Summary
Ozônio combinado e endotoxina bacteriana exposição de camundongos mostram morte celular generalizada, incluindo a de neutrófilos. Observamos adaptações celulares como interrupção da lamellipodia citoesquelética, aumento da expressão celular da complexa subunidade de synthase V ATP β e angiostatina na lavagem bronco-alveolar, supressão da resposta imune pulmonar e recrutamento retardado de neutrófilos.
Abstract
Os pulmões são continuamente confrontados com insultos diretos e indiretos na forma de condições inflamatórias estéreis (partículas ou reativas) e infecciosas (bacterianas, virais ou fúngicas). Uma resposta esmagadora do hospedeiro pode resultar em respiração comprometida e lesão pulmonar aguda, que é caracterizada pelo recrutamento de neutrófilos pulmonares como resultado da resposta imunológica, coagulativa e remodelagem de tecidos. Métodos microscópicos sensíveis para visualizar e quantificar adaptações celulares pulmonares murinas, em resposta ao ozônio de baixa dose (0,05 ppm), um potente poluente ambiental em combinação com lipopólise bacteriana, um agonista TLR4, são cruciais para entender os mecanismos inflamatórios e de reparo. Descrevemos uma análise microscópica fluorescente abrangente de vários compartimentos corporais pulmonares e sistêmicos, ou seja, o fluido de lavage bronco-alveolar, perfusato vascular pulmonar, crioseções pulmonares esquerdas e perfusato de medula óssea severa. Mostramos danos de macrófagos alveolares, neutrófilos, tecido parenchímal pulmonar, bem como células de medula óssea em correlação com uma resposta imune retardada (até 36-72 h) que é marcada por gradientes de quimioterapia discretos nos compartimentos analisados. Além disso, apresentamos a matriz extracelular pulmonar e interações citosqueléticas celulares (actina, tubulina), espécies de oxigênio mitocondrial e reativa, plasminogen anticoagulativo, seu fragmento de peptídeo anti-angiogênico angiogenic, as subunidades do complexo de sintetizador ATP mitocondrial V, α e β. Esses marcadores substitutos, quando complementados com ensaios adequados em células in vitro e técnicas de imagem animal in vivo, como microscopia intravital, podem fornecer informações vitais para entender a resposta pulmonar a novos agentes imunomodulatórios.
Introduction
A lesão pulmonar aguda (ALI) é uma resposta patológica crucial dos pulmões a estímulos infecciosos ou outros prejudiciais que é marcada pela ativação simultânea dos sistemas imunológicos coagulativos, fibrinolíticos e inatos1. Os neutrófilos detectam prontamente padrões microbianos, bem como padrões de danos intracelulares através da família receptor toll-like (TLR)2,3,4. Os neutrófilos liberam citocinas pré-formadas e o conteúdo do grânulo citotóxico, que pode causar danos colaterais ao tecido. O dano alveolar resultante é marcado com a morte celular secundária levando à liberação de moléculas como o triptosfato de adenosina (ATP)5, estabelecendo-se assim em um ciclo vicioso de desregulação imunológica.
Um problema não resolvido na compreensão da ALI diz respeito à questão de como a lesão é iniciada dentro da membrana alveolar. O complexo de transporte de elétrons V, g1F0 ATP synthase, é uma proteína mitocondrial conhecida por ser expressa onipresentemente, na célula (incluindo membrana plasmática endotelial, leucócito, epitelial) durante a inflamação. O citoesqueleto celular, composto por actina e tubulina, abriga muitas formas e funções de células modulando, bem como proteínas mitocondriais, respectivamente. Recentemente mostramos que o bloqueio da synthase ATP por uma molécula endógena, angiostatina, silencia o recrutamento de neutrófilos, ativação e lipopólise (LPS) induzida inflamação pulmonar6. Assim, tanto os mecanismos bioquímicos (ATP synthase) quanto os imunológicos (TLR4) podem regular a barreira alveolar durante a inflamação pulmonar.
A exposição ao ozônio (O3),poluente ambiental, prejudica a função pulmonar, aumenta a suscetibilidade a infecções pulmonares, e os baixosníveis curtos de exposições de O 3 aumentam o risco de mortalidade naqueles com condições cardiorrespiratórias subjacentes7,8,9,10,11,12,13,14. Assim, a exposição a concentrações fisiologicamente relevantes de O3 fornece um modelo significativo de ALI para estudar mecanismos fundamentais de inflamação7,8. Nosso laboratório estabeleceu recentemente um modelo murino de baixa dose O3 induzido ALI15. Após a realização de uma dose e uma resposta ao tempo-resposta às baixas concentrações de O3, observamos que a exposição a 0,05 ppm O3 por 2 h, induz lesão pulmonar aguda que é marcada pela subunidade V do complexo de synthase do pulmão Β (ATPβ) e expressão de angiostatina, semelhante ao modelo LPS. Imagens pulmonares intravitais revelaram a desorganização de microfilamentos de actina alveolar indicando danos pulmonares, e ablação dos níveis de oxigênio reativo septal alveolar (ROS) (indicando revogação da sinalização celular de base) e potencial de membrana mitocondrial (indicando morte celular aguda) após 2 h de exposição a 0,05 ppm O315 que se correlacionava com um pulmão heterogêneo 18retenção FDG16,recrutamento de neutrófilos e liberação de citocinas, liberação, mais notavelmente IL-16 e SDF-1α. A mensagem de nossa última opinião é que O3 produz toxicidade exponencialmente alta quando exposto em concentrações abaixo dos limites permitidos de 0,063 ppm acima de 8h (por dia) para exposição humana. É importante ressaltar que não existe uma compreensão clara sobre se essas exposições sub-clínicas O3 podem modular mecanismos mediados pelo TLR4, como pela endotoxina bacteriana17. Assim, estudamos um modelo de exposição de O3 e LPS de duplo sucesso e observamos as adaptações celulares imunes e não imunes.
Descrevemos uma análise microscópica fluorescente abrangente de vários compartimentos corporais pulmonares e sistêmicos, ou seja, o fluido de lavage bronco-alveolar (ou seja, BAL) que amostra os espaços alveolares, o perfusato vascular pulmonar (i.e., LVP) que amostra a vasculatura pulmonar e o interstício septal alveolar no caso de uma barreira endotelial comprometida, crioseções pulmonares esquerdas, para olhar para leucócitos parnchímicos e aderentes deixados no tecido pulmonar lavado , sangue periférico que representa os leucócitos circulantes e os perfusados da medula óssea sternal e do fêmur que amostram os locais proximais e distais da mobilização de células hematopoiéticas durante a inflamação, respectivamente.
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Protocol
O desenho do estudo foi aprovado pelo Conselho de Ética em Pesquisa Animal da Universidade de Saskatchewan e aderiu ao Conselho Canadense de Orientações de Cuidados Com Animais para uso humano de animais. Foram adquiridos camundongos C57BL/6J masculinos de seis semanas. NOTA: Eutanize todos os animais que desenvolvem letargia grave, dificuldade respiratória ou outros sinais de grave angústia antes do ponto final programado.
NOTA: Prepare o seguinte: 27-18 G de agulha-blunted (vai depender do diâmetro traqueal do rato), tubos de PE de tamanho adequado para caber a agulha cega (fazer uma cânula pe para cada rato), cânula, 2 tesouras afiadas, 2 fórceps contundentes (pequenos), 1 fórceps afiados (pequenos), 3 1 mL de seringas, tubos de microfuge rotulados (para BAL, coleta de perfusato de sangue, vascular e medula óssea) e frascos rotulados (para fixação de tecidos), sacos de amostra/criovials para coleta de tecido, rolo de fio de algodão do açougueiro (cortado em ligaduras adequadas). Todos os produtos químicos utilizados para os experimentos estão indicados na Tabela de Materiais.
1. Exposições de ozônio e LPS para indução de lesão pulmonar murina
- Exposição ao ozônio
- Prepare uma caixa de indução O3 personalizada. Adicione ração de rato, garrafa de água, brinquedos de enriquecimento e roupas de cama limpas em ordem e imite o ambiente de habitação dos ratos.
NOTA: Essas etapas garantirão que os ratos tenham livre acesso a alimentos e água quando alojados na caixa de indução personalizada e ajudarão a aliviar o estresse indevido. - Alterne o calibrador/gerador O3 "ON" (colocado em direção à porta de entrada) para estabilizar a lâmpada UV antes (cerca de 15 minutos antes das exposições) e conecte-se com o monitor O3 em linha.
NOTA: O monitor O3 deve ler uma média de 0,05 ppm, como amostrado da tomada a temperatura constante do ar da câmara (72 ±3 °F) e umidade relativa (50±15%). - Para exposições O3, coloque suavemente ratos na caixa de indução personalizada e exponha continuamente os ratos a 0,05 ppm O3 por 2 h.
- Prepare uma caixa de indução O3 personalizada. Adicione ração de rato, garrafa de água, brinquedos de enriquecimento e roupas de cama limpas em ordem e imite o ambiente de habitação dos ratos.
- Administração de Anestesia e LPS intranasal
- Prepare 10 mg/mL para cetamina e xilazina, separadamente.
- Prepare um coquetel misturando 20 partes de cetamina e 1 parte de xilazina. Se o mouse pesa X g, injete (X/200) mL de coquetel de cetamina/xilazina na cavidade peritoneal. Para um rato, prepare 1 mL de coquetel composto por 1000 μL do estoque de cetamina de 10 mg/mL e 50 μL do estoque de xilazina. Misture bem por pipetting para cima e para baixo em um tubo de microfuça.
NOTA: As ações de cetamina e xilazina podem ser preparadas com uma semana de antecedência. - Anestesiar os camundongos sob cetamina intraperitoneal leve (IP) (50 mg/kg)/xylazine (1 mg/kg) (por exemplo, para um rato de 25 g, injete 0,125 mL do coquetel).
- Prepare uma solução de 1 mg/mL de LPS, em soro fisiológico, e encha 50 μL da solução em uma pipeta.
- Segure o mouse ereto com a parte traseira/dorsal na palma da mão, segurando as orelhas com a mesma mão. Agora, coloque 50 μL da solução LPS18 delicadamente externa das narinas (ou seja, 25 μL em cada narina ou 50 μL em uma narina; não importa enquanto o procedimento for rápido) e permita que os ratos inalem a solução LPS.
- Incutir camundongos de controle com 50 μL de soro fisiológico estéril.
Atenção: Não exceda mais de 100 μL para instilação, o que pode ser fatal. Muito menos volume (ou seja, <50 μL) e há risco de apenas deposição nasal. - Após a administração do LPS, deita suavemente os ratos, seja de barriga para baixo ou de costas sobre o monte de cama com a cabeça ligeiramente inclinada para baixo.
NOTA: Esta orientação prolonga a retenção da solução na cavidade nasal19. - Às 0, 2, 4, 24, 36 e 72 h após a exposição, anestesiar os camundongos i.p. com dose completa de cetamina (200 mg/kg)/xylazine (4 mg/kg) mistura (ou seja, X/50 mL do coquetel, onde X é o peso do rato em gramas ou 0,50 mL para um rato de 25 g).
- Observe o mouse até que ele perca a consciência e o reflexo certo (ou seja, não volte quando colocado em posição supina). Agora, verifique se o mouse está em busca de profundidade de anestesia, monitorando a respiração (excursões rítmicas do peito) e a frequência cardíaca, que deve cair visivelmente, após 1-2 minutos.
- Em seguida, verifique se há reflexos do pedal, ou seja, belisque qualquer um dos dígitos do membro traseiro e observe se há retração do membro, como reflexo. Se o mouse responder, retoe com injeções adicionais de 0,1 mL ou mais, conforme necessário.
NOTA: Para alcançar anestesia profunda, tenha em mente que certas cepas ou camundongos obesos geralmente têm um volume maior de distribuição e, portanto, podem ser facilmente superdos, se não for permitido tempo suficiente para anestesia completa (que pode ser em torno de 10 minutos ou mais). Assim, algumas cepas podem ser resistentes à anestesia e, portanto, requerem mais recargas. Esse conhecimento é adquirido após muitas observações práticas e experiência com camundongos de diferentes cepas e idade. Como alguns experimentos piloto também foram realizados imediatamente após as exposições de O3 e LPS (ou seja, no ponto de tempo de 2h), também incluímos algumas análises de células BAL muito precoces desses experimentos para destacar os efeitos imediatos da exposição combinada de O3e LPS.
2. Coleta de amostras
- Coloque o mouse na bandeja cirúrgica. Agora, coloque suavemente a pomada lubrificante nos olhos para evitar a perda de fluidos e higienize o mouse com 70% de spray de etanol.
- Faça pequenos cortes nas membranas superiores e inferiores da pele com tesouras, para expor a traqueia e o tórax.
- Faça um corte logo abaixo do esterno e exponha o coração.
- Punção cardíaca
- Coloque uma agulha 25G presa à seringa heparinizada no ventrículo direito e tire sangue por punção cardíaca.
NOTA: O sangue geralmente se desenha com o mínimo de êmbolo, se o tempo de expor o coração à punção cardíaca for inferior a um minuto. Depois de coletar cerca de 0,4-0,5 mL, pode-se precisar parar por alguns segundos antes de coletar o sangue restante. Isso é feito para deixar o coração bombear qualquer volume restante para a câmara ventricular direita. No final da coleta de sangue, o coração pára para bombear. - Colete o sangue e armazene em tubos de microfuça para posterior processamento.
- Coloque uma agulha 25G presa à seringa heparinizada no ventrículo direito e tire sangue por punção cardíaca.
- Traqueostomia
- Use cuidadosamente pinças/fórceps contundentes para limpar a região traqueal do tecido sobrelado. Use as mãos enluvadas mais do que os instrumentos cirúrgicos para evitar sangramento. Se muito sangue está escorrendo, há risco de contaminar as amostras de BAL. Use cotonetes de algodão, se necessário, embora não preferenciais. Kimwipes são alternativas melhores.
- Agora, corte a caixa torácica para expor os pulmões. Novamente, tenha cuidado para não cortar o esterno e as artérias intercostal ou a aorta ascendente; fazer cortes menores enquanto avança pela caixa torácica)
- Passe uma ligadura de algodão abaixo do corte traqueal e deixe como tal por enquanto.
- Corte a traqueia em um local adequado na parte distal 1/3, apontando para os pulmões, para permitir o acesso a uma cânula traqueal de 28 G.
- Insira uma cânula pe de 28 G (um comprimento mínimo de 3-5 mm e extremidade distal aparada para facilitar a inserção) na traqueia. Cuidado com o fim da traqueia antes da bifurcação e, em seguida, puxe cerca de um mm para trás para evitar a amostragem apenas de lobo único.
- Com firmeza, amarre a ligadura de algodão para manter a cânula no lugar. Não destrua a cânula.
- Lavage broncho-alveolar (BAL)
- Encha 0,5 mL de PBS em uma seringa de 1 mL.
- Agora, injete gradualmente 0,5 mL de PBS na cânula com a ajuda de 1 mL de seringa.
- Depois de injetar PBS, aspire a seringa desde que não resista à sucção.
NOTA: Se houver resistência ao aspirar o fluido BAL, isso indica o colapso do tecido alveolar ou brônquico. Nesse caso, puxe a cânula por um minúsculo para desprender a cânula formar as paredes do tecido. - Colete o fluido aspirado em um tubo de microfuça rotulado e coloque no gelo.
- Realizar mais duas lavages de forma semelhante coletando no mesmo frasco (ou seja, um total de 0,5 X 3 = 1,5 mL lavage).
- Meça o volume do fluido BAL coletado. A recuperação da lavage deve ser próxima de 90%.
- Perfusato vascular pulmonar (LVP)
- Corte a aorta torácica descendente em um local entre as metades torácica e abdominal, para evitar qualquer recuo de perfusado nos pulmões enquanto perfusa através do ventrículo direito.
- Borrida a cavidade perto da extremidade da aorta cortada, livre de sangue.
- Em seguida, perprendo os pulmões com 0,5 mL de solução salina heparinizada heparinizada injetada através do ventrículo direito.
- Recolher o perfusato vascular da cavidade na extremidade cortada da aorta torácica descendente, em um tubo de microfuge, colocado no gelo e medir seu volume.
- Ligate o bronco direito proximal à sua ramificação da traqueia (com fio de algodão).
- In situ fixação pulmonar esquerda
- Conecte uma seringa de 1 mL à cânula traqueal, que é longa o suficiente para inserir através da incisão traqueal anterior.
- Desenhe o ar na seringa até 0,6 mL de marca.
- Em seguida, encha a seringa restante (até o final) com 2% de paraformaldeído à temperatura ambiente. Certifique-se de que o êmbolo está pronto para sair sem sugar qualquer ar da cânula.
- Agora, afixe a seringa com uma fita adesiva, em um recipiente vertical, medido até 20 cm de altura.
- Suavemente, desenhe o êmbolo para deixar o fluxo fixador em direção à traqueia. Caso haja algumas bolhas de ar na cânula, coloque suavemente o êmbolo em cima da seringa e o fluido começará a fluir após alguns segundos.
- Deixe o pulmão esquerdo inflar até sua capacidade total in situ, por 5 minutos, a partir de uma altura de 20 cm formando uma coluna de água de 20 cm.
- Durante este procedimento, certifique-se de proteger os lóbulos pulmonares certos de entrar em contato com paraformaldeído, pois isso afetará os ensaios a jusante.
- Coloque tecidos de laboratório dobrados para absorver qualquer paraformaldeído que possa entrar em contato com os lóbulos pulmonares certos.
ATENÇÃO: O paraformaldeído é altamente tóxico. Portanto, não inspire ou coloque contato com quaisquer partes expostas do corpo. Tenha extrema cautela durante o manuseio. - Durante o tempo de instilação de paraformaldeído, higienize o abdômen.
- Corte os lóbulos pulmonares certos da traqueia certificando-se de remover qualquer rosca e imediatamente coloque os lóbulos em um criovial rotulado e solte-o em nitrogênio líquido para análise de citocinas moleculares/bioquímicas a jusante/RT-PCR/análise de manchas ocidentais de homogeneizar o pulmão.
- Corte cuidadosamente o pulmão esquerdo para qualquer tecido conjuntivo ou membranas pleurais e mergulhe-o em 2% de paraformaldeído por 24 h a 4 °C.
- Incorpore o pulmão fixo em parafina de acordo com o protocolo padrão de incorporação.
Atenção: Não aqueça demais as amostras de pulmão. - Corte a parte abdominal e desefo-a do osso pélvico (quadril).
- Separe os ossos do fêmur esquerdo e direito da porção pélvica, em uma placa de petri cheia de soro fisiológico mantida no gelo.
- Coleção de aspiração de medula óssea de sternal e fêmur
- Limpe o tecido e os músculos dos ossos usando tecidos de laboratório.
- Colete a caixa torácica ventral e o esterno em uma placa de Petri cheia de soro fisiológico mantida no gelo.
- Corte as pontas distal e proximal dos ossos de esterno e fêmur.
- Perfunda os ossos 4 vezes com 0,5 mL de soro fisiológico, usando agulhas bem equipadas (24 a 28 G) em seringas de 1 mL, e colete as frações de cada osso em tubos rotulados equipados com filtros e colocados no gelo.
NOTA: O medidor de agulha varia entre o tamanho do animal. Após a descarga, o osso do fêmur deve aparecer transparente. - Uma vez coletadas as amostras, ensace o rato em um saco plástico e coloque em um freezer de carcaça animal para o descarte adequado, conforme orientações da instalação institucional de animais.
3. Processamento de amostras
- Contagem total (TLC) e diferencial (DLC) de leucócitos
- Centrífuga de sangue periférico, BAL, perfusato vascular pulmonar e medula óssea (sternal e fêmur) amostras por 10 min a 500 g.
- Colete os supernantes, congele-os e armazene-os a -80 °C até uma análise mais aprofundada.
- Reconstituir as células em um mínimo de 200 μL de PBS.
- Realize o TLC contando células bal, sangue, perfusato vascular pulmonar e medula óssea em um hemótmetro.
- Manche outra alíquota de 9 μL de BAL com uma mistura de 1 μL de ethidium homodimer-1 verde e vermelho para quantificar células vivas (verdes) devido à atividade de esterásse intracelular e quaisquer células BAL danificadas (em vermelho) devido à perda da integridade da membrana plasmática.
- Adicione 2% de ácido acético aos RBCs de lise, em uma proporção de 1:10 para TLC sanguíneo e proporção de 1:2 para TLC vascular vascular pulmonar.
ATENÇÃO: Ajuste as concentrações celulares diluindo-se em PBS se a concentração for superior a 1x106 células por mL (muito importante para as amostras de medula óssea). - Centrifugar as células para preparar citospinas em lâminas e manchas como explicado abaixo para DLCs. Conte um mínimo de 100 células para contagem diferencial de células leucócitos (DLCs).
NOTA: Normalmente, pode-se preparar dois citospins em um slide. E depois de 10-15 minutos de secagem de ar, prossiga com a etapa de coloração. - Divida o BAL coletado de três ratos-piloto por grupo em dois citospins cada e colora para actina/tubulina e mitocôndrias com fosforilação oxidativa ativa (mitotracker reduzido). Utilize o BAL de mais três ratos para dividir em dois citospins cada, para slides manchados NK1.1/Gr1/CX3CR1 e ATPβ/Ki-67/CD61/Angiostatin. Divida o BAL de mais três ratos em dois citospões cada para coloração para ATPα/Ly6G e CX3CR1/Siglec-F.
- Lavage de broncoalveolar (BAL) e Perfusato Vascular Pulmonar (LVP) quantificação total de proteínas
- A fim de quantificar os compartimentos induzidos por O3 e LPS da barreira vascular ou da pressão oncótica relativa nos dois compartimentos pulmonares (ou seja, os compartimentos septo alveolar (intersticial) e perfusato vascular pulmonar (vascular), medem o teor total de proteínas nos fluidos coletados.
- Analise as frações supernacas descongeladas para sua concentração total de proteínas usando um assisay colorimétrico resistente ao detergente padrão.
- Análise de quimiocina de lavagem de broncoalveolar (BAL) e perfusato vascular pulmonar (LVP)
- Em seguida, analise as quimiocinas em refusão vascular de BAL e perfusato pulmonar (LVP) usando um imunoensaio à base de contas magnéticas de 33 plex. Isso informará sobre a direcionalidade das vias aéreas/interstitium vs gradientes de quimiocina vascular estabelecidos após exposições combinadas.
- Analyze the following panel of chemokines : CXCL13 (B-lymphocyte chemoattractant), CCL27 (IL-11 R-alpha-locus chemokine (ILC)), CXCL5 (epithelial-derived neutrophil-activating peptide 78 (ENA-78)), CCL-11 (eotaxin-1), eotaxin-2 (CCL-24), CX3CL1 (fractalkine), GM-CSF (CSF-2), CCL1, IFNγ (interferon gamma), IL-10 (interleukin-10), IL-16 (interleukin-16), IL-1β (interleukin-1 beta), IL-2 (interleukin-2), IL-4 (interleukin-4), IL-6 (interleukin-6), CXCL-10 (interferon gamma-induced protein 10 (IP-10)), CXCL11 (Interferon-gamma-inducible protein 9 (IP-9)), KC (keratinocyte chemoattractant), MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1), MCP-3 (monocyte chemoattractant protein-3), MCP-5 (monocyte chemoattractant protein-5), MDC (macrophage-derived chemokine (CCL22)), MIP-1α (macrophage inflammatory protein-1 alpha), MIP-1β (macrophage inflammatory protein-1 beta), MIP-2 (macrophage inflammatory protein-2), MIP-3α (macrophage inflammatory protein-3 alpha), MIP-3β (macrophage inflammatory protein-3 beta), RANTES (regulado na ativação, célula T normal expressa e secretado (CCL5)), CXCL-16, CXCL-12/SDF-1alpha (fator derivado de células estroma), TARC (timo e ativação regulada quimiócina (TARC)), TECK (Thymus-ExpressEd Chemokine (CCL25)) e TNαF (fator de necrose tumoral).
4. Mancha de citospin e histologia pulmonar
- Manchas bioquímicas de citospin
- Cerque os citospins com uma caneta hidrofóbica para conter os produtos químicos para incubação durante o procedimento.
- Reidratar os citospins na PBS por 5 minutos.
- Fixar as amostras de citospin em 2% de paraformaldeído por 10 minutos, lavar três vezes com PBS por 5 minutos cada.
- Permeabilize com frio frio 70% acetona por 7 minutos e lave novamente três vezes com PBS por 5 minutos cada.
- Mancha para actina e tubulina ou Mitotracker reduzida (incubar com uma mistura de 2 μg/50 μL de Alexa 488 fábula conjugada mostrada em verde, e 2 μg/μL de Alexa 555 camundongo conjugado anti-α tubulina ou mitotracker reduzido mostrado em vermelho, respectivamente) por 15 minutos.
NOTA: Use anticorpo de controle isótipo IgG1 do mouse, em um citospina separado, para validar o protocolo de coloração da tubulina. Executar os mesmos passos que explicados de 4.1.1 para 4.1.8, mas para controles isótipos. - Remova as manchas derrubando suavemente a mistura do slide. Incubar os slides com DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilôndole) por 5-10 min para coloração de núcleos.
- Lave os citospins 3 vezes com PBS por 5 minutos cada, cubra com mídia de montagem anti-fade e armazene durante a noite no escuro à temperatura ambiente antes da imagem.
- Adquira imagens sob um microscópio vertical de campo largo equipado com uma câmera científica. Certifique-se de tempos consistentes de exposição da câmera definidos para os diferentes canais fluorescentes ao deslizar imagens.
- Manchas imuno-fluorescentes de citospin:
- Cerque os citospins com uma caneta hidrofóbica para conter os produtos químicos para incubação durante o procedimento. Reidratar os citospins na PBS por 5 minutos.
- Fixar as amostras de citospin incubando em 2% paraformaldeído por 10 minutos, lave três vezes com PBS por 5 minutos cada.
- Permeabilize com tritão 0,1% frio X-100 por 2 minutos, lave três vezes com PBS por 5 min cada.
- Em seguida, bloco Fc por 15 minutos incubando o citospin com diluição de 1:50 do estoque de anticorpos do bloco Fc (para garantir que o anticorpo do rato primário não reagem não especificamente com os anticorpos fc do mouse).
- Incline os slides para remover o bloco Fc e mude para 1% BSA para e incubar o citospin com uma mistura de 3 anticorpos primários de interesse (consulte a Tabela 1 para as várias combinações) por 30 minutos.
NOTA: Certifique-se de executar anticorpos de controle de isótipo (incubar com um mix de anticorpos primários IgG1 e rat IgG2b kappa realizando etapas 4.2.1 a 4.2.9 e substituindo os anticorpos por controles isótipos) em paralelo com anticorpos secundários correspondentes, como discutido em nosso estudo recente20. - Lave 3 vezes com PBS por 5 minutos cada. Incubar os citospins com uma mistura de anticorpos secundários devidamente projetados (consulte a Tabela 1 para obter os detalhes).
- Remova as manchas derrubando suavemente a mistura do slide, incubar com DAPI (4′,6-diamidino-2-fenildole) por 5-10 min para colorir núcleos. Lave 3 vezes com PBS por 5 minutos cada.
- Tampar com mídia de montagem anti-fade e armazenar durante a noite no escuro à temperatura ambiente antes da imagem.
- Adquira imagens sob um microscópio vertical de campo largo equipado com uma câmera científica. Certifique-se de tempos consistentes de exposição da câmera definidos para todos os canais fluorforeiro quando a imagem deslizar.
- Histologia de hematoxilina e eosina (H&E)
- Realize a coloração modificada de H&E3 em crio-seções pulmonares para todos os grupos.
- Análise de imagem
- Processar e analisar os arquivos de dados de imagem (.tiff) no software aberto Fiji ImageJ (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
- Verifique os parâmetros necessários (Área, Perímetro, Densidade Integrada, Descritores de forma, diâmetro de Feret, Circularidade, Etiqueta display) a serem registrados sob a guia Analisar e Definir Medidas.
- Usando o gerenciador de ROI,delineie manualmente cerca de 50-200 células no painel de imagem mesclado usando a ferramenta "seleções à mão livre". Salve as regiões de interesse (ROI) com o comando Ctrl+T e copie os ROIs salvos para cada célula em todos os canais fluorforeiro.
- Em seguida, pressione Ctrl+M para medir os parâmetros pré-definidos para todos os canais fluorescentes (por exemplo, 405 nm (DAPI ou ATPβ em azul), 488 nm (actin ou NK1.1 ou Ki-67 em verde), 568 nm (tubulina ou Gr1 ou CD61 em vermelho) e 633 nm (CX31 ou angiostatin em magenta)).
- Salve os Resultados como .csv arquivo sob um nome apropriado que represente sua análise. Copie os resultados do arquivo .csv para uma planilha e divida a intensidade de fluorescência (FI) (que é a coluna Densidade Integrada Bruta do arquivo Resultados) da molécula manchada pela da DAPI ou CD61 FI, conforme o desenho de coloração. Essas proporções são denominadas como "razões FI normalizadas de DAPI ou CD61".
- Em seguida, plote essas relações normalizadas, circularidade, perímetro celular e diâmetro de Feret, para avaliar qualquer alteração no tamanho da célula após a exposição combinada de O3 e LPS.
- Use software estatístico adequado para verificar a normalidade dos dados coletados e testar a hipótese nula (consulte a seção de análise estatística abaixo).
- análise estatística
- Expresse resultados como ± SEM. Foram utilizados no mínimo três camundongos por grupo.
- Para análise de dados de quimiocina, ajuste os valores p de ANOVA unidirecional para taxa de descoberta falsa de acordo com a correção de Benjamini e Hoshberg.
- Analisar parâmetros de imagem, celularidade, diâmetro de Feret, perímetro, DAPI ou CD61 normalizados razões de intensidade de fluorescência pelo teste Mann-Whitney U (para comparar dois grupos) ou teste de Kruskal Wallis (para comparar vários grupos) como esses dados normalmente não foram distribuídos.
- Para o resto dos experimentos de imagem, analise os resultados usando uma análise unidirecência de variância seguida das múltiplas comparações de Sidak. p-valores <0,05 foram considerados significativos.
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Representative Results
A exposição combinada o3 e LPS leva à inflamação sistêmica e à mobilização da medula óssea em 72 h: A contagem de células em diferentes compartimentos revelou alterações significativas no sangue periférico e a célula total da medula óssea do fêmur conta com exposições combinadas de O3 e LPS. Embora as exposições combinadas de O3 e LPS não tenham induzido alterações nas contagens totais de células BAL (Figura 1A) ou LVP(Figura 1B),as células polimorfonucleares apresentaram-se como o tipo de célula predominante em 24 (Figura 1F, Figura Suplementar 1),36 e 72 h após a exposição. Observe a ausência de manchas de Siglec-f e CX3CR1 em células polimorfóriares a 24 h imagem de citospin BAL(Figura 1F). A coloração tripla de cytospins DAPI/CD11b/Gr1 de citospins BAL mostrou presença de grandes células mononucleares CD11b e Gr1 positivos que são macrófagos a 0h, o que muda para células polimorfômicas menores mostrando apimentação gr1staining, mas desprovida de manchas de CD11b a 4 h (como mostrado no inset em Supplemental 1F). A maioria das células BAL são polimorfonucleares e positivas tanto para CD11b quanto para Gr1, a 24 h pós-exposição(Figura Suplementar 1).
Os camundongos apresentaram leucocitose sistêmica às 24 h (3,3 vezes vs 0 h, p<0,05, Figura 1C) seguido por leucopenia em 72 h, que foi marcada por 13 vezes menor contagem em sangue periférico em comparação com 24 h (p<0,01) e 8,6 vezes menor em comparação com 4 h (p<0,05) após exposição combinada O3 e LPS(Figura 1C). As células de medula óssea severa também permaneceram inalteradas quando comparadas a 0h ou após exposição combinada de O3 e LPS(Figura 1D). A contagem da medula óssea do fêmur apresentou um pico tardio de 28,8 vezes a 72 h quando comparado a 0h (p<0,01, Figura 1E) bem como outros pontos de tempo (p<0,01, Figura 1E). A visualização das células de medula óssea do LVP, e do severo, bem como do fêmur, também apresentou alterações nos tipos de células para células predominantemente polimorfonucleares(Figura Suplementar 1). As células de medula óssea severas mostraram sinais de danos como evidenciado por material nuclear extracelular. A medula óssea do fêmur apresentou maior número de células positivas CD11b e Gr1(Figura Suplementar 1),que coincidem com a contagem celular.
O teor total de proteína bal foi maior em 36 h após a exposição combinada de O3 e LPS: A quantificação das proteínas totais nos compartimentos LVP e BAL foi realizada para correlacionar o edema pulmonar induzido pelo ozônio, ou seja, exsudação de proteína plasmática devido ao comprometimento da barreira vascular e epitelial resultante devido à exposição combinada. A proteína total bal foi 4,5 vezes maior em 36 h (p<0,05) quando comparada a 4 h(Figura 2A). No entanto, a proteína LVP não foi alterada após a exposição(Figura 2B).
A exposição combinada o3 e LPS induz fortes gradientes de quimiocina no compartimento vascular pulmonar e não bal: ensaios multiplex de quimiocina foram realizados tanto em supernantes BAL e LVP. Observe que as diferenças relativas entre esses dois compartimentos representam retenção preferencial em um compartimento específico. O eotaxina eosinófilo 2 foi 4,3 vezes maior em 4h no compartimento LVP em comparação com 0h (p<0,05, Figura 3A). No compartimento BAL, a eotaxina-2 foi 3,2 vezes menor em 4h quando comparada a 0h (p<0,01, Figura 3B). Os níveis de eotaxina BAL-2 continuaram diminuindo consistentemente até 72h com redução de 12,6 vezes em relação a 0h (p<0,01, Figura 3B). O quimioattractant IL-2 foi 10,1 vezes maior em 4h no compartimento LVP em comparação com 0h (p<0,05, Figura 3C). No compartimento BAL, o IL-2 foi 5,0 vezes menor em 36 h quando comparado com 0h (p<0,05, Figura 3D). Os níveis de eotaxina BAL-2 continuaram diminuindo consistentemente 5,9 vezes em 72 h em comparação com 0h (p<0,05, Figura 3D).
Curiosamente, muitas quimiocinas foram alteradas às 4h, no LVP e não no BAL. A maioria dessas quimiocinas apresentou aumento modesto, mas significativo, nos níveis de LVP em 4h quando comparado com os pontos de tempo posteriores. Embora os níveis de eotaxina-1 não tenham sido elevados após as exposições quando comparados a 0h, mas os níveis foram significativamente elevados em 4h quando comparados a 24 (2,7 vezes, p<0,05) e 72 h (5,0 vezes, p<0,01, Figura 4A) após exposição combinada. Os níveis de LVP TNFα foram 3,4 vezes maiores em 4h quando comparados com 36 h (p<0,05, Figura 4B). Da mesma forma, LVP IFNγ foi 2,9 vezes maior em 4h quando comparado com 72 h (p<0,05, Figura 4C). Os níveis de CX3CL1 também foram elevados em 4h quando comparados com 24 (1,7 vezes, p<0,05), 36 (1,6 vezes, p<0,05) e 72 h (2,2 vezes, p<0,01) após exposições combinadas(Figura 4D). Os níveis de CCL27 apresentaram níveis mais elevados em 4h também quando comparados com 24 (2,7 vezes, p<0,05), 36 (3,9 vezes, p<0,01) e 72 h (2,9 vezes, p<0,05) após exposições combinadas(Figura 4E).
Algumas quimiocinas tiveram forte presença no LVP às 4h após exposições combinadas, e não mudaram no BAL antes e depois da exposição, indicando uma forte resposta de quimioterapia dos capilares pulmonares. Às 4h, Os níveis de LVP IL-16 foram 3,4 vezes comparados a 0h (p<0,01), 3,2 vezes em comparação com 24 h (p<0,01), 4.5 vezes em comparação com 36 h (p<0,01) e 4,6 vezes em comparação com 72 h (p<0,01) após exposições combinadas(Figura 4F). Às 4h, a quimioterapia neutrófila, Os níveis de LVP CXCL5 foram de 2,0 vezes em comparação com 0h (p<0,01), 4,7 vezes em comparação com 24 h (p<0,01), 2.01 2 vezes em comparação com 36 h (p<0,01) e 2,7 vezes em comparação com 72 h (p<0,01) após exposições combinadas(Figura 4G). Às 4h, Os níveis de LVP CXCL10 foram de 2,3 vezes em comparação com 0h (p<0,01), 2,1 vezes em comparação com 24 h (p<0,05), 2.5 vezes em comparação com 36 h (p<0,01) e 2,7 vezes em comparação com 72 h (p<0,01) após exposições combinadas(Figura 4H). Às 36 h, os níveis de quimiocina neutrófila, SDF1α LVP foram 4,2 vezes em comparação com 0h (p<0,01), 2,9 vezes em comparação com 24 h (p<0,05), 6,8 vezes em comparação com 72 h (p<0,01) após exposições combinadas(Figura 4I). Às 4h, os níveis de LVP MIP3β foram 2,3 vezes em comparação com 0h (p<0,05) e 2,3 vezes em comparação com 72 h (p<0,05) após exposições combinadas(Figura 4J).
A exposição combinada o3 e lps induz necrose, interrompe citosqueletal celular, membrana plasmática e integridade mitocondrial: Como a contagem de leucócitos compartimentais e o conteúdo de proteínas não estavam correlacionados com os gradientes de quimioterapia LVP, tornou-se mais importante visualizar as células obtidas a partir desses compartimentos. Ex vivo actin/tubulin coloração da linha de base (0 h) As células BAL mostraram presença de actina cortical, fibras de estresse, bem como lamellipodia (mostrada em verde, painel superior esquerdo da Figura 5) e rede de microtúbulos (mostrada em vermelho, Figura 5 painel superior esquerdo) que coincidiu com a redução da coloração mitotracker indicando presença de mitocôndrias ativas (mostrada em vermelho, Figura 5 painel inferior esquerdo). Mais de 95% das células BAL eram mononucleares na linha de base. Às 4h, as células BAL apresentaram material nuclear extracelular, coloração de actina citoplasmática pontual desprovida de lamellipodia e coloração de actina cortical reduzida (mostrada em verde, painel superior direito figura 5), rede de microtúbulos alarde (mostrada em vermelho, figura 5 painel superior direito) que não correspondia à redução da coloração mitotracker (mostrada em vermelho, figura 5 painel direito esquerdo). A análise de intensidade fluorescente de actina normalizada do DAPI mostrou uma redução de 3,7 vezes na razão indicando redução na coloração de actina em 4h após exposição (p<0,01, Figura 6A). Da mesma forma, o DAPI normalizou a intensidade fluorescente da tubulina também reduzida em 1,5 vezes após a exposição (p<0,01, Figura 6B), indicando uma redução na coloração da tubulina. A perda de lamellipodia ficou evidente com o aumento da circularidade do citoesqueleto celular BAL imediatamente, ou seja, às 2h (p<0,01, Figura 6C) e 4 h (p<0,05, Figura 6C) após exposição quando comparada a 0h e diminuição da circularidade citoesquelético em 24 (p<0,05) e 36 h (p<0,01) após a exposição, quando comparada a 0h(Figura 6C).
Até 24 h, as células BAL da exposição combinada foram duplamente positivas para calceína (em verde, Figura 7) indicando presença de atividade esterase ativa, e ethidium homodimer (em vermelho, Figura 7), indicando que, embora algumas células estivessem mortas (vermelhas), a maioria eram células parcialmente comprometidas. Às 36 h, as células BAL eram em grande parte viáveis (verde), indicando a substituição das células comprometidas por leucócitos recrutados de outros compartimentos sistêmicos(Figura 7).
A coloração específica de ATPα e Ly6G das células BAL revelou localização intracelular discreta (Filmes 1 e 2) tanto das proteínas em macrófagos alveolares quanto de neutrófilos após a exposição(Figura 7). A exposição combinada levou à redução da razão de intensidade fluorescente normalizada do DAPI de ATPα(Figura 7,8A) e aumento do teor de proteína Ly6G intracelular(Figura 7, Figura 8B,Filmes 1 e 2). Redução da coloração ATPα, em 24h após a exposição, correlacionada com tubulina inferior e, em certa medida, redução da coloração mitotracker. Também observamos corpos celulares anucleares ATPα positivos após a exposição, que poderiam ser plaquetas. No entanto, não confirmamos nossas descobertas. Às 2h, observamos células BAL mononucleares menores (p<0,01 Figura 8C, p<0,01 Figura 8D) quando comparadas a 0h, mas em 4h, as células mononucleares foram maiores (p<0,01 Figura 8C, p<0,01 Figura 8D) quando comparadas a 0 h. Aos 24 (p<0,01 Figura 8C, p<0,01 Figura 8D) e 36 h (p<0,01 Figura 8C, p<0,01 Figura 8D), as células BAL tornaram-se progressivamente menores devido a uma mudança para as células polifomorrogas, quando comparadas a 0h.
O imunofenofoteping de células BAL revelou expressões transitórias de NK1.1, ATP β e Ki-67 e expressões sustentadas de Células BAL Gr1, CX3CR1 e angiostatina positiva após exposições combinadas de O3 e LPS: A coloração imunofluorescente do primeiro conjunto de citospins BAL foi normalizada para a coloração da DAPI. Houve aumento nas células positivas NK1.1 celulares às 24h (p<0,05 vs 0 h, Figura 9,10A). Às 36 h, as células BAL apresentaram menor intensidade fluorescente NK1.1 celular (p<0,01 vs 0 e 24 h, Figura 9,10A). A intensidade fluorescente Gr1 celular foi maior em 24 h (p<0,01 vs 0 h, Figura 9, 10B) e 36 h (p<0,01 vs 0h, Figura 9, 10B). Da mesma forma, a intensidade fluorescente CX3CR1 celular foi maior em 24 h (p<0,01 vs 0 h, Figura 9, 10C) bem como 36 h (p<0,01 vs 0h, Figura 9,10C).
Quando normalizado para CD61 celular, que também é onipresente na expressão, revelou um aumento na intensidade fluorescente ATPβ celular em 24 h (p<0,01 vs 0 h, Figura 9,10D) e diminuição da intensidade fluorescente ATPβ celular em 36 h (p<0,01 vs 0 e 24h, Figura 9,10D). Notavelmente, o ATPβ apresentou localização predominantemente nuclear em 24 h em comparação com a localização periférica a 36 h(Figura 9). A intensidade fluorescente celular de BAL Ki-67, indicador de proliferação celular, foi maior em 24 h (p<0,01 vs 36 h, Figura 9, 10E) em comparação com 0 e 36 h. Os níveis foram abaixo dos níveis de linha de base em 36 h (p<0,01, Figura 9, 10E), provavelmente devido à maior expressão polimorfo-nuclear CD61 vs Ki-67 a 36 h(Figura 9). Por fim, a intensidade fluorescente celular da angiostatina BAL foi consistentemente alta em 24 e 36 h (p<0,01 vs 0 h, Figura 9, 10F), indicando um aumento específico neste fragmento de plasminogen cortado metaloproteinase, durante a resposta inflamatória pulmonar.
Exposições combinadas produzem danos pulmonares de grande disseminação: A histologia pulmonar revelou que as exposições combinadas produzem danos prolongados aos pulmões, como visto nas crioseções manchadas de H&E(Figura 11). Embora fosse esperado dano septo brônquio e alveolar, foi surprizing observar danos endoteliais de vasos maiores, a 36 h após a exposição(Figura 11). Havia leucócitos intravasculares aderentes, manchas de agregados leucócitos (incluindo neutrófilos) nas regiões septal alveolar danificada e peri-bronquiolar(Figura 11).
Figura 1: Leucócito compartimental conta: A) Broncho-alveolar lavage (BAL) conta em 0 (ou seja, linha de base), 4, 24, 36 e 72 h após o total de 0,05 ppb ozone (O3) e 50 μg de exposição LPS intranasal a camundongos. B) Perfusato vascular pulmonar (LVP) concentração total de leucócitos em 0 (ou seja, linha de base), 4, 24, 36 e 72 h após a combinação de 0,05 ppb de ozônio (O3) e 50 μg de exposição LPS intranasal a camundongos. C) Concentração total de leucócitos de sangue periférico (PB) em 0 (ou seja, linha de base), 4, 24, 36 e 72 h após ozônio combinado de 0,05 ppb (O3) e 50 μg de exposição lps intranasal a camundongos. D) Concentração total de leucócitos de medula óssea severa (MB) em 0 (ou seja, linha de base), 4, 24, 36 e 72 h após o ozônio combinado de 0,05 ppb (O3) e 50 μg de exposição LPS intranasal a camundongos. E) A medula óssea do fêmur (MMC) concentração total de leucócitos em 0 (ou seja, linha de base), 4, 24, 36 e 72 h após a combinação de 0,05 ppb de ozônio (O3) e 50 μg de exposição LPS intranasal a camundongos. Para os gráficos A-E, 0 h é representado em azul, 4h em vermelho, 24 h em verde, 36 h em roxo e 72 h em pontos de dados laranja; * p<0,05 e ** p<0,01. F) Representante BAL citospin slide de exposição 24 h, mostrando células mononucleares e polimorfonucleares quando manchado para núcleos com DAPI (em azul), CX3CR1 (em verde) e Siglec-F (em vermelho). Note que a fusão de CX3CR1 e Siglec-F aparece como laranja-amarelo. A maioria das células mononucleares são positivas para o Siglec-F, que é uma característica dos macrófagos alveolares. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Quantificação total da proteína: A) Teor total de proteínas bronchoalveolares (BAL) e B) A concentração total de proteína vascular pulmonar (LVP) foi estimada pelo ensaio proteico de 660 nm (Termocientífico, IL, EUA). Para os gráficos A-B, 0 h é representado em azul, 4h em vermelho, 24 h em verde, 36 h em roxo e 72 h em pontos de dados laranja; * p<0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Eotaxina pulmonar-2 e gradientes de quimioterapia IL-2: Dos 33 quimiófilos, duas quimiocinas que foram significativamente alteradas no perfusato vascular pulmonar (LVP) e lavagem de broncoalveolar (BAL) e fluido após ozônio combinado de 0,05 ppb (O3) e 50 μg de exposição intranasal LPS aos camundongos A) LVP eotaxina-2, B) BAL eotaxin-2, C) LVP IL-2 e D) BAL IL-2. Os dados foram analisados pela anova unidirecional e o valor p para a falsa taxa de descoberta de múltiplas variáveis foi ajustado conforme a correção de Benjamini e Hoshberg. Para os gráficos A-D, 0 h é representado em azul, 4h em vermelho, 24 h em verde, 36 h em roxo e 72 h em pontos de dados laranja. Comparações em pares foram analisadas após a correção de Bonferroni. * representa p<0,05, ** representa p<0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Concentrações de quimiocina perfusada vascular pulmonar: Concentrações de mais dez quimiócias foram alteradas, mas apenas no compartimento vascular de perfusato pulmonar (LVP). A) Eotaxina-1, B) TNFα, C) IFNγ, D) CX3CL1, E) CCL27, F) IL-16, G) CXCL5, H) CXCL10, I) SDF1α e J) MIP3β. Para os gráficos A-J, 0 h é representado em azul, 4h em vermelho, 24 h em verde, 36 h em roxo e 72 h em pontos de dados laranja. Comparações em pares foram analisadas após a correção de Bonferroni. * representa p<0,05, ** representa p<0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Lavage broncoalveolar (BAL) cytospin actin/tubulin e coloração de mitotracker reduzida: Imagens representativas de actin/tubulin manchadas de bal citospins de A) 0 h e B) 4 h após ozônio combinado de 0,05 ppb (O3) e 50 μg de exposição intranasal LPS a ratos. Observe que o DAPI é mostrado em azul, actin em verde e tubulina em vermelho. Imagens representativas de mitotracker manchado bal citospins de A) 0 h e B) 4 h depois combinados 0,05 ppb ozone (O3) e 50 μg de exposição intranasal LPS a camundongos. Observe que o DAPI é mostrado em azul e o mitotracker reduzido em vermelho. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Análise da proteína citoesquelético broncoalveolar (BAL) e análise de circularidade: Os citospins BAL manchados para actina e tubulina foram analisados para parâmetros normalizados da DAPI, ou seja, A) Actin para a intensidade fluorescente DAPI (FI) em 0 e 4 h, B) Relação de intensidade fluorescente de tubulina para DAPI (FI) em 0 e 4 h e C) cellularidade celular BAL em 0 (n=75 células), 2 (n=105 células), 4 (n=66 células), 24 (n=31 células), 36 (n=154 células) h. Como alguns experimentos piloto também foram realizados imediatamente após as exposições O3 e LPS, ou seja, a 2h de ponto de tempo, também incluímos algumas análises de celularidade BAL muito cedo a partir do ponto de tempo de 2h para destacar os efeitos imediatos de O3. Para os gráficos A-C, 0 h é representado em azul, 2h em vermelho, 4h no verde, 24 h em roxo e 36 h em pontos de dados laranja. * representa p<0,05, ** representa p<0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Situação intracelular e membrana plasmática : As células BAL foram manchadas para manchas vitais, calceína (em verde) e ethidium homodimers/EthHD (em vermelho) como mostrado em painéis de imagem superior representativos em A) 0, B) 24 e C) 36 h após exposições O3 e LPS. Barra de escala = 200 μm. Os citospins BAL foram imunostidas para DAPI (em azul), ATPα (em verde) e Ly6G (em vermelho). As imagens representativas são mostradas nos painéis de imagem inferiores em A) 0 e B) 24 h após as exposições O3 e LPS. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Lavage broncoalveolar (BAL) proteína mitocondrial ATPα, proteína lysômica Ly6G e análise do tamanho celular: As células BAL imunossuadas foram normalizadas para dapi para calcular A) razão de intensidade fluorescente DAPI (FI) e B) Ly6G para dapi fi, em 0 e 24 h após as exposições de O3 e LPS. As células BAL imunossumetias também foram analisadas para o perímetro A) mais longo, ou seja, diâmetro do furão e B), em 0, 2, 4, 24 e 36 h após as exposições O3 e LPS. Para os gráficos A-D, 0 h (n=119 células) é representado em azul, 2 h (n=105 células) em vermelho, 4 h (n=66 células) em verde, 24 h (n=309 células) em roxo e 36 h (n=154 células) em pontos de dados laranja. * representa p<0,05, ** representa p<0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Fenoge de broncoalveolar (BAL) fenotipagem intracelular: as células BAL foram imunossuídas para DAPI (em azul), NK1.1 (em verde), Gr1 (em vermelho) e CX3CR1 (em magenta) como mostrado em painéis de imagem superior representativos em A) 0, B) 24 e C) 36 h após exposições O3 e LPS. Barra de escala = 50 μm. Os citospins BAL foram imunossuídores para ATPβ (em azul), Ki-67 (em verde), CD61 (em vermelho) e angiostatina (em magenta). As imagens representativas são mostradas nos painéis de imagem inferiores em A) 0, B) 24 e C) 36 h após as exposições O3 e LPS. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: Lavagem de broncoalveolar (BAL) proteína mitocondrial ATPβ, Proteína lisossômica Gr1, proporção de intensidade fluorescente intracelular CX3CR1 e angiostatina: As células BAL imunossuadas foram normalizadas para dapi computar A) NK1,1 para proporção de intensidade fluorescente DAPI (FI), B) Gr1 para razão DAPI FI e C) CX3CR1 para dapi fi, a 0, 24 e 36 h após as exposições O3 e LPS. As células BAL imunosteradas foram normalizadas para a relação CD61 para calcular A) ATPβ para DAPI de intensidade fluorescente (FI) razão B) Ki-67 para dapi fi e B) Angiostatina (ANG) para dapi fi, em 0, 24 e 36 h após as exposições O3 e LPS. Para os gráficos A-F, 0 h (n=21 células) é representado em azul, 24 h (n=796 células) em vermelho e 36 h (n=2692 células) em pontos de dados verdes. * representa p<0,05, ** representa p<0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 11: Hemaoxilina pulmonar e histologia de eosina (H&E). Ozônio (O3) e LPS induziram a histologia da criosecção pulmonar H&E em 0, 24 e 36 h após exposições combinadas de O3 e LPS. Regiões de danos epiteliais alveolares são marcadas por flechas pretas sólidas e danos endoteliais por pontas de flecha preta. Asteriscos amarelos (*) representam manchas de leucócitos nas regiões septais alveolares. A = espaço alveolar, B = brônquios, V = vasculatura, barra de escala = 100 μm para painéis de imagem da mão esquerda e 50 μm para painéis de imagem no lado direito. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| S.No. | Anticorpo primário | Anticorpo secundário invitrogen |
| 1 | Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136), Catálogo Invitrogen nº 16-5941-82 | Alexa 488 cabra conjugada anti-mouse IgG (H+L), Catálogo No. A11002 |
| 2 | Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5), Catálogo Invitrogen nº 53-5931-82 | Alexa 568 cabra conjugada anti-rato IgG (H+L), Catálogo No. A11077 |
| 3 | Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880), Catálogo Invitrogen nº 14-6093-81 | Alexa 633 cabra conjugada anti-coelho IgG (H+L), Catálogo No. A21070 |
| 4 | Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9), Catálogo Invitrogen nº 459240 | Alexa 488 cabra conjugada anti-mouse IgG (H+L), Catálogo No. A11002 |
| 5 | Rato anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8), Catálogo Invitrogen nº 16-9668-82 | Alexa 568 cabra conjugada anti-rato IgG (H+L), Catálogo No. A11077 |
| 6 | Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1), Catálogo Thermofisher No. A-21351 | Alexa 350 cabra conjugada anti-mouse IgG (H+L), Catálogo No. A11045 |
| 7 | Rato anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa, Catálogo Invitrogen nº 14-5698-82 | Alexa 568 cabra conjugada anti-rato IgG (H+L), Catálogo No. A11077 |
| 8 | Hamster armênio anti-CD61 (clone 2C9. G2) IgG1 kappa, Catálogo BD nº 553343 | Alexa 568 cabra conjugada anti-hamster IgG (H+L), Catálogo No. A21112 |
| 9 | Coelhista anti-angiostatina (mouse aa 98-116) IgG, Catálogo Abcam No. ab2904 | Alexa 633 cabra conjugada anti-coelho IgG (H+L), Catálogo No. A21070 |
Tabela 1: Combinações de anticorpos primários e secundários usados para manchar citospins preparados a partir das amostras.
| Leitura | Bal | LVP | Pb | SBM | FBM |
| Tlc | * | * | + às 24h; - aos 36, 72 h | + às 72h | |
| Neutrófilos | + aos 24, 36, 72 h | + às 24h | * | + às 4, 24, 36, 72 h | + às 4, 24, 36, 72 h |
| proteína | + às 36h | * | N.D. | N.D. | N.D. |
| Perfil de quimioterapia | - Para eotaxina-2, IL-2 em 4, 24, 36, 72 h | + para Eotaxin-1/2, IL-2, TNFα, IFNγ, CX3CL1, CCL27, IL-16, CXCL5, CXCL10, MIP3β a 4 h; + para SDF1α às 36 h | N.D. | N.D. | N.D. |
| Tamanho da célula | + às 4h; - às 24, 36 h | N.D. | N.D. | N.D. | N.D. |
| ATPα | - às 24h | N.D. | N.D. | N.D. | N.D. |
| NK1.1/Ki-67 | + às 24h | N.D. | N.D. | N.D. | N.D. |
| ATPβ/Gr1/CX3CR1/ANG | + às 24, 36 h | N.D. | N.D. | N.D. | N.D. |
Tabela 2: Um resumo abrangente dos principais achados do estudo em diferentes compartimentos. * denota nenhuma alteração, + denota um aumento e - denota uma diminuição nos parâmetros medidos. BAL denota o fluido de lavage bronco-alveolar, LVP denota perfusato vascular pulmonar, PB denota sangue periférico, SBM denota medula óssea esterno e FBM denota compartimento de medula óssea do fêmur.
Figura suplementar 1: Imunostaining Gr1 e CD11b: Imagens representativas dos compartimentos DAPI (em azul), Gr1 (em verde) e CD11b (em vermelho) de citospin fluorescente de perfusato vascular pulmonar (LVP), medula óssea popal (BM) e medula óssea do fêmur (MM) a 0, 4 e 24 h depois de exposições combinadas de O3 e LPS. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Filme suplementar 1 Volume renderizado tridimensional de macrófagos BAL a partir de 0h ponto de tempo (ou seja, linha de base), mostrando núcleo (mostrado em azul) e imunostained para ATPα (mostrado em verde) e Ly6G (mostrado em vermelho). Clique aqui para baixar este Filme.
Filme suplementar 2: Volume renderizado tridimensional de macrófagos BAL a partir de 24h de ponto de tempo após exposições combinadas de O3 e LPS, mostrando núcleo (mostrado em azul) e imunostained para ATPα (mostrado em verde) e Ly6G (mostrado em vermelho). Note a presença de corpos positivos atpα anuclear, bem como uma célula fragmentada. Clique aqui para baixar este Filme.
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Discussion
Os métodos apresentados no presente estudo destacam a utilidade da análise de múltiplos compartimentos para estudar múltiplos eventos celulares durante a inflamação pulmonar. Resumimos os resultados na Tabela 2. Nós e muitos laboratórios estudamos extensivamente a resposta murina à instilação intranasal do LPS, que é marcada pelo rápido recrutamento de neutrófilos pulmonares, que atinge o pico entre 6-24 h após o qual, a resolução começa. E recentemente, temos demonstrado que a sub-clínica O3 (a 0,05 ppm por 2 h) sozinha pode induzir danos pulmonares significativos na sub-cepa C57BL/6NJ15, que é marcada pela partição de neutrófilos no compartimento vascular pulmonar, enquanto macrófagos e detritos danificados foram observados no BAL, indicando assim o potencial inflamatório de O3. Nesse modelo observamos a ausência de neutrófilos no compartimento alveolar como resultado de dano epitelial alveolar induzido O3 e fagocitose resultante pelos macrófagos alveolares. Não só observamos DNA extracelular e detritos no modelo O3, os macrófagos BAL eram dismórficos que se correlacionam com altos níveis de IL-16, um alarme geralmente liberado por neutrófilos moribundos. Portanto, é importante entender se essesníveis subcênquicicos O 3 podem afetar a resposta imune na sub-cepa C57BL/6J robusta, como observado com O supra-fisiológico O3 níveis 21. Observamos que a endotoxina bacteriana combinada O3 e a endotoxina induzida pelo recrutamento de neutrófilos nos compartimentos pulmonares e sistêmicos, marcados pela presença de neutrófilos danificados em BAL, perfusato vascular pulmonar, compartimentos de medula óssea popal e fêmur a partir de 4h, que permaneceram elevados em 24, 36 e 72 h. O dano celular foi representado como perda de actina cortical e lamellipodia e aumento do tamanho celular em leucócitos BAL; os neutrófilos, analisados no compartimento BAL, apresentaram significativa redução da reatividade positiva ao microtúbulo, α do complexo de synthase ATP α (ATPα) e mancha mitocondrial ativa. Os pulmões se adaptam a essa exposição combinada, regulando a expressão da subunidade V do complexo de sintetizador ATP celular β (ATPβ), bem como a do ligante ATPβ, angiostatina(Tabela 2).
Um aspecto importante do estudo da inflamação é entender a necrose celular junto com os gradientes de quimioterapia. Foi interessante notar que a contagem total de leucócitos não eram diferentes, exceto no sangue periférico e no compartimento da medula óssea do fêmur. Essas observações nos levaram a investigar os padrões citoesqueléticos celulares, tamanho e imunofenofoteping. Observamos uma perda de lamellipodia e mitocôndrias ativas em células BAL indicando danos celulares. A organização da actina cortical é uma característica essencial da sinalização intercelular e das propriedades de barreira resultantes. A desorganização citoesqueletal é, portanto, um bom marcador de dano celular quando a necrose não é tão óbvia para avaliar. Mesmo às 36 h, as células BAL tinham membrana plasmática comprometida, como indicado pela coloração homodimero de ethidium. Imediatamente após as exposições combinadas, os neutrófilos em BAL mostraram positividade Gr1, mas uma coloração essencialmente negativa para o CD11b, que se localiza em direção à borda principal e auxilia no septo alveolar rastejando22. Assim, as exposições combinadas levam ao acúmulo de neutrófilos atípicos desprovidos da proteína CD11b. O LPS não induz a baixa regulação do CD11b. Assim, essa característica é provavelmente resultado de danos induzidos por O3 aos neutrófilos.
As células BAL apresentaram uma assinatura proteica única com maior coloração NK1.1, Ki-67 e ATPβ a 24 h em comparação com 0 h(Tabela 2). As células BAL apresentaram maior expressão de Gr1, CX3CR1 e angiostatina, em 24, bem como 36 h quando comparadas a 0h(Tabela 2). Esses achados foram corroborados pela presença de mais neutrófilos positivos gr1 em BAL, às 24 e 36 h, após exposição(Tabela 2). A presença de células positivas NK1.1, CX3CR1 e Gr1, a 24 h, indica o recrutamento de células mononucleares e polimorfonucleares no BAL. Entre as células mononucleares, as células positivas CX3CR1 dominaram a 36 h indicando presença de macrófagos intersticiais, plaquetas ou macrófagos derivados de monocitos. A inclusão tanto de Ki-67 quanto de angiostatina como marcadores nos informou sobre o ambiente proliferativo versus anti-angiogênico, respectivamente no BAL. Assim, as exposições combinadas de O3 e LPS levam à proliferação de macrófagos provavelmente seguidos por um meio anti-angiogênico devido à infiltração neutrófila. O aumento transitório da coloração atpβ pode indicar uma adaptação importante para um aumento da sobrevida dos leucócitos BAL às 24 horas. Deve-se notar que o ATPβ pode se ligar à angiostatina e inibir a sobrevida prolongada6,23, o que é de fato refletido no menor índice Ki-67 em 36 h pós exposição.
Embora a proteína BAL tenha sido mais alta em 36 h, e não outros pontos de tempo, o perfusato vascular pulmonar não mostrou alterações na concentração proteica antes ou depois da exposição. É possível que o compartimento vascular não tenha sido afetado, mas isso é provavelmente confundido devido à oxidação de aminoácidos ricos em elétrons, como metionina, histidina e cisteína por O3 induzir radicais livres e proteínas surfactantes resultantes (SP-A, SP-B), bem como vazamento vascular24,25,26. Quantificação de BAL IgM, proteínas surfactantes BAL, albumina BAL ou extravasação de corante (usando azul Evans ou fluoresceína iso-tiocianato (FITC) dextran) são métodos alternativos para avaliar a integridade epitelial e endotelial.
Curiosamente, os níveis de perfusato vascular pulmonar de eotaxina-2 e IL-2 foram agudamente elevados no ponto de tempo de 4h. Os níveis de eotaxina BAL-2 e IL-2 foram significativamente reduzidos após a exposição, indicando degradação no espaço alveolar ou armadilha na vasculatura pulmonar. Mais quimiocinas analisadas no perfusato vascular pulmonar revelaram níveis mais elevados da quimiocina eosinófila (eotaxina-1), TNFα, IFNγ, quimiocinas de células mononucleares derivadas do linfonodo (CX3CL1, CXCL10, CCL27, MIP3β), quimiocina de neutrófilo derivado epitelial (CXCL5) e o alarmina (IL-16) liberado após necrose secundária de neutrófilos27, mas apenas às 4h após a exposição. Às 36 h, a medula óssea derivada pan-leucocyte chemokine, SDF1α28, foi maior no perfusato vascular pulmonar. As concentrações sdf1α derivadas da medula óssea se correlacionam com os achados de citologia pelos quais as células positivas CD11b e Gr1 são abundantes em 24 e 36 h após a exposição. Assim, os perfis quimiocinas e citológicos refletem uma mobilização leucócito significativa dos compartimentos de medula óssea (Tabela 2).
Nossos modelos animais e descobertas de pesquisa são vitais tendo em mente as situações do mundo real em que os seres vivos em ambientes urbanos são provavelmente expostos a tais sub-clínicos O3 e agentes infecciosos8. Nosso modelo murino serve como um protótipo facilmente acessível que pode ser reproduzido em laboratórios de contenção nível 2 para estudar mecanismos pulmonares e extra-pulmonares de morte celular invasiva e infecções, como é o caso de infecções COVID-1929. Estudos futuros devem ser direcionados para visualizar o reparo ou o acompanhamento em fase tardia, bem como exposições crônicas para investigar as adaptações celulares de longo prazo. Assim, para estudos abrangentes de inflamação pulmonar envolvendo o órgão vivo15 e animal16,30,31 técnicas de imagem, o desenho atual do estudo de ponto final pode fornecer insights vitais sobre a resposta do hospedeiro à dose baixa combinada O3 (morte celular) e LPS (estimulação imunológica), e assim decifrar os mecanismos de lesão pulmonar aguda.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse ou divulgações para fazer.
Acknowledgments
A pesquisa realizada é financiada pela subvenção do Presidente NSERC, bem como fundos de start-up do Centro Canadense de Inovação Nuclear Sylvia Fedoruk. O Centro Canadense de Inovação Nuclear De Sylvia Fedoruk é financiado pela Innovation Saskatchewan. A imagem de fluorescência foi realizada no Centro de Imagem WCVM, que é financiado pela NSERC. Jessica Brocos (Estudante de MSc) e Manpreet Kaur (Estudante de MSc) foram financiadas pelos fundos de start-up do Centro Canadense de Inovação Nuclear Sylvia Fedoruk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 33-plex Bioplex chemokine panel | Biorad | 12002231 | |
| 63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives | Leica | HCX PL APO CS (11506188) | |
| Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11045 | |
| Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11002 | |
| Alexa 488 conjugated phalloidin | Invitrogen | A12370 | |
| Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1A | Millipore | 05-829X-555 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L) | Invitrogen | A21112 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | |
| Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21070 | |
| Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa | BD Pharmingen | 553343 | |
| C57BL/6 J Mice | Jackson Laboratories | 64 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | Leica TCS SP5 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Invitrogen | D1306 | aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C |
| Inverted fluorescent wide field microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Ketamine (Narketan) | Vetoquinol | 100 mg/ml | Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock |
| Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit | Invitrogen | L3224 | |
| Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9) | Invitrogen | 459240 | |
| Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1) | Invitrogen | A-21351 | |
| Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136) | Invitrogen | 16-5941-82 | |
| Pierce 660 nm protein assay | Thermoscientific | 22660 | |
| Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG | Abcam | ab2904 | |
| Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880) | Invitrogen | 14-6093-81 | |
| Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa | Invitrogen | 14-5698-82 | |
| Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8) | Invitrogen | 16-9668-82 | |
| Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 53-5931-82 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2) | BD Pharmingen | 553142 | |
| Reduced mitotracker orange | Invitrogen | M7511 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | 20 mg/ml | Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock |
References
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