di isole intraperitoneali presenta alcune limitazioni, tra cui la scarsa efficacia del trapianto, la difficile capacità di rilevamento dell'innesto e la mancanza di capacità di graftectomia per l'analisi post-trapianto. In questo articolo, "trapianto di isole ricoperte di grasso", un metodo di trapianto di isole intraperitoneali che utilizza tessuto adiposo bianco epididimale, viene utilizzato per valutare gli effetti terapeutici delle isole bioingegnerizzate. La semplicità del metodo sta nella semina di isole sul tessuto adiposo bianco dell'epididimo e nell'utilizzo del tessuto per coprire le isole. Mentre questo metodo può essere classificato come una tecnica di trapianto di isole intraperitoneali, condivide le caratteristiche con il trapianto di isole di tessuto intra-adiposo. Tuttavia, il metodo di trapianto di isole ricoperte di grasso dimostra effetti terapeutici più robusti rispetto al trapianto di isole di tessuto intra-adiposo, compreso il miglioramento dei livelli di glucosio nel sangue e di insulina plasmatica e il potenziale di rimozione del trapianto. Si consiglia l'adozione di questo metodo per valutare i meccanismi di attecchimento delle isole nel tessuto adiposo bianco e gli effetti terapeutici delle isole bioingegnerizzate.
Introduction
Il trapianto di isole è una terapia cellulare sostitutiva per i pazienti con diabete mellito grave. Recenti rapporti hanno dimostrato che i tassi di insulino-indipendenza a tre anni dal trapianto migliorano fino al 44%1 e che circa l'80% dei riceventi che ricevono più di 600.000 equivalenti insulari totali raggiungono l'insulino-indipendenza2. Inoltre, nel più recente rapporto del Collaborative Islet Transplant Registry, è stato rivelato che i livelli di glucosio nel sangue a digiuno sono stati mantenuti a 60-140 mg / dL per un periodo di 5 anni in oltre il 70% dei pazienti sottoposti a trapianto di isole da solo. Lo studio ha anche determinato che circa il 90% dei pazienti che hanno ricevuto il trapianto di isole da solo o il trapianto di isole dopo trapianto di rene non hanno sviluppato eventi ipoglicemici gravi per oltre 5 anni3.
Sebbene i risultati clinici di questo trattamento siano migliorati, alcune limitazioni devono ancora essere affrontate, inclusa la necessità di stabilire un sito di trapianto ottimale. Il fegato è un tipico sito di trapianto per il trapianto di isole cliniche perché è l'organo più grande che può ospitare un elevato volume di isole. Tuttavia, in alcuni pazienti il fegato non è disponibile (ad esempio, a causa di ipertensione portale, epatite e / o cirrosi4) e quindi altri siti, tra cui lo spazio subcapsulare renale5,6, la sacca omentale 7,8,9,10, il mesentere 11, il tratto gastrointestinale 12, il muscolo scheletrico 13, il tessuto sottocutaneo 13, il midollo osseo14 e la milza 15 ,16,17, sono stati considerati come siti di trapianto alternativi.
Sebbene il trapianto intraperitoneale di isole possa essere eseguito facilmente in anestesia locale, rendendo la cavità intraperitoneale un sito attraente per il trapianto clinico di isole, al momento del trapianto, le isole sono disperse in tutta la cavità intraperitoneale, rendendo difficile il rilevamento dell'attecchimento delle isole e la conferma dell'attecchimento di successo. Pertanto, la cavità intraperitoneale non è ampiamente riconosciuta come sito di trapianto clinico ideale. Invece, è spesso utilizzato come modello di controllo per studi preclinici per studiare l'efficacia delle isole trapiantate incapsulate18 e bioingegnerizzate19. Tuttavia, un confronto esatto tra isole bioingegnerizzate e di controllo è difficile da ottenere a causa delle difficoltà nell'eseguire una valutazione accurata dell'attecchimento.
Al contrario, l'uso di tessuto adiposo bianco intraperitoneale nella sacca omentale8, nel mesentere e in altre sedi extraepatiche è stato ben riportato 10,20,21,22,23 e molti degli studi che hanno studiato la funzione delle isole bioingegnerizzate trapiantate utilizzando tessuto adiposo bianco sono stati in grado di riportare risultati terapeutici promettenti20,24,25, 26. Poiché l'uso del tessuto adiposo epididimo facilita la rilevazione delle isole trapiantate, il "metodo di trapianto di isole ricoperte di grasso", utilizzando tessuto adiposo epididimale, è stato sviluppato per superare i limiti del trapianto di isole intraperitoneali. In questo articolo viene descritto il trapianto di isole ricoperte di grasso utilizzando tessuto adiposo epididimale.
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Protocol
La procedura seguente viene eseguita in tre passaggi. Il primo passo include l'induzione del diabete nei topi riceventi e l'isolamento delle isole donatrici. Il secondo passo prevede la preparazione delle isole prima del trapianto. Nella terza fase, viene eseguito il trapianto di isole sul tessuto adiposo epididimo e la copertura delle isole utilizzando il tessuto adiposo. Successivamente, sono stati valutati gli effetti terapeutici. La manipolazione dei topi e le procedure sperimentali eseguite in questo studio sono conformi ai "Principi di cura degli animali da laboratorio" (Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, National Institutes of Health pubblicazione 8° edizione, 2011), e il protocollo sperimentale è stato approvato dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Fukuoka (numero di approvazione: 186018).
1. Preparazione chirurgica
- Induzione del diabete: indurre il diabete in topi maschi riceventi di 20-25 g di peso corporeo, di 8-12 settimane attraverso iniezione endovenosa di 18 mg / ml di soluzione di streptozotocina preparata in tampone citrato 0,1 M (180 mg / kg di peso corporeo). I topi con livelli di glucosio nel sangue superiori a 400 mg / dL sono considerati diabetici. Utilizzare topi diabetici entro 1 settimana dopo l'induzione del diabete prima di un'eccessiva atrofia del tessuto adiposo bianco dell'epididimo per coprire le isole.
- Isolamento delle isole: eseguire l'isolamento delle isole murine un giorno prima del trapianto seguendo il metodo27 di Gotoh per l'isolamento delle isole.
- In breve, digerire il tessuto pancreatico utilizzando la soluzione di collagenasi. Isolare le isole mediante centrifugazione a gradiente di densità utilizzando una soluzione appropriata di separazione cellulare. Quindi isole di coltura durante la notte in un incubatore a 22 ° C e 5% CO2 (la coltura a <37 ° C è stata segnalata per prevenire la morte delle isole 28,29,30,31).
NOTA: Manipolare le colture di isole purificate in un armadio di sicurezza. Filtrare-sterilizzare tutte le soluzioni utilizzate per l'isolamento e la coltura delle isole utilizzando un filtro da 0,22 μm.
2. Preparazione di isole per il trapianto
- Raccogliere gli strumenti e i materiali appropriati come indicato nella Figura 1A.
- Poiché gli enzimi digestivi come l'amilasi e la lipasi possono causare lesioni alle isole isolate e trapiantate e può verificarsi una perdita di isole intrappolate nella contaminazione dei tessuti fibrosi all'interno del piatto di coltura, prima del trapianto, utilizzare una pinza per selezionare manualmente qualsiasi componente extra-insulare dal pancreas, compresi i tessuti acinosi e fibrosi (Figura 1B), sotto un microscopio da dissezione. Dopo la raccolta, utilizzare un filtro cellulare per filtrare le singole cellule acinose.
- Trasferire le isole filtrate in un nuovo piatto di coltura contenente qualsiasi terreno di coltura appropriato o soluzione tampone (ad esempio, DMEM con basso glucosio, RPMI1640, CMRL1066 o HBSS) integrato con siero bovino o albumina per evitare l'attaccamento delle isole alla plastica e ruotare il piatto per posizionare le isole al centro del piatto (Figura 1C). Utilizzando una micropipetta P200 e il microscopio, prelevare le singole isole in un tubo di raccolta appropriato (Figura 1D).
- Posizionare un nuovo filtro cellulare da 40 μm sopra un tubo di plastica da 50 ml (Figura 1E a sinistra e al centro) e lavare il filtro con un mezzo fresco (Figura 1E a destra).
- Utilizzare una pipetta da 1000 μL per aggiungere le isole al filtro per separare le isole e le singole celle acinose (Figura 1 F1 e Figura 1F2).
NOTA: Le isole purificate sul filtro cellulare saranno pure al 100%. - Utilizzare una pinza per capovolgere il filtro su un nuovo piatto di coltura non trattato di dimensioni 60 o 100 mm contenente terreno di coltura o una soluzione tampone appropriata integrata con siero bovino o albumina (figura 1 F3 e figura 1F4). Utilizzare un mezzo / tampone fresco per lavare le isole in un nuovo piatto di coltura. Quindi aggiungere un mezzo / tampone sufficiente al piatto di coltura per raggiungere un volume totale di circa 20 ml.
- Contare le isole al microscopio e dividere equamente il numero di isole tra le singole provette di centrifuga in plastica da 1,5 mL in base al numero di animali donatori (Figura 1G). Ad esempio, duecento, 100-200 μm di isolotti equivalenti (IEQ) da due topi verrebbero aggiunti a ciascuno dei due tubi.
- Centrifugare le isole a 2.100 x g entro 1 minuto a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante. Circa 20-30 μL di soluzione residua rimarranno tipicamente nel tubo (Figura 1H).
3. Trapianto di isole su tessuto adiposo epididimo e copertura con tessuto adiposo bianco epididimo
- Prima dell'intervento, raccogliere una macchina per anestesia per piccoli animali, stereomicroscopio, sorgente luminosa, micropipetta da 50-200 μL con punte per micropipette da 200 μL, tamponi di cotone, un set di sutura 4-0 e strumenti chirurgici disinfettati (Figura 2A). Autoclave le forbici da bottaio, le forbici oftalmiche, le pinze per piselli, le pinzette e i portaaghi. Dopo l'autoclave, immergere l'apparecchiatura in una soluzione di iodio povidone all'1% (Figura 2A). Utilizzare tamponi di cotone per la mobilizzazione del tessuto adiposo bianco epididimo e per l'emostasi in caso di sanguinamento. Utilizzare una micropipetta con punte da 50-200 μL per il trapianto di isole.
- Somministrare l'anestesia al topo ricevente diabetico utilizzando un agente anestetico inalato (isoflurano al 2% in ossigeno). Applicare lubrificante oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire l'essiccazione. Quindi posizionare il mouse in posizione supina (Figura 2B a sinistra) e rimuovere i peli dall'addome per prevenire l'infezione utilizzando tagliacapelli e / o crema depilatoria. Disinfettare l'addome e la regione inguinale utilizzando almeno tre cicli alternati di una soluzione di povidone-iodio seguiti da etanolo al 70% (Figura 2B a destra). Prima dell'intervento, confermare la profondità dell'anestesia attraverso l'assenza di un riflesso del pizzico del piede. Fornire supporto termico intraoperatorio utilizzando una piastra riscaldante e utilizzare un drappo chirurgico per fissare l'area chirurgica sterile.
- Incidere la pelle nella zona mediana inferiore (Figura 2C a sinistra). Si raccomanda un'incisione cutanea di circa 2 cm di lunghezza. Bloccare la parete addominale sinistra con la pinza Pean (è possibile utilizzare anche una pinza atraumatica o un divaricatore) e tirare il tessuto sul lato sinistro del mouse per fissare il campo chirurgico (Figura 2C a destra). Dopo laparotomia, diminuire la percentuale di isoflurano all'1,0-1,5% per il mantenimento dell'anestesia.
- Utilizzare un batuffolo di cotone per mobilitare l'intestino tenue e crasso sul lato destro del mouse (cioè sul lato sinistro dell'operatore). Il tessuto adiposo bianco epididimo sinistro nella cavità addominale si trova nella zona inguinale sinistra. Mobilitare il tessuto adiposo bianco epididimo e il testicolo sinistro all'esterno dell'addome (Figura 2D a sinistra) e allungare il tessuto (2D a destra).
- Utilizzare una micropipetta P200 dotata di una punta di pipetta da 200 μL per raccogliere l'intero volume di isole da un tubo da 1,5 mL con un pipettaggio delicato (Figura 2E a sinistra), avendo cura che non rimangano isole nel tubo al momento della raccolta. Lasciare che le isole raccolte si depositino sulla punta della pipetta per gravità (Figura 2E a destra).
- Posizionare leggermente la punta della micropipetta sul tessuto adiposo disteso. Avendo cura di evitare un eccessivo lavaggio del substrato / tampone nella punta, seminare accuratamente le isole sul tessuto (Figura 2F a sinistra). Dopo la semina, confermare un corretto posizionamento delle isole al microscopio da dissezione (Figura 2F a destra).
- Coprire le isole con il tessuto adiposo bianco epididimo (Figura 2G). Non è necessario l'uso di punti di sutura o agenti bioleganti.
- Posizionare il testicolo sinistro sotto il tessuto adiposo bianco dell'epididimo e riportare i tessuti nella cavità intraperitoneale (Figura 2H). Chiudere la pelle in due strati (peritoneo, poi muscolo e pelle) utilizzando una sutura 4-0 (è possibile utilizzare qualsiasi sutura come nylon o suture assorbibili) (Figura 2I). Iniettare acido acetilsalicilico (300 mg/kg; SQ) vicino alla ferita per analgesia postoperatoria. Quindi posizionare il mouse sotto una lampada di calore e monitorare fino al completo recupero.
4. Monitoraggio dopo trapianto di isole (Riassunto)
- Valutare gli effetti terapeutici del trapianto di isole monitorando la glicemia, il test di tolleranza al glucosio e la valutazione istologica al giorno postoperatorio (POD) 28.
- Monitorare la glicemia, comprese le misurazioni della glicemia al test di tolleranza al glucosio, utilizzando un piccolo misuratore di glucosio.
- Raccogliere i campioni di sangue (un po 'di microlitri) dalla vena della coda. Per quanto riguarda la valutazione istologica, l'insulina murina (per rilevare le isole innestate) e il fattore di von Willebrand (per il rilevamento dei vasi, che è una prova per l'attecchimento delle isole) sono stati rilevati nelle isole trapiantate nel tessuto adiposo epididimo recuperato mediante immunoistochimica.
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Representative Results
Per confrontare l'efficacia del trapianto di isole ricoperte di grasso con quella dopo il trapianto di isole intraperitoneali, lo stesso numero di isole è stato impiantato sul peritoneo nello spazio paracolico sinistro degli animali diabetici riceventi di controllo. I livelli di glucosio nel sangue dei topi con trapianto di isole ricoperte di grasso sono stati osservati diminuire gradualmente e significativamente rispetto ai topi trapiantati di isole intraperitoneali (p = 0,0023; Figura 3A). Un mese dopo il trapianto, la glicemia nei topi con trapianto di isole coperte di grasso è stata mantenuta a livelli inferiori a quelli osservati nei topi trapiantati di isole intraperitoneali come valutato dal test di tolleranza al glucosio intraperitoneale (p = 0,0046; Figura 3B). Inoltre, come abbiamo riferito in precedenza, anche i livelli plasmatici di insulina sono migliorati dopo il trapianto di isole coperte di grasso. È stato confermato anche il ri-innalzamento dei livelli di glucosio nel sangue. Questi dati dimostrano che il trapianto di isole ricoperte di grasso intraperitoneale utilizzando 200 IEQ può migliorare significativamente le condizioni diabetiche dei topi riceventi.
È stato inoltre eseguito un esame istologico per valutare l'attecchimento delle isole nel tessuto adiposo bianco epididimale. Negli animali riceventi di trapianto di isole ricoperte di grasso, la colorazione dell'ematossilina-eosina rivela la presenza di isole all'interno del tessuto adiposo bianco dell'epididimo (Figura 3C, immagine in alto). Inoltre, la colorazione anticorpale coniugata con fluorescenza delle isole insulino-positive ha facilitato la rilevazione di microvasi positivi al fattore di von Willebrand all'interno del tessuto adiposo bianco epididimo di tutti i topi riceventi (n = 6; Figura 3C). Al contrario, nei topi trapiantati di isole intraperitoneali, non sono state osservate isole innestate né nel tessuto adiposo bianco epididimo né nella parete addominale (dati non mostrati).
Figura 1-ABC. Preparazione di isole per il trapianto su tessuto adiposo epididimo e copertura con tessuto adiposo bianco epididimale. (A) Preparazione degli strumenti: a. coadiuvante per pipette, b. 10 mL di punte per pipette, c. 50 mL di tubi di plastica, d. 15 mL di tubi di plastica, e. 50-200 μL (a sinistra) e 200-1000 μL (a destra) di micropipette, f. 1,5 mL di provette di plastica per centrifuga, g. punte di micropipette da 200 e 1000 μL, h. terreno o tampone contenente albumina o siero fetale bovino (cioè DMEM con basso contenuto di glucosio contenente il 10% di siero fetale bovino e 100 U/mL di penicillina + 100 U/mL di soluzione di streptomicina), e i. Filtro cellulare da 40 μm. (B) Isole isolate con tessuti acinosi (a sinistra: indicati da una freccia) e fibrosi (a destra). Barra della scala = 200 μm. (C) Isole raccolte nel tubo di plastica. A sinistra, isolotti dispersi nel piatto di cultura. Centro, gli isolotti sono raccolti al centro del piatto di cultura vorticosamente. A destra, isolotti raccolti al centro del piatto. Barra di scala = 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 1-DEF. Preparazione di isole per il trapianto su tessuto adiposo epididimo e copertura con tessuto adiposo bianco epididimale. (D) Le isole raccolte (a sinistra) vengono trasferite in tubi di plastica da 15 ml (a destra). (E) Il filtro cellulare da 40 μm è posto sopra il tubo di plastica da 50 mL (a sinistra e al centro). Terreno preparato/tampone aggiunto ad un altro tubo di plastica da 50 mL per lavare le isole sul filtro cellulare in un nuovo piatto di coltura (a destra). f) 1. Isole raccolte utilizzando una micropipetta da 200-1000 μL. 2. Isole versate nel filtro cellulare. 3 e 4. Mezzo/tampone utilizzato per lavare le isole sul colino in un nuovo piatto di coltura. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 1-GH. Preparazione di isole per il trapianto su tessuto adiposo epididimo e copertura con tessuto adiposo bianco epididimale. (G) Isole suddivise in provette da centrifuga di plastica da 1,5 mL in base al numero di topi riceventi. Qui, duecento isolotti equivalenti (IEQ) da 100-200 μm sono stati divisi equamente in ciascun tubo. (H) Isole divise equamente in provette da 1,5 mL prima della centrifugazione (a sinistra). Isolotti centrifugati per raccogliere sul fondo del tubo (al centro). 20-30 μL di surnatante rimangono nel tubo dopo aver scartato la soluzione in eccesso (a destra). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2-ABC. La procedura di trapianto di isole su tessuto adiposo epididimo e copertura utilizzando tessuto adiposo bianco epididimale. (A) Preparazione di strumenti: a. macchina per anestesia per piccoli animali, b. stereomicroscopio, c. sorgente luminosa, d. strumenti chirurgici disinfettati, e. isole divise in tubi di plastica da 1,5 ml, f. micropipette da 50-200 μL, g. punte per micropipette da 200 μL e suture h. 4-0. (B) Topo ricevente diabetico in posizione supina in anestesia generale con isoflurano al 2% (a sinistra). L'addome e la regione inguinale vengono disinfettati utilizzando etanolo al 70% e coperti da una salvietta da laboratorio di carta (a destra). (C) La pelle è incisa in posizione mediana inferiore (a sinistra). La parete addominale sinistra è bloccata da una pinza Pean e tirata sul lato sinistro del mouse per proteggere il campo chirurgico (a destra). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2-DEF. La procedura di trapianto di isole su tessuto adiposo epididimo e copertura utilizzando tessuto adiposo bianco epididimale. (D) Il tessuto adiposo bianco epididimo sinistro e il testicolo sinistro sono mobilizzati all'esterno dell'addome (a sinistra) e distesi (a destra). Barra scala = 1 cm. (E) Le isole in tubi di plastica da 1,5 ml vengono completamente raccolte utilizzando una micropipetta con punta della pipetta da 200 μL (a sinistra). Le isole raccolte (indicate dalla freccia) hanno permesso di affondare completamente per gravità sulla punta della pipetta (a destra). (F) Punta di micropipetta leggermente posizionata sul tessuto adiposo disteso (a sinistra). Semina di isole (cerchio tratteggiato) sul tessuto confermata dal microscopio da dissezione (a destra). Barra della scala = 1 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2-GHI. La procedura di trapianto di isole su tessuto adiposo epididimo e copertura utilizzando tessuto adiposo bianco epididimale. (G) Le isole sono ricoperte di tessuto adiposo bianco epididimale. (H) Il testicolo sinistro e il tessuto adiposo bianco epididimo sono tornati nella cavità intraperitoneale. (I) Immagine dopo la chiusura dell'addome. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3. L'effetto terapeutico del trapianto di isole ricoperte di grasso. (A) Livello di glucosio nel sangue. Linea blu: trapianto di isole ingrassate (n = 6); Linea arancione: trapianto di isole intraperitoneali (n = 6) L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando l'analisi della varianza con misure ripetute e una differenza significativa è stata definita come p < 0,05. (B) Livello di glucosio nel sangue dal test di tolleranza al glucosio un mese dopo il trapianto. Linea blu: trapianto di isole ingrassate (n = 6); Linea arancione: trapianto intraperitoneale di isole (n = 6). L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando misure ripetute di analisi della varianza e una differenza significativa è stata definita come p < 0,05. (C) Immagine istologica delle isole innestate un mese dopo il trapianto. Immagine in alto: colorazione dell'ematossilina-eosina; Immagine in basso: immunoistocolorazione per insulina murina (verde) e fattore di von Willebrand (vWF: rosso, indicato da una freccia bianca). Barra di scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Il metodo di trapianto di isole ricoperte di grasso incorpora tecniche di due diverse tecniche di trapianto: trapianto di isole intraperitoneali e trapianto di isole di tessuto intra-adiposo. Poiché la membrana superficiale del tessuto adiposo bianco dell'epididimo è considerata il tessuto adiposo bianco coperto dal peritoneo e che è attaccato all'epididimo, il metodo di trapianto di isole ricoperte di grasso può essere anatomicamente classificato come un tipo di trapianto di isole intraperitoneali. La tecnica con cui le isole vengono consegnate all'animale ricevente, tuttavia, è più simile a quelle utilizzate nel trapianto di isole di tessuto intra-adiposo. I nostri dati mostrano che l'effetto terapeutico del metodo di trapianto di isole ricoperte di grasso è superiore a quello del trapianto di isole intraperitoneali. Il nostro studio precedente ha anche dimostrato che l'efficacia del trapianto di questo metodo è quasi uguale a quella del trapianto di isole subcapsulari renali, un metodo di trapianto di isole con un'efficacia suprema del trapianto23. Si ipotizza che l'utilità di questo metodo possa essere dovuta alle molecole di adesione presenti all'interno dei tessuti adiposi bianchi e delle adipocitochine e che si pensa contribuiscano all'attecchimento delle isole10,23.
La dimensione del tessuto adiposo bianco dell'epididimo consente di ospitare un grande volume di isole. Al contrario, il roditore maggiore omento è troppo piccolo per contenere facilmente e accedere a molti isolotti. L'unica limitazione fisica del tessuto adiposo bianco epididimo come potenziale sito sperimentale di trapianto di isole è che non fornisce una circolazione portale di insulina10.
Il metodo è unico perché le isole sono coperte di tessuto adiposo, invece di essere direttamente infuse nel tessuto. Le isole trapiantate di tessuto intra-adiposo possono soffrire dell'influenza della lipotossicità, poiché la funzione insulinica compromessa negli animali diabetici può portare a un eccesso di acidi grassi liberi32. Questo metodo inoltre non richiede agenti di biolegame o sutura per prevenire la perdita di isole impiantate. Come osservato nella Figura 3C, le isole rimangono innestate con successo all'interno del tessuto adiposo fino a 1 mese dopo il trapianto e il mantenimento del livello di glucosio nel sangue è stato confermato dopo la graftectomia23. Questo fenomeno può essere dovuto alla capacità del tessuto adiposo di intrappolare le isole, che diventano difficili da staccare.
I vantaggi di questo metodo sono che è tecnicamente facile da eseguire, consente una valutazione metabolica e istologica degli effetti terapeutici delle isole e facilita la valutazione dell'espressione genica e/o proteica delle isole dopo graftectomia. Rispetto agli studi precedenti, l'efficacia di questo metodo non è inferiore a quella del trapianto di isole nel tessuto adiposo bianco epididimo 10,33,34,35,36. È importante notare che una semina precisa delle isole sul tessuto adiposo bianco dell'epididimo senza perdita di isole è necessaria per un attecchimento di successo. Per garantire il successo, l'intero volume delle isole deve essere aspirato delicatamente nella punta della micropipetta dal tubo di plastica da 1,5 ml, poiché il pipettaggio ruvido e rapido può causare l'adesione dell'isolotto alle pareti del tubo di plastica, rendendo difficile l'erogazione. L'adesione delle isole è una delle ragioni principali per la semina inadeguata delle isole. Dopo aver permesso alle isole di depositarsi sulla punta della punta della micropipetta, le isole devono essere impiantate sul tessuto adiposo epididimo senza arrossamento. È importante ridurre al minimo la depressione del pulsante dello stantuffo durante l'aspirazione e l'erogazione delle isole per evitare un eccessivo lavaggio del tessuto adiposo. Pertanto, è essenziale attendere che le isole si siano completamente aggregate sulla punta della punta della micropipetta prima di premere il pulsante dello stantuffo della micropipetta per l'impianto. È sufficiente posizionare leggermente la punta sul tessuto adiposo e confermare la semina di isole sul tessuto mediante microscopia ottica.
In conclusione, questo metodo è molto semplice, nonostante richieda diversi passaggi critici per il suo successo. Speriamo nell'ampia adozione di questo metodo per aiutare ulteriormente nella facilitazione dell'attecchimento delle isole sul tessuto adiposo bianco e per un'ulteriore valutazione degli effetti terapeutici delle isole bioingegnerizzate.
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Disclosures
Non abbiamo alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo studio è stato finanziato da un Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (19K09839, NS) del Ministero dell'Istruzione, della Cultura, dello Sport, della Scienza e della Tecnologia del Giappone.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 Nylon | Alfresa | ER2004NA45-KF2 | Closing abdomen |
| Alexa 488-conjugated donkey anti-guinea pig | Jackson Immunoresearch | 706-546-148 | Secondary antibody for insulin antibody |
| Alexa 647-conjugated donkey anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-606-152 | Secondary antibody for von Willebrand factor antibody |
| DMEM, low glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11885084 | Culturing islets, transplanting islets |
| Eosin | Fujifilm Wako Chemicals | 051-06515 | Using for staining tissue by eosin |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Collecting islets |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352095 | Collecting islets |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Using for separating islets from other pancreatic tissue |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | Discarding excessive medium/buffer |
| Guinea pig anti-insulin | Agilent Technologies Japan, Ltd. (Dako) | IR002 | Primary antibody for murine insulin |
| Hematoxylin | Muto Pure Chemicals Co., Ltd. | 30002 | Using for staining tissue by hematoxylin |
| Isodine solution 10% | Shionogi&Co., Ltd. | no catalog number | Using for disinfection |
| Isoflurane | Fujifilm Wako Chemicals | 095-06573 | Using for anesthesia |
| Labcon 1000 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips | Labcon | 1177-965-008 | Using for separating islets from other pancreatic tissue |
| Labcon 200 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips | Labcon | 1179-965-008 | Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue |
| Mintsensor | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co. Ltd., | 8AEB02E | Using for monitoring blood glucose |
| Pipetteman P-1000 | Gilson | F123602 | Using for separating islets from other pancreatic tissue |
| Pipetteman P-200 | Gilson | F123601 | Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue |
| Rabbit anti-vWF | Abcam | ab6994 | Primary antibody for murine von Willebrand factor |
References
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