Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

संयुक्त ओजोन और एलपीएस प्रेरित मुरीन तीव्र फेफड़ों की चोट के दौरान फेफड़ों के सेलुलर अनुकूलन की कल्पना

Published: March 21, 2021 doi: 10.3791/62097
Automatic Translation
1, 1, 1
1Small Animal Clinical Sciences, Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan

Summary

संयुक्त ओजोन और बैक्टीरियल एंडोटॉक्सिन उजागर चूहों को न्यूट्रोफिल सहित व्यापक प्रसार कोशिका मृत्यु दिखाई देती है। हमने सेलुलर अनुकूलन जैसे साइटोस्केलेटल लैमेलिपोडिया में व्यवधान, जटिल वी एटीपी सिंथास सबयूनिट β की सेलुलर अभिव्यक्ति और ब्रोनचो-अल्वेलर लावाज में एंजियोस्टैटिन, फेफड़ों की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का दमन और न्यूट्रोफिल भर्ती में देरी जैसे सेलुलर अनुकूलन देखा।

Abstract

फेफड़ों को लगातार बाँझ (कणों या प्रतिक्रियाशील विषाक्त पदार्थों) और संक्रामक (बैक्टीरियल, वायरल या फंगल) भड़काऊ स्थितियों के रूप में प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष अपमान का सामना करना पड़ता है। एक भारी मेजबान प्रतिक्रिया के परिणामस्वरूप श्वसन और तीव्र फेफड़ों की चोट हो सकती है, जो पाथो-तार्किक मेजबान प्रतिरक्षा, कोआ गुलाटीव और ऊतक रीमॉडलिंग प्रतिक्रिया के परिणामस्वरूप फेफड़ों के न्यूट्रोफिल भर्ती की विशेषता है। कम खुराक (0.05 पीपीएम) ओजोन, बैक्टीरियल लिपोपोलीसैकराइड, एक टीएलआर 4 एगोनिस्ट के संयोजन में एक शक्तिशाली पर्यावरण प्रदूषक, मेजबान भड़काऊ और मरम्मत तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं, कम खुराक (0.05 पीपीएम) ओजोन के जवाब में, मुरीन फेफड़ों के सेलुलर अनुकूलन की कल्पना और मात्रा निर्धारित करने के लिए संवेदनशील सूक्ष्म तरीके महत्वपूर्ण हैं। हम विभिन्न फेफड़ों और प्रणालीगत शरीर के डिब्बों के एक व्यापक फ्लोरोसेंट सूक्ष्म विश्लेषण का वर्णन करते हैं, अर्थात् ब्रोन्चो-अल्वेलर लावेज तरल पदार्थ, फेफड़ों के संवहनी परफ्यूसेट, बाएं फेफड़ों के क्रायोस्क्यूक्शन, और स्टर्नल बोन मैरो परफ्यूसेट। हम अल्वोलार मैक्रोफेज, न्यूट्रोफिल, फेफड़ों के पैरेंचिमल ऊतक, साथ ही अस्थि मज्जा कोशिकाओं को देरी (36-72 घंटे तक) प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के साथ संबंध में नुकसान दिखाते हैं जो विश्लेषण किए गए डिब्बों में असतत केमोकीन ग्रेडिएंट द्वारा चिह्नित होता है। इसके अलावा, हम फेफड़ों के एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स और सेलुलर साइटोस्केलेल इंटरैक्शन (ऐक्टिन, ट्यूबलिन), माइटोकॉन्ड्रियल और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां, एंटी-कोआ गुलाटिवेव प्लाज्मिनोजेन, इसका एंटी-एंजियोजेनिक पेप्टाइड टुकड़ा एंजियोस्टैटिन, माइटोकॉन्ड्रियल एटीपी सिंथेस कॉम्प्लेक्स वी सबयूनिट, α और β पेश करते हैं। ये सरोगेट मार्कर, जब पर्याप्त इन विट्रो सेल-आधारित परख के साथ पूरक होते हैं और वीवो पशु इमेजिंग तकनीकों जैसे इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी में, उपन्यास इम्यूनोमोडुलेटरी एजेंटों के फेफड़ों की प्रतिक्रिया को समझने की दिशा में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकते हैं।

Introduction

तीव्र फेफड़ों की चोट (अली) संक्रामक या अन्य हानिकारक उत्तेजनाओं के लिए फेफड़ों की एक महत्वपूर्ण रोगात्मक प्रतिक्रिया है जो कोआ गुलाटीव, फाइब्रिनोलिटिक और जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली1के एक साथ सक्रियण द्वारा चिह्नित है। न्यूट्रोफिल टोल जैसे रिसेप्टर (टीएलआर) परिवार2, 3, 4के माध्यम से माइक्रोबियल के साथ-साथ इंट्रासेलुलर क्षति पैटर्न को तुरंतसमझतेहैं। न्यूट्रोफिल प्रीफॉर्म साइटोकिन्स और साइटोटॉक्सिक ग्रैन्यूल सामग्री जारी करते हैं, जो तब संपाश्र्वक ऊतक क्षति का कारण बन सकते हैं। आगामी अल्वोलार क्षति माध्यमिक कोशिका मृत्यु के साथ होती है जिससे एडेनोसाइन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) 5 जैसे अणुओं को रिहा कियाजाताहै, इस प्रकार प्रतिरक्षा-डिस्रेगुलेशन के दुष्चक्र में स्थापित होता है।

अली की समझ में एक अनसुलझी समस्या इस सवाल से संबंधित है कि अल्वेलर झिल्ली के भीतर चोट कैसे शुरू की जाती है। इलेक्ट्रॉन परिवहन परिसर वी, F1F0 एटीपी सिंथेस, एक माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन है जिसे सूजन के दौरान कोशिका (एंडोथेलियल, ल्यूकोसिट, एपिथेलियल सहित) प्लाज्मा झिल्ली पर सर्वव्यापी रूप से व्यक्त किया जाता है। सेल साइटोस्केलेटन जिसमें ऐक्टिन और ट्यूबलिन शामिल है, क्रमशः कई सेल आकार और कार्य मॉड्यूलिंग के साथ-साथ माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन को बंदरगाह करता है। हमने हाल ही में दिखाया है कि एक अंतर्जात अणु, एंजियोस्टैटिन, मौन न्यूट्रोफिल भर्ती, सक्रियण और लिपोपॉलिसाकराइड (एलपीएस) द्वारा एटीपी सिंथेस की नाकाबंदी फेफड़ों की सूजन6प्रेरित । इस प्रकार, दोनों जैव रासायनिक (एटीपी सिंथेस) और प्रतिरक्षा (TLR4) तंत्र फेफड़ों की सूजन के दौरान अल्वियोलर बाधा को विनियमित कर सकते हैं ।

ओजोन (ओ3),एक पर्यावरण प्रदूषक, फेफड़ों के कार्य को ख़राब करता है, फेफड़े के संक्रमण के प्रति संवेदनशीलता बढ़ाता है, और ओ3 एक्सपोजर के छोटे निम्न स्तर अंतर्निहित कार्डियोरेस्पिरेटरी स्थितियों7,8,9,10, 11,12, 13,14के साथ उन लोगों में मृत्यु के जोखिम को बढ़ाते हैं। इस प्रकार , ओ3 की शारीरिक रूप से प्रासंगिक सांद्रता के संपर्क में आने से सूजन के मौलिक तंत्रों का अध्ययन करने के लिए अली का एक सार्थक मॉडल प्रदान करता है7,8. हमारी प्रयोगशाला ने हाल ही में कम खुराक ओ3 प्रेरित अली15का एक मुरीन मॉडल स्थापित किया है । कम ओ 3 सांद्रता के लिए एक खुराक और समय-प्रतिक्रिया करने के बाद, हमनेदेखा कि 2 घंटे के लिए 0.05 पीपीएम ओ3 के संपर्क में, फेफड़ों की तीव्र चोट को प्रेरित करता है जो फेफड़ों के एटीपी सिंथेस कॉम्प्लेक्स वी सबयूनिट β (एटीपी) और एंजियोस्टैटिन अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित है, एलपीएस मॉडल के समान। इंट्राविटल फेफड़ों इमेजिंग से फेफड़ों के नुकसान का संकेत देने वाले अल्वेलर ऐक्टिन माइक्रोफिलामेंट्स के विघटन का पता चला, और अल्वेलर सेप्टल प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के स्तर (बेसलाइन सेल सिग्नलिंग के उन्मूलन का संकेत) और माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (तीव्र कोशिका मृत्यु का संकेत) 0.05 पीपीएम ओ3 15के 2 एच एक्सपोजर के बाद जो विषम फेफड़े18 एफडीजी रिटेंशन16,न्यूट्रोफिल भर्ती और साइकोकिन रिलीज के साथ सहसंबद्ध है। सबसे विशेष रूप से आईएल-16 और एसडीएफ-1α। हमारे हाल के अध्ययनों से ले घर संदेश यह है कि ओ3 तेजी से उच्च विषाक्तता पैदा करता है जब मानव जोखिम के लिए 8 घंटे (प्रति दिन) से अधिक ०.०६३ पीपीएम की अनुमति सीमा से नीचे सांद्रता पर उजागर । महत्वपूर्ण बात यह है कि इस बारे में कोई स्पष्ट समझ मौजूद नहीं है कि क्या ये उप-नैदानिक ओ3 एक्सपोजर टीएलआर 4-मध्यस्थता तंत्र को मिलाना कर सकते हैं जैसे बैक्टीरियल एंडोटॉक्सिन17द्वारा। इस प्रकार, हमने दोहरी-हिट ओ3 और एलपीएस एक्सपोजर मॉडल का अध्ययन किया और प्रतिरक्षा और गैर-प्रतिरक्षा सेलुलर अनुकूलन देखा।

हम विभिन्न फेफड़ों और प्रणालीगत शरीर के डिब्बों के एक व्यापक फ्लोरोसेंट सूक्ष्म विश्लेषण का वर्णन करते हैं, अर्थात् ब्रोनचो-अल्वेलर लावेज तरल पदार्थ (यानी, बाल) जो अल्वोलार रिक्त स्थान, फेफड़ों के संवहनी परफ्यूसेट (यानी, एलवीपी) के नमूने लेते हैं जो एक समझौता एंडोथेलियल बैरियर की स्थिति में पल्मोनरी वैक्यूलेचर और अल्वेलर सेप्टल इंटरस्टिटियम का नमूने लेते हैं, फेफड़ों के क्रायोसेक्शन छोड़ दिया जाता है, जो लावग्ड फेफड़ों के ऊतकों में छोड़ दिया निवासी पैरान्चिमल और अनुयायी ल्यूकोसाइट्स को देखने के लिए , परिधीय रक्त जो परिसंचारी ल्यूकोसाइट्स और स्टर्नल और फीमर बोन मैरो का प्रतिनिधित्व करता है जो सूजन के दौरान हेमेटोपोइटिक सेल जुटाने के समीपस्थ और डिस्टल साइटों का नमूना लेता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

अध्ययन डिजाइन साकटचेवान पशु अनुसंधान नैतिकता बोर्ड के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था और मानवीय पशु उपयोग के लिए पशु देखभाल दिशा निर्देशों पर कनाडा परिषद का पालन किया । छह-आठ सप्ताह पुराने पुरुष C57BL/6J चूहों की खरीद की गई । नोट: किसी भी जानवर जो गंभीर सुस्ती, श्वसन संकट या अनुसूचित अंत बिंदु से पहले गंभीर संकट के अन्य संकेत विकसित इच्छामृत्यु ।

नोट: निम्नलिखित तैयार करें: 27-18 जी सुई-कुंद (माउस श्वासनली व्यास पर निर्भर करेगा), कुंद सुई को फिट करने के लिए उचित रूप से पीई ट्यूबिंग आकार (हर माउस के लिए पीई कैनुला बनाएं), कैनुला, 2 तेज कैंची, 2 कुंद संदंश (छोटे), 1 तेज संदंश (छोटे), 3 1 एमएल सीरिंज, लेबल माइक्रोफ्यूज ट्यूब (बाल, रक्त, संवहनी और बोन मैरो परफ्यूसेट संग्रह के लिए) और लेबलेड शीशियों (ऊतक निर्धारण के लिए), नमूना बैग/ऊतक संग्रह के लिए क्रायोवियल, कसाई के कपास धागे रोल (पर्याप्त आकार के चित्र में कटौती) । प्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी रसायन सामग्री तालिका में दर्शाए जाते हैं।

1. मुरीन फेफड़ों की चोट को शामिल करने के लिए ओजोन और एलपीएस एक्सपोजर

  1. ओजोन एक्सपोजर
    1. एक कस्टम ओ3 इंडक्शन बॉक्स तैयार करें। माउस फ़ीड, पानी की बोतल, संवर्धन खिलौने और स्वच्छ बिस्तर क्रम में जोड़ें और चूहों के आवास पर्यावरण की नकल करें।
      नोट: ये कदम यह सुनिश्चित करेंगे कि चूहों को कस्टम इंडक्शन बॉक्स में रखे जाने पर भोजन और पानी तक मुफ्त पहुंच प्राप्त हो और अनुचित तनाव को कम करने में मदद मिलेगी।
    2. हाथ से पहले यूवी लैंप को स्थिर करने के लिए ओ3 कैलिब्रेटर/जनरेटर "ऑन" (इनलेट पोर्ट की ओर रखा गया) स्विच करें और इन-लाइन ओ3 मॉनिटर से जुड़ें।
      नोट: ओ3 मॉनिटर 0.05 पीपीएम के एक औसत पढ़ना चाहिए, के रूप में लगातार चैंबर हवा के तापमान (72 ±3 डिग्री एफ) और सापेक्ष आर्द्रता (50±15%)
    3. ओ3 एक्सपोजर के लिए, धीरे-धीरे चूहों को कस्टम इंडक्शन बॉक्स में रखें और चूहों को 2 घंटे के लिए 0.05 पीपीएम ओ3 में लगातार बेनकाब करें।
  2. एनेस्थीसिया और इंट्रानासल एलपीएस प्रशासन
    1. केटामाइन और जाइलाजिन के लिए 10 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक अलग से तैयार करें ।
    2. केटामाइन के 20 पार्ट्स और जाइलाजिन के 1 पार्ट को मिलाकर कॉकटेल तैयार करें। यदि माउस का वजन एक्स जी है, तो केटामाइन/जाइलाज़ीन कॉकटेल के एमएल को पेरिटोनियल गुहा में इंजेक्ट करें (X/200) एमएल । एक माउस के लिए, कॉकटेल के 1 एमएल तैयार करें जिसमें 10 मिलीग्राम/एमएल केटामाइन स्टॉक के 1000 माइक्रोन और जाइलाज़ीन स्टॉक के 50 माइक्रोन शामिल हैं। माइक्रोफ्यूज ट्यूब में ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह से मिलाएं।
      नोट: केटामाइन और जाइलाज़ीन स्टॉक्स को एक सप्ताह पहले तैयार किया जा सकता है।
    3. प्रकाश इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) केटामाइन (50 मिलीग्राम/किलो) /जाइलाज़ीन (1 मिलीग्राम/किलो) मिश्रण (उदाहरण के लिए, 25 ग्राम माउस के लिए, कॉकटेल के 0.125 मिलीएल इंजेक्ट) के तहत चूहों को एनेस्थेटाइज करें।
    4. एलपीएस का 1 मिलीग्राम/एमएल समाधान तैयार करें, खारे में, और एक पिपेट में समाधान के 50 μL भरें।
    5. हथेली पर अपनी पीठ/पृष्ठीय पक्ष के साथ माउस को सीधा रखें, एक ही हाथ से कान पकड़े । अब, एलपीएस समाधान के 50 माइक्रोन रखें18 धीरे से बाहर नथुने (यानी, प्रत्येक नथुने पर 25 माइक्रोन या एक नथुने में 50 माइक्रोन; जब तक प्रक्रिया जल्दी है तब तक कोई फर्क नहीं पड़ता) और चूहों को एलपीएस समाधान को श्वास लेने की अनुमति दें।
    6. बाँझ खारा के 50 माइक्रोन के साथ चूहों को नियंत्रित करें।
      सावधानी:पैदा करने के लिए 100 माइक्रोल से अधिक न करें, जो घातक हो सकता है। एक मात्रा (यानी, <50 μL) का बहुत कम है और केवल नाक जमाव का खतरा है।
    7. एलपीएस प्रशासन के बाद, धीरे चूहों नीचे रखना, या तो उनके पेट पर या उनके सिर के साथ बिस्तर के टीले पर उनकी पीठ थोड़ा नीचे angled ।
      नोट: यह अभिविन्यास नाक गुहा19में समाधान की अवधारण को बढ़ाता है ।
    8. एक्सपोजर के बाद 0, 2, 4, 24, 36 और 72 घंटे में, चूहों को केटामाइन (200 मिलीग्राम/किलो) /जाइलाज़ीन (4 मिलीग्राम/किलो) मिक्स (यानी, एक्स/50 एमएल कॉकटेल में माउस वजन या 0.50 एमएल में 25 g माउस के लिए) की पूरी खुराक के साथ एनेस्थेटाइज करें।
    9. माउस का निरीक्षण करें जब तक कि यह चेतना खो न दे और सही पलटा (यानी, जब रीढ़ की स्थिति में रखा जाता है) वापस नहीं जाता है। अब, संज्ञाहरण की गहराई के लिए माउस की जांच करें, श्वास (लयबद्ध छाती यात्रा) और हृदय गति की निगरानी करके, जो 1-2 मिनट के बाद काफ़ी गिर जाना चाहिए।
    10. इसके बाद, पेडल सजगता की जांच करें यानी, हिंद-अंग अंकों में से किसी को चुटकी लें और अंग के पीछे हटने के लिए एक पलटा के रूप में देखें। यदि माउस प्रतिक्रिया करता है, तो आवश्यकतानुसार अतिरिक्त 0.1 एमएल इंजेक्शन या उससे अधिक के साथ टॉप-अप करें।
      नोट: गहरी संज्ञाहरण को प्राप्त करने के लिए, ध्यान रखें कि कुछ उपभेदों या मोटापे से ग्रस्त चूहों में आमतौर पर वितरण की एक बड़ी मात्रा होती है और इस प्रकार आसानी से अधिक डोज किया जा सकता है, यदि पूर्ण संज्ञाहरण के लिए पर्याप्त समय की अनुमति नहीं है (जो लगभग 10 मिनट या उससे अधिक हो सकती है)। तदनुसार, कुछ उपभेदों संज्ञाहरण के लिए प्रतिरोधी हो सकता है और इस तरह अधिक शीर्ष अप की आवश्यकता होती है । यह ज्ञान विभिन्न उपभेदों और उम्र के चूहों के साथ कई व्यावहारिक टिप्पणियों और अनुभव के बाद प्राप्त किया जाता है। चूंकि ओ 3 और एलपीएस एक्सपोजर(यानी, 2 एच टाइम-पॉइंट पर) के तुरंत बाद कुछ प्रायोगिक प्रयोग भी किए गए थे, इसलिए हमने संयुक्त ओ3और एलपीएस एक्सपोजर के तात्कालिक प्रभावों को उजागर करने के लिए उन प्रयोगों से कुछ बहुत जल्दी बाल सेल विश्लेषण भी शामिल किया।

2. नमूना संग्रह

  1. सर्जिकल ट्रे पर माउस रखें। अब, तरल पदार्थ के नुकसान से बचने के लिए दोनों आंखों पर चिकनाई आंख मरहम धीरे से रखें और 70% इथेनॉल स्प्रे के साथ माउस को साफ करें।
    1. श्वासनली और छाती को बेनकाब करने के लिए कैंची के साथ ऊपरी और निचली त्वचा झिल्ली के माध्यम से छोटे कटौती करें।
    2. स्टर्नम के ठीक नीचे एक कट बनाएं और दिल को बेनकाब करें।
  2. कार्डियक पंचर
    1. सही वेंट्रिकल में हेपरिनाइज्ड सिरिंज से जुड़ी 25G सुई रखें और कार्डियक पंचर द्वारा रक्त खींचें।
      नोट: रक्त आमतौर पर न्यूनतम प्लंजर ड्रा के साथ खींचता है, अगर हृदय पंचर के लिए दिल को उजागर करने से समय एक मिनट के तहत है । लगभग 0.4-0.5 एमएल इकट्ठा करने के बाद, शेष रक्त एकत्र करने से पहले कुछ सेकंड के लिए रुकने की आवश्यकता हो सकती है। यह दिल सही वेंट्रिकुलर कक्ष में किसी भी शेष मात्रा पंप जाने के लिए किया जाता है । रक्त संग्रह के अंत तक, दिल पंप करने के लिए बंद हो जाता है।
    2. रक्त को इकट्ठा करें और आगे की प्रक्रिया के लिए माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में स्टोर करें।
  3. ट्रेकोस्टोमी
    1. ध्यान से चिमटी का उपयोग करें/कुंद संदंश के लिए दूर overlying ऊतक से श्वासनली क्षेत्र साफ । रक्तस्राव से बचने के लिए सर्जिकल उपकरणों की तुलना में दस्ताने हाथों का अधिक उपयोग करें। यदि बहुत सारा खून बह रहा है, तो बाल नमूनों को दूषित करने का खतरा है। यदि आवश्यक हो, तो कपास झाड़ू का उपयोग करें, हालांकि पसंद नहीं है। किमवाइप्स बेहतर विकल्प हैं।
    2. अब, फेफड़ों को बेनकाब करने के लिए रिबकेज के माध्यम से काटें। फिर, स्टर्नम और इंटरकोस्टल धमनियों या आरोही महाधमनी को काटने के लिए सतर्क न रहें; रिब पिंजरे के माध्यम से आगे बढ़ते हुए छोटे कटौती करें)
    3. श्वासनली स्निप के नीचे एक सूती लिगेचर पास करें और समय के लिए छोड़ दें।
    4. डिस्टल 1/3भाग में एक उपयुक्त स्थान पर श्वासनली स्निप, फेफड़ों की ओर इशारा करते हुए, एक 28 जी श्वासनली कैनुला के लिए उपयोग की अनुमति देने के लिए ।
    5. श्वासनली में 28 ग्राम पीई कैनुला (3-5 मिमी की न्यूनतम लंबाई और प्रविष्टि की आसानी के लिए छंटनी की गई डिस्टल एंड) डालें। विभाजन से पहले श्वासनली के अंत के लिए बाहर देखो और फिर केवल एकल पालि नमूना से बचने के लिए एक मिमी के बारे में वापस खींच ।
    6. मजबूती से, कैनुला को जगह में रखने के लिए कपास लिगेचर बांधें। कैनुला को न गिराएँ।
  4. ब्रोंचो-अल्वेलर लावगे (बाल)
    1. 1 एमएल सिरिंज में पीबीएस का 0.5 एमएल भरें।
    2. अब धीरे-धीरे 1 मिलील सिरिंज की मदद से 0.5 एमएल पीबीएस को कैनुला में इंजेक्ट करें।
    3. पीबीएस इंजेक्शन लगाने के बाद, जब तक यह सक्शन का विरोध नहीं करता है, तब तक सिरिंज को बाहर निकालें।
      नोट: यदि बाल द्रव को बाहर निकालते समय प्रतिरोध है, तो यह अल्वेलर या ब्रोंकियल ऊतक के पतन को इंगित करता है। उस मामले में, कैनुला को ऊतक की दीवारों के रूप में अलग करने के लिए एक लघु द्वारा कैनुला को वापस खींचें।
    4. एक लेबल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में एस्पिरेटेड तरल पदार्थ ले लीजिए और बर्फ पर जगह है।
    5. एक ही शीशी में इकट्ठा इसी तरह के फैशन में दो और lavages प्रदर्शन (यानी, 0.5 X 3 = 1.5 एमएल लावगे की कुल)।
    6. एकत्र बाल तरल पदार्थ की मात्रा को मापें। लावगे रिकवरी 90% के करीब होनी चाहिए।
  5. फेफड़ों के संवहनी परफ्यूसेट (एलवीपी)
    1. वक्ष और पेट के हिस्सों के बीच एक स्थान पर उतरते वक्ष महाधमनी को काटें, ताकि सही वेंट्रिकल के माध्यम से परफसिंग करते हुए फेफड़ों में परफ्यूसेट के किसी भी बैक-अप से बचा जा सके।
    2. कट महाधमनी अंत के पास गुहा दाग, रक्त से मुक्त।
    3. इसके बाद, सही वेंट्रिकल के माध्यम से इंजेक्शन कमरे-अस्थायी हेपरिनाइज्ड खारा के 0.5 एमएल के साथ फेफड़ों को छिद्रित करें।
    4. एक माइक्रोफ्यूज ट्यूब में, उतरते वक्ष महाधमनी के कट अंत में गुहा से संवहनी perfusate ले लीजिए, बर्फ पर रखा और इसकी मात्रा को मापने।
    5. ट्रेकिया (सूती धागे के साथ) से इसकी शाखाओं में बंटी करने के लिए सही ब्रोंकस समीपस्थ लिगेट करें।
  6. सीटू बाएं फेफड़ों के निर्धारण में
    1. एक 1 एमएल सिरिंज को श्वासनली कैनुला से कनेक्ट करें, जो पिछले श्वासनली चीरा के माध्यम से डालने के लिए काफी लंबा है।
    2. 0.6 एमएल मार्क तक सिरिंज में वापस हवा खींचें।
    3. फिर, कमरे के तापमान पर 2% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ शेष सिरिंज (बहुत अंत तक) भरें। सुनिश्चित करें कि प्लंजर कैनुला से किसी भी हवा को वापस चूसने के बिना बाहर पॉप करने के लिए तैयार है।
    4. अब, एक स्कॉच टेप के साथ सिरिंज प्रत्यय, एक ईमानदार कंटेनर के लिए, 20 सेमी ऊंचाई तक मापा ।
    5. धीरे-धीरे, प्लंजर को बाहर निकालने के लिए बाहर निकालें ताकि सुधार की ओर स्थिर प्रवाह हो सके। यदि कैनुला में कुछ हवा के बुलबुले हैं, तो धीरे-धीरे सिरिंज के शीर्ष पर प्लंजर रखें और तरल पदार्थ कुछ सेकंड के बाद प्रवाहित होना शुरू हो जाएगा।
    6. बाएं फेफड़े को 20 सेमी पानी के कॉलम को बनाने वाली 20 सेमी ऊंचाई से 5 मिनटके लिए, सीटू में अपनी कुल क्षमता तक फुलाने दें।
    7. इस प्रक्रिया के दौरान, दाहिने फेफड़ों के लोब्स को पैराफॉर्मलडिहाइड के संपर्क में आने से बचाना सुनिश्चित करें क्योंकि यह डाउनस्ट्रीम परख को प्रभावित करेगा।
    8. किसी भी पैराफॉर्मलडिहाइड को अवशोषित करने के लिए मुड़ा हुआ प्रयोगशाला ऊतक रखें जो सही फेफड़ों के पालि के संपर्क में आ सकता है।
      सावधानी: पैराफॉर्मल्डिहाइड अत्यधिक विषाक्त है। इसलिए, श्वास न लें या शरीर के किसी भी उजागर हिस्सों से संपर्क न करें। हैंडलिंग करते समय अत्यधिक सावधानी बरतें।
    9. पैराफॉर्मलडिहाइड इन्सिलेशन के समय, पेट को साफ करें।
    10. सही फेफड़ों के लोब्स को ट्रेकिया से काट लें जिससे किसी भी धागे को हटाना सुनिश्चित हो और तुरंत एक लेबल वाले क्रायोवियल में लोब्स डाल दें और इसे डाउनस्ट्रीम मॉलिक्यूलर/बायोकेमिकल साइटोकिन एनालिसिस/आरटी-पीसीआर/वेस्टर्न ब्लॉट एनालिसिस ऑफ फेफड़ों के समरूपता के लिए लिक्विड नाइट्रोजन में छोड़ दें ।
    11. किसी भी कनेक्टिव ऊतक या प्ल्युरल झिल्ली के लिए बाएं फेफड़ों को सावधानीपूर्वक ट्रिम करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए 2% पैराफॉर्मलडिहाइड में डुबोएं।
    12. मानक एम्बेडिंग प्रोटोकॉल के अनुसार पैराफिन में फिक्स्ड फेफड़े को एम्बेड करें।
      सावधानी-फेफड़ों के नमूनों को अधिक गर्म न करें।
    13. पेट के हिस्से को काटकर पेल्विक (कूल्हे) की हड्डी से डी-स्किन करें।
    14. बर्फ पर रखे एक नमकीन भरे पेट्री डिश में पेल्विक हिस्से से लेफ्ट और राइट फीमर हड्डियों को अलग करें ।
  7. स्टर्नल और फीमर बोन मैरो एस्पिरेट संग्रह
    1. प्रयोगशाला ऊतकों का उपयोग करके हड्डियों से ऊतक और मांसपेशियों को साफ करें।
    2. बर्फ पर रखे एक नमकीन भरे पेट्री डिश में वेंट्रल रिबकेज और स्टर्नम को इकट्ठा करें।
    3. स्टर्नल और फीमर हड्डियों के डिस्टल और समीपस्थ युक्तियों को काटें।
    4. 1 मिली सीरिंज पर अच्छी तरह से फिट सुई (24 से 28 ग्राम) का उपयोग करके, नमकीन के 0.5 एमएल के साथ हड्डियों को 4 बार प्रेरित करें, और प्रत्येक हड्डी से फिल्टर के साथ लगे लेबल ट्यूबों में अंश एकत्र करें और बर्फ पर रखा जाए।
      नोट: सुई गेज जानवरों के आकार के बीच बदलता रहता है । फ्लशिंग के बाद, फीमर हड्डी को पारदर्शी दिखाना चाहिए।
    5. एक बार नमूने एकत्र हो जाने के बाद, संस्थागत पशु सुविधा के दिशा-निर्देशों के अनुसार, माउस को प्लास्टिक की थैली में बैग करें और उचित निपटान के लिए पशु शव फ्रीजर में डाल दें ।

3. नमूना प्रसंस्करण

  1. कुल (टीएलसी) और अंतर (डीएलसी) ल्यूकोसिट मायने रखता है
    1. 500 ग्राम पर 10 मिनट के लिए सेंट्रलाइज पेरिफेरल ब्लड, बाल, फेफड़ों के संवहनी परफ्यूरेट और बोन मैरो (स्टर्नल और फीमर) नमूने।
    2. सुपरनेटेंट को इकट्ठा करें, उन्हें फ्लैश करें और उन्हें आगे के विश्लेषण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. पीबीएस के न्यूनतम 200 माइक्रोन में कोशिकाओं का पुनर्गठन करें।
    4. हीमोसाइटोमीटर पर बाल, रक्त, फेफड़ों के संवहनी परफ्यूरेट और बोन मैरो कोशिकाओं की गिनती करके टीएलसी करें।
    5. प्लाज्मा झिल्ली अखंडता की हानि के कारण इंट्रासेल्युलर एस्ट्रेस गतिविधि और किसी भी क्षतिग्रस्त बाल कोशिकाओं (लाल रंग में) के कारण लाइव (हरी) कोशिकाओं की मात्रा निर्धारित करने के लिए कैल्सीन हरे और लाल एथिडियम होममिमर-1 के 1 माइक्रोन मिश्रण के साथ बाल के एक और 9μL aliquot दाग।
    6. रक्त टीएलसी के लिए 1:10 अनुपात में और फेफड़ों के संवहनी शुक्रास्फेट टीएलसी के लिए 1:2 अनुपात में, lyse RBCs में 2% एसिटिक एसिड जोड़ें।
      सावधानी: पीबीएस में कमजोर करके कोशिका सांद्रता को समायोजित करें यदि एकाग्रता 1x10 6 कोशिकाओं प्रतिएमएल (अस्थि मज्जा के नमूनों के लिए बहुत महत्वपूर्ण) से अधिक है।
    7. डीएलसी के लिए नीचे बताए गए स्लाइड्स और दाग पर साइटोस्पिन तैयार करने के लिए सेल को सेंट्रलाइज करें। डिफरेंशियल ल्यूकोसाइट सेल काउंट (डीएलसी) के लिए कम से कम 100 सेल काउंट करें।
      नोट: आमतौर पर, एक स्लाइड पर दो साइटोस्पिन तैयार कर सकते हैं। और हवा सूखने के 10-15 मिनट के बाद, धुंधला कदम के साथ आगे बढ़ें।
    8. एकत्र बाल को प्रति समूह तीन पायलट चूहों से दो साइटोस्पिन प्रत्येक में विभाजित करें और सक्रिय ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन (कम मिटोटट्रैकर) के साथ ऐक्टिन/ट्यूबलिन और माइटोकॉन्ड्रिया के लिए दाग दें। तीन और चूहों से बाल का उपयोग करने के लिए दो cytospins प्रत्येक में विभाजित, NK1.1/Gr1/CX3CR1 और एटीपी/Ki-67/CD61/एंजियोस्टेटिन दाग स्लाइड के लिए । तीन और चूहों से बाल को दो साइटोस्पिन में विभाजित करें प्रत्येक को एटीपीα/Ly6G और CX3CR1/Siglec-F के लिए दाग ।
  2. ब्रोंकोएलवेलर लावगे (बाल) और फेफड़े संवहनी परफ्यूसेट (एलवीपी) कुल प्रोटीन क्वांटिफिकेशन
    1. दो फेफड़े के डिब्बों (यानी, अल्वेलर सेप्टल (इंटरस्टिशियल) और फेफड़े संवहनी परफ्यूसेट (संवहनी) डिब्बों में ओ3 और एलपीएस प्रेरित क्षोभ या क्षोभ को निर्धारित करने के लिए, एकत्र तरल पदार्थ में कुल प्रोटीन सामग्री को मापते हैं।
    2. एक मानक डिटर्जेंट प्रतिरोधी कोलोरिमेट्रिक परख का उपयोग करके उनके कुल प्रोटीन एकाग्रता के लिए गल गए सुपरनेट अंशों का विश्लेषण करें।
    3. ब्रोंकोएलवेओलर लावेज (बाल) और फेफड़ों के संवहनी परफ्यूसेट (एलवीपी) केमोकी विश्लेषण
      1. इसके बाद, 33-प्लेक्स चुंबकीय मनका-आधारित इम्यूनोसे का उपयोग करके बाल और फेफड़ों के संवहनी परफ्यूसेट (एलवीपी) सुपरनेटेंट में केमोकिनों का विश्लेषण करें। यह संयुक्त एक्सपोजर के बाद स्थापित वायुमार्ग/इंटरस्टिटियम बनाम वैस्कुलर केमोकीन ढाल की दिशात्मकता के बारे में सूचित करेगा ।
      2. Analyze the following panel of chemokines : CXCL13 (B-lymphocyte chemoattractant), CCL27 (IL-11 R-alpha-locus chemokine (ILC)), CXCL5 (epithelial-derived neutrophil-activating peptide 78 (ENA-78)), CCL-11 (eotaxin-1), eotaxin-2 (CCL-24), CX3CL1 (fractalkine), GM-CSF (CSF-2), CCL1, IFNγ (interferon gamma), IL-10 (interleukin-10), IL-16 (interleukin-16), IL-1β (interleukin-1 beta), IL-2 (interleukin-2), IL-4 (interleukin-4), IL-6 (interleukin-6), CXCL-10 (interferon gamma-induced protein 10 (IP-10)), CXCL11 (Interferon-gamma-inducible protein 9 (IP-9)), KC (keratinocyte chemoattractant), MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1), MCP-3 (monocyte chemoattractant protein-3), MCP-5 (monocyte chemoattractant protein-5), MDC (macrophage-derived chemokine (CCL22)), MIP-1α (macrophage inflammatory protein-1 alpha), MIP-1β (macrophage inflammatory protein-1 beta), MIP-2 (macrophage inflammatory protein-2), MIP-3α (macrophage inflammatory protein-3 alpha), MIP-3β (macrophage inflammatory प्रोटीन-3 बीटा), रण्टेस (सक्रियण पर विनियमित, सामान्य टी सेल व्यक्त और स्रावित (सीसीएल 5)), सीएक्ससीएल-16, सीएक्ससीएल-12/एसडीएफ-1एलफा (स्ट्रोमल सेल-व्युत्पन्न कारक 1), टारसी (थाइमस और एक्टिवेशन विनियमित केमोकेन (TARC)), टेक (थाइमस-एक्सप्रेस केमोकेन (CCL25)) और TNFα (ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर अल्फा)।

4. साइटोस्पिन धुंधला और फेफड़ों की हिस्टोलॉजी

  1. साइटोस्पिन बायोकेमिकल धुंधला
    1. प्रक्रिया के दौरान इनक्यूबेशन के लिए रसायनों को नियंत्रित करने के लिए साइटोस्पिन को हाइड्रोफोबिक पेन से घेरना।
    2. पीबीएस में साइटोस्पिन को 5 मिनट के लिए रीहाइड्रेट करें।
    3. साइटोस्पिन नमूनों को 10 मिनट के लिए 2% पैराफॉर्मलडिहाइड में ठीक करें, प्रत्येक 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
    4. बर्फ ठंड 70% एसीटोन के साथ 7 मिनट के लिए परमीलाइज करें और फिर से 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
    5. ऐक्टिन और ट्यूबुलिन या कम मिटोट्रैकर के लिए दाग (एलेक्सा 488 के 2 μg/50 माइक्रोन के मिश्रण के साथ इनक्यूबेट हरे रंग में दिखाया गया है, और एलेक्सा 555 संयुग्मित माउस विरोधी α ट्यूबलिन या कम माइटोट्रैकर के 2 μg/μl क्रमशः) 15 मिनट के लिए।
      नोट: ट्यूबलिन स्टेनिंग प्रोटोकॉल को मान्य करने के लिए, एक अलग साइटोस्पिन में माउस इग्जी1 आइसोटाइप कंट्रोल एंटीबॉडी का उपयोग करें। 4.1.1 से 4.1.8 तक समझाए गए समान चरण करें, लेकिन आइसोटाइप नियंत्रण के लिए।
    6. स्लाइड से मिश्रण को धीरे-धीरे टिप करके दाग हटा दें। डैपी (4′, 6-डायमिडिनो-2-फेनीलिंडोल) के साथ 5-10 मिनट के लिए दाग नाभिक के साथ स्लाइड्स को इनक्यूबेट करें ।
    7. 5 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस के साथ 3 बार साइटोस्पिन धोएं, एंटी-फीका बढ़ते मीडिया के साथ कवरलिप करें और इमेजिंग से पहले कमरे के तापमान पर रात भर अंधेरे में स्टोर करें।
    8. एक वैज्ञानिक कैमरे से लैस एक व्यापक क्षेत्र ईमानदार माइक्रोस्कोप के तहत छवियों का अधिग्रहण करें। इमेजिंग स्लाइड करते समय विभिन्न फ्लोरोसेंट चैनलों के लिए लगातार कैमरा एक्सपोजर समय निर्धारित करें।
  2. साइटोस्पिन प्रतिरक्षा-फ्लोरोसेंट धुंधला:
    1. प्रक्रिया के दौरान इनक्यूबेशन के लिए रसायनों को नियंत्रित करने के लिए साइटोस्पिन को हाइड्रोफोबिक पेन से घेरना। पीबीएस में साइटोस्पिन को 5 मिनट के लिए रीहाइड्रेट करें।
    2. 10 मिनट के लिए 2% पैराफॉर्मलडिहाइड में इनक्यूबेटिंग करके साइटोस्पिन नमूनों को ठीक करें, 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
    3. 2 मिनट के लिए 0.1% ठंड ट्राइटन एक्स-100 के साथ परमीलिज करें, प्रत्येक 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
    4. इसके बाद, एफसी ब्लॉक एंटीबॉडी स्टॉक के 1:50 कमजोर पड़ने के साथ साइटोस्पिन को इनक्यूबेटिंग करके 15 मिनट के लिए एफसी ब्लॉक (यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्राथमिक माउस एंटीबॉडी माउस एफसी एंटीबॉडी के साथ विशेष रूप से गैर-प्रतिक्रिया नहीं करता है)।
    5. एफसी ब्लॉक को हटाने और 30 मिनट के लिए 3 प्राथमिक एंटीबॉडी (विभिन्न संयोजनों के लिए तालिका 1 को देखें) के मिश्रण के साथ साइटोस्पिन को बदलने और 1% बीएसए में बदलने के लिए स्लाइड टिप करें।
      नोट: आइसोटाइप नियंत्रण एंटीबॉडी (एक मिश्रण माउस IgG1 और चूहा IgG2b kappa प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट कदम 4.2.1 से 4.2.9 प्रदर्शन और आईएसोटाइप नियंत्रण के साथ एंटीबॉडी की जगह) इसी माध्यमिक एंटीबॉडी के समानांतर में चलाने के लिए सुनिश्चित करें के रूप में हमारे हाल के अध्ययन20में चर्चा की ।
    6. प्रत्येक 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ 3 बार धोएं। उचित रूप से डिजाइन किए गए माध्यमिक एंटीबॉडी के मिश्रण के साथ साइटोस्पिन को इनक्यूबेट करें (कृपया विवरण के लिए तालिका 1 का उल्लेख करें)।
    7. धीरे से स्लाइड से मिश्रण टिपिंग द्वारा दाग निकालें, DAPI के साथ इनक्यूबेट (4′, 6-diamidino-2-phenylindole) 5-10 मिनट के लिए दाग नाभिक के लिए । प्रत्येक 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ 3 बार धोएं।
    8. विरोधी फीका बढ़ते मीडिया के साथ कवरलिप और इमेजिंग से पहले कमरे के तापमान पर अंधेरे में रात भर स्टोर ।
    9. एक वैज्ञानिक कैमरे से लैस एक व्यापक क्षेत्र ईमानदार माइक्रोस्कोप के तहत छवियों का अधिग्रहण करें। इमेजिंग स्लाइड करते समय सभी फ्लोरोफोर चैनलों के लिए लगातार कैमरा एक्सपोजर समय निर्धारित करें।
  3. हेमेटॉक्सीलिन और ियोसिन (एचएंडई) हिस्टोलॉजी
    1. सभी समूहों के लिए फेफड़ों के क्रायो-सेक्शन पर संशोधित एचएंडई धुंधला3 करें।
  4. छवि विश्लेषण
    1. फिजी इमेजजे ओपन सॉफ्टवेयर (https://imagej.net/Fiji/Downloads) में इमेज डेटा (.tiff) फाइलों की प्रक्रिया और विश्लेषण करें।
    2. विश्लेषण टैब और सेट मापनके तहत दर्ज किए जाने वाले आवश्यक मापदंडों (क्षेत्र, परिधि, एकीकृत घनत्व, आकार वर्णनकर्ता, फेरेट का व्यास, परिपत्रता, डिस्प्ले लेबल) की जांच करें।
    3. आरओआई प्रबंधकका उपयोग करके, "फ्रीहैंड चयन" उपकरण का उपयोग करके विलय किए गए छवि पैनल में लगभग 50-200 कोशिकाओं को मैन्युअल रूप से रेखांकित करें। सीटीआरएल + टी कमांड के साथ ब्याज (आरओआई) के क्षेत्रों को सहेजें और सभी फ्लोरोफोर चैनलों पर प्रत्येक सेल के लिए सहेजे गए आरओआई को कॉपी करें।
    4. अगला प्रेस Ctrl + M सभी फ्लोरोसेंट चैनलों के लिए पूर्व निर्धारित मापदंडों को मापने के लिए (उदाहरण के लिए, 405 एनएम (नीले रंग में DAPI या ATPο), 488 एनएम (ऐक्टिन या एनके 1.1 या की-67 हरे रंग में), 568 एनएम (तुबुलिन या जीआर 1 या लाल रंग में सीडी 61) और 633 एनएम (सीएक्स3सीआर1 या मैजेंटा में एंजियोस्टेटिन)।
    5. परिणामों को एक उपयुक्त नाम के तहत फ़ाइल .csv रूप में सहेजें जो आपके विश्लेषण का प्रतिनिधित्व करता है। .csv से परिणामों को एक स्प्रेडशीट पर फाइल करें और धुंधला डिजाइन के अनुसार, DAPI या CD61 FI द्वारा दाग अणु के फ्लोरेसेंस तीव्रता (एफआई) (जो परिणाम फ़ाइल से कच्चे एकीकृत घनत्व स्तंभ है) को विभाजित करें। इन अनुपातों को "DAPI या CD61 सामान्यीकृत एफआई अनुपात" कहा जाता है।
    6. इसके बाद, संयुक्त ओ3 और एलपीएस एक्सपोजर के बाद सेल आकार में किसी भी परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए इन सामान्यीकृत अनुपात, परिपत्रता, सेल परिधि और फेरेट व्यास को प्लॉट करें।
    7. एकत्र किए गए डेटा की सामान्य स्थिति की जांच करने और शून्य परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए उपयुक्त सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें (कृपया नीचे सांख्यिकीय विश्लेषण अनुभाग का उल्लेख करें)।
  5. सांख्यिकीय विश्लेषण
    1. एक्सप्रेस परिणाम के रूप में मतलब है ± SEM । प्रति समूह न्यूनतम तीन चूहों का उपयोग किया गया था।
    2. केमोकीन डेटा विश्लेषण के लिए, बेंजामिन और होशबर्ग सुधार के अनुसार झूठी खोज दर के लिए एक तरफा ANOVA पी-मूल्यों को समायोजित करें।
    3. छवि मापदंडों, सेलुलरिटी, फेरेट व्यास, परिधि, DAPI या CD61 सामान्यीकृत फ्लोरेसेंस तीव्रता अनुपात का विश्लेषण मान-व्हिटनी यू परीक्षण (दो समूहों की तुलना के लिए) या क्रुस्कल वालिस परीक्षण (कई समूहों की तुलना के लिए) क्योंकि ये डेटा सामान्य रूप से वितरित नहीं किए गए थे।
    4. इमेजिंग प्रयोगों के बाकी के लिए, सिडक की कई तुलनाओं के बाद विचरण के एक तरफा विश्लेषण का उपयोग करके परिणामों का विश्लेषण करें। पी मूल्यों <0.05 महत्वपूर्ण माना जाता था.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

संयुक्त ओ3 और एलपीएस एक्सपोजर 72 घंटे में प्रणालीगत सूजन और अस्थि मज्जा जुटाने की ओर जाता है: विभिन्न डिब्बों में सेल की गिनती परिधीय रक्त में महत्वपूर्ण परिवर्तन का पता चला और फीमर बोन मैरो कुल सेल संयुक्त ओ3 और एलपीएस एक्सपोजर पर मायने रखता है। हालांकि संयुक्त ओ3 और एलपीएस एक्सपोजर ने कुल बाल(चित्रा 1A)या एलवीपी(चित्रा 1 बी)सेल काउंट में कोई परिवर्तन नहीं किया, बहुरूपी कोशिकाओं को एक्सपोजर के बाद 24(चित्रा 1F,पूरक चित्रा 1), 36और 72 घंटे में प्रमुख सेल प्रकार के रूप में प्रस्तुत किया गया। कृपया 24 एच बाल साइटोस्पिन छवि(चित्रा 1F)पर बहुरूपी कोशिकाओं में सिग्लेक-एफ और CX3CR1 धुंधला की अनुपस्थिति पर ध्यान दें। ट्रिपल DAPI/CD11b/Gr1 bal cytospins के धुंधला बड़े CD11b-और Gr1-सकारात्मक मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं जो 0 घंटे में मैक्रोफेज हैं, जो छोटे बहुरूपता कोशिकाओं में परिवर्तन, लेकिन 4 एच पर CD11b धुंधला से रहित (जैसा कि पूरक 1Fमें इनसेट में दिखाया गया है) की उपस्थिति दिखाई । बाल कोशिकाओं के बहुमत बहुरूपी और दोनों CD11b और Gr1 के लिए सकारात्मक हैं, 24 घंटे के बाद जोखिम(पूरक चित्रा 1) पर ।

चूहों ने 24 घंटे (3.3 गुना बनाम 0 एच) पर प्रणालीगत ल्यूकोसिटोसिस प्रदर्शित किया, पी<0.05, चित्रा 1C)72 घंटे में ल्यूकोपेनिया के बाद जो 24 घंटे (पी<0.01) और संयुक्त O 3 और एलपीएस एक्सपोजर(चित्रा 1C)के बाद 4 घंटे (पी<0.05) की तुलना में परिधीय रक्त में13 गुना कम गिनती द्वारा चिह्नित किया गया था । 0 एच की तुलना में या संयुक्त ओ3 और एलपीएस एक्सपोजर(चित्रा 1D)के बाद स्टर्नल बोन मैरो कोशिकाओं को भी अपरिवर्तित किया गया था। फीमर बोन मैरो की गिनती में 0 एच (पी<0.01, फिगर 1E)के साथ-साथ अन्य समय अंक (पी<0.01, चित्रा 1E)की तुलना में 72 घंटे में देर से 28.8 गुना स्पाइक दिखाया गया। एलवीपी के विज़ुअलाइज़ेशन, और स्टर्नल के साथ-साथ फीमर बोन मैरो कोशिकाओं ने भी कोशिका प्रकारों में मुख्य रूप से बहुरूपी कोशिकाओं(पूरक चित्रा 1)में परिवर्तन दिखाया। स्टर्नल बोन मैरो कोशिकाओं को नुकसान के लक्षण दिखाई दिए जैसा कि बाह्य परमाणु सामग्री का सबूत है । फीमर बोन मैरो ने CD11b और Gr1 सकारात्मक कोशिकाओं(पूरक चित्रा 1)की अधिक संख्या दिखाई, जो सेल की गिनती के साथ मेल खाती है ।

संयुक्त ओ 3 और एलपीएस एक्सपोजर के बाद बाल कुल प्रोटीन सामग्री36 घंटे में सबसे अधिक थी: एलवीपी और बाल डिब्बों में कुल प्रोटीन का मात्राकरण संयुक्त एक्सपोजर के कारण परिणामस्वरूप संवहनी और एपीथियल बाधा हानि के कारण ओजोन प्रेरित फेफड़ों के एडेमा यानी प्लाज्मा प्रोटीन एक्सडेशन को सहसंबंधित करने के लिए किया गया था। 4 घंटे(चित्रा 2 ए)की तुलना में बाल कुल प्रोटीन 36 घंटे (पी<0.05) पर 4.5 गुना अधिक था। हालांकि, एलवीपी प्रोटीन एक्सपोजर(चित्रा 2B) केबाद अपरिवर्तित था।

संयुक्त ओ3 और एलपीएस एक्सपोजर फेफड़ों के संवहनी डिब्बे में मजबूत केमोकीन ढाल को प्रेरित करता है न कि बाल: केमोकिन मल्टीप्लेक्स परख बाल और एलवीपी सुपरनेटेंट दोनों पर आयोजित किए गए थे। कृपया ध्यान दें कि इन दोनों डिब्बों के बीच सापेक्ष मतभेद एक विशेष डिब्बे में तरजीही प्रतिधारण का प्रतिनिधित्व करता है । 0 घंटे (पी<0.05, चित्रा 3 ए)की तुलना में एलवीपी डिब्बे में 4 घंटे में 4.3 गुना अधिक था। बाल डिब्बे में, eotaxin-2 0 घंटे (पी<0.01, चित्रा 3B)की तुलना में 4 घंटे में 3.2 गुना कम था। बाल eotaxin-2 स्तर 0 घंटे (पी<0.01, चित्रा 3B)की तुलना में १२.६ गुना कमी के साथ ७२ घंटे तक लगातार कम पर रखा । लिम्फोसाइट केमोट्रेक्ट्ट आईएल-2 एलवीपी डिब्बे में 0 घंटे (पी<0.05, चित्रा 3सी)की तुलना में एलवीपी डिब्बे में 4 घंटे में 10.1 गुना अधिक था। बाल डिब्बे में, आईएल-2 0 घंटे (पी<0.05, चित्रा 3 डी)की तुलना में 36 घंटे पर 5.0 गुना कम था। बाल eotaxin-2 स्तर 0 घंटे (पी<0.05, चित्रा 3 डी)की तुलना में ७२ घंटे पर लगातार ५.९ गुना कमी को कम करने पर रखा ।

दिलचस्प बात यह है कि एलवीपी में 4 घंटे में कई केमोकिंस बदल गए थे न कि बाल में । इनमें से अधिकांश केमोकिंस ने बाद के समय-बिंदुओं की तुलना में 4 घंटे में एलवीपी के स्तर में मामूली, अभी तक महत्वपूर्ण, वृद्धि दिखाई। हालांकि 0 घंटे की तुलना में एक्सपोजर के बाद eotaxin-1 का स्तर उच्च नहीं था, लेकिन संयुक्त एक्सपोजर के बाद 24 (2.7 गुना, पी<0.05) और 72 एच (5.0 गुना, पी<0.01, चित्रा 4 ए) कीतुलना में स्तर 4 घंटे में काफी अधिक थे। एलवीपी टीएनएफपीवाई का स्तर 36 घंटे (पी<0.05, चित्रा 4B)की तुलना में 4 घंटे में 3.4 गुना अधिक था। इसी तरह, एलवीपी IFNγ 72 घंटे (पी<0.05, चित्रा 4C)की तुलना में 4 घंटे में 2.9 गुना अधिक था। संयुक्त एक्सपोजर(चित्रा 4D)के बाद 24 (1.7 गुना, पी<0.05), 36 (1.6 गुना, पी<0.05) और 72 घंटे (2.2 गुना, पी<0.01) की तुलना में CX3CL1 का स्तर भी 4 घंटे में उच्च था। CCL27 के स्तर पर उच्च स्तर 4 घंटे के रूप में अच्छी तरह से दिखाया जब 24 (२.७ गुना, पी<०.०५), ३६ (३.९ गुना, पी<0.01) और ७२ घंटे (२.९ गुना, पी<0.05) संयुक्त जोखिम के बाद(चित्रा 4E)की तुलना में ।

कुछ केमोकिनों ने संयुक्त एक्सपोजर के बाद 4 घंटे में एलवीपी में एक मजबूत उपस्थिति दर्ज की थी, और एक्सपोजर से पहले और बाद में बाल में नहीं बदला, जो फेफड़े के केशिकाओं से एक मजबूत केमोकीन प्रतिक्रिया का संकेत देता है। 4 घंटे में, आईएल-16 एलवीपी का स्तर 0 घंटे (पी<0.01) की तुलना में 3.4 गुना था, 24 घंटे (पी<0.01) की तुलना में 3.2 गुना संयुक्त एक्सपोजर (चित्रा 4F) के बाद 72 घंटे (पी<0.01) की तुलना में 36 घंटे (पी<0.01) और 4.6 गुना की तुलना में4.5गुना। 4 घंटे में, न्यूट्रोफिल केमोकीन, CXCL5 एलवीपी का स्तर 0 घंटे (पी<0.01), 4.7 गुना की तुलना में 24 घंटे (पी<0.01), 2 की तुलना में 2.0 गुना था . 2 गुना ३६ घंटे (पी<०.०१) और २.७ की तुलना में ७२ घंटे (पी<0.01) संयुक्त जोखिम(चित्रा 4G)के बाद की तुलना में गुना । 4 घंटे में, CXCL10 एलवीपी का स्तर 0 घंटे (पी<0.01), 24 घंटे (पी<0.05), 2 की तुलना में 2.1 गुना था . 5 गुना ३६ घंटे (p<०.०१) और २.७ की तुलना में ७२ घंटे (p<०.०१) संयुक्त जोखिम(चित्रा 4H)के बाद की तुलना में । 36 घंटे में, न्यूट्रोफिल केमोकेन, एसडीएफ1α एलवीपी का स्तर 0 एच (पी<0.01) की तुलना में 4.2 गुना था, 24 घंटे (पी<0.05) की तुलना में 2.9 गुना, संयुक्त एक्सपोजर(चित्रा 4)के बाद 72 घंटे (पी<0.01) की तुलना में 6.8 गुना 4 घंटे में, MIP3ο LVP स्तर 0 घंटे (पी<0.05) की तुलना में 2.3 गुना थे, और संयुक्त एक्सपोजर(चित्रा 4J)के बाद 72 घंटे (पी<0.05) की तुलना में 2.3 गुना।

संयुक्त ओ3 और एलपीएस एक्सपोजर नेक्रोसिस को प्रेरित करता है, सेलुलर साइटोस्केलेल, प्लाज्मा झिल्ली और माइटोकॉन्ड्रियल अखंडता को बाधित करता है: जैसा कि कंपार्टमेंटल ल्यूकोसिटे गिनती और प्रोटीन सामग्री एलवीपी केमोकीन ग्रेडिएंट्स के साथ सह-संबंधित नहीं थी, इन डिब्बों से प्राप्त कोशिकाओं की कल्पना करना अधिक महत्वपूर्ण हो गया। बेसलाइन (0 एच) बाल कोशिकाओं के पूर्व वीवो ऐक्टिन/ट्यूबलिन स्टेनिंग ने कॉर्टिकल ऐक्टिन, स्ट्रेस फाइबर के साथ-साथ लैमेलिपोडिया (हरे रंग में दिखाया गया, चित्रा 5 बाएं ऊपरी पैनल) और माइक्रोटुबुल नेटवर्क (लाल, चित्रा 5 बाएं ऊपरी पैनल में दिखाया गया) की उपस्थिति दिखाई जो सक्रिय माइटोकॉन्ड्रिया की उपस्थिति का संकेत देने वाले कम मिटोक्रर धुंधला के साथ हुआ (लाल, चित्रा 5 बाएं निचले पैनल में दिखाया गया है)। बाल कोशिकाओं के 95% से अधिक बेसलाइन पर मोनोन्यूक्लियर थे। 4 घंटे में, बाल कोशिकाओं ने बाह्य परमाणु सामग्री दिखाई, लैमेलिपोडिया से रहित साइटोप्लाज्मिक ऐक्टिन स्टेनिंग और कम कॉर्टिकल ऐक्टिन स्टेनिंग (हरे रंग में दिखाया गया है, चित्रा 5 दाएं ऊपरी पैनल), माइक्रोट्यूबुल नेटवर्क को हवा दी (लाल, चित्रा 5 दाएं ऊपरी पैनल में दिखाया गया) जो कम मिटोट्रैकर धुंधला (लाल, चित्रा 5 बाएं दाएं पैनल में दिखाया गया) के अनुरूप नहीं था। DAPI सामान्यीकृत actin फ्लोरोसेंट तीव्रता विश्लेषण जोखिम के बाद 4 घंटे पर actin धुंधला में कमी का संकेत अनुपात में ३.७ गुना कमी से पता चला (पी<०.०१, चित्रा 6A)। इसी तरह, DAPI सामान्यीकृत ट्यूबुलिन फ्लोरोसेंट तीव्रता भी एक्सपोजर (पी<0.01, चित्रा 6B) के बाद 1.5गुना कम हो गई, जो ट्यूबलिन धुंधला में कमी का संकेत देती है। लैमेलिपोडिया का नुकसान बाल सेलुलर साइटोस्केलेटन की गोलाकारता में वृद्धि के साथ स्पष्ट था, यानी, 2 घंटे (पी<0.01, चित्रा 6C)और 4 घंटे (पी<0.05, चित्रा 6C)एक्सपोजर के बाद जब 0 घंटे की तुलना में और 24 (पी<0.05) और 36 घंटे (पी<0.01) पर साइटोस्केलेल सर्कुलरिटी में कमी, जब 0 घंटे(चित्रा 6C) कीतुलना में।

24 घंटे तक, संयुक्त एक्सपोजर से बाल कोशिकाएं कैल्शियम (हरे रंग में, चित्रा 7)के लिए डबल सकारात्मक थीं, जो सक्रिय एस्टेरास गतिविधि की उपस्थिति का संकेत देती थीं, और एथिडियम होमोमर (लाल, चित्रा 7में), यह दर्शाता है कि हालांकि कुछ कोशिकाएं मृत थीं (लाल), बहुमत आंशिक रूप से छेड़छाड़ की गई कोशिकाओं से समझौता किया गया था। 36 घंटे में, बाल कोशिकाएं काफी हद तक व्यवहार्य (हरे रंग) थीं, जो अन्य प्रणालीगत डिब्बों(चित्र 7)से भर्ती ल्यूकोसाइट्स द्वारा समझौता कोशिकाओं के प्रतिस्थापन का संकेत देती थीं।

बाल कोशिकाओं के विशिष्ट एटीपीऔर Ly6G धुंधला से पता चला कि अल्वेलर मैक्रोफेज में दोनों प्रोटीन के साथ-साथ एक्सपोजर(चित्र 7)के बाद न्यूट्रोफिल के असतत इंट्रासेलुलर स्थानीयकरण(फिल्में 1 और 2)। संयुक्त एक्सपोजर के कारण एटीपीपी(चित्रा 7, 8ए) के DAPI सामान्यीकृत फ्लोरोसेंट तीव्रता अनुपात में कमी आई और इंट्रासेल्युलर Ly6G प्रोटीन सामग्री(चित्रा 7, चित्रा 8B,सिनेमा 1 और 2)में वृद्धि हुई। एटीपीα धुंधला में कमी, एक्सपोजर के बाद 24 घंटे में, कम ट्यूबलिन के साथ सहसंबद्ध और कुछ हद तक कम माइटोट्रैकर धुंधला। हमने एक्सपोजर के बाद परमाणु एटीपीवाई पॉजिटिव सेल बॉडीज को भी देखा, जो प्लेटलेट्स हो सकते हैं । हालांकि, हमने अपने निष्कर्षों की पुष्टि नहीं की । 2 घंटे में, हमने 0 घंटे की तुलना में छोटे मोनोन्यूक्लियर बाल कोशिकाओं (पी<0.01 चित्रा 8C,पी<0.01 चित्रा 8D)देखा, लेकिन 4 घंटे में, मोनोन्यूक्लियर कोशिकाएं बड़ी थीं (पी<0.01 चित्रा 8C,पी<0.01 चित्रा 8D)जब 0 घंटे की तुलना में। 24 (पी<0.01 चित्रा 8C,पी<0.01 चित्रा 8D)और 36 एच (पी<0.01 चित्रा 8C,पी<0.01 चित्रा 8 डी),बाल कोशिकाओं को उत्तरोत्तर बहुरूपी कक्ष की ओर एक बदलाव के कारण छोटे हो गया, जब 0 घंटे की तुलना में ।

बाल कोशिकाओं के इम्यूनोफेनोटाइपिंग ने एनके 1.1, एटीपी β और की-67 की क्षणिक अभिव्यक्ति का खुलासा किया और संयुक्त ओ3 और एलपीएस एक्सपोजर के बाद जीआर1, सीएक्स3सीआर 1 और एंजियोस्टैटिन सकारात्मक बाल कोशिकाओं की निरंतर अभिव्यक्ति: बाल साइटोस्पिन के पहले सेट के इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला को डीएपीआई धुंधला करने के लिए सामान्य किया गया था। 24 घंटे (पी<0.05 बनाम 0 एच, चित्रा 9,10ए)पर सेलुलर NK1.1 सकारात्मक कोशिकाओं में वृद्धि हुई थी। 36 घंटे में, बाल कोशिकाओं में कम सेलुलर एनके1.1 फ्लोरोसेंट तीव्रता (पी<0.01 बनाम 0 और 24 घंटे, चित्रा 9,10 ए)थी। सेलुलर जी1 फ्लोरोसेंट तीव्रता 24 घंटे (पी<0.01 बनाम 0 घंटे, चित्रा 9,10B)के साथ-साथ 36 घंटे (पी<0.01 बनाम 0 एच, चित्रा 9, 10B)पर अधिक थी। इसी तरह, सेलुलर CX3CR1 फ्लोरोसेंट तीव्रता 24 घंटे (पी<0.01 बनाम 0 घंटे, चित्रा 9,10C)के साथ-साथ 36 घंटे (पी<0.01 बनाम 0 घंटे, चित्रा 9,10C)पर अधिक थी।

जब सेलुलर सीडी 61 को सामान्यीकृत किया जाए, जो अभिव्यक्ति में भी सर्वव्यापी है, 24 घंटे (पी<0.01 बनाम 0 एच, चित्रा 9,10D)पर सेलुलर एटीपी फ्लोरोसेंट तीव्रता में वृद्धि और 36 घंटे (पी<0.01 बनाम 0 और 24 एच, चित्रा 9,10)पर सेलुलर एटीपी फ्लोरोसेंट तीव्रता में वृद्धि का पता चला। विशेष रूप से, एटीपी ने 36 घंटे(चित्रा 9)पर परिधीय स्थानीयकरण की तुलना में 24 घंटे में मुख्य रूप से परमाणु स्थानीयकरण दिखाया। सेलुलर प्रसार का सूचक बाल की-67 की सेलुलर फ्लोरोसेंट तीव्रता 0 और 36 घंटे की तुलना में 24 घंटे (पी<0.01 बनाम 36 घंटे, चित्रा 9,10E)पर अधिक थी। यह स्तर 36 घंटे (पी<0.01, चित्रा 9,10E)पर आधारभूत स्तर से नीचे थे, जो उच्च बहुरूपी-परमाणु सीडी 61 बनाम की-67 अभिव्यक्ति के कारण 36 घंटे(चित्रा 9)पर सबसे अधिक संभावना थी। अंत में, बाल एंजियोस्टैटिन की सेलुलर फ्लोरोसेंट तीव्रता लगातार 24 और 36 दोनों घंटे (पी<0.01 बनाम 0 एच, चित्रा 9,10F)पर थी, जो फेफड़ों की भड़काऊ प्रतिक्रिया के दौरान इस धातुकोप्रोटीन स्लोवेड प्लाज्मिनोजेन टुकड़े में विशिष्ट वृद्धि का संकेत देती थी।

संयुक्त एक्सपोजर व्यापक प्रसार फेफड़ों की क्षति का उत्पादन: फेफड़ों के हिस्टोलॉजी से पता चला है कि संयुक्त एक्सपोजर फेफड़ों को लंबे समय तक नुकसान पहुंचाते हैं जैसा कि एचएंडई दाग क्रायोसेक्शन(चित्रा 11)में देखा गया है । हालांकि ब्रोंकिओलर और अल्वेलर सेप्टल क्षति की उम्मीद थी, लेकिन एक्सपोजर(चित्र 11)के बाद 36 घंटे में बड़े जहाजों के एंडोथेलियल क्षति का निरीक्षण करना बढ़ रहा था। क्षतिग्रस्त अल्वेलर सेप्टल और पेरी-ब्रोनचिओलर क्षेत्रों(चित्र 11)में ल्यूकोसाइट एग्रीगेट्स (न्यूट्रोफिल सहित) के अनुयायी इंट्रावैस्कुलर ल्यूकोसाइट्स थे।

Figure 1
चित्रा 1:कंपार्टमेंटल ल्यूकोसिटे मायने रखता है: ए) ब्रोनचो-अल्वेलर लावगे (बाल) कुल ल्यूकोसिटे की गिनती 0 (यानी बेसलाइन), 4, 24, 36 और 72 घंटे के बाद संयुक्त 0.05 पीपीबी ओजोन (ओ3)और 50 माइक्रोग्राम इंट्रानासाल एलपीएस चूहों के संपर्क में है। ख) फेफड़ों संवहनी perfusate (एलवीपी) 0 (यानी, बेसलाइन), 4, 24, 36 और 72 घंटे पर कुल ल्यूकोसाइट एकाग्रता के बाद संयुक्त ०.०५ पीपीबी ओजोन (O3)और ५० μg इंट्रानासल एलपीएस चूहों के लिए जोखिम । ग) परिधीय रक्त (पीबी) 0 (यानी, बेसलाइन), 4, 24, 36 और 72 घंटे पर कुल ल्यूकोसाइट एकाग्रता संयुक्त 0.05 पीपीबी ओजोन (ओ3)और 50 μg इंट्रानासाल एलपीएस चूहों के संपर्क में आने के बाद। घ) स्टर्नल बोन मैरो (बीएम) चूहों के संपर्क में 0 (यानी, बेसलाइन), 4, 24, 36 और 72 घंटे पर कुल ल्यूकोसाइट एकाग्रता संयुक्त 0.05 पीपीबी ओजोन (ओ3)और 50 माइक्रोन इंट्रानासल एलपीएस एक्सपोजर के बाद। ई) फीमर बोन मैरो (बीएम) कुल ल्यूकोसाइट एकाग्रता पर 0 (यानी, बेसलाइन), 4, 24, ३६ और ७२ घंटे के बाद संयुक्त ०.०५ पीपीबी ओजोन (ओ3)और ५० μg इंट्रानासल एलपीएस चूहों के संपर्क में । रेखांकन ए-ई के लिए, 0 एच नीले रंग में, लाल रंग में 4 घंटे, हरे रंग में 24 घंटे, बैंगनी में 36 घंटे और नारंगी डेटा बिंदुओं में 72 घंटे का प्रतिनिधित्व किया जाता है; * पी<0.05 और ** पी<0.01। एफ) प्रतिनिधि बाल साइटोस्पिन 24 एच एक्सपोजर से स्लाइड, मोनोन्यूक्लियर और पॉलीमॉर्फोक्यूक्लियर कोशिकाओं को दिखाता है जब डीएपीआई (नीले रंग में), CX3CR1 (हरे रंग में) और सिग्लेक-एफ (लाल रंग में) के साथ नाभिक के लिए दागदार होता है। ध्यान दें कि CX3CR1 और सिग्लेक-एफ का मर्ज नारंगी-पीले रंग के रूप में दिखाता है। अधिकांश मोनोन्यूक्लियर कोशिकाएं सिग्लेक-एफ के लिए सकारात्मक होती हैं, जो अल्वियोलर मैक्रोफेज की विशेषता है। स्केल बार = 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2:कुल प्रोटीन मात्राकरण: ए) Bronchoalveolar lavage (बाल) कुल प्रोटीन सामग्री और बी) फेफड़ों संवहनी perfusate (एलवीपी) कुल प्रोटीन एकाग्रता byPierce ६६० एनएम प्रोटीन परख (थर्मोसाइंटिफिक, आईएल, अमेरिका) का अनुमान था । रेखांकन ए-बी के लिए, 0 एच नीले रंग में, लाल रंग में 4 घंटे, हरे रंग में 24 घंटे, बैंगनी में 36 घंटे और नारंगी डेटा बिंदुओं में 72 घंटे का प्रतिनिधित्व किया जाता है; * पी<0.05। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:फेफड़े Eotaxin-2 और आईएल-2 केमोकिन ढाल: ३३ केमोकिंस में से, दो केमोकिन जो फेफड़ों के संवहनी परफ्यूसेट (एलवीपी) और ब्रोंकोल्वेलर लावेज (बाल) और तरल पदार्थ में 0.05 पीपीबी ओजोन (ओ3)और 50 माइक्रोन इंट्रानासाल एलपीएस एक्सपोजर के बाद चूहों ए) एलवीपी इओटेक्सिन-2, बी) बाल इटक्सिन-2, में काफी बदल गए थे। C) एलवीपी आईएल-2 और डी) बाल आईएल-2 । डेटा का विश्लेषण वन-वे इनोवा द्वारा किया गया था और बेंजामिन और होशबर्ग सुधार के अनुसार कई चरों की झूठी खोज दर के लिए पी-वैल्यू को समायोजित किया गया था। रेखांकन ए-डी के लिए, 0 एच नीले रंग में, लाल रंग में 4 घंटे, हरे रंग में 24 घंटे, बैंगनी में 36 घंटे और नारंगी डेटा अंक में 72 घंटे का प्रतिनिधित्व किया है। बोनफेरोनी के सुधार के बाद जोड़ी के लिहाज से तुलना का विश्लेषण किया गया । * पी<0.05 का प्रतिनिधित्व करता है, ** पी<0.01 का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4:फेफड़ों के संवहनी perfusate केमोकिन सांद्रता: दस और केमोकिन की सांद्रता बदल रहे थे, लेकिन केवल फेफड़ों संवहनी perfusate (एलवीपी) डिब्बे में । ए) Eotaxin-1, B) TNFα, C) IFNγ, डी) CX3CL1, ई) CCL27, F) IL-16, G) CXCL5, H) CXCL10, I) SDF1α और J) MIP3ο । रेखांकन ए-जे के लिए, 0 एच नीले रंग में, लाल रंग में 4 घंटे, हरे रंग में 24 घंटे, बैंगनी में 36 घंटे और नारंगी डेटा अंक में 72 घंटे का प्रतिनिधित्व किया है। बोनफेरोनी के सुधार के बाद जोड़ी के लिहाज से तुलना का विश्लेषण किया गया । * पी<0.05 का प्रतिनिधित्व करता है, ** पी<0.01 का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:Bronchoalveolar lavage (बाल) साइटोस्पिन ऐक्टिन/ट्यूबलिन और कम मिटोट्रैकर धुंधला: प्रतिनिधि छवियां ofactin/tubulin दाग बाल साइटोस्पिन ए) 0 घंटे और बी) संयुक्त के बाद 4 घंटे संयुक्त ०.०५ पीपीबी ओजोन (O3)और ५० g intranasalPS चूहों के लिए जोखिम । ध्यान रहे कि दापी को नीले रंग में, हरे रंग में ऐक्टिन और लाल रंग में ट्यूबलिन दिखाया गया है। 0.05 पीपीबी ओजोन (ओ3)और चूहों के लिए 50 माइक्रोन इंट्रानासल एलपीएस एक्सपोजर के बाद 0 एच और बी) 4 घंटे के बाद कम से कम माइटोट्रैकर दाग वाले माइटोट्रैकर की प्रतिनिधि छवियां। ध्यान दें कि DAPI नीले रंग में दिखाया गया है, और लाल रंग में कम mitotracker। स्केल बार = 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6:Bronchoalveolar lavage (BAL) साइटोस्केलेटल प्रोटीन और परिपत्रता विश्लेषण: बाल साइटोस्पिन ऐक्टिन और ट्यूबलिन के लिए दाग DAPI सामान्यीकृत मापदंडों के लिए विश्लेषण किया गया यानी, ए) ऐक्टिन से DAPI फ्लोरोसेंट तीव्रता (एफआई) अनुपात 0 और 4 एच पर, ख) तुबुलिन से DAPI फ्लोरोसेंट तीव्रता (एफआई) अनुपात 0 और 4 घंटे और सी पर) बाल सेल सेलुलरिटी 0 (n= 75 कोशिकाओं), 2 (n= 105 कोशिकाओं), 4 (n= 66 कोशिकाओं), 24 (n= 31 कोशिकाओं), 36 (n= 154 सेल) एच पर। चूंकि ओ3 और एलपीएस एक्सपोजर के तुरंत बाद कुछ प्रायोगिक प्रयोग भी किए गए थे, यानी 2 एच टाइम-पॉइंट पर, हमने ओ3के तात्कालिक प्रभावों को उजागर करने के लिए 2 एच टाइम-पॉइंट से कुछ बहुत जल्दी बाल सेलुलरिटी विश्लेषण भी शामिल किया । रेखांकन ए-सी के लिए, 0 एच नीले रंग में, लाल रंग में 2 घंटे, हरे रंग में 4 घंटे, बैंगनी में 24 घंटे और नारंगी डेटा अंक में 36 घंटे का प्रतिनिधित्व किया है। * पी<0.05 का प्रतिनिधित्व करता है, ** पी<0.01 का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7:Bronchoalveolar lavage (बाल) इंट्रासेलुलर और प्लाज्मा झिल्ली स्थिति: बाल कोशिकाओं महत्वपूर्ण दाग के लिए दाग थे, कैल्शियम (हरे रंग में) और ethidium homodimers/EthHD (लाल रंग में) के रूप में प्रतिनिधि ऊपरी छवि पैनलों में दिखाया गया है के रूप में एक में) 0, बी) 24 और सी) 36 एच ओ 3 और एलपीएस जोखिम के बाद । स्केल बार = 200 माइक्रोन। बाल साइटोस्पिन DAPI (नीले रंग में), एटीपी (हरे रंग में) और Ly6G (लाल रंग में) के लिए इम्यूनोडांडा था। प्रतिनिधि छवियों को ओ3 और एलपीएस एक्सपोजर के बाद ए) 0 और बी) 24 घंटे में निचले छवि पैनलों में दिखाया गया है। स्केल बार = 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 8
चित्रा 8:Bronchoalveolar lavage (बाल) माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन एटीपी, लिसोसोमल प्रोटीन Ly6G और सेल आकार विश्लेषण: इम्यूनोडांग बाल कोशिकाओं को डीएपीआई के लिए सामान्यीकृत किया गया था एक गणना करने के लिए) एटीपी α से DAPI फ्लोरोसेंट तीव्रता (FI) अनुपात और बी) Ly6G से डीए फिपी अनुपात, 0 और 24 घंटे के बाद ओ3 और एलपीएस एक्सपोजर । इम्यूनोटांग बाल कोशिकाओं को भी उनके एक के लिए विश्लेषण किया गया) सबसे लंबे समय तक यानी, फेरेट व्यास और बी) परिधि, 0, 2, 4, 24 और३६ घंटे के बाद ओ 3 और एलपीएस एक्सपोजर । रेखांकन ए-डी के लिए, 0 एच (एन = 119 कोशिकाओं) नीले रंग में, 2 एच (n= 105 कोशिकाओं) लाल रंग में, 4 घंटे (n= 66 कोशिकाओं) हरे रंग में, 24 घंटे (n = 309 कोशिकाओं) बैंगनी में और 36 एच (n= 154 कोशिकाओं) नारंगी डेटा अंक में प्रतिनिधित्व किया है। * पी<0.05 का प्रतिनिधित्व करता है, ** पी<0.01 का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 9
चित्रा 9:Bronchoalveolar lavage (बाल) इंट्रासेलुलर फेनोटाइपिंग: बाल कोशिकाओं DAPI के लिए इम्यूनोडांडा था (नीले रंग में), NK1.1 (हरे रंग में), Gr1 (लाल में) और CX3CR1 (मजेंटा में) के रूप में एक में प्रतिनिधि ऊपरी छवि पैनलों में दिखाया गया है) 0, बी) 24 और सी) 36 एच O 3 और LPS जोखिम के बाद । स्केल बार = 50 माइक्रोन. बाल साइटोस्पिन एटीपी (नीले रंग में), की-67 (हरे रंग में), सीडी 61 (लाल रंग में) और एंजियोस्टैटिन (मैजेंटा में) के लिए इम्यूनोडांडा हुआ था। प्रतिनिधि छवियों को ओ3 और एलपीएस एक्सपोजर के बाद ए) 0, बी) 24 और सी) 36 घंटे में निचले छवि पैनलों में दिखाया गया है। स्केल बार = 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 10
चित्रा 10:ब्रोंकोल्वेलर लावगे (बाल) माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन एटीपी, lysosomal प्रोटीन Gr1, इंट्रासेलुलर CX3CR1 और एंजियोस्टैटिन विश्लेषण: इम्यूनोडांग बाल कोशिकाओं को डीएपीआई के लिए सामान्यीकृत किया गया था ए की गणना करने के लिए) एनके1.1 से DAPI फ्लोरोसेंट तीव्रता (एफआई) अनुपात, बी) जीआर 1 से DAPI FI अनुपात और सी) CX3CR1 से डीएपीआई एफआई अनुपात, ओ 3 और एलपीएस एक्सपोजर के बाद 0, 24 और36 एच पर। इम्यूनोडांगेड बाल कोशिकाओं को सीडी 61 के लिए सामान्यीकृत किया गया था ए की गणना करने के लिए) एटीपी को डेपी फ्लोरोसेंट तीव्रता (एफआई) अनुपात बी) की-67 से डीएपीआई एफआई अनुपात और बी) एंजियोस्टेटिन (आंग) से डीएपीआई एफआई अनुपात, ओ 3 और एलपीएस एक्सपोजर के बाद 0, 24 और36 घंटे पर। रेखांकन ए-एफ के लिए, 0 एच (एन = 21 कोशिकाओं) को नीले रंग में, 24 एच (एन = 796 कोशिकाओं) को लाल रंग में और 36 एच (एन = 2692 कोशिकाओं) को हरे डेटा बिंदुओं में दर्शाया गया है। * पी<0.05 का प्रतिनिधित्व करता है, ** पी<0.01 का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 11
चित्रा 11:फेफड़ों हेमेटॉक्सीलिन और ियोसिन (एचएंडई) हिस्टोलॉजी । ओजोन (ओ3)और एलपीएस ने संयुक्त ओ 3 और एलपीएस एक्सपोजर के बाद फेफड़ों के क्रायोसेक्शन एचएंडई हिस्टोलॉजी को 0, 24 और36 घंटे पर प्रेरित किया । अल्वियोलर एपिथेलियल क्षति के क्षेत्रों को ठोस काले तीर और काले तीर सिर द्वारा एंडोथेलियल क्षति द्वारा चिह्नित किया जाता है। येलो एस्टेरिस्क (*) अल्वियोलर सेप्टल क्षेत्रों में ल्यूकोसाइट्स के पैच का प्रतिनिधित्व करते हैं। A = alveolar अंतरिक्ष, बी = ब्रोंकस, वी = वास्कुलेचर, स्केल बार = बाएं हाथ के छवि पैनलों के लिए 100 माइक्रोन और दाईं ओर छवि पैनलों के लिए 50 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

S.No। प्राथमिक एंटीबॉडी इनवितरोजन सेकेंडरी एंटीबॉडी
1 माउस एंटी-NK1.1 IgG2a कापा (क्लोन PK136), इनविट्रोजन कैटलॉग नंबर 16-5941-82 एलेक्सा 488 संयुग्मित बकरी एंटी-माउस आईजीजी (एच +एल), कैटलॉग नं. A11002
2 चूहा विरोधी Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b कापा (क्लोन RB6-8C5), Invitrogen सूची संख्या 53-5931-82 एलेक्सा ५६८ संयुग्मित बकरी विरोधी चूहा IgG (एच + एल), सूची नहीं । A11077
3 खरगोश विरोधी CX3CR1 आईजीजी (RRID 467880), इनविटरोजन सूची संख्या 14-6093-81 एलेक्सा ६३३ संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश IgG (एच + एल), सूची नहीं । A21070
4 माउस एंटी-एटीपी5ए1 IgG2b (क्लोन 7H10BD4F9), इनविट्रोजन कैटलॉग नंबर 459240 एलेक्सा 488 संयुग्मित बकरी एंटी-माउस आईजीजी (एच +एल), कैटलॉग नं. A11002
5 चूहा विरोधी Ly6G IgG2a कापा (क्लोन 1A8), Invitrogen सूची संख्या 16-9668-82 एलेक्सा ५६८ संयुग्मित बकरी विरोधी चूहा IgG (एच + एल), सूची नहीं । A11077
6 माउस एंटी-एटीपी5एगिग2बी (क्लोन 3D5AB1), थर्मोफिशर कैटलॉग नं। ए-21351 एलेक्सा ३५० संयुग्मित बकरी विरोधी माउस आईजीजी (एच + एल), सूची नहीं । A11045
7 चूहा विरोधी Ki-67 (क्लोन SolA15) IgG2a कापा, Invitrogen सूची संख्या 14-5698-82 एलेक्सा ५६८ संयुग्मित बकरी विरोधी चूहा IgG (एच + एल), सूची नहीं । A11077
8 आर्मेनियाई हम्सटर एंटी-सीडी 61 (क्लोन 2C9। G2) IgG1 कापा, बीडी कैटलॉग नंबर 553343 एलेक्सा ५६८ संयुग्मित बकरी विरोधी हम्सटर आईजीजी (एच + एल), सूची नहीं । A21112
9 खरगोश विरोधी एंजियोस्टेटिन (माउस एए 98-116) आईजीजी, Abcam सूची नहीं । ab2904 एलेक्सा ६३३ संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश IgG (एच + एल), सूची नहीं । A21070

तालिका 1: नमूनों से तैयार साइटोस्पिन को दाग देने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी संयोजन।

पढ़ें-आउट बाल एलवीपी पंजाब एसबीएम एफबीएम
टीएलसी * * + 24 घंटे में; - 36, 72 घंटे में + 72 घंटे पर
न्यूट्रोफिल्स + 24, 36, 72 घंटे में + 24 घंटे में * + 4, 24, 36, 72 घंटे में + 4, 24, 36, 72 घंटे में
प्रोटीन + 36 घंटे पर * एन.डी. एन.डी. एन.डी.
केमोकी प्रोफाइल - eotaxin-2, आईएल-2 के लिए 4, 24, 36, 72 घंटे में + Eotaxin के लिए-1/2, आईएल-2, TNFα, IFNγ, CX3CL1, CCL27, IL-16, CXCL5, CXCL10, MIP3ο के लिए 4 घंटे में; + 36 घंटे पर SDF1α के लिए एन.डी. एन.डी. एन.डी.
सेल का आकार + 4 घंटे में; - 24, 36 घंटे में एन.डी. एन.डी. एन.डी. एन.डी.
एटीपी α - 24 घंटे में एन.डी. एन.डी. एन.डी. एन.डी.
NK1.1/Ki-67 + 24 घंटे में एन.डी. एन.डी. एन.डी. एन.डी.
ATPο/Gr1/CX3CR1/ANG + 24, 36 घंटे में एन.डी. एन.डी. एन.डी. एन.डी.

तालिका 2: विभिन्न डिब्बों में अध्ययन के मुख्य निष्कर्षों का एक व्यापक सारांश। * कोई परिवर्तन नहीं दर्शाता है, + एक वृद्धि को दर्शाता है और - मापा मापदंडों में कमी को दर्शाता है। बाल ब्रोंचो-अल्वेरलाहर लावेज तरल पदार्थ को दर्शाता है, एलवीपी फेफड़ों के संवहनी परफ्यूरेट को दर्शाता है, पीबी परिधीय रक्त को दर्शाता है, एसबीएम स्टर्नम बोन मैरो को दर्शाता है और एफबीएम फीमर बोन मैरो डिब्बे को दर्शाता है।

अनुपूरक चित्रा 1: Gr1 और CD11b इम्यूनोस्टेपिंग: DAPI से प्रतिनिधि छवियां (नीले रंग में), Gr1 (हरे रंग में) और CD11b (लाल रंग में) फ्लोरोसेंट इम्यूनोडांडा साइटोस्पिन फेफड़ों के संवहनी perfusate (एलवीपी), स्टर्नल बोन मैरो (बीएम) और फीमर बोन मैरो (बीएम) डिब्बों के संयुक्त ओ 3 और एलपीएस एक्सपोजर के बाद0, 4 और 24 घंटे पर । स्केल बार = 50 माइक्रोन. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक मूवी 1 0 एच टाइम-पॉइंट (यानी बेसलाइन) से बाल मैक्रोफेज की त्रि-आयामी प्रदान की गई मात्रा, नाभिक (नीले रंग में दिखाया गया है) और एटीपी के लिए इम्यूनोडैंग (हरे रंग में दिखाया गया) और Ly6G (लाल रंग में दिखाया गया) दिखा। कृपया इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक फिल्म 2: संयुक्त ओ3 और एलपीएस एक्सपोजर के बाद 24 एच समय-बिंदु से बाल मैक्रोफेज की त्रि-आयामी प्रदान की गई मात्रा, नाभिक (नीले रंग में दिखाया गया है) और एटीपी के लिए इम्यूनोडैंग (हरे रंग में दिखाया गया) और Ly6G (लाल रंग में दिखाया गया) दिखा। एक परमाणु एटीपी पॉजिटिव बॉडीज के साथ-साथ एक खंडित सेल की मौजूदगी पर ध्यान दें। कृपया इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

वर्तमान अध्ययन में प्रस्तुत तरीकों फेफड़ों की सूजन के दौरान कई सेलुलर घटनाओं का अध्ययन करने के लिए कई डिब्बे विश्लेषण की उपयोगिता पर प्रकाश डाला । हमने तालिका 2में निष्कर्षों का सारांश दिया है । हम और कई प्रयोगशालाओं बड़े पैमाने पर इंट्रानासल एलपीएस instillation है, जो फेफड़ों के न्यूट्रोफिल, जो 6-24 घंटे के बीच चोटियों के बाद जो, संकल्प में kicks की तेजी से भर्ती द्वारा चिह्नित है के लिए murine प्रतिक्रिया का अध्ययन किया है । और हाल ही में, हमने दिखाया है कि उप-नैदानिक ओ3 (2 एच के लिए 0.05 पीपीएम पर) अकेले C57BL/6NJ उप-तनाव15में महत्वपूर्ण फेफड़ों की क्षति को प्रेरित कर सकता है, जिसे फेफड़ों के संवहनी डिब्बे में न्यूट्रोफिल के विभाजन से चिह्नित किया जाता है, जबकि बाल में क्षतिग्रस्त मैक्रोफेज और मलबे देखे गए थे, इस प्रकार ओ3की भड़काऊ क्षमता का संकेत मिलता है। उस मॉडल में हमने ओ3 प्रेरित अल्वेलर एपिथेलियल क्षति और जिसके परिणामस्वरूप अल्वेलर मैक्रोफेज द्वारा फागोसाइटोसिस के परिणामस्वरूप अल्वेलर डिब्बे में न्यूट्रोफिल की अनुपस्थिति देखी। न केवल हमने ओ3 मॉडल में बाह्राश डीएनए और मलबे का निरीक्षण किया, बाल मैक्रोफेज डिस्मॉर्फिक थे जो उच्च आईएल-16 स्तरों के साथ सहसंबंधित थे, आमतौर पर न्यूट्रोफिल मरने से जारी एक अलार्मिन। इसलिए, यह समझना महत्वपूर्ण है कि क्या ये उप-नैदानिक ओ3 स्तर अन्यथा मजबूत C57BL/6J उप-तनाव में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं, जैसा कि अधि-शारीरिक ओ3 स्तर21के साथ उल्लेख किया गया है। हमने देखा कि संयुक्त ओ3 और इंट्रानासल बैक्टीरियल एंडोटॉक्सिन ने फेफड़े के साथ-साथ प्रणालीगत डिब्बों में न्यूट्रोफिल भर्ती को प्रेरित किया, जो बाल में क्षतिग्रस्त न्यूट्रोफिल की उपस्थिति, फेफड़े संवहनी परफ्यूसेट, स्टर्नल और फीमर बोन मैरो डिब्बों 4 घंटे से शुरू होता है जो 24, 36 और 72 घंटे में उच्च बना रहा। सेलुलर क्षति को कॉर्टिकल ऐक्टिन और लैमेलिपोडिया के नुकसान और बाल ल्यूकोसाइट्स में सेल आकार में वृद्धि के रूप में दर्शाया गया था; बाल डिब्बे में विश्लेषण किए गए न्यूट्रोफिल ने माइक्रोट्यूबुल, एटीपी सिंथेस कॉम्प्लेक्स वी सबयूनिट α (एटीपीडब्ल्यूवाई) और सक्रिय माइटोकॉन्ड्रियल दाग के लिए सकारात्मक प्रतिक्रियाशीलता को काफी कम प्रदर्शित किया। फेफड़े सेलुलर एटीपी सिंथेस कॉम्प्लेक्स वी सबयूनिट β (एटीपी) के साथ-साथ एटीपी लिगांड, एंजियोस्टैटिन(टेबल 2)की अभिव्यक्ति को बढ़ाकर इस संयुक्त एक्सपोजर के अनुकूल हो जाते हैं।

सूजन का अध्ययन करने का एक महत्वपूर्ण पहलू केमोकीन ग्रेडिएंट के साथ सेलुलर परिगलन को समझना है। यह ध्यान रखना दिलचस्प था कि परिधीय रक्त और फीमर बोन मैरो डिब्बे को छोड़कर कुल ल्यूकोसिटे काउंट अलग नहीं थे। इन टिप्पणियों ने हमें सेलुलर साइटोस्केलेल पैटर्न, आकार और इम्यूनोफेनोटाइपिंग की जांच करने के लिए नेतृत्व किया। हमने बाल कोशिकाओं में लैमेलिपोडिया और सक्रिय माइटोकॉन्ड्रिया का नुकसान देखा जो सेलुलर क्षति का संकेत देता है। कॉर्टिकल ऐक्टिन ऑर्गनाइजेशन इंटर-सेलुलर सिग्नलिंग और परिणामी बाधा गुणों की एक अनिवार्य विशेषता है। साइटोस्केलेल विघटन इस प्रकार सेल क्षति का एक अच्छा मार्कर है जब परिगलन का आकलन करने के लिए स्पष्ट नहीं है। यहां तक कि ३६ घंटे में, बाल कोशिकाओं ने प्लाज्मा झिल्ली से समझौता किया था जैसा कि एथिडियम होमाडिमर स्टेनिंग द्वारा इंगित किया गया था । संयुक्त एक्सपोजर के तुरंत बाद, बाल में न्यूट्रोफिल ने Gr1 सकारात्मकता दिखाई, लेकिन CD11b के लिए एक अनिवार्य रूप से नकारात्मक धुंधला, जो अल्वियोलर सेप्टल रेंगने22में अग्रणी किनारे और एड्स की ओर स्थानीयकरण करता है। इस प्रकार, संयुक्त एक्सपोजर सीडी 11बी प्रोटीन से रहित असामान्य न्यूट्रोफिल का संचय करता है। एलपीएस CD11b के डाउनरेगुलेशन को प्रेरित नहीं करता है। इस प्रकार, यह सुविधा न्यूट्रोफिल को ओ3 प्रेरित क्षति का परिणाम है।

बाल कोशिकाओं में उच्च NK1.1, Ki-67 और 0 घंटे(तालिका2) की तुलना में 24 घंटे पर एटीपी धुंधला के साथ एक अद्वितीय प्रोटीन हस्ताक्षर था । बाल कोशिकाओं में 0 एच(टेबल2) की तुलना में 24 के साथ-साथ 36 घंटे में Gr1, CX3CR1 के साथ-साथ एंजियोस्टैटिन की उच्च अभिव्यक्ति थी। इन निष्कर्षों को एक्सपोजर(टेबल2) के बाद 24 और 36 घंटे में बाल में उत्तरोत्तर अधिक Gr1 सकारात्मक न्यूट्रोफिल की उपस्थिति से पुष्ट किया गया था। 24 घंटे में NK1.1, CX3CR1 और Gr1 सकारात्मक कोशिकाओं की उपस्थिति, बाल में मोनोन्यूक्लियर और पॉलीमॉर्फोक्यूक्लियर कोशिकाओं दोनों की भर्ती को इंगित करती है। मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के बीच, CX3CR1 सकारात्मक कोशिकाओं में 36 ही पर प्रभुत्व है या तो इंटरस्टिटियल मैक्रोफेज, प्लेटलेट्स या मोनोसाइट व्युत्पन्न मैक्रोफाज की उपस्थिति का संकेत है। मार्कर के रूप में की-67 और एंजियोस्टैटिन दोनों को शामिल करने से हमें बाल में क्रमशः प्रोलिफेरेटिव बनाम एंटी-एंजियोजेनिक परिवेश के बारे में सूचित किया गया। इस प्रकार, संयुक्त ओ3 और एलपीएस एक्सपोजर शायद मैक्रोफेज के प्रसार का कारण बनते हैं जिसके बाद न्यूट्रोफिलिक घुसपैठ के कारण एंटी-एंजियोजेनिक परिवेश होता है। एटीपी धुंधला में क्षणिक वृद्धि 24 घंटे में बाल ल्यूकोसाइट्स के बढ़ते अस्तित्व की दिशा में एक महत्वपूर्ण अनुकूलन का संकेत हो सकता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एटीपी एंजियोस्टैटिन से बांध सकता है और लंबे समय तक अस्तित्व6,23को रोक सकता है, जो वास्तव में 36 घंटे के बाद एक्सपोजर पर निचले की-67 सूचकांक में परिलक्षित होता है।

हालांकि बाल प्रोटीन ३६ घंटे में सबसे अधिक था, और नहीं अंय समय अंक, फेफड़ों संवहनी perfusate से पहले या जोखिम के बाद प्रोटीन एकाग्रता में कोई परिवर्तन नहीं दिखा था । यह संभव है कि संवहनी डिब्बे प्रभावित नहीं हुआ था, लेकिन यह सबसे अधिक संभावना इलेक्ट्रॉन से भरपूर अमीनो-एसिड जैसे मेथियोनाइन, हिस्टिडीन और सिस्टीन के ऑक्सीकरण के कारण ओ3 प्रेरित मुक्त कण और परिणामी सर्फेक्टेंट प्रोटीन (एसपी-ए, एसपी-बी) क्षरण के साथ-साथ संवहनी रिसाव24,25, 26के ऑक्सीकरण के कारण चकित है। बाल आईजीएम, बाल सर्फेक्टेंट प्रोटीन, बाल एल्बुमिन या डाई एक्सेस्ट्रेवेशन (इवांस ब्लू या फ्लोरोसेइन आइसो-थियासाइनेट (एफटीसी) डेक्सट्रान का उपयोग करके) एपिथेलियल और एंडोथेलियल अखंडता का आकलन करने के लिए वैकल्पिक तरीके हैं।

दिलचस्प बात यह है कि 4 एच टाइम-पॉइंट पर इओटॉक्सिन-2 और आईएल-2 के फेफड़ों के संवहनी पर्फ्यूसेट स्तर को तीव्रता से बढ़ाया गया था। बाल eotaxin-2 और आईएल-2 के स्तर को एक्सपोजर के बाद काफी कम कर दिया गया था, जो या तो अल्वेलर अंतरिक्ष में गिरावट या फेफड़ों के वाक्यूलेचर में फंसाने का संकेत देता है। फेफड़ों के संवहनी परफ्यूसेट में विश्लेषण किए गए अधिक केमोकिन्स ने इओसिनोफिल केमोकिन (इओटक्सिन-1), टीएनएफ α के उच्च स्तर का पता चला, IFNγ, लिम्फ-नोड ने मोनोन्यूक्लियर सेल केमोकिन (CX3CL1, CXCL10, CCL27, MIP33,), एपिथेलियल व्युत्पन्न न्यूट्रोफिल केमोकिन (सीएक्ससीएल5), और न्यूट्रोफिल 27 के माध्यमिक नेक्रोसिस के बाद जारी किया गया अलार्मिन(आईएल-16),लेकिन एक्सपोजर के बाद केवल 4 घंटे में। 36 घंटे में, बोन मैरो व्युत्पन्न पैन-ल्यूकोसाइट केमोकिन, एसडीएफ1α28,फेफड़ों के संवहनी परफ्यूसेट में अधिक था। बोन मैरो व्युत्पन्न SDF1α सांद्रता साइटोलॉजी निष्कर्षों के साथ सहसंबंधित है जिससे CD11b और Gr1 सकारात्मक कोशिकाओं को जोखिम के बाद 24 और ३६ घंटे में प्रचुर मात्रा में हैं । इस प्रकार, केमोकाइन और साइटोलॉजिकल प्रोफाइल बोन मैरो डिब्बों (तालिका 2) से महत्वपूर्ण ल्यूकोसाइट जुड़ाव को दर्शाते हैं।

हमारे पशु मॉडल और अनुसंधान के निष्कर्ष वास्तविक दुनिया की स्थितियों को ध्यान में रखतेहुए महत्वपूर्ण हैं जिससे शहरी सेटिंग्स में जीवित प्राणियों की संभावना ऐसे उप-नैदानिक ओ 3 और संक्रामकएजेंटों 8के संपर्क में आती है। हमारा मुरीन मॉडल एक आसानी से सुलभ प्रोटोटाइप के रूप में कार्य करता है जिसे इनवेसिव सेल डेथ और संक्रमणों के फेफड़े और अतिरिक्त फेफड़े के तंत्र का अध्ययन करने के लिए स्तर-2 रोकथाम प्रयोगशालाओं में पुन: पेश किया जा सकता है, जैसा कि COVID-19 संक्रमण29के मामले में है। भविष्य के अध्ययनों को दीर्घकालिक सेलुलर अनुकूलनों की जांच करने के लिए मरम्मत या देर चरण अनुवर्ती कार्रवाई के साथ-साथ पुराने एक्सपोजर की कल्पना करने के लिए निर्देशित किया जाना चाहिए। इस प्रकार, जीवित अंग15 और पशु 16,30,31इमेजिंग तकनीकों से जुड़े व्यापक फेफड़ों की सूजन अध्ययनोंके लिए, वर्तमान अंत बिंदु अध्ययन डिजाइन संयुक्त कम खुराक ओ3 (सेल डेथ) और एलपीएस (प्रतिरक्षा उत्तेजना) के लिए मेजबान प्रतिक्रिया में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है, और इस प्रकार तीव्र फेफड़ों की चोट के तंत्र को समझने।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के हित या खुलासे के लिए कोई संघर्ष नहीं करना है ।

Acknowledgments

किए गए शोध को राष्ट्रपति के NSERC अनुदान के साथ-साथ सिल्विया फेडोरुक कनाडाई सेंटर फॉर न्यूक्लियर इनोवेशन से स्टार्ट-अप फंड द्वारा वित्त पोषित किया जाता है । सिल्विया फेडोरुक कनाडाई सेंटर फॉर न्यूक्लियर इनोवेशन को इनोवेशन साकटचेवान द्वारा वित्त पोषित किया जाता है । फ्लोरेसेंस इमेजिंग WCVM इमेजिंग सेंटर में किया गया था, जो NSERC द्वारा वित्त पोषित है । जेसिका ब्रोकोस (एमएससी स्टूडेंट) और मनप्रीत कौर (एमएससी स्टूडेंट) को सिल्विया फेडोरुक कैनेडियन सेंटर फॉर न्यूक्लियर इनोवेशन से स्टार्ट-अप फंड्स द्वारा फंड दिया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
33-plex Bioplex chemokine panel Biorad 12002231
63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives Leica HCX PL APO CS (11506188)
Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Invitrogen A11045
Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Invitrogen A11002
Alexa 488 conjugated phalloidin Invitrogen A12370
Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1A Millipore 05-829X-555
Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L) Invitrogen A21112
Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L) Invitrogen A11077
Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen A21070
Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa BD Pharmingen 553343
C57BL/6 J Mice Jackson Laboratories 64
Confocal laser scanning microscope Leica Leica TCS SP5
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) Invitrogen D1306 aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C
Inverted fluorescent wide field microscope Olympus Olympus IX83
Ketamine (Narketan) Vetoquinol 100 mg/ml Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock
Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit Invitrogen L3224
Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9) Invitrogen 459240
Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1) Invitrogen A-21351
Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136) Invitrogen 16-5941-82
Pierce 660 nm protein assay Thermoscientific 22660
Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG Abcam ab2904
Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880) Invitrogen 14-6093-81
Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa Invitrogen 14-5698-82
Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8) Invitrogen 16-9668-82
Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5) Invitrogen 53-5931-82
Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2) BD Pharmingen 553142
Reduced mitotracker orange Invitrogen M7511
Xylazine (Rompun) Bayer 20 mg/ml Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhattacharya, J., Matthay, M. A. Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury. Annual Review of Physiology. 75, 593-615 (2013).
  2. Aulakh, G. K. Neutrophils in the lung: "the first responders". Cell Tissue Research. , (2017).
  3. Aulakh, G. K., Suri, S. S., Singh, B. Angiostatin inhibits acute lung injury in a mouse model. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (1), 58-68 (2014).
  4. Schneberger, D., Aulakh, G., Channabasappa, S., Singh, B. Toll-like receptor 9 partially regulates lung inflammation induced following exposure to chicken barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 11 (1), 1-10 (2016).
  5. Shah, D., Romero, F., Stafstrom, W., Duong, M., Summer, R. Extracellular ATP mediates the late phase of neutrophil recruitment to the lung in murine models of acute lung injury. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 152-161 (2014).
  6. Aulakh, G. K., Balachandran, Y., Liu, L., Singh, B. Angiostatin inhibits activation and migration of neutrophils. Cell Tissue Research. , (2013).
  7. Cakmak, S., et al. Associations between long-term PM2.5 and ozone exposure and mortality in the Canadian Census Health and Environment Cohort (CANCHEC), by spatial synoptic classification zone. Environment International. 111, 200-211 (2018).
  8. Dauchet, L., et al. Short-term exposure to air pollution: Associations with lung function and inflammatory markers in non-smoking, healthy adults. Environment International. 121, Pt 1 610-619 (2018).
  9. Delfino, R. J., Murphy-Moulton, A. M., Burnett, R. T., Brook, J. R., Becklake, M. R. Effects of air pollution on emergency room visits for respiratory illnesses in Montreal, Quebec. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 568-576 (1997).
  10. Peterson, M. L., Harder, S., Rummo, N., House, D. Effect of ozone on leukocyte function in exposed human subjects. Environmental Research. 15 (3), 485-493 (1978).
  11. Rush, B., et al. Association between chronic exposure to air pollution and mortality in the acute respiratory distress syndrome. Environmental Pollution. 224, 352-356 (2017).
  12. Rush, B., Wiskar, K., Fruhstorfer, C., Celi, L. A., Walley, K. R. The Impact of Chronic Ozone and Particulate Air Pollution on Mortality in Patients With Sepsis Across the United States. Journal of Intensive Care Medicine. , (2018).
  13. Stieb, D. M., Burnett, R. T., Beveridge, R. C., Brook, J. R. Association between ozone and asthma emergency department visits in Saint John, New Brunswick, Canada. Environmental Health Perspectives. 104 (12), 1354-1360 (1996).
  14. Thomson, E. M., Pilon, S., Guenette, J., Williams, A., Holloway, A. C. Ozone modifies the metabolic and endocrine response to glucose: Reproduction of effects with the stress hormone corticosterone. Toxicology and Applied Pharmacology. 342, 31-38 (2018).
  15. Aulakh, G. K., Brocos Duda, J. A., Guerrero Soler, C. M., Snead, E., Singh, J. Characterization of low-dose ozone-induced murine acute lung injury. Physiological Reports. 8 (11), 14463 (2020).
  16. Aulakh, G. K., et al. Quantification of regional murine ozone-induced lung inflammation using [18F]F-FDG microPET/CT imaging. Scientific Reports. 10 (1), 15699 (2020).
  17. Charavaryamath, C., Keet, T., Aulakh, G. K., Townsend, H. G., Singh, B. Lung responses to secondary endotoxin challenge in rats exposed to pig barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 3, London, England. 24 (2008).
  18. Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation. Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).
  19. Southam, D. S., Dolovich, M., O'Byrne, P. M., Inman, M. D. Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position, and anesthesia. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 282 (4), 833-839 (2002).
  20. Aulakh, G. K. Lack of CD34 produces defects in platelets, microparticles, and lung inflammation. Cell Tissue Research. , (2020).
  21. Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone. Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).
  22. Yipp, B. G., et al. The Lung is a Host Defense Niche for Immediate Neutrophil-Mediated Vascular Protection. Science Immunology. 2 (10), (2017).
  23. Lee, T. Y., et al. Angiostatin regulates the expression of antiangiogenic and proapoptotic pathways via targeted inhibition of mitochondrial proteins. Blood. 114 (9), 1987-1998 (2009).
  24. Hawkins, C. L., Davies, M. J. Detection, identification, and quantification of oxidative protein modifications. Journal of Biological Chemistry. 294 (51), 19683-19708 (2019).
  25. Hemming, J. M., et al. Environmental Pollutant Ozone Causes Damage to Lung Surfactant Protein B (SP-B). Biochemistry. 54 (33), 5185-5197 (2015).
  26. Oosting, R. S., et al. Exposure of surfactant protein A to ozone in vitro and in vivo impairs its interactions with alveolar cells. American Journal of Physiology. 262 (1), Pt 1 63-68 (1992).
  27. Roth, S., et al. Secondary necrotic neutrophils release interleukin-16C and macrophage migration inhibitory factor from stores in the cytosol. Cell Death & Discovery. 1, 15056 (2015).
  28. Kawaguchi, N., Zhang, T. T., Nakanishi, T. Involvement of CXCR4 in Normal and Abnormal Development. Cells. 8 (2), (2019).
  29. Gupta, A., et al. Extrapulmonary manifestations of COVID-19. Nature Medicine. 26 (7), 1017-1032 (2020).
  30. Aulakh, G. K., Kuebler, W. M., Singh, B., Chapman, D. 2017 IEEE Nuclear Science Symposium and Medical Imaging Conference (NSS/MIC). , 1-2 (2017).
  31. Aulakh, G. K., et al. Multiple image x-radiography for functional lung imaging. Physics in Medicine & Biology. 63 (1), 015009 (2018).

Tags

इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 169 ओजोन एलपीएस तीव्र फेफड़ों की सूजन F1F0 एटीपी सिंथेस (जटिल वी) उपइकाइयों प्रतिरक्षा फ्लोरोसेंट साइटोलॉजी आईएल-16
संयुक्त ओजोन और एलपीएस प्रेरित मुरीन तीव्र फेफड़ों की चोट के दौरान फेफड़ों के सेलुलर अनुकूलन की कल्पना
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Duda, J. A. B., Kaur, M., Aulakh, G. … More

Duda, J. A. B., Kaur, M., Aulakh, G. K. Visualizing Lung Cellular Adaptations during Combined Ozone and LPS Induced Murine Acute Lung Injury. J. Vis. Exp. (169), e62097, doi:10.3791/62097 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter