Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

تصور التكيفات الخلوية الرئة خلال الأوزون المشترك وLPS الناجمة عن إصابة الرئة مورين الحادة

Published: March 21, 2021 doi: 10.3791/62097
Automatic Translation
1, 1, 1
1Small Animal Clinical Sciences, Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan

Summary

تظهر الفئران المتعرضة للأوزون والبكتيريا مجتمعة موت الخلايا واسع الانتشار، بما في ذلك موت العدلات. لاحظنا التكيفات الخلوية مثل تعطيل اللاميلبوديا الهيكل الخلوي، وزيادة التعبير الخلوي من وحدة فرعية V ATP synthase المعقدة β والأنجيوستاتين في الحمم الهوائية القصبية، وقمع الاستجابة المناعية الرئة وتأخير تجنيد العدلات.

Abstract

تواجه الرئتين باستمرار الإهانات المباشرة وغير المباشرة في شكل حالات التهابية معقمة (جزيئات أو سموم تفاعلية) ومعدية (بكتيرية أو فيروسية أو فطرية). قد تؤدي استجابة المضيف الساحقة إلى تعرض التنفس للخطر وإصابة الرئة الحادة ، والتي تتميز بتوظيف العدلات الرئوية نتيجة للاستجابة المناعية المضيفة المنطقية المرضية والتخثرية وإعادة عرض الأنسجة. تعتبر الطرق المجهرية الحساسة لتصور وقياس التكيفات الخلوية الرئوية المورينية ، استجابة للأوزون منخفض الجرعة (0.05 صفحة في المليون) ، وهو ملوث بيئي قوي بالاشتراك مع شحم الدهون البكتيري ، وهو ناهض TLR4 ، حاسمة من أجل فهم آليات الالتهاب والإصلاح المضيفة. نحن نصف تحليل مجهري فلوري شامل لمختلف مقصورات الرئة والجسم الجهازية ، وهي سائل الحمم الهوائية الحويصلات ، وثقب الأوعية الدموية الرئوية ، والتبريد الرئوي الأيسر ، وثقب نخاع العظم القصي. نظهر تلف الضامة السنفية ، العدلات ، الأنسجة الرئوية ، وكذلك خلايا نخاع العظام في ارتباط مع استجابة مناعية متأخرة (تصل إلى 36-72 ساعة) تتميز بتدرجات chemokine منفصلة في المقصورات التي تم تحليلها. وبالإضافة إلى ذلك، نقدم مصفوفة الرئة خارج الخلية والتفاعلات الخلوية الخلوية الخلوية (أكتين، توبولين)، الميتوكوندريا وأنواع الأكسجين التفاعلية، البلازمينوجين المضادة للتخثر، وشظايا الببتيد المضادة للأجيوجين أنجيوستاتين، والميتوكوندريا ATP synthase مجمع V الوحدات الفرعية، α β. هذه العلامات البديلة، عندما تستكمل مع المقايسات الكافية في المختبر القائم على الخلايا وتقنيات التصوير الحيواني في الجسم الحي مثل المجهر داخل الجسم، يمكن أن توفر معلومات حيوية نحو فهم استجابة الرئة لعوامل المناعة الجديدة.

Introduction

إصابة الرئة الحادة (ALI) هي استجابة مرضية حاسمة للرئتين للمحفزات المعدية أو غيرها من المحفزات الضارة التي تتميز بالتنشيط المتزامن للجهاز المناعي التخثري والشظي والفطري1. العدلات الشعور على الفور الميكروبات وكذلك أنماط الضرر داخل الخلايا من خلال مستقبلات مثل حصيلة (TLR) الأسرة2،3،4. تطلق العدلات السيتوكينات مسبقة التشكيل ومحتويات الحبيبات السامة للخلايا ، والتي يمكن أن تسبب بعد ذلك تلفا جانبيا في الأنسجة. ويشوب الضرر السنفي الذي أعقب ذلك مع موت الخلايا الثانوية مما يؤدي إلى إطلاق جزيئات مثل أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)5، وبالتالي وضع في حلقة مفرغة من خلل التنظيم المناعي.

مشكلة لم تحل في فهم ALI تتعلق بمسألة كيفية بدء الإصابة داخل الغشاء الحويصلي. مجمع نقل الإلكترون V، F1F0 ATP synthase، هو بروتين الميتوكوندريا المعروف أن أعرب في كل مكان، على الخلية (بما في ذلك البطانية، الكريات البيض، الظهارية) غشاء البلازما أثناء الالتهاب. هيكل الخلية الخلوي الذي يتكون من أكتين وتوبولين، يؤوي العديد من شكل الخلية وتعديل الوظائف وكذلك البروتينات الميتوكوندريا، على التوالي. لقد أظهرنا مؤخرا أن الحصار المفروض على SYNTHASE ATP بواسطة جزيء داخلي، أنجيوستاتين، يسكت تجنيد العدلات، والتنشيط وlipopolysaccharide (LPS) الناجم عن التهاب الرئة6. وهكذا، قد تنظم كل من الآليات الكيميائية الحيوية (ATP synthase) والمناعة (TLR4) حاجز الحويصلات أثناء التهاب الرئة.

التعرض للأوزون (O3)،وهو ملوث بيئي، يضعف وظائف الرئة، ويزيد من التعرض للالتهابات الرئوية، ومستويات منخفضة قصيرة من التعرض O3 تزيد من خطر الوفيات في أولئك الذين يعانون من أمراض القلب والجهاز التنفسي الكامنة7،8،9،10،11،12،13،14. وهكذا، والتعرض لتركيزات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية من O3 يوفر نموذجا ذا مغزى من ALIلدراسةالآليات الأساسية للالتهاب 7،8. وقد أنشأت مختبرنا مؤخرا نموذج مورين من جرعة منخفضة O3 المستحثة ALI15. بعد إجراء جرعة والاستجابة الزمنية لتركيزات O3 منخفضة، لاحظنا أن التعرض ل0.05 ppm O3 لمدة 2 ساعة، يؤدي إلى إصابة الرئة الحادة التي تتميز الرئة ATP synthase مجمع β الفرعي الخامس (ATPа) والتعبير أنجيوستاتين، على غرار نموذج LPS. كشف التصوير الرئوي داخل الفيتية عدم تنظيم ال أكتين الحويصلات الدقيقة التي تشير إلى تلف الرئة، واجتثاث من أنواع الأكسجين التفاعلي الحاجز السني (ROS) مستويات (مما يدل على إلغاء إشارات الخلايا الأساسية) وإمكانات غشاء الميتوكوندريا (مما يشير إلى موت الخلايا الحادة) بعد التعرض 2 ساعة إلى 0.05 جزء في المليون O315 التي ترتبط مع الرئة غير المتجانسة 18FDG الاحتفاظ16،تجنيد العدلات وإطلاق السيتوكين، أبرزها IL-16 و SDF-1α. الرسالة التي تحظى بها دراساتنا الحديثة هي أن O 3 ينتجسمية عالية بشكل كبير عند التعرض بتركيزات أقل من الحدود المسموح بها البالغة 0.063 جزء في المليون أكثر من 8 ساعة (يوميا) للتعرض البشري. الأهم من ذلك ، لا يوجد فهم واضح حول ما إذا كانت هذه التعرضات دون السريرية O3 يمكن أن تعدل الآليات بوساطة TLR4 مثل السموم الداخلية البكتيرية17. وهكذا، درسنا نموذج التعرض O3 وLPS مزدوجة الضرب ولاحظنا التكيفات الخلوية المناعية وغير المناعية.

نحن نصف تحليل مجهري فلوري شامل لمختلف مقصورات الرئة والجسم الجهازية ، وهي سائل الحمم الهوائية الهوائية (أي ، BAL) الذي عينات من المساحات السنفية، وتغلغل الأوعية الدموية الرئة (أي LVP) أن عينات الأوعية الدموية الرئوية وانترستيتيوم الحاجز السنفي في حالة وجود حاجز البطانية للخطر، والتبريد الرئة اليسرى، للنظر في الكريات البيض parenchymal المقيمين وأتباع اليسار في أنسجة الرئة المحمى ، الدم المحيطي الذي يمثل الكريات البيض المتداولة ونخاع عظم القص والفخذ التي تتذوق المواقع القريبة والبادئة لتعبئة الخلايا الدموية أثناء الالتهاب ، على التوالي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد وافق مجلس أخلاقيات البحوث الحيوانية في جامعة ساسكاتشوان على تصميم الدراسة والتزم بالمبادئ التوجيهية للمجلس الكندي لرعاية الحيوان للاستخدام الإنساني للحيوانات. تم شراء الفئران الذكور C57BL/6J البالغ من العمر ستة أسابيع. ملاحظة: القتل الرحيم أي الحيوانات التي تتطور الخمول الشديد، والضائقة التنفسية أو غيرها من علامات الضيق الشديد قبل نقطة النهاية المقررة.

ملاحظة: إعداد ما يلي: 27-18 G إبرة حادة (سوف تعتمد على قطر القصبة الهوائية الماوس)، أنابيب PE الحجم المناسب لتناسب الإبرة حادة (جعل قنية PE لكل فأر)، قنية، 2 مقص حاد، 2 ملقط حاد (صغير)، 1 ملقط حاد (صغير)، 3 1 مل المحاقن، وأنابيب الميكروفوغ المسمى (لBAL، الدم، الأوعية الدموية وجمع نخاع العظام perfusate) وقوارير وصفت (لتثبيت الأنسجة)، أكياس العينة / cryovials لجمع الأنسجة، لفة خيط القطن الجزار (مقطعة إلى أربطة الحجم الكافي). جميع المواد الكيميائية المستخدمة في التجارب مبينة في جدول المواد.

1. التعرض للأوزون وLPS لتحريض إصابة الرئة مورين

  1. التعرض للأوزون
    1. إعداد مربع تعريف O3 مخصص. إضافة تغذية الماوس وزجاجة المياه ولعب التخصيب والفراش نظيفة من أجل وتقليد البيئة السكنية الفئران.
      ملاحظة: هذه الخطوات سوف تضمن أن الفئران لديها حرية الوصول إلى الغذاء والماء عندما يسكن في مربع التعريفي مخصص وسيساعد على تخفيف الإجهاد لا مبرر له.
    2. قم بتبديل جهاز المعايرة/المولد O3 "ON" (الموضوع باتجاه منفذ المدخل) لتثبيت مصباح الأشعة فوق البنفسجية قبل اليد (حوالي 15 دقيقة قبل التعرض) والاتصال بشاشة O3 في الخط.
      ملاحظة: يجب أن تقرأ شاشة O3 ما متوسطه 0.05 جزء في المليون، كما تم أخذ عينات من المنفذ في درجة حرارة هواء الغرفة الثابتة (72 ±3 درجة فهرنهايت) والرطوبة النسبية (50±15٪).
    3. بالنسبة لتعرض O3 ، ضع الفئران برفق في مربع التعريفي المخصص وعرض الفئران باستمرار إلى 0.05 ppm O3 لمدة 2 ساعة.
  2. التخدير وإدارة LPS داخل الرحم
    1. إعداد 10 ملغ / مل الأسهم للكيتامين والإكسيلازين, بشكل منفصل.
    2. إعداد كوكتيل عن طريق خلط 20 أجزاء من الكيتامين وجزء واحد من الزيلازين. إذا كان الفأر يزن X g، قم بحقن (X/200) مل من كوكتيل الكيتامين / الإكسيلازين في تجويف الصفاق. لفأر واحد، وإعداد 1 مل من كوكتيل تتألف من 1000 ميكرولتر من المخزون 10 ملغ / مل الكيتامين و 50 ميكرولتر من المخزون xylazine. تخلط جيدا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا في أنبوب microfuge.
      ملاحظة: يمكن إعداد مخزون الكيتامين والإكسيلازين قبل أسبوع.
    3. تخدير الفئران تحت ضوء داخل الصفاق (IP) الكيتامين (50 ملغم / كغ) / xylazine (1 ملغ / كغ) مزيج (على سبيل المثال، ل25 غرام الماوس، وحقن 0.125 مل من الكوكتيل).
    4. إعداد محلول 1 ملغ / مل من LPS، في المالحة، وملء 50 ميكرولتر من الحل في ماصة.
    5. عقد الماوس تستقيم مع ظهره / الجانب الظهري على النخيل، وعقد الأذنين بنفس اليد. الآن ، ضع 50 ميكرولتر من محلول LPS18 بلطف خارج الخياشيم (أي 25 ميكرولتر على كل منخر أو 50 ميكرولتر في فتحة أنف واحدة ؛ لا يهم طالما أن الإجراء سريع) والسماح للفئران باستنشاق محلول LPS.
    6. غرس الفئران السيطرة مع 50 ميكرولتر من المالحة المعقمة.
      تحذير:لا تتجاوز أكثر من 100 ميكرولتر لغرس، والتي يمكن أن تكون قاتلة. أقل من حجم (أي <50 ميكرولتر) وهناك خطر ترسب الأنف فقط.
    7. بعد إدارة LPS ، وضع الفئران بلطف ، إما على بطنهم أو ظهورهم على كومة الفراش مع رؤوسهم الزاوية إلى أسفل قليلا.
      ملاحظة: هذا التوجه يطيل الاحتفاظ بالمحلول في تجويف الأنف19.
    8. في 0, 2, 4, 24, 36 و 72 ح بعد التعرض, تخدير الفئران أي p. مع جرعة كاملة من الكيتامين (200 ملغ /كغ)/xylazine (4 ملغ/كغ) مزيج (أي, X/50 مل من الكوكتيل, حيث X هو وزن الماوس في غرام أو 0.50 مل ل25 غرام الماوس).
    9. مراقبة الماوس حتى يفقد وعيه ومنعكس الحق (أي، لا يعود عندما وضعت في موقف supine). الآن، تحقق من الماوس لعمق التخدير، من خلال رصد التنفس (الرحلات الصدر الإيقاعي) ومعدل ضربات القلب، والتي ينبغي أن تنخفض بشكل ملحوظ، بعد 1-2 دقيقة.
    10. بعد ذلك ، تحقق من ردود الفعل دواسة أي قرصة أي من الأرقام في الأطراف الخلفية ومراقبة للتراجع عن الطرف ، كرد فعل. إذا كان الماوس يستجيب، أعلى المتابعة مع حقن إضافية 0.1 مل أو أكثر، كما هو مطلوب.
      ملاحظة: لتحقيق التخدير العميق، نضع في اعتبارنا أن بعض السلالات أو الفئران البدينة وعادة ما يكون حجم أكبر من التوزيع، وبالتالي يمكن بسهولة الإفراط في مداواة، إذا كان الوقت الكافي إذا لم يسمح للتخدير الكامل (والتي يمكن أن تكون حوالي 10 دقيقة أو أكثر). وبناء على ذلك، يمكن أن تكون بعض السلالات مقاومة للتخدير وبالتالي تتطلب المزيد من الأعلى المنبثقة. يتم الحصول على هذه المعرفة بعد العديد من الملاحظات العملية والخبرة مع الفئران من سلالات مختلفة والعمر. كما تم إجراء عدد قليل من التجارب التجريبية أيضا مباشرة بعد التعرض O3 وLPS (أي في 2 ساعة نقطة زمنية)، أدرجنا أيضا بعض تحليل الخلية BAL في وقت مبكر جدا من تلك التجارب لتسليط الضوء على الآثار المباشرة للتعرض O3وLPS مجتمعة.

2. جمع العينات

  1. ضع الماوس على صينية جراحية. الآن، وضع بلطف مرهم العين التشحيم على كلتا العينين لتجنب فقدان السوائل وتطهير الماوس مع رذاذ الإيثانول 70٪.
    1. إجراء تخفيضات صغيرة من خلال أغشية الجلد العلوي والسفلي مع مقص، لفضح القصبة الهوائية والصدر.
    2. جعل قطع فقط تحت القص وفضح القلب.
  2. ثقب القلب
    1. ضع إبرة 25G تعلق على حقنة الهيباريني في البطين الأيمن ورسم الدم عن طريق ثقب القلب.
      ملاحظة: عادة ما يسحب الدم مع الحد الأدنى من رسم المكبس، إذا كان الوقت من تعريض القلب لثقب القلب أقل من دقيقة. بعد جمع حوالي 0.4-0.5 مل، قد يحتاج المرء إلى وقفة لبضع ثوان قبل جمع الدم المتبقي. ويتم ذلك للسماح للقلب ضخ أي حجم المتبقية في غرفة البطين الأيمن. في نهاية جمع الدم، يتوقف القلب عن الضخ.
    2. جمع الدم وتخزينها في أنابيب microfuge لمزيد من المعالجة.
  3. فغر القصبة الهوائية
    1. استخدام ملاقط بعناية / ملقط حادة لمسح قبالة منطقة القصبة الهوائية من الأنسجة المفرطة. استخدام قفاز اليدين أكثر من الأدوات الجراحية لتجنب النزيف. إذا كان الكثير من الدم ناز، وهناك خطر تلويث عينات BAL. استخدام مسحات القطن، إذا لزم الأمر، على الرغم من عدم تفضيل. كيمويب هي بدائل أفضل.
    2. الآن، قطع من خلال القفص الصدري لفضح الرئتين. مرة أخرى، يجب توخي الحذر من قطع القص والشرايين الوربية أو الشريان الأورطي الصاعد. إجراء تخفيضات أصغر أثناء التقدم من خلال القفص الصدري)
    3. تمرير ربط القطن تحت قصاصة القصبة الهوائية وترك على هذا النحو في الوقت الحاضر.
    4. قص القصبة الهوائية في مكان مناسب فيالجزء الثالث من النزال ، مشيرا نحو الرئتين ، للسماح بالوصول إلى قنية القصبة الهوائية 28 G.
    5. أدخل قنية PE 28 G (طول الحد الأدنى من 3-5 مم ونهاية البعيدة قلصت لسهولة الإدراج) في القصبة الهوائية. احترس من نهاية القصبة الهوائية قبل التشعب ثم سحب حوالي مم مرة أخرى لتجنب أخذ العينات فص واحد فقط.
    6. بحزم، ربط ربطة القطن لعقد القنية في مكانها. لا تنهار القنية.
  4. حمم برونشو الحويصلات الهوائية (BAL)
    1. ملء 0.5 مل من برنامج تلفزيوني في حقنة 1 مل.
    2. الآن حقن تدريجيا 0.5 مل من برنامج تلفزيوني في القنية بمساعدة حقنة 1 مل.
    3. بعد حقن برنامج تلفزيوني، يستنشق المحقنة طالما أنها لا تقاوم الشفط.
      ملاحظة: إذا كان هناك مقاومة أثناء قرصنة السائل BAL بها، وهذا يشير إلى انهيار الأنسجة الهوائية أو الشعب الهوائية. في هذه الحالة، سحب القنية بواسطة صغير لفصل القنية شكل جدران الأنسجة.
    4. جمع السائل يستنشق في أنبوب microfuge وصفت ومكان على الجليد.
    5. أداء اثنين من أكثر lavages بطريقة مماثلة جمع في نفس القارورة (أي ما مجموعه 0.5 × 3 = 1.5 مل lavage).
    6. قياس حجم السائل بال التي تم جمعها. Lavage الانتعاش ينبغي أن تكون قريبة من 90 ٪.
  5. تغلغل الأوعية الدموية الرئوية (LVP)
    1. قطع الشريان الأورطي الصدري التنازلي في موقع بين أنصاف الصدر والبطن، لتجنب أي احتياطية من perfusate في الرئتين في حين تتغلغل من خلال البطين الأيمن.
    2. لطخة تجويف بالقرب من نهاية الشريان الأورطي قطع، خالية من الدم.
    3. بعد ذلك، يتغلغل في الرئتين مع 0.5 مل من درجة حرارة الغرفة المالحة حقن من خلال البطين الأيمن.
    4. جمع perfusate الأوعية الدموية من تجويف في نهاية قطع الشريان الأورطي الصدري تنازلي، في أنبوب microfuge، وضعت على الجليد وقياس حجمه.
    5. Ligate الشعب الهوائية الحق قريبة من تفريعها من القصبة الهوائية (مع خيط القطن).
  6. تثبيت الرئة اليسرى في الموقع
    1. قم بتوصيل حقنة 1 مل بقنية القصبة الهوائية، وهي طويلة بما يكفي لإدخالها من خلال شق القصبة الهوائية السابق.
    2. سحب الهواء مرة أخرى في حقنة تصل إلى 0.6 مل علامة.
    3. ثم، ملء المحاقن المتبقية (حتى النهاية) مع 2٪ paraformaldehyde في درجة حرارة الغرفة. تأكد من أن المكبس على استعداد لموسيقى البوب دون امتصاص أي هواء من القنية.
    4. الآن، لصق المحقنة مع شريط سكوتش، إلى حاوية تستقيم، تقاس تصل إلى 20 سم الارتفاع.
    5. بلطف، رسم المكبس للسماح تدفق مثبت نحو القصبة الهوائية. في حالة وجود عدد قليل من فقاعات الهواء في القنية ، ضع المكبس برفق فوق الحقنة وسيبدأ السائل في التدفق بعد بضع ثوان.
    6. دع الرئة اليسرى تتضخم إلى طاقتها الإجمالية في الموقع، لمدة 5 دقائق ، من ارتفاع 20 سم تشكيل عمود الماء 20 سم.
    7. خلال هذا الإجراء، تأكد من حماية فصوص الرئة اليمنى من الحصول على اتصال مع paraformaldehyde لأن هذا سوف يؤثر على المقايسات المصب.
    8. ضع أنسجة مختبرية مطوية لامتصاص أي بارافورمالديهايد قد تلامس فصوص الرئة اليمنى.
      تنبيه: البارافورمالديهايد شديد السمية. لذلك، لا تستنشق أو تضع الاتصال بأي أجزاء مكشوفة من الجسم. توخي الحذر الشديد أثناء التعامل معها.
    9. خلال فترة غرس البارافورمالديهيد ، تعقيم البطن.
    10. قطع فصوص الرئة اليمنى من القصبة الهوائية التأكد من إزالة أي خيط ووضع الفصوص على الفور في cryovial وصفت وإسقاطه في النيتروجين السائل لتحليل السيتوكين الجزيئية / الكيميائية الحيوية المصب / RT-PCR / تحليل لطخة الغربية من تجانس الرئة.
    11. تقليم بعناية الرئة اليسرى لأي النسيج الضام أو الأغشية الجنبية وتراجع في 2٪ paraformaldehyde لمدة 24 ساعة في 4 درجة مئوية.
    12. تضمين الرئة الثابتة في البارافين وفقا لبروتوكول تضمين القياسية.
      تحذير: لا تبالغ في تسخين عينات الرئة.
    13. قطع جزء البطن وإزالة الجلد من الحوض (الورك) العظام.
    14. فصل عظام عظم الفخذ الأيسر والأيمن من الجزء الحوض، في طبق بتري مملوءة المالحة أبقى على الجليد.
  7. جمع عظم عظم القص ونخاع الفخذ
    1. تنظيف الأنسجة والعضلات من العظام باستخدام الأنسجة المختبرية.
    2. جمع القفص الصدري البطني والقص في طبق بيتري مملوءة المالحة أبقى على الجليد.
    3. قطع النصائح البعيدة والقربة من عظام القص وعظم الفخذ.
    4. Perfuse العظام 4 مرات مع 0.5 مل من المالحة، وذلك باستخدام الإبر المجهزة جيدا (24 إلى 28 G) على إلى 1 مل المحاقن، وجمع الكسور من كل عظمة في أنابيب وصفت مزودة مرشحات ووضعها على الجليد.
      ملاحظة: يختلف مقياس الإبرة بين حجم الحيوان. بعد التنظيف ، يجب أن تظهر عظمة الفخذ شفافة.
    5. وبمجرد جمع العينات، ضع الفأر في كيس بلاستيكي ووضع في ثلاجة جثث الحيوانات للتخلص منها بشكل صحيح، وفقا للمبادئ التوجيهية للمرفق الحيواني المؤسسي.

3. معالجة العينات

  1. مجموع (TLC) والتفاضلي (DLC) عدد الكريات البيض
    1. أجهزة الطرد المركزي الدم المحيطي، BAL، الرئة الأوعية الدموية وثقب نخاع العظم (القص وعظم الفخذ) عينات لمدة 10 دقيقة في 500 غرام.
    2. جمع supernatants ، فلاش تجميدها وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل.
    3. إعادة تشكيل الخلايا في الحد الأدنى من 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
    4. أداء TLC عن طريق عد BAL, دم, الرئة الأوعية الدموية perfusate وخلايا نخاع العظام على مقياس الدم.
    5. وصمة عار أخرى 9 ميكرولتر aliquot من BAL مع مزيج 1 ميكرولتر من كالسين الأخضر والأحمر ethidium homodimer-1 لقياس الخلايا الحية (الخضراء) بسبب نشاط استراز داخل الخلية وأي خلايا BAL التالفة (باللون الأحمر) بسبب فقدان سلامة غشاء البلازما.
    6. إضافة 2٪ حمض الخليك إلى الليس RBCs، في نسبة 1:10 لTLC الدم و 1:2 نسبة لTLC الأوعية الدموية الرئة.
      تنبيه: ضبط تركيزات الخلايا عن طريق التخفيف في برنامج تلفزيوني إذا كان التركيز أكثر من 1x106 خلايا لكل مل (مهم جدا لعينات نخاع العظام).
    7. الطرد المركزي الخلايا لإعداد السيتوسبينات على الشرائح والبقع كما هو موضح أدناه لDLCs. عد ما لا يقل عن 100 خلية لأعداد خلايا الكريات البيض التفاضلية (DLCs).
      ملاحظة: عادة، يمكن للمرء تحضير اثنين من السيتوسبينات على شريحة واحدة. وبعد 10-15 دقيقة من تجفيف الهواء، والمضي قدما في خطوة تلطيخ.
    8. تقسيم BAL التي تم جمعها من ثلاثة فئران التجريبية لكل مجموعة إلى اثنين من السيتوسبينات لكل منهما ووصمة عار للactin / توبولين والميتوكوندريا مع الفوسفور التأكسدي النشط (انخفاض mitotracker). الاستفادة من BAL من ثلاثة فئران أخرى لتقسيمها إلى اثنين من السيتوسبينات لكل منهما، لNK1.1/Gr1/CX3CR1 و ATPβ/Ki-67/CD61/Angiostatin الشرائح الملون. تقسيم BAL من ثلاثة فئران أخرى إلى اثنين من السيتوسبينات لكل وصمة عار ل ATPα/Ly6G وCX3CR1/Siglec-F.
  2. الحمم الهوائية (BAL) والرئة الأوعية الدموية Perfusate (LVP) مجموع البروتين الكمي
    1. من أجل تحديد كميا O3 وLPS الاضطرابات الناجمة عن حاجز الأوعية الدموية أو الضغط العائي النسبي في المقصورتين الرئويتين (أي الحاجز الحويصلات الهوائية (الخلالي) والرئة الأوعية الدموية perfusate (الأوعية الدموية) المقصورات)، وقياس إجمالي محتوى البروتين في السوائل التي تم جمعها.
    2. تحليل الكسور الفائقة المذابة لتركيز البروتين الكلي باستخدام معيار قياس الألوان المقاوم للمنظفات.
    3. حمم القصبات الهوائية (BAL) وتحليل التشوش الوعائي الرئوي (LVP) chemokine
      1. بعد ذلك ، قم بتحليل الكيموكينات في BAL ومضادات الحشرات الوعائية الرئوية (LVP) باستخدام اختبار مناعي مغناطيسي قائم على حبة 33. وهذا سوف يبلغ عن اتجاه مجرى الهواء / إنترستيتيوم مقابل التدرجات chemokine الأوعية الدموية التي أنشئت بعد التعرض مجتمعة.
      2. Analyze the following panel of chemokines : CXCL13 (B-lymphocyte chemoattractant), CCL27 (IL-11 R-alpha-locus chemokine (ILC)), CXCL5 (epithelial-derived neutrophil-activating peptide 78 (ENA-78)), CCL-11 (eotaxin-1), eotaxin-2 (CCL-24), CX3CL1 (fractalkine), GM-CSF (CSF-2), CCL1, IFNγ (interferon gamma), IL-10 (interleukin-10), IL-16 (interleukin-16), IL-1β (interleukin-1 beta), IL-2 (interleukin-2), IL-4 (interleukin-4), IL-6 (interleukin-6), CXCL-10 (interferon gamma-induced protein 10 (IP-10)), CXCL11 (Interferon-gamma-inducible protein 9 (IP-9)), KC (keratinocyte chemoattractant), MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1), MCP-3 (monocyte chemoattractant protein-3), MCP-5 (monocyte chemoattractant protein-5), MDC (macrophage-derived chemokine (CCL22)), MIP-1α (macrophage inflammatory protein-1 alpha), MIP-1β (macrophage inflammatory protein-1 beta), MIP-2 (macrophage inflammatory protein-2), MIP-3α (macrophage inflammatory protein-3 alpha), MIP-3β (macrophage inflammatory بروتين-3 بيتا)، RANTES (ينظم على التنشيط، الخلية T العادية المعرب عنها والإفراز (CCL5)) ، CXCL-16 ، CXCL-12/SDF-1alpha (عامل الخلايا النجمية المشتقة 1) ، TARC (الصعترية والتنشيط chemokine المنظمة (TARC)) ، TECK (Thymus-Expressed Chemokine (CCL25)) و TNFα (عامل نخر الورم ألفا).

4. تلطيخ السيتوسبين والأنسجة الرئة

  1. تلطيخ السيتوسبين الكيميائي الحيوي
    1. تطويق السيتوسبينات بقلم كاره للماء لاحتواء المواد الكيميائية لاحتضانها أثناء الإجراء.
    2. إعادة ترطيب السيتوسبينات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
    3. إصلاح عينات السيتوسبين في 2٪ بارافورمالديهايد لمدة 10 دقائق، يغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    4. Permeabilize مع الجليد الباردة 70٪ الأسيتون لمدة 7 دقائق وغسل مرة أخرى ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    5. وصمة عار للأكتين والتوبيولين أو انخفاض Mitotracker (حضانة مع مزيج من 2 ميكروغرام / 50 ميكرولتر من اليكسا 488 phalloidin المقترنة هو مبين باللون الأخضر، و 2 ميكروغرام / ميكرولتر من اليكسا 555 الماوس المقترنة المضادة α التوبولين أو انخفاض ميتوتراكر هو مبين باللون الأحمر، على التوالي) لمدة 15 دقيقة.
      ملاحظة: استخدام الماوس IgG1 isotype التحكم الأجسام المضادة, في cytospin منفصلة, للتحقق من صحة بروتوكول تلطيخ أنبوبولين. تنفيذ نفس الخطوات كما هو موضح من 4.1.1 إلى 4.1.8 ولكن لعناصر التحكم متساوية النمط.
    6. إزالة البقع عن طريق ترجيح بلطف المزيج من الشريحة. احتضان الشرائح مع DAPI (4'، 6-diamidino-2-phenylindole) لمدة 5-10 دقيقة وصمة عار النوى.
    7. غسل السيتوسبينات 3 مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما، coverslip مع وسائل الإعلام تصاعد المضادة للتلاشي وتخزينها بين عشية وضحاها في الظلام في درجة حرارة الغرفة قبل التصوير.
    8. الحصول على الصور تحت المجهر تستقيم واسعة المجال مجهزة كاميرا علمية. تأكد من ضبط أوقات تعرض الكاميرا بشكل متناسق للقنوات الفلورية المختلفة عند عرض الشرائح التصويرية.
  2. تلطيخ الفلورسنت المناعي Cytospin:
    1. تطويق السيتوسبينات بقلم كاره للماء لاحتواء المواد الكيميائية لاحتضانها أثناء الإجراء. إعادة ترطيب السيتوسبينات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
    2. إصلاح عينات السيتوسبين عن طريق احتضان في 2٪ paraformaldehyde لمدة 10 دقائق، وغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    3. Permeabilize مع 0.1٪ بارد تريتون X-100 لمدة 2 دقيقة، يغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    4. بعد ذلك ، FC block لمدة 15 دقيقة عن طريق احتضان السيتوسبين مع تخفيف 1:50 من مخزون الأجسام المضادة Fc Block (لضمان عدم تفاعل جسم الماوس الأساسي المضاد بشكل غير محدد مع الأجسام المضادة Fc الماوس).
    5. قم بقلب الشرائح لإزالة كتلة Fc وتغييرها إلى 1٪ BSA لسيتوسبين واحتضانه بمزيج من 3 أجسام مضادة أولية ذات أهمية (راجع الجدول 1 للتوليفات المختلفة) لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: تأكد من تشغيل الأجسام المضادة للتحكم isotype (احتضان مع مزيج الماوس IgG1 والجرذ IgG2b كابا الأجسام المضادة الأولية عن طريق تنفيذ الخطوات 4.2.1 إلى 4.2.9 واستبدال الأجسام المضادة مع عناصر التحكم isotype) بالتوازي مع الأجسام المضادة الثانوية المقابلة كما نوقش في دراستنا الأخيرة20.
    6. غسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما. احتضان السيتوسبينات بمزيج من الأجسام المضادة الثانوية المصممة بشكل مناسب (يرجى الرجوع إلى الجدول 1 للحصول على التفاصيل).
    7. إزالة البقع عن طريق ترجيح بلطف المزيج من الشريحة، واحتضان مع DAPI (4′، 6-diamidino-2-phenylindole) لمدة 5-10 دقيقة وصمة عار النوى. غسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    8. Coverslip مع وسائل الإعلام المضادة للتلاشي تصاعد وتخزينها بين عشية وضحاها في الظلام في درجة حرارة الغرفة قبل التصوير.
    9. الحصول على الصور تحت المجهر تستقيم واسعة المجال مجهزة كاميرا علمية. تأكد من ضبط أوقات تعرض الكاميرا بشكل متناسق لجميع قنوات الفلوروفور عند عرض الشرائح التصويرية.
  3. هيماتوكسيلين و إيوزين (H &؛ E) الأنسجة
    1. إجراء تعديل H & Eتلطيخ 3 على الرئة التبريد المقاطع لجميع المجموعات.
  4. تحليل الصور
    1. معالجة وتحليل بيانات الصور (.tiff) الملفات في فيجي ImageJ البرمجيات المفتوحة (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
    2. تحقق من المعلمات المطلوبة (المنطقة، المحيط، الكثافة المتكاملة، واصفات الشكل، قطر Feret، التعميم، تسمية العرض) ليتم تسجيلها تحت علامة التبويب تحليل وتعيين القياسات.
    3. باستخدام مدير عائد الاستثمار، مخطط يدويا حول 50-200 خلية في لوحة الصور المدمجة باستخدام أداة "التحديدات الحرة". احفظ مناطق الاهتمام (ROI) باستخدام أمر Ctrl+T وانسخ ROIs المحفوظة لكل خلية إلى جميع قنوات الفلوروفور.
    4. اضغط بعد ذلك Ctrl +M لقياس المعلمات المحددة مسبقا لجميع القنوات الفلورية (على سبيل المثال، 405 نانومتر (DAPI أو ATPβ باللون الأزرق)، و488 نانومتر (أكتين أو NK1.1 أو Ki-67 باللون الأخضر)، و568 نانومتر (توبولين أو Gr1 أو CD61 باللون الأحمر) و633 نانومتر (CX3CR1 أو angiostatin باللون الأرجواني)).
    5. حفظ النتائج كملف .csv تحت اسم مناسب يمثل التحليل الخاص بك. نسخ النتائج من ملف .csv إلى جدول بيانات وتقسيم كثافة الفلورسينس (FI) (وهو عمود الكثافة المتكاملة الخام من ملف النتائج) من جزيء ملون من قبل أن من DAPI أو CD61 FI، وفقا لتصميم تلطيخ. و يطلق على هذه النسب "DAPI أو CD61 نسب FI العادية".
    6. بعد ذلك ، رسم هذه النسب العادية ، والتعميم ، ومحيط الخلية وقطر Feret ، لتقييم أي تغيير في حجم الخلية بعد التعرض المشترك O3 وLPS.
    7. استخدام البرامج الإحصائية المناسبة للتحقق من طبيعة البيانات التي تم جمعها واختبار الفرضية الخالية (يرجى الرجوع إلى قسم التحليل الإحصائي أدناه).
  5. التحليل الإحصائي
    1. نتائج صريحة كمعني ± SEM. تم استخدام ما لا يقل عن ثلاثة فئران لكل مجموعة.
    2. لتحليل بيانات chemokine ، وضبط اتجاه واحد ANOVA ف القيم لمعدل اكتشاف كاذبة وفقا لتصحيح بنياميني وهوشبرغ.
    3. تحليل معلمات الصورة، الخلوية، قطر فيريت، محيط، DAPI أو CD61 تطبيع نسب كثافة الفلورية من قبل مان ويتني U اختبار (لمقارنة مجموعتين) أو اختبار كروسكال واليس (لمقارنة مجموعات متعددة) كما لم يتم توزيع هذه البيانات عادة.
    4. بالنسبة لبقية تجارب التصوير، قم بتحليل النتائج باستخدام تحليل أحادي الاتجاه للتباين متبوعا بمقارنات Sidak المتعددة. واعتبرت القيم p <0.05 كبيرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يؤدي التعرض المشترك ل O3 وLPS إلى التهاب جهازي وتعبئة نخاع العظم عند 72 ساعة: كشفت أعداد الخلايا في مقصورات مختلفة عن تغييرات كبيرة في الدم المحيطي وإجمالي عدد خلايا نخاع عظم الفخذ عند التعرض المشترك ل O3 و LPS. علىالرغم من أن التعرض مجتمعة O 3 وLPS لم تحفز أي تغييرات في مجموع BAL (الشكل 1A) أو LVP (الشكل 1B) عدد الخلايا, الخلايا متعددة الأشكال التي قدمت كنوع الخلية السائدة في 24 (الشكل 1F, الشكل التكميلي 1), 36 و 72 ح بعد التعرض. يرجى ملاحظة عدم وجود Siglec-f وCX3CR1 تلطيخ في الخلايا متعددة الأشكال في 24 ساعة BAL صورة السيتوسبين (الشكل 1F). ثلاثي DAPI/CD11b/Gr1 تلطيخ السيتوسبينات BAL أظهرت وجود خلايا CD11b-و Gr1-إيجابية أحادية نووية التي هي الضامة في 0 ساعة، والتي تتغير إلى أصغر الخلايا متعددة الأشكال التي تظهر punctate Gr1staining ولكن خالية من تلطيخ CD11b في 4 ساعة (كما هو مبين في مجموعة في 1F التكميلية). غالبية خلايا BAL هي متعددة الأشكال وإيجابية لكل من CD11b و Gr1 ، عند التعرض بعد 24 ساعة(الشكل التكميلي 1).

الفئران عرض ترسب الكريات البيضاء الجهازية في 24 ساعة (3.3 أضعاف مقابل 0 ساعة، ع<0.05، الشكل 1C)يليه طوبينيا في 72 ساعة التي تميزت عدد أقل 13 أضعاف في الدم المحيطي مقارنة مع 24 ساعة (p<0.01) وانخفاض 8.6 أضعاف مقارنة مع 4 ساعة (ع<0.05) بعد مجتمعة O3 وLPS التعرض(الشكل 1C). كما لم تتغير خلايا نخاع العظم القصي عند مقارنتها ب 0 ساعة أو بعد التعرض المشترك ل O3 وLPS(الشكل 1D). وأظهرت تعدادات نخاع عظم الفخذ ارتفاع 28.8 مرة في وقت متأخر عند 72 ساعة بالمقارنة مع 0 ساعة (p<0.01، الشكل 1E)وكذلك النقاط الزمنية الأخرى (p<0.01، الشكل 1E). كما أظهر تصور LVP ، وخلايا نخاع عظم الفخذ وكذلك القص تغيرات في أنواع الخلايا إلى خلايا متعددة الأشكال في الغالب(الشكل التكميلي 1). وأظهرت خلايا نخاع العظم القصي علامات الضرر كما يتضح من المواد النووية خارج الخلية. أظهر نخاع عظم الفخذ أعدادا أكبر من الخلايا الإيجابية CD11b و Gr1 (الشكل التكميلي 1) ، والتي تتزامن مع عدد الخلايا.

وكان إجمالي محتوى البروتين بال أعلى في 36 ساعة بعد التعرض مجتمعة O3 وLPS: تم تحديد كمي من مجموع البروتينات في مقصورات LVP وBAL لربط وذمة الرئة الناجمة عن الأوزون أي ينضح بروتين البلازما بسبب ضعف الحاجز الوعائي والظهاري الناتج بسبب التعرض المشترك. وكان البروتين الكلي بال 4.5 أضعاف أعلى في 36 ساعة (p<0.05) بالمقارنة مع 4 ساعة (الشكل 2A). ومع ذلك، لم يتغير البروتين LVP بعد التعرض (الشكل 2B).

مجتمعة O3 والتعرض LPS يحفز التدرجات chemokine قوية في مقصورة الأوعية الدموية الرئة وليس BAL: تم إجراء المقايسات Chemokine multix على كل من BAL وLVP supernatants. يرجى ملاحظة أن الاختلافات النسبية بين هاتين المقصورتين تمثل استبقاء تفضيليا في مقصورة معينة. وكان اليوزينوف الكيماوية eotaxin-2 4.3 أضعاف أعلى في 4 ساعة في مقصورة LVP مقارنة مع 0 ساعة (p<0.05, الشكل 3A). في مقصورة BAL، كان eotaxin-2 أقل بمقدار 3.2 أضعاف عند 4 ساعة بالمقارنة مع 0 ساعة (p<0.01، الشكل 3B). ظلت مستويات BAL eotaxin-2 تتناقص باستمرار حتى 72 ساعة مع انخفاض 12.6 مرة مقارنة ب 0 ساعة (p<0.01، الشكل 3B). وكان الخلايا الليمفاوية chemoattractant IL-2 10.1 أضعاف أعلى في 4 ساعة في مقصورة LVP مقارنة مع 0 ساعة (ع<0.05، الشكل 3C). في مقصورة BAL، كان IL-2 أقل بمقدار 5.0 أضعاف عند 36 ساعة بالمقارنة مع 0 ساعة (p<0.05، الشكل 3D). واصلت مستويات ال Eotaxin-2 بال انخفاض مستمر 5.9 أضعاف في 72 ساعة مقارنة مع 0 ساعة (p<0.05، الشكل 3D).

ومن المثير للاهتمام، تم تغيير العديد من chemokines في 4 ساعة، في LVP وليس BAL. وأظهرت معظم هذه chemokines متواضعة، ولكن كبيرة، وزيادة في مستويات LVP في 4 ساعة بالمقارنة مع النقاط الزمنية في وقت لاحق. على الرغم من أن مستويات eotaxin-1 لم تكن مرتفعة بعد التعرض عند مقارنتها ب 0 ساعة ، ولكن المستويات كانت مرتفعة بشكل كبير عند 4 ساعة بالمقارنة مع 24 (2.7 أضعاف ، p<0.05) و 72 ساعة (5.0 أضعاف ، p<0.01 ، الشكل 4A)بعد التعرض المشترك. وكانت مستويات LVP TNFα أعلى بمقدار 3.4 أضعاف عند 4 ساعة بالمقارنة مع 36 ساعة (p<0.05، الشكل 4B). وبالمثل، كان LVP IFNа 2.9 أضعاف أعلى في 4 ساعة بالمقارنة مع 72 ساعة (p<0.05، الشكل 4C). كما كانت مستويات CX3CL1 مرتفعة عند 4 ساعة بالمقارنة مع 24 (1.7 أضعاف، p<0.05)، 36 (1.6 أضعاف، p<0.05) و 72 ساعة (2.2 أضعاف، p<0.01) بعد التعرض المشترك(الشكل 4D). وأظهرت مستويات CCL27 مستويات أعلى عند 4 ساعة كذلك بالمقارنة مع 24 (2.7 أضعاف، p<0.05)، 36 (3.9 أضعاف، p<0.01) و 72 ساعة (2.9 أضعاف، p<0.05) بعد التعرض مجتمعة(الشكل 4E).

وكان لبعض chemokines وجود قوي في LVP في 4 ساعة بعد التعرض مجتمعة, ولم يتغير في BAL قبل وبعد التعرض, مما يدل على استجابة قوية chemokine من الشعيرات الدموية الرئوية. في 4 ساعة، وكانت مستويات IL-16 LVP 3.4 أضعاف مقارنة مع 0 ساعة (p<0.01)، 3.2 أضعاف مقارنة مع 24 ساعة (p<0.01)، 4 5.5 أضعاف مقارنة مع 36 ساعة (p<0.01) و 4.6 أضعاف مقارنة مع 72 ساعة (p<0.01) بعد التعرض مجتمعة (الشكل 4F). في 4 ساعة، كيموكين العدلات، وكانت مستويات CXCL5 LVP 2.0 أضعاف مقارنة مع 0 ساعة (p<0.01)، 4.7 أضعاف مقارنة مع 24 ساعة (p<0.01)، 2.01 2 أضعاف مقارنة مع 36 ساعة (p<0.01) و 2.7 أضعاف مقارنة مع 72 ساعة (p<0.01) بعد التعرض مجتمعة(الشكل 4G). في 4 ساعة، وكانت مستويات CXCL10 LVP 2.3 أضعاف مقارنة مع 0 ساعة (p<0.01)، 2.1 أضعاف مقارنة مع 24 ساعة (p<0.05)، 2.05 5 أضعاف مقارنة مع 36 ساعة (p<0.01) و 2.7 أضعاف مقارنة مع 72 ساعة (ع<0.01) بعد التعرض مجتمعة (الشكل 4H). عند 36 ساعة، كانت مستويات كيموكين العدلات، SDF1α LVP 4.2 أضعاف مقارنة مع 0 ساعة (p<0.01)، 2.9 أضعاف مقارنة مع 24 ساعة (p<0.05)، 6.8 أضعاف مقارنة مع 72 ساعة (p<0.01) بعد التعرض مجتمعة(الشكل 4I). عند 4 ساعة، كانت مستويات MIP3β LVP 2.3 أضعاف مقارنة ب 0 ساعة (p<0.05)، و 2.3 مرة مقارنة ب 72 ساعة (p<0.05) بعد التعرض المشترك(الشكل 4J).

يؤدي التعرض المشترك O3 وLPS إلى النخر ، ويعطل الهيكل الخلوي وغشاء البلازما وسلامة الميتوكوندريا: بما أن تعداد الكريات البيض المجزأة ومحتويات البروتين لم تكن مرتبطة بتدرجات LVP chemokine ، أصبح من المهم أكثر تصور الخلايا التي تم الحصول عليها من هذه المقصورات. ex vivo actin/tubulin تلطيخ خط الأساس (0 ساعة) وأظهرت خلايا BAL وجود أكتين القشرية, ألياف الإجهاد وكذلك lamellipodia (هو مبين في الأخضر, الشكل 5 لوحة العلوي الأيسر) وشبكة microtubule (هو مبين باللون الأحمر, الشكل 5 اللوحة العليا اليسرى) التي تزامنت مع انخفاض تلطيخ ميتوتراكر تشير إلى وجود الميتوكوندريا النشطة (يظهر باللون الأحمر, الشكل 5 اليسار لوحة أقل). أكثر من 95٪ من خلايا BAL كانت أحادية النووية عند خط الأساس. في 4 ح, وأظهرت الخلايا BAL المواد النووية خارج الخلية, punctate السيتوبلازمية أكتين تلطيخ خالية من lamellipodia وانخفاض تلطيخ أكتين القشرية (هو مبين في الأخضر, الشكل 5 لوحة العلوي الأيمن), شبكة microtubule fanned (يظهر باللون الأحمر, الشكل 5 لوحة العلوي الأيمن) التي لا تتوافق مع انخفاض mitotracker تلطيخ (يظهر باللون الأحمر, الشكل 5 اللوحة اليمنى اليسرى). DAPI تطبيع actin تحليل كثافة الفلورسنت أظهرت انخفاض 3.7 أضعاف في نسبة تشير إلى انخفاض في تلطيخ أكتين في 4 ساعة بعد التعرض (p<0.01، الشكل 6A). وبالمثل، DAPI تطبيع كثافة الفلورسنت توبولين خفضت أيضا بمقدار 1.5 أضعاف بعد التعرض (p<0.01، الشكل 6B)،مما يدل على انخفاض في تلطيخ التوبولين. وكان فقدان lamellipodia واضح مع زيادة في تعميم الهيكل الخلوي BAL على الفور أي، في 2 ساعة (ص<0.01، الشكل 6C) و 4 ساعة (p<0.05، الشكل 6C)بعد التعرض عند مقارنتها ب 0 ساعة وانخفاض في دائرية الهيكل الخلوي عند 24 (p<0.05) و 36 ساعة (p<0.01) بعد التعرض، بالمقارنة مع 0 ساعة(الشكل 6C).

حتى 24 ساعة، كانت خلايا BAL من التعرض المشترك إيجابية مزدوجة للكالسين (باللون الأخضر، الشكل 7)مما يشير إلى وجود نشاط إستراز نشط، وهوموديمر الإيثيديوم (باللون الأحمر، الشكل 7)،مما يشير إلى أنه على الرغم من أن بعض الخلايا كانت ميتة (حمراء)، إلا أن معظمها كانت خلايا معرضة للخطر جزئيا. في 36 ساعة، كانت خلايا BAL قابلة للحياة إلى حد كبير (خضراء)، مما يشير إلى استبدال الخلايا المعرضة للخطر بالخلايا البيضاء التي تم تجنيدها من مقصورات نظامية أخرى(الشكل 7).

كشفت ATPα محددة وتلطيخ Ly6G من خلايا BAL توطين منفصلة داخل الخلايا (أفلام 1 و 2) من كل من البروتينات في الضامة السنفية وكذلك العدلات بعد التعرض (الشكل 7). أدى التعرض المشترك إلى انخفاض في نسبة كثافة الفلورسنت العادية ل DAPI من ATPα(الشكل 7، 8A) وزيادة في محتوى بروتين Ly6G داخل الخلية (الشكل 7، الشكل 8B، الأفلام 1 و 2). انخفاض في ATPα تلطيخ, في 24 ساعة بعد التعرض, يرتبط مع انخفاض التوبولين وإلى حد ما خفض تلطيخ ميتوتراكر. لاحظنا أيضا أجسام الخلايا الإيجابية ATPα anuclear بعد التعرض ، والتي يمكن أن تكون الصفائح الدموية. ومع ذلك، لم نؤكد النتائج التي توصلنا إليها. في 2 ساعة، لاحظنا أصغر خلايا BAL أحادية نووية (p<0.01 الشكل 8C، p<0.01 الشكل 8D)بالمقارنة مع 0 ساعة ولكن في 4 ساعة، كانت الخلايا أحادية النووية أكبر (p<0.01 الشكل 8C، p<0.01 الشكل 8D) بالمقارنة مع 0 ساعة. في 24 (p<0.01 الشكل 8C, p<0.01 الشكل 8D) و 36 ح (p<0.01 الشكل 8C, p<0.01 الشكل 8D), أصبحت خلايا BAL أصغر تدريجيا بسبب التحول نحو الخلايا متعددة الأشكال, بالمقارنة مع 0 ح.

كشفت الفينوبينغ المناعي لخلايا BAL عن تعبيرات عابرة ل NK1.1 و ATP β و Ki-67 وتعبيرات مستمرة عن Gr1 و CX3CR1 وخلايا BAL الإيجابية angiostatin بعد التعرض المشترك O3 و LPS: تم تطبيع تلطيخ المناعة من المجموعة الأولى من السيتوسبينات BAL إلى تلطيخ DAPI. كانت هناك زيادة في الخلوية NK1.1 الخلايا الإيجابية في 24 ساعة (ع<0.05 مقابل 0 ساعة، الشكل 9،10A). في 36 ساعة، وكان خلايا BAL أقل كثافة الفلورسنت الخلوية NK1.1 (p<0.01 مقابل 0 و 24 ح، الشكل 9،10A). وكانت كثافة الفلورسنت Gr1 الخلوية أعلى عند 24 ساعة (p<0.01 مقابل 0 ساعة، الشكل 9، 10B)وكذلك 36 ساعة (p<0.01 مقابل 0 h، الشكل 9، 10B). وبالمثل، كانت كثافة الفلورسنت CX3CR1 الخلوية أعلى عند 24 ساعة (p<0.01 مقابل 0 h، الشكل 9، 10C) وكذلك 36 ساعة (p<0.01 مقابل 0 ساعة، الشكل 9، 10C).

عندما تطبيعها إلى CD61 الخلوية، والتي هي أيضا في كل مكان في التعبير، وكشفت عن زيادة في كثافة الفلورسنت ATPβ الخلوية في 24 ساعة (ع<0.01 مقابل 0 ساعة، الشكل 9،10D) وانخفاض في كثافة الفلورسنت ATPβ الخلوية في 36 ساعة (ع<0.01 مقابل 0 و 24 ساعة، الشكل 9، 10D). وتجدر الإشارة إلى أن ATPβ أظهرت في الغالب توطين النووية في 24 ساعة مقارنة مع توطين الطرفية في 36 ساعة (الشكل 9). وكانت كثافة الفلورسنت الخلوية ل BAL Ki-67، وهو مؤشر على الانتشار الخلوي، أعلى عند 24 ساعة (p<0.01 مقابل 36 h، الشكل 9، 10E) مقارنة ب 0 و 36 ساعة. وكانت المستويات أقل من مستويات خط الأساس عند 36 ساعة (p<0.01، الشكل 9، 10E)،على الأرجح بسبب ارتفاع متعدد الأشكال النووية CD61 مقابل كي-67 التعبير في 36 ساعة (الشكل 9). وأخيرا، كانت كثافة الفلورسنت الخلوية ل BAL angiostatin عالية باستمرار عند كل من 24 و 36 ساعة (p<0.01 مقابل 0 h، الشكل 9، 10F)، مما يشير إلى زيادة محددة في هذا الجزء البلازمينوجين المشقوق ميتالوبروتيناز، خلال الاستجابة الالتهابية الرئة.

ينتج عن التعرضات المجمعة تلف رئوي واسع الانتشار: وكشف علم الأنسجة الرئة أن التعرض مجتمعة تنتج تلف لفترات طويلة في الرئتين كما رأينا في H & E شفط التبريد الملون(الشكل 11). على الرغم من أنه كان من المتوقع تلف القصبات الهوائية والعفاريت السنخية ، كان من الصعب مراقبة الأضرار البطانية للسفن الكبيرة ، عند 36 ساعة بعد التعرض (الشكل 11). كانت هناك الكريات البيض داخل الأوعية الدموية، وبقع من المجاميع الكريات البيض (بما في ذلك العدلات) في الحاجز الحراري التالفة والمناطق المحيطة برونتشيولار(الشكل 11).

Figure 1
الشكل 1:عدد الكريات البيض المجزأة: أ) رغوة القصبات الهوائية (BAL) مجموع عدد الكريات البيض في 0 (أي خط الأساس)، 4 و 24 و 36 و 72 ساعة بعد الجمع بين 0.05 جزء في المليار الأوزون (O3)و 50 ميكروغرام LPS داخل النعرة التعرض للفئران. ب) تركيز الكريات البيض الكلي في الرئة والأوعية الدموية (LVP) عند 0 (أي خط الأساس) و4 و24 و36 و72 ساعة بعد الجمع بين 0.05 جزء في الأوزون (O3)و50 ميكروغرام من التعرض داخل الجهاز العصبي المسال داخل الجهاز الداخلي للفئران. ج) إجمالي تركيز الكريات البيض في الدم المحيطي (PB) عند 0 (أي خط الأساس) و4 و24 و36 و72 ساعة بعد الجمع بين 0.05 جزء في الأوزون (O3)و50 ميكروغرام من التعرض داخل الخلايا العضلية للفئران. د) نخاع العظم القصي (BM) مجموع تركيز الكريات البيض في 0 (أي خط الأساس)، 4، 24، 36 و 72 ساعة بعد مجتمعة 0.05 جزء في المليار الأوزون (O3)و 50 ميكروغرام التعرض LPS داخل الصدر للفئران. E) نخاع عظم الفخذ (BM) مجموع تركيز الكريات البيض في 0 (أي خط الأساس)، 4، 24، 36 و 72 ساعة بعد مجتمعة 0.05 جزء في المليار الأوزون (O3)و 50 ميكروغرام LPS داخل الرحم التعرض للفئران. بالنسبة للرسومات البيانية A-E، يتم تمثيل 0 ساعة باللون الأزرق، و4 ح باللون الأحمر، و24 ساعة باللون الأخضر، و36 ساعة باللون الأرجواني، و72 ساعة في نقاط البيانات البرتقالية؛ * ع <0.05 و ** ع <0.01. F) النائب BAL cytospin الشريحة من التعرض 24 ساعة، والتي تبين الخلايا أحادية النواة وتعدد الأشكال عندما ملطخة للنوى مع DAPI (باللون الأزرق)، CX3CR1 (باللون الأخضر) وسيغلك-F (باللون الأحمر). لاحظ أن دمج CX3CR1 و Siglec-F يظهر باللون البرتقالي والأصفر. غالبية الخلايا أحادية النووية إيجابية لسيغليك-F، وهي سمة من سمات الضامة السنفية. مقياس الشريط = 50 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: مجموع البروتين الكمي: أ) تم تقدير كمية الحمم الهوائية (BAL) مجموع محتوى البروتين و B) الرئة الأوعية الدموية perfusate (LVP) تم تقدير مجموع تركيز البروتين byPierce 660 نانومتر اختبار البروتين (الحرارية، IL، الولايات المتحدة). بالنسبة للرسومات البيانية A-B، يتم تمثيل 0 ساعة باللون الأزرق، و4 ح باللون الأحمر، و24 ساعة باللون الأخضر، و36 ساعة باللون الأرجواني، و72 ساعة في نقاط البيانات البرتقالية؛ * ع<0.05. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الرئة Eotaxin-2 و IL-2 التدرجات chemokine: من أصل 33 chemokines، اثنين من chemokines التي تم تغييرها بشكل كبير في الرئة الأوعية الدموية perfusate (LVP) والحمم القصبات الهوائية (BAL) والسوائل بعد مجتمعة 0.05 جزء في المليار الأوزون (O3)و 50 ميكروغرام التعرض LPS داخل الجهاز العصبي للفئران A) LVP eotaxin-2، B) BAL eotaxin-2، ج) LVP IL-2 و D) BAL IL-2. تم تحليل البيانات من قبل anova في اتجاه واحد وتم تعديل قيمة p لمعدل اكتشاف زائف لمتغيرات متعددة وفقا لتصحيح بنياميني وهوشبيرغ. بالنسبة للرسوم البيانية A-D، يتم تمثيل 0 ساعة باللون الأزرق، و4 ساعة باللون الأحمر، و24 ساعة باللون الأخضر، و36 ساعة باللون الأرجواني، و72 ساعة في نقاط البيانات البرتقالية. تم تحليل المقارنات الثنائية بعد تصحيح Bonferroni. * يمثل p<0.05 ، ** يمثل p<0.01. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4:تركيزات كيموكين التشوفوسات الوعائية الرئوية: تم تغيير تركيزات عشرة كيموكينات أخرى، ولكن فقط في مقصورة تغلغل الأوعية الدموية في الرئة (LVP). أ) Eotaxin-1، B) TNFα، C) IFNа، D) CX3CL1، E) CCL27، F) IL-16، G) CXCL5، H) CXCL10، I) SDF1α و J) MIP3β. بالنسبة للرسوم البيانية A-J، يتم تمثيل 0 ساعة باللون الأزرق، و4 ساعة باللون الأحمر، و24 ساعة باللون الأخضر، و36 ساعة باللون الأرجواني، و72 ساعة في نقاط البيانات البرتقالية. تم تحليل المقارنات الثنائية بعد تصحيح Bonferroni. * يمثل p<0.05 ، ** يمثل p<0.01. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: Bronchoalveolar lavage (BAL) السيتوسبين أكتين / توبولين وانخفاض تلطيخ ميتوتراكر: صور تمثيلية مناكتين / توبولين الملون BAL cytospins من A) 0 ساعة وباء) 4 ساعة بعد الجمع بين 0.05 جزء في الأوزون (O3)و 50 ميكروغرام التعرض LPS داخل النعر للفئران. لاحظ أن يظهر DAPI باللون الأزرق، actin باللون الأخضر وتوبولين باللون الأحمر. صور تمثيلية من mitotracker المستحثة الملون BAL cytospins من A) 0 ساعة وباء) 4 ساعة بعد مجتمعة 0.05 جزء في المليار الأوزون (O3) و 50 ميكروغرام التعرض LPS داخل الجهاز الداخلي للفئران. لاحظ أن DAPI يظهر باللون الأزرق، وتقليل mitotracker باللون الأحمر. مقياس الشريط = 50 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: تم تحليلlavage Bronchoalveolar (BAL) البروتين الخلوي وتحليل التعميم: بال cytospins ملطخة actin و tubulin لمعلمات DAPI تطبيع أي, أ) Actin إلى DAPI نسبة كثافة الفلورسنت (FI) في 0 و 4 ح، B) توبولين إلى DAPI نسبة كثافة الفلورسنت (FI) في 0 و 4 ح و C) BAL الخلوية في 0 (ن = 75 خلايا)، 2 (ن = 105 خلايا)، 4 (ن = 66 خلية)، 24 (ن = 31 خلية)، 36 (ن = 154 خلية) ح. كما تم إجراء عدد قليل من التجارب التجريبية أيضا مباشرة بعد O3 والتعرض LPS أي، في 2 ساعة نقطة زمنية، أدرجنا أيضا بعض التحليل الخلوي BAL في وقت مبكر جدا من 2 ساعة نقطة زمنية لتسليط الضوء على الآثار المباشرة للO3. بالنسبة للرسومات البيانية A-C، يتم تمثيل 0 ساعة باللون الأزرق، و2 ساعة باللون الأحمر، و4 ساعة باللون الأخضر، و24 ساعة باللون الأرجواني، و36 ساعة في نقاط البيانات البرتقالية. * يمثل p<0.05 ، ** يمثل p<0.01. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: المرحاض القصبي (BAL) حالة غشاء الخلايا والبلازما: كانت ملطخة خلايا BAL للبقع الحيوية، كالسين (باللون الأخضر) وethidium homodimers / EthHD (باللون الأحمر) كما هو مبين في لوحات الصورة العليا التمثيلية في A) 0، B) 24 و C) 36 ساعة بعد التعرض O3 وLPS. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. كانت السيتوسبينات BAL ملطخة بالمناعة ل DAPI (باللون الأزرق) و ATPα (باللون الأخضر) وLy6G (باللون الأحمر). وتظهر الصور التمثيلية في لوحات الصور السفلية في A) 0 و B) 24 ساعة بعد التعرض O3 وLPS. مقياس الشريط = 50 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8:مراحيض القصبات الهوائية (BAL) بروتين الميتوكوندريا ATPα، البروتين الليسوسومي Ly6G وتحليل حجم الخلية: تم تطبيع خلايا BAL الملطخة بالمناعة لDAPI لحساب A) ATPα إلى DAPI نسبة كثافة الفلورسنت (FI) وباء) Ly6G إلى DAPI FI نسبة، في 0 و 24 ساعة بعد O3 والتعرض LPS. كما تم تحليل خلايا BAL الملطخة بالمناعة لأطول محيط لها A) أي قطر النمس وB) ، في 0 و 2 و 4 و 24 و 36 ساعة بعد التعرض O3 و LPS. بالنسبة للرسوم البيانية A-D، يتم تمثيل 0 h (n= 119 خلية) باللون الأزرق، و2 ساعة (n= 105 خلايا) باللون الأحمر، و4 h (n=66 خلية) باللون الأخضر، و24 ساعة (n=309 خلايا) باللون الأرجواني، و36 ساعة (n=154 خلية) في نقاط بيانات برتقالية. * يمثل p<0.05 ، ** يمثل p<0.01. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 9
الشكل 9:رغوة القصبات الهوائية (BAL) الفينوتين داخل الخلايا: كانت خلايا BAL ملطخة بالمناعة ل DAPI (باللون الأزرق) وNK1.1 (باللون الأخضر) وGr1 (باللون الأحمر) وCX3CR1 (باللون الأرجواني) كما هو موضح في لوحات الصور العليا التمثيلية في A) 0 و B) 24 و C) 36 ساعة بعد التعرض ل O3 وLPS. مقياس شريط = 50 ميكرومتر. كانت السيتوسبينات BAL مناعة ل ATPβ (باللون الأزرق)، كي-67 (باللون الأخضر)، CD61 (باللون الأحمر) وأنجيوستاتين (باللون الأرجواني). وتظهر الصور التمثيلية في لوحات الصور السفلية في A) 0 و B) 24 و C) 36 ساعة بعد التعرض O3 وLPS. مقياس الشريط = 50 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 10
الشكل 10: رغوة القصبات الهوائية (BAL) بروتين الميتوكوندريا ATPβ, البروتين الليسوسومي Gr1، CX3CR1 داخل الخلايا وتحليل أنجيوستاتين: تم تطبيع خلايا BAL الملطخة بالمناعة لDAPI لحساب A) NK1.1 إلى DAPI كثافة الفلورسنت (FI) نسبة، B) Gr1 إلى DAPI FI نسبة وجيم) CX3CR1 إلى DAPI FI نسبة، في 0 و 24 و 36 ساعة بعد O3 وLPS التعرض. تم تطبيع خلايا BAL الملطخة بالمناعة لCD61 لحساب A) ATPβ إلى DAPI نسبة الفلورسنت (FI) نسبة B) كي-67 إلى DAPI FI نسبة وباء) أنجيوستاتين (ANG) إلى DAPI FI نسبة، في 0 و 24 و 36 ساعة بعد O3 والتعرض LPS. بالنسبة للرسومات البيانية A-F، يتم تمثيل 0 h (n= 21 خلية) باللون الأزرق، و24 ساعة (n= 796 خلية) باللون الأحمر و36 ساعة (n=2692 خلية) في نقاط البيانات الخضراء. * يمثل p<0.05 ، ** يمثل p<0.01. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 11
الشكل 11:أمراض الدم الرئوية واليوزين (H&E). الأوزون (O3)وLPS المستحثة الرئة cryosection H & E الأنسجة في 0, 24 و 36 ح بعد التعرض مجتمعة O3 وLPS. تتميز مناطق الضرر الظهاري الحويصل بسهام سوداء صلبة وتلف بطانة الرأس بواسطة رؤوس الأسهم السوداء. تمثل النجمة الصفراء (*) بقع الكريات البيض في مناطق الحاجز الحويصلات. A = الفضاء الحويصلات، B = bronchus، V = الأوعية الدموية، شريط مقياس = 100 ميكرومتر لوحات صورة اليد اليسرى و 50 ميكرومتر لوحات الصور على الجانب الأيمن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

S.No الأجسام المضادة الأولية الأجسام المضادة الثانوية إنفيتروجين
1 الماوس المضادة NK1.1 IgG2a كابا (استنساخ PK136)، كتالوج Invitrogen رقم 16-5941-82 اليكسا 488 الماعز المترافقة المضادة للفأرة IgG (H + L) ، كتالوج رقم A11002
2 الجرذ المضادة للLy6G/Ly6C (Gr1) IgG2b كابا (استنساخ RB6-8C5), كتالوج Invitrogen رقم 53-5931-82 اليكسا 568 الماعز المترافقة المضادة للفئران IgG (H + L)، كتالوج رقم A11077
3 أرنب مكافحة CX3CR1 IgG (RRID 467880)، كتالوج Invitrogen رقم 14-6093-81 اليكسا 633 الماعز المترافقة المضادة للأرانب IgG (H + L)، كتالوج رقم A21070
4 الماوس المضادة ATP5A1 IgG2b (استنساخ 7H10BD4F9)، كتالوج Invitrogen رقم 459240 اليكسا 488 الماعز المترافقة المضادة للفأرة IgG (H + L) ، كتالوج رقم A11002
5 الجرذ المضادة للLy6G IgG2a كابا (استنساخ 1A8)، كتالوج Invitrogen رقم 16-9668-82 اليكسا 568 الماعز المترافقة المضادة للفئران IgG (H + L)، كتالوج رقم A11077
6 الماوس المضادة ATP5β IgG2b (استنساخ 3D5AB1)، كتالوج Thermofisher رقم A-21351 اليكسا 350 الماعز المترافقة المضادة للفأرة IgG (H + L) ، كتالوج رقم A11045
7 الفئران المضادة كي-67 (استنساخ SolA15) IgG2a كابا، كتالوج Invitrogen رقم 14-5698-82 اليكسا 568 الماعز المترافقة المضادة للفئران IgG (H + L)، كتالوج رقم A11077
8 الهامستر الأرمنية المضادة للCD61 (استنساخ 2C9. G2) IgG1 كابا، BD كتالوج رقم 553343 اليكسا 568 الماعز المترافقة المضادة الهامستر IgG (H + L)، كتالوج رقم A21112
9 أرنب المضادة الأنجيوستاتين (الماوس aa 98-116) IgG، Abcam كتالوج رقم ab2904 اليكسا 633 الماعز المترافقة المضادة للأرانب IgG (H + L)، كتالوج رقم A21070

الجدول 1: تركيبات الأجسام المضادة الأولية والثانوية المستخدمة لتلطيخ السيتوسبينات المعدة من العينات.

القراءة ال LVP PB SBM FBM
TLC * * + في 24 ساعة; - عند 36، 72 ساعة + عند 72 ساعة
العدلات + في 24، 36، 72 ساعة + عند 24 ساعة * + في 4، 24، 36، 72 ساعة + في 4، 24، 36، 72 ساعة
بروتين + في 36 ساعة * ن.د. ن.د. ن.د.
نبذة عن كيموكين - بالنسبة إلى إيوتاشين-2، IL-2 عند 4، 24، 36، 72 ساعة + لEotaxin-1/2، IL-2، TNFα، IFNа، CX3CL1، CCL27، IL-16، CXCL5، CXCL10، MIP3β في 4 ساعة؛ + ل SDF1α عند 36 ساعة ن.د. ن.د. ن.د.
حجم الخلية + في 4 ساعة; - عند 24، 36 ساعة ن.د. ن.د. ن.د. ن.د.
ATPα - عند 24 ساعة ن.د. ن.د. ن.د. ن.د.
NK1.1/كي-67 + عند 24 ساعة ن.د. ن.د. ن.د. ن.د.
ATPβ/Gr1/CX3CR1/ANG + عند 24، 36 ساعة ن.د. ن.د. ن.د. ن.د.

الجدول 2: ملخص شامل للنتائج الرئيسية للدراسة في أقسام مختلفة. * يدل على أي تغيير، + يدل على زيادة و- يدل على انخفاض في المعلمات المقاسة. BAL يدل على broncho-alveolar lavage السائل، LVP يدل على تغلغل الأوعية الدموية الرئة، PB يدل على الدم المحيطي، SBM يدل على نخاع عظم القص وFBM يدل على عظم الفخذ حجرة نخاع العظام.

الشكل التكميلي 1: الاحتواء المناعي لل gr1 و CD11b: صور تمثيلية من DAPI (باللون الأزرق) وGr1 (باللون الأخضر) وCD11b (باللون الأحمر) شرائح السيتوسبين الفلوري الملون المناعي من شرايين الرئة perfusate (LVP) ونخاع العظم القصي (BM) ومقصورات نخاع عظم الفخذ (BM) في 0 و 4 و 24 ساعة بعد التعرض المشترك O3 وLPS. مقياس الشريط = 50 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

فيلم تكميلي 1 حجم ثلاثي الأبعاد المقدمة من الضامة BAL من 0 ساعة نقطة زمنية (أي خط الأساس)، تظهر نواة (هو مبين باللون الأزرق) والملطخة بالمناعة ل ATPα (هو مبين باللون الأخضر) وLy6G (هو مبين باللون الأحمر). الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيلم.

الفيلم التكميلي 2: حجم ثلاثي الأبعاد المقدمة من الضامة BAL من 24 ساعة نقطة زمنية بعد التعرض مجتمعة O3 وLPS، والتي تبين نواة (هو مبين باللون الأزرق) والملطخة بالمناعة ل ATPα (هو مبين باللون الأخضر) وLy6G (هو مبين باللون الأحمر). لاحظ وجود أجسام إيجابية ATPα anuclear وكذلك خلية مجزأة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيلم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الأساليب المعروضة في الدراسة الحالية تسليط الضوء على فائدة تحليل مقصورة متعددة لدراسة الأحداث الخلوية متعددة أثناء التهاب الرئة. وقد لخصنا النتائج في الجدول 2. وقد درسنا نحن والعديد من المختبرات على نطاق واسع استجابة المورين لغرس LPS داخل الجهاز الداخلي ، والذي يتميز بالتوظيف السريع للني العدلات الرئوية ، والتي تبلغ ذروتها بين 6-24 ساعة بعد ذلك ، يبدأ القرار. ومؤخرا، أظهرنا أن دون السريرية O3 (في 0.05 جزء في المليون لمدة 2 ساعة) وحدها يمكن أن تحفز تلف الرئة كبيرة في C57BL/6NJ sub-strain15، والتي تتميز بتقسيم العدلات في مقصورة الأوعية الدموية الرئة، في حين لوحظ الضامة التالفة والحطام في BAL، مما يدل على الإمكانات الالتهابية من O3. في هذا النموذج لاحظنا عدم وجود العدلات في مقصورة الحويصلات الشمسية نتيجة للضرر الظهاري الحويصلات المائية الناجمة O3 وما نتج عن ذلك من البلعوم الحويصلات. ليس فقط لم نلاحظ الحمض النووي خارج الخلية والحطام في نموذج O3 ، كانت الضامة BAL dysmorphic التي ترتبط مع مستويات IL-16 عالية ، وهو التنبيه الذي يطلق عادة عن طريق العدلات المحتضرة. لذلك، من المهم أن نفهم ما إذا كانت هذه المستويات دون السريرية O3 يمكن أن تؤثر على الاستجابة المناعية في خلاف ذلك قوية C57BL/6J سلالة فرعية، كما لوحظ مع مستويات O3 فوق الفسيولوجية21. لاحظنا أن الجمع بين O3 و endotoxin البكتيرية داخل الجهاز يسبب تجنيد العدلات في المقصورات الرئوية وكذلك الجهازية، وتتميز بوجود العدلات التالفة في BAL، وثقب الأوعية الدموية الرئوية، ومقصورات نخاع العظم القصي والفخذ بدءا من 4 ساعة والتي ظلت مرتفعة عند 24 و 36 و 72 ساعة. تم تمثيل الضرر الخلوي على أنه فقدان أكتين القشرية ولاميلبوديا وزيادة في حجم الخلية في الكريات البيض بال; العدلات، وتحليلها في مقصورة BAL، وعرض انخفاض كبير في التفاعل الإيجابي إلى microtubule، ATP synthase مجمع V α الفرعية (ATPα) وبقعة الميتوكوندريا النشطة. الرئتين التكيف مع هذا التعرض مجتمعة عن طريق upregulating التعبير عن الخلوية ATP synthase مجمع V β الفرعية (ATPβ) وكذلك أن من ليغاند ATPβ، أنجيوستاتين (الجدول 2).

جانب مهم من دراسة الالتهاب هو فهم نخر الخلوية جنبا إلى جنب مع التدرجات chemokine. كان من المثير للاهتمام أن نلاحظ أن مجموع تعداد الكريات البيض لم تكن مختلفة إلا في الدم المحيطي وحجر نخاع عظم الفخذ. قادتنا هذه الملاحظات إلى التحقيق في الأنماط الخلوية الخلوية للهيكل الخلوي والحجم والنقص المناعي. لاحظنا فقدان اللاميليبوديا والميتوكوندريا النشطة في خلايا BAL مما يشير إلى تلف خلوي. منظمة أكتين القشرية هي سمة أساسية للإشارات بين الخلوية وخصائص الحاجز الناتج. وبالتالي فإن عدم التنظيم الهيكلي الخلوي هو علامة جيدة على تلف الخلايا عندما لا يكون النخر واضحا لتقييمه. حتى في 36 ساعة، كانت خلايا BAL قد عرضت للخطر غشاء البلازما كما هو مبين من قبل تلطيخ ethidium homodimer. مباشرة بعد التعرض مجتمعة، أظهرت العدلات في BAL الإيجابية Gr1 ولكن تلطيخ سلبية أساسا لCD11b، الذي ي توطين نحو الحافة الرائدة ويساعد في الحاجز السنفي الزحف22. وبالتالي ، فإن التعرض مجتمعة تؤدي إلى تراكم العدلات غير نمطية خالية من البروتين CD11b. LPS لا تحفز على خفض تنظيم CD11b. وبالتالي، هذه الميزة هي على الأرجح نتيجة للضرر الناجم عن O3 إلى العدلات.

وكان للخلايا BAL توقيع بروتين فريد مع ارتفاع NK1.1، كي-67 و ATPβ تلطيخ في 24 ساعة مقارنة مع 0 ساعة (الجدول 2). وكان الخلايا BAL أعلى التعبير عن Gr1, CX3CR1 وكذلك أنجيوستاتين, في 24 وكذلك 36 ح بالمقارنة مع 0 ساعة (الجدول 2). وقد أكدت هذه النتائج وجود المزيد من العدلات الإيجابية Gr1 تدريجيا في BAL، في 24 و 36 ساعة، بعد التعرض(الجدول 2). وجود NK1.1، CX3CR1 و Gr1 الخلايا الإيجابية، في 24 ساعة، يشير إلى تجنيد كل من الخلايا أحادية النووية وتعدد الأشكال في BAL. بين الخلايا أحادية النووية، والخلايا الإيجابية CX3CR1 تهيمن على 36 ساعة مما يدل على وجود إما الضامة الخلالية، والصفائح الدموية أو الضامة المشتقة من الخلايا الأحادية. إدراج كل من كي-67 وأنجيوستاتين كعلامات أبلغنا عن الوسط التكاثري مقابل المضاد للأجيوجينية، على التوالي في BAL. وهكذا، فإن التعرض مجتمعة O3 وLPS يؤدي إلى انتشار الضامة ربما تليها بيئة مضادة للأجيوجين بسبب تسلل العدلات. قد تشير الزيادة العابرة في تلطيخ ATPβ إلى تكيف مهم نحو زيادة بقاء الكريات البيض بال عند 24 ساعة. تجدرالإشارةإلى أن ATPβ يمكن ربط أنجيوستاتين وتمنع البقاء على قيد الحياة لفترات طويلة 6,23, وهو ما ينعكس في الواقع في انخفاض مؤشر كي-67 في 36 ساعة بعد التعرض.

على الرغم من أن بروتين BAL كان أعلى عند 36 ساعة ، وليس نقاط زمنية أخرى ، إلا أن تغلغل الأوعية الدموية في الرئة لم يظهر أي تغييرات في تركيز البروتين قبل أو بعد التعرض. فمن الممكن أن مقصورة الأوعية الدموية لم تتأثر ولكن هذا هو على الأرجح الخلط بسبب أكسدة الأحماض الأمينية الغنية بالإلكترونات مثل ميثيونين, الهستيدين والسيستين من قبل O3 الجذور الحرة المستحثة والبروتينات السطحية الناتجة (SP-A, SP-B) تدهور وكذلك تسرب الأوعية الدموية24,25,26. القياس الكمي للبروتينات BAL IgM، BAL السطحي، بال الألبومين أو البذخ صبغ (باستخدام ايفانز الأزرق أو الفلورسين ايزو ثيوسيانات (FITC) dextran) هي طرق بديلة لتقييم سلامة الظهارية والظهارية.

ومن المثير للاهتمام، أن مستويات تغلغل الأوعية الدموية في الرئة من إيوتاسين-2 وIL-2 قد أثيرت بشكل حاد عند نقطة زمنية تبلغ 4 ساعة. وقد انخفضت مستويات اللوتاكسين-2 وIL-2 إلى حد كبير بعد التعرض، مما يشير إما إلى تدهور في الفضاء الحويصلات الشمسية أو الفخ في الأوعية الدموية في الرئة. كشفت المزيد من chemokines تحليلها في الرئة الأوعية الدموية perfusate مستويات أعلى من chemokine اليوزينية (eotaxin-1)، TNFα، IFNа، العقدة الليمفاوية المشتقة chemokines الخلايا أحادية نووية (CX3CL1، CXCL10، CCL27، MIP3β)، الظهارية المشتقة من النيوتروفيل chemokine (CXCL5)، وneepin (IL-16) صدر بعد نخر الثانوية من العدلات27،ولكن فقط في 4 ساعة بعد التعرض. في 36 ح, نخاع العظم المستمدة عموم الكريات البيض chemokine, SDF1α28, كان أعلى في الرئة الأوعية الدموية perfusate. ترتبط تركيزات SDF1α المشتقة من نخاع العظم بنتائج علم الخلايا حيث تكون الخلايا الإيجابية CD11b و Gr1 وفيرة عند 24 و 36 ساعة بعد التعرض. وهكذا، فإن ملامح كيموكيين والسيكلوتي تعكس تعبئة الكريات البيض كبيرة من مقصورات نخاع العظام (الجدول 2).

نموذجنا الحيواني ونتائج البحوث الحيوية مع الأخذ في الاعتبار حالات العالم الحقيقي حيث الكائنات الحية في البيئات الحضرية من المرجح أن تتعرض لمثل هذه دون السريرية O3 والعوامل المعدية8. نموذج المورين لدينا بمثابة نموذج يمكن الوصول إليها بسهولة التي يمكن استنساخها في مختبرات الاحتواء المستوى 2 لدراسة الآليات الرئوية وخارج الرئة من موت الخلايا الغازية والالتهابات، كما هو الحال مع العدوى COVID-1929. وينبغي توجيه الدراسات المستقبلية إلى تصور الإصلاح أو متابعة المراحل المتأخرة وكذلك التعرض المزمن للتحقيق في التعديلات الخلوية طويلة الأجل. وهكذا ، لدراسات التهاب الرئة الشاملة التي تنطوي على الجهاز الحي15 والحيوان16،30،31 تقنيات التصوير ، وتصميم دراسة نقطة النهاية الحالية يمكن أن توفر رؤى حيوية في استجابة المضيف لجرعة منخفضة مجتمعة O3 (موت الخلية) وLPS (التحفيز المناعي) ، وبالتالي فك آليات إصابة الرئة الحادة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يوجد لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح أو إفصاحات.

Acknowledgments

يتم تمويل البحث الذي أجري من خلال منحة الرئيس NSERC بالإضافة إلى أموال بدء التشغيل من مركز سيلفيا فيدوروك الكندي للابتكار النووي. يتم تمويل مركز سيلفيا فيدوروك الكندي للابتكار النووي من قبل الابتكار ساسكاتشوان. تم إجراء التصوير الفلوري في مركز التصوير WCVM ، الذي تموله NSERC. تم تمويل جيسيكا بروكوس (طالبة MSc) وManpreet Kaur (طالبة MSc) من أموال بدء التشغيل من مركز سيلفيا فيدوروك الكندي للابتكار النووي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
33-plex Bioplex chemokine panel Biorad 12002231
63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives Leica HCX PL APO CS (11506188)
Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Invitrogen A11045
Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Invitrogen A11002
Alexa 488 conjugated phalloidin Invitrogen A12370
Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1A Millipore 05-829X-555
Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L) Invitrogen A21112
Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L) Invitrogen A11077
Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen A21070
Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa BD Pharmingen 553343
C57BL/6 J Mice Jackson Laboratories 64
Confocal laser scanning microscope Leica Leica TCS SP5
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) Invitrogen D1306 aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C
Inverted fluorescent wide field microscope Olympus Olympus IX83
Ketamine (Narketan) Vetoquinol 100 mg/ml Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock
Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit Invitrogen L3224
Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9) Invitrogen 459240
Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1) Invitrogen A-21351
Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136) Invitrogen 16-5941-82
Pierce 660 nm protein assay Thermoscientific 22660
Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG Abcam ab2904
Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880) Invitrogen 14-6093-81
Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa Invitrogen 14-5698-82
Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8) Invitrogen 16-9668-82
Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5) Invitrogen 53-5931-82
Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2) BD Pharmingen 553142
Reduced mitotracker orange Invitrogen M7511
Xylazine (Rompun) Bayer 20 mg/ml Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhattacharya, J., Matthay, M. A. Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury. Annual Review of Physiology. 75, 593-615 (2013).
  2. Aulakh, G. K. Neutrophils in the lung: "the first responders". Cell Tissue Research. , (2017).
  3. Aulakh, G. K., Suri, S. S., Singh, B. Angiostatin inhibits acute lung injury in a mouse model. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (1), 58-68 (2014).
  4. Schneberger, D., Aulakh, G., Channabasappa, S., Singh, B. Toll-like receptor 9 partially regulates lung inflammation induced following exposure to chicken barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 11 (1), 1-10 (2016).
  5. Shah, D., Romero, F., Stafstrom, W., Duong, M., Summer, R. Extracellular ATP mediates the late phase of neutrophil recruitment to the lung in murine models of acute lung injury. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 152-161 (2014).
  6. Aulakh, G. K., Balachandran, Y., Liu, L., Singh, B. Angiostatin inhibits activation and migration of neutrophils. Cell Tissue Research. , (2013).
  7. Cakmak, S., et al. Associations between long-term PM2.5 and ozone exposure and mortality in the Canadian Census Health and Environment Cohort (CANCHEC), by spatial synoptic classification zone. Environment International. 111, 200-211 (2018).
  8. Dauchet, L., et al. Short-term exposure to air pollution: Associations with lung function and inflammatory markers in non-smoking, healthy adults. Environment International. 121, Pt 1 610-619 (2018).
  9. Delfino, R. J., Murphy-Moulton, A. M., Burnett, R. T., Brook, J. R., Becklake, M. R. Effects of air pollution on emergency room visits for respiratory illnesses in Montreal, Quebec. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 568-576 (1997).
  10. Peterson, M. L., Harder, S., Rummo, N., House, D. Effect of ozone on leukocyte function in exposed human subjects. Environmental Research. 15 (3), 485-493 (1978).
  11. Rush, B., et al. Association between chronic exposure to air pollution and mortality in the acute respiratory distress syndrome. Environmental Pollution. 224, 352-356 (2017).
  12. Rush, B., Wiskar, K., Fruhstorfer, C., Celi, L. A., Walley, K. R. The Impact of Chronic Ozone and Particulate Air Pollution on Mortality in Patients With Sepsis Across the United States. Journal of Intensive Care Medicine. , (2018).
  13. Stieb, D. M., Burnett, R. T., Beveridge, R. C., Brook, J. R. Association between ozone and asthma emergency department visits in Saint John, New Brunswick, Canada. Environmental Health Perspectives. 104 (12), 1354-1360 (1996).
  14. Thomson, E. M., Pilon, S., Guenette, J., Williams, A., Holloway, A. C. Ozone modifies the metabolic and endocrine response to glucose: Reproduction of effects with the stress hormone corticosterone. Toxicology and Applied Pharmacology. 342, 31-38 (2018).
  15. Aulakh, G. K., Brocos Duda, J. A., Guerrero Soler, C. M., Snead, E., Singh, J. Characterization of low-dose ozone-induced murine acute lung injury. Physiological Reports. 8 (11), 14463 (2020).
  16. Aulakh, G. K., et al. Quantification of regional murine ozone-induced lung inflammation using [18F]F-FDG microPET/CT imaging. Scientific Reports. 10 (1), 15699 (2020).
  17. Charavaryamath, C., Keet, T., Aulakh, G. K., Townsend, H. G., Singh, B. Lung responses to secondary endotoxin challenge in rats exposed to pig barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 3, London, England. 24 (2008).
  18. Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation. Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).
  19. Southam, D. S., Dolovich, M., O'Byrne, P. M., Inman, M. D. Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position, and anesthesia. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 282 (4), 833-839 (2002).
  20. Aulakh, G. K. Lack of CD34 produces defects in platelets, microparticles, and lung inflammation. Cell Tissue Research. , (2020).
  21. Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone. Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).
  22. Yipp, B. G., et al. The Lung is a Host Defense Niche for Immediate Neutrophil-Mediated Vascular Protection. Science Immunology. 2 (10), (2017).
  23. Lee, T. Y., et al. Angiostatin regulates the expression of antiangiogenic and proapoptotic pathways via targeted inhibition of mitochondrial proteins. Blood. 114 (9), 1987-1998 (2009).
  24. Hawkins, C. L., Davies, M. J. Detection, identification, and quantification of oxidative protein modifications. Journal of Biological Chemistry. 294 (51), 19683-19708 (2019).
  25. Hemming, J. M., et al. Environmental Pollutant Ozone Causes Damage to Lung Surfactant Protein B (SP-B). Biochemistry. 54 (33), 5185-5197 (2015).
  26. Oosting, R. S., et al. Exposure of surfactant protein A to ozone in vitro and in vivo impairs its interactions with alveolar cells. American Journal of Physiology. 262 (1), Pt 1 63-68 (1992).
  27. Roth, S., et al. Secondary necrotic neutrophils release interleukin-16C and macrophage migration inhibitory factor from stores in the cytosol. Cell Death & Discovery. 1, 15056 (2015).
  28. Kawaguchi, N., Zhang, T. T., Nakanishi, T. Involvement of CXCR4 in Normal and Abnormal Development. Cells. 8 (2), (2019).
  29. Gupta, A., et al. Extrapulmonary manifestations of COVID-19. Nature Medicine. 26 (7), 1017-1032 (2020).
  30. Aulakh, G. K., Kuebler, W. M., Singh, B., Chapman, D. 2017 IEEE Nuclear Science Symposium and Medical Imaging Conference (NSS/MIC). , 1-2 (2017).
  31. Aulakh, G. K., et al. Multiple image x-radiography for functional lung imaging. Physics in Medicine & Biology. 63 (1), 015009 (2018).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 169، الأوزون، LPS، التهاب الرئة الحاد، F1F0 ATP synthase (مجمع V) وحدات فرعية، علم الخلايا الفلوري المناعي، IL-16
تصور التكيفات الخلوية الرئة خلال الأوزون المشترك وLPS الناجمة عن إصابة الرئة مورين الحادة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Duda, J. A. B., Kaur, M., Aulakh, G. … More

Duda, J. A. B., Kaur, M., Aulakh, G. K. Visualizing Lung Cellular Adaptations during Combined Ozone and LPS Induced Murine Acute Lung Injury. J. Vis. Exp. (169), e62097, doi:10.3791/62097 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter