Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Visualisering av lungecelletilpasninger under kombinert ozon og LPS indusert Murine akutt lungeskade

Published: March 21, 2021 doi: 10.3791/62097
Automatic Translation
1, 1, 1
1Small Animal Clinical Sciences, Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan

Summary

Kombinert ozon og bakteriell endotoksin eksponert mus viser bred spredt celledød, inkludert nøytrofiler. Vi observerte cellulære tilpasninger som forstyrrelse av cytoskeletal lamellipodia, økt cellulært uttrykk for kompleks V ATP syntase subenhet β og angiostatin i bronko-alveolar lavage, undertrykkelse av lunge immunrespons og forsinket nøytrofil rekruttering.

Abstract

Lunger står kontinuerlig overfor direkte og indirekte fornærmelser i form av sterile (partikler eller reaktive giftstoffer) og smittsomme (bakterielle, virale eller sopp) inflammatoriske forhold. En overveldende vertsrespons kan føre til kompromittert respirasjon og akutt lungeskade, som er preget av lunge nøytrofil rekruttering som følge av den pato-logiske verten immun, koagulativ og vev ombygging respons. Sensitive mikroskopiske metoder for å visualisere og kvantifisere murin lunge cellulære tilpasninger, som svar på lavdose (0,05 ppm) ozon, en potent miljøgift i kombinasjon med bakteriell lipopolysakkarid, en TLR4-agonist, er avgjørende for å forstå vertsinflammatoriske og reparasjonsmekanismer. Vi beskriver en omfattende fluorescerende mikroskopisk analyse av ulike lunge- og systemiske kroppsrom, nemlig bronko-alveolar lavagevæske, lungevaskulær perfusat, venstre lungekryosser og sternal benmarg perfusat. Vi viser skade på alveolar makrofager, nøytrofiler, lungeparenchymalt vev, samt benmargsceller i korrelasjon med en forsinket (opptil 36-72 h) immunrespons som er preget av diskrete kjemokingradienter i de analyserte rommene. I tillegg presenterer vi lunge ekstracellulær matrise og cellulære cytoskeletale interaksjoner (aktin, tubulin), mitokondrie og reaktive oksygenarter, antikoagulerende plasminogen, dets anti-angiogene peptidfragment angiostatin, mitokondrie-ATP-syntasekomplekset V-underenheter, α og β. Disse surrogatmarkørene, når de suppleres med tilstrekkelig in vitro cellebaserte analyser og in vivo dyreavbildningsteknikker som intravital mikroskopi, kan gi viktig informasjon for å forstå lungeresponsen på nye immunmodulerende midler.

Introduction

Akutt lungeskade (ALI) er en avgjørende patologisk respons av lunger til smittsomme eller andre skadelige stimuli som er preget av samtidig aktivering av koagulativ, fibrinolytisk og medfødt immunforsvar1. Nøytrofiler registrerer raskt mikrobielle så vel som intracellulære skademønstre gjennom den tolllignende reseptorfamilien (TLR)2,3,4. Nøytrofiler frigjør preformede cytokiner og cytotoksisk granulatinnhold, noe som deretter kan forårsake sikkerhetsskade. Den påfølgende alveolarskaden er marred med sekundær celledød som fører til frigjøring av molekyler som adenosin triphosfat (ATP)5, og dermed satt i en ond syklus av immundysregulering.

Et uløst problem i forståelsen av ALI er knyttet til spørsmålet om hvordan skaden er initiert i alveolarmembranen. Elektrontransportkomplekset V, F1F0 ATP-syntase, er et mitokondrieprotein kjent for å uttrykkes allestedsnærværende, på celle (inkludert endotelial, leukocytt, epitel) plasmamembran under betennelse. Cellesytoskjelettet som består av aktin og tubulin, har mange celleformer og funksjon som modulerer henholdsvis mitokondrieproteiner. Vi har nylig vist at blokade av ATP-syntase av et endogent molekyl, angiostatin, stillhet nøytrofil rekruttering, aktivering og lipopolysakkarid (LPS) indusert lungebetennelse6. Dermed kan både biokjemiske (ATP syntase) og immunmekanismer (TLR4) regulere alveolarbarrieren under lungebetennelse.

Eksponering for ozon (O3), en miljøgift, svekker lungefunksjonen, øker følsomheten for lungeinfeksjoner, og korte lave nivåer av O3-eksponeringer øker risikoen for dødelighet hos de med underliggende kardiorespiratoriske forhold7,8,9,10,11,12,13,14. Dermed gir eksponering for fysiologisk relevante konsentrasjoner av O3 en meningsfull modell av ALI for å studere grunnleggende mekanismer for betennelse7,8. Laboratoriet vårt har nylig etablert en murinmodell av lavdose O3 indusert ALI15. Etter å ha utført en dose og tidsrespons på lave O3-konsentrasjoner, observerte vi at eksponering for 0,05 ppm O3 i 2 timer, induserer akutt lungeskade som er preget av lunge ATP syntase kompleks V-underenhet β (ATPβ) og angiostatinuttrykk, lik LPS-modellen. Intravital lungeavbildning avdekket uorganisering av alveolar actinmikrofilamenter som indikerer lungeskade, og ablasjon av alveolar septal reaktive oksygenarter (ROS) nivåer (indikerer abrogasjon av baseline celle signalering) og mitokondriemembran potensial (indikerer akutt celledød) etter 2 h eksponering for 0,05 ppm O315 som korrelert med en heterogen lunge 18FDG oppbevaring16, nøytrofil rekruttering og cytokinfrigjøring, spesielt IL-16 og SDF-1α. Take-home-meldingen fra våre nylige studier er at O3 produserer eksponentielt høy toksisitet når den eksponeres ved konsentrasjoner under de tillatte grensene på 0,063 ppm over 8 timer (per dag) for menneskelig eksponering. Det er viktig at det ikke finnes noen klar forståelse av om disse subkliniske O3-eksponeringene kan modulere TLR4-medierte mekanismer som ved bakteriell endotoksin17. Dermed studerte vi en dual-hit O3 og LPS eksponeringsmodell og observerte immun- og ikke-immuncelletilpasninger.

Vi beskriver en omfattende fluorescerende mikroskopisk analyse av ulike lunge- og systemiske kroppsrom, nemlig bronko-alveolar lavagevæske (dvs. BAL) som prøver alveolarrommene, lungevaskulært perfusat (dvs. LVP) som prøver lungevaskulaturen og alveolaren septal interstitium i tilfelle en kompromittert endotelbarriere, venstre lungekrysoseksjoner, for å se på beboere parenchymale og tilhørende leukocytter igjen i lavaged lungevev , perifert blod som representerer de sirkulerende leukocyttene og sternal- og lårbenmargen perfusater som prøver de proksimale og distale stedene for hematopoietisk cellemobilisering under betennelse, henholdsvis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Studiedesignet ble godkjent av University of Saskatchewan's Animal Research Ethics Board og fulgte Canadian Council on Animal Care retningslinjer for human dyrebruk. Seks-åtte uker gamle mannlige C57BL/6J mus ble anskaffet. MERK: Avlive dyr som utvikler alvorlig sløvhet, luftveisproblemer eller andre tegn på alvorlig nød før planlagt sluttpunkt.

MERK: Forbered følgende: 27-18 G nål-stump (vil avhenge av musens trakeale diameter), passende størrelse PE-slange for å passe til den stumpe nålen (lag en PE-kanyle for hver mus), kanyle, 2 skarpe saks, 2 stumpe tang (liten), 1 skarpe tang (liten), 3 1 ml sprøyter, merkede mikrofugerør (for BAL, blod, vaskulær og benmarg perfusate samling) og merkede hetteglass (for vevsfiksering), prøveposer / kryolegemer for vevsinnsamling, slakterens bomullstrådrull (kuttet i tilstrekkelig størrelse ligaturer). Alle kjemikalier som brukes til forsøkene er angitt i materialtabellen.

1. Ozon- og LPS-eksponering for induksjon av murin lungeskade

  1. Ozoneksponering
    1. Klargjør en egendefinert O 3-induksjonsboks. Tilsett musemating, vannflaske, berikelsesleker og rent sengetøy i rekkefølge og etterligne musenes boligmiljø.
      MERK: Disse trinnene vil sikre at musene har fri tilgang til mat og vann når de er plassert i den tilpassede induksjonsboksen og vil bidra til å lindre unødig stress.
    2. Slå på O 3-kalibratoren/generatoren (plassert mot innløpsporten) for å stabilisere UV-lampen før hånd (rundt 15 minutter før eksponering) og koble til in-line O3-monitoren.
      MERK: O3-skjermen skal lese i gjennomsnitt 0,05 ppm, som samplet fra utløpet ved konstant kammerlufttemperatur (72 ±3 °F) og relativ fuktighet (50±15%).
    3. For O3-eksponeringer plasserer du musene forsiktig i den tilpassede induksjonsboksen og utsetter musene kontinuerlig for 0,05 ppm O3 i 2 timer.
  2. Anestesi- og intranasal LPS-administrasjon
    1. Forbered 10 mg/ml lagre for ketamin og xylazin, separat.
    2. Forbered en cocktail ved å blande 20 deler ketamin og 1 del xylazin. Hvis musen veier X g, injiser (X/200) ml ketamin/xylazincocktail i bukhulen. For en mus, lag 1 ml cocktail bestående av 1000 μL av 10 mg / ml ketamin lager og 50 μL xylazine lager. Bland godt ved å pipettere opp og ned i et mikrofugerør.
      MERK: Ketamin- og xylazinbestandene kan tilberedes en uke i forveien.
    3. Bedøv musene under lett intraperitoneal (IP) ketamin (50 mg/kg)/xylazinblanding (1 mg/kg) (f.eks. for en 25 g mus, injiser 0,125 ml av cocktailen).
    4. Forbered en 1 mg / ml løsning av LPS, i saltvann, og fyll 50 μL av løsningen i en pipette.
    5. Hold musen oppreist med ryggen / dorsalsiden på håndflaten, og hold ørene med samme hånd. Plasser nå 50 μL av LPS-løsningen18 forsiktig utenfor neseborene (dvs. 25 μL på hvert nesebor eller 50 μL i ett nesebor; spiller ingen rolle så lenge prosedyren er rask) og la musene inhalere LPS-løsningen.
    6. Innpod kontrollmus med 50 μL steril saltvann.
      Forsiktig: Ikke overskrid mer enn 100 μL for instillasjon, noe som kan være dødelig. For mindre av et volum (dvs. <50 μL) og det er risiko for bare neseavsetning.
    7. Etter LPS-administrasjon legger du forsiktig ned musene, enten på magen eller ryggen på haugen av sengetøy med hodet vinklet litt nedover.
      MERK: Denne retningen forlenger oppbevaringen av oppløsningen i nesehulen19.
    8. Ved 0, 2, 4, 24, 36 og 72 timer etter eksponeringen bedøver du musene i.p. med full dose ketamin (200 mg/kg)/xylazin (4 mg/kg) blanding (dvs. X/50 ml av cocktailen, der X er musevekten i gram eller 0,50 ml for en 25 ml).
    9. Vær oppmerksom på musen til den mister bevisstheten og høyre refleks (dvs. vender ikke tilbake når den legges i liggende stilling). Sjekk nå musen for dybde av anestesi, ved å overvåke pusten (rytmiske brystutflukter) og hjertefrekvens, som skal falle merkbart, etter 1-2 minutter.
    10. Deretter må du se etter pedalreflekser, det vil si klemme et av baklemsifrene og observere for tilbaketrekking av lemmen, som en refleks. Hvis musen reagerer, fyll på med ytterligere 0,1 ml injeksjoner eller mer, etter behov.
      MERK: For å oppnå dyp anestesi, husk at visse stammer eller overvektige mus vanligvis har et større distribusjonsvolum og dermed lett kan overdoseres, hvis tilstrekkelig tid hvis det ikke er tillatt for full anestesi (som kan være rundt 10 minutter eller mer). Følgelig kan noen stammer være motstandsdyktige mot anestesi og krever dermed flere påfyll. Denne kunnskapen er tilegnet etter mange praktiske observasjoner og erfaring med mus av forskjellige stammer og alder. Ettersom noen få piloteksperimenter også ble utført umiddelbart etter O3- og LPS-eksponeringer (dvs. ved 2-timers tidspunktet), inkluderte vi også noen svært tidlige BAL-celleanalyser fra disse eksperimentene for å markere de umiddelbare effektene av den kombinerte O3-og LPS-eksponeringen.

2. Eksempel samling

  1. Plasser musen på kirurgisk skuff. Legg nå forsiktig smøreøyesalve på begge øynene for å unngå væsketap og desinfisere musen med 70% etanolspray.
    1. Lag små kutt gjennom øvre og nedre hudmembraner med saks, for å eksponere luftrøret og thoraxen.
    2. Lag et kutt like under brystbenet og eksponer hjertet.
  2. Hjerte punktering
    1. Plasser en 25G nål festet til heparinisert sprøyte i høyre ventrikel og trekk blod ved hjerte punktering.
      MERK: Blodet trekker vanligvis med minimal stempeltrekning, hvis tiden fra å utsette hjertet til hjerte punktering er under et minutt. Etter å ha samlet rundt 0,4-0,5 ml, kan det hende man må pause i noen sekunder før man samler det gjenværende blodet. Dette gjøres for å la hjertet pumpe eventuelt gjenværende volum inn i høyre ventrikkelkammer. Ved slutten av blodsamlingen stopper hjertet for å pumpe.
    2. Samle blodet og lagre i mikrofuge rør for videre behandling.
  3. Trakeostomi
    1. Bruk forsiktig pinsett/stumpe tang for å fjerne trakealområdet fra overlysende vev. Bruk hanskede hender mer enn de kirurgiske instrumentene for å unngå blødning. Hvis mye blod oser, er det fare for å forurense BAL-prøvene. Bruk bomullspinne, om nødvendig, men ikke foretrukket. Kimwipes er bedre alternativer.
    2. Nå, kutt gjennom ribbeina for å eksponere lungene. Igjen, vær forsiktig så du ikke kutter brystbenet og intercostal arteriene eller stigende aorta; lage mindre kutt mens du går gjennom ribbeburet)
    3. Send en bomullsligatur under trakealklippet og la det være som sådan inntil videre.
    4. Klipp luftrøret på et passende sted i den distale 1/3rd-delen, som peker mot lungene, for å gi tilgang til en 28 G trakeal kanyle.
    5. Sett inn en 28 G PE-kanyle (en minimal lengde på 3-5 mm og distal ende trimmet for enkel innsetting) i luftrøret. Se opp for enden av luftrøret før bifurkasjon, og trekk deretter omtrent en mm tilbake for å unngå prøvetaking bare enkelt lobe.
    6. Fest bomullsligaturen godt for å holde kanylen på plass. Ikke skjul kanylen.
  4. Broncho-alveolar lavage (BAL)
    1. Fyll 0,5 ml PBS i en 1 ml sprøyte.
    2. Injiser nå gradvis 0,5 ml PBS i kanylen ved hjelp av 1 ml sprøyte.
    3. Etter å ha injisert PBS, aspirer ut sprøyten så lenge den ikke motstår sugingen.
      MERK: Hvis det er motstand mens du aspirerer BAL-væsken ut, indikerer det sammenbrudd av alveolaren eller bronkialvevet. I så fall trekker du kanylen tilbake med en miniscule for å løsne kanylen som danner vevets vegger.
    4. Samle den aspirerte væsken i et merket mikrofugerør og legg på is.
    5. Utfør to toaletter til på lignende måte som samler seg i samme hetteglass (dvs. totalt 0,5 X 3 = 1,5 ml lavage).
    6. Mål volumet av samlet BAL væske. Lavage utvinning bør være nær 90%.
  5. Lungevaskulær perfusat (LVP)
    1. Klipp den synkende thoracic aorta på et sted mellom thoracic og abdominal halvdeler, for å unngå back-up av perfusate i lungene mens parfyme gjennom høyre ventrikel.
    2. Flekk hulrommet nær den kuttede aortaenden, fri for blod.
    3. Deretter parfymerer lungene med 0,5 ml rom-temp heparinisert saltvann injisert gjennom høyre ventrikel.
    4. Samle vaskulær perfusat fra hulrommet i den kuttede enden av den synkende thorax aorta, i et mikrofugerør, plassert på is og mål volumet.
    5. Ligate høyre bronchus proksimal til sin forgrening fra luftrør (med bomull tråd).
  6. In situ venstre lungefiksering
    1. Koble en 1 ml sprøyte til trakealkanyle, som er lang nok til å sette inn gjennom det forrige trakeale snittet.
    2. Trekk tilbake luft i sprøyten opp til 0,6 ml merke.
    3. Fyll deretter den gjenværende sprøyten (helt til slutten) med 2% paraformaldehyd ved romtemperatur. Pass på at stempelet er klart til å sprette ut uten å suge tilbake luft fra kanylen.
    4. Nå, fest sprøyten med et scotch tape, til en oppreist beholder, målt opp til 20 cm høyde.
    5. Trekk stempelet forsiktig ut for å la fikseringsstrømmen mot luftrøret. I tilfelle det er noen luftbobler i kanylen, plasser stempelet forsiktig på toppen av sprøyten, og væsken begynner å strømme etter noen sekunder.
    6. La venstre lunge blåse opp til sin totale kapasitet in situ, i 5 minutter, fra en 20 cm høyde som danner en 20 cm vannsøyle.
    7. Under denne prosedyren, sørg for å beskytte de riktige lungelobene fra å komme i kontakt med paraformaldehyd, da dette vil påvirke nedstrømsanalysene.
    8. Plasser foldede laboratorievev for å absorbere paraformaldehyd som kan komme i kontakt med de riktige lungelobene.
      FORSIKTIG: Paraformaldehyd er svært giftig. Derfor må du ikke inhalere eller plassere kontakt med utsatte deler av kroppen. Utvis ekstrem forsiktighet under håndtering.
    9. I løpet av tiden for paraformaldehyd instillasjon, desinfiser magen.
    10. Klipp de riktige lungelobene av fra luftrøret, sørg for å fjerne enhver tråd og legg umiddelbart lobene i en merket kryo toårig og slipp den i flytende nitrogen for nedstrøms molekylær / biokjemisk cytokinanalyse / RT-PCR / vestlig blotanalyse av lungehomogenat.
    11. Trim forsiktig venstre lunge for bindevev eller pleuralmembraner og dypp den i 2% paraformaldehyd i 24 timer ved 4 °C.
    12. Bygg inn den faste lungen i parafin i henhold til standard innebyggingsprotokoll.
      Forsiktig: Ikke varm opp lungeprøvene for mye.
    13. Klipp bukdelen og avhud den fra bekkenbenet (hoften).
    14. Skill ut venstre og høyre lårben fra bekkendelen, i en saltvannsfylt petriskål holdt på is.
  7. Sternal og lårbensmarg aspirerer samling
    1. Rengjør vevet og musklene av beinene ved hjelp av laboratorievev.
    2. Samle ventral ribcage og brystben i en saltvann fylt Petri parabolen holdt på is.
    3. Klipp de distale og proksimale spissene på bryst- og lårbenene.
    4. Perfuse beinene 4 ganger med 0,5 ml saltvann, ved hjelp av godt monterte nåler (24 til 28 G) på til 1 ml sprøyter, og samle fraksjonene fra hvert bein i merkede rør utstyrt med filtre og plassert på is.
      MERK: Nålemåleren varierer mellom dyrestørrelse. Etter spyling skal lårbenet vise seg gjennomsiktig.
    5. Når prøvene er samlet inn, bag musen i en plastpose og legg i en dyrekropp fryser for riktig avhending, i henhold til retningslinjer for institusjonelt dyreanlegg.

3. Prøvebehandling

  1. Totalt antall (TLC) og differensial (DLC) leukocytttall
    1. Sentrifuger perifert blod, BAL, lungevaskulær perfusat og benmarg (sternal og lårben) prøver i 10 min ved 500 g.
    2. Samle supernatantene, blits fryse dem og lagre dem ved -80 °C inntil videre analyse.
    3. Rekonstituer cellene i minst 200 μL PBS.
    4. Utfør TLC ved å telle BAL, blod, lungevaskulær perfusat og benmargceller på et hemocytometer.
    5. Flekk en annen 9 μL aliquot av BAL med en 1 μL blanding av calcein grønn og rød ethidium homodimer-1 å kvantifisere levende (grønne) celler på grunn av intracellulær esterase aktivitet og eventuelle skadede BAL celler (i rødt) på grunn av tap av plasmamembran integritet.
    6. Tilsett 2% eddiksyre til lyse RBCer, i et 1: 10-forhold for blod TLC og 1: 2-forhold for lungevaskulærperfusat TLC.
      FORSIKTIG: Juster cellekonsentrasjonene ved å fortynne i PBS hvis konsentrasjonen er mer enn 1x106 celler per ml (svært viktig for benmargsprøvene).
    7. Sentrifuger cellene for å forberede cytospiner på lysbilder og flekk som forklart nedenfor for DLCer. Tell minst 100 celler for differensial leukocyttcelleantall (DLC).
      MERK: Vanligvis kan man forberede to cytospiner på ett lysbilde. Og etter 10-15 minutter med lufttørking, fortsett med fargingstrinn.
    8. Del den innsamlede BAL fra tre pilotmus per gruppe i to cytospiner hver og flekk for aktin/tubulin og mitokondrier med aktiv oksidativ fosforylering (redusert miitotracker). Bruk BAL fra tre mus til for å dele i to cytospiner hver, for NK1.1/Gr1/CX3CR1 og ATPβ/Ki-67/CD61/Angiostatin fargede lysbilder. Del BAL fra tre mus til i to cytospiner hver for å flekke for ATPα / Ly6G og CX3CR1 / Siglec-F.
  2. Bronchoalveolar lavage (BAL) og Lung Vascular Perfusate (LVP) total protein kvantifisering
    1. For å kvantifisere O3 og LPS induserte perturbasjoner av den vaskulære barrieren eller det relative onkotiske trykket i de to lungerommene (dvs. alveolar septal (interstitiell) og lungevaskulære perfusat (vaskulære) rom), måle totalt proteininnhold i de innsamlede væskene.
    2. Analyser de tinte supernatante fraksjonene for deres totale proteinkonsentrasjon ved hjelp av en standard vaskemiddelresistent kolorimetrisk analyse.
    3. Bronchoalveolar lavage (BAL) og lungevaskulær perfusat (LVP) kjemokinanalyse
      1. Deretter analyserer du kjemokinene i BAL og lungevaskulære perfusate (LVP) supernatanter ved hjelp av en 33-plex magnetisk peradbasert immunoassay. Dette vil informere om retningen av luftveier / interstitium vs vaskulære kjemokin gradienter etablert etter kombinert eksponering.
      2. Analyze the following panel of chemokines : CXCL13 (B-lymphocyte chemoattractant), CCL27 (IL-11 R-alpha-locus chemokine (ILC)), CXCL5 (epithelial-derived neutrophil-activating peptide 78 (ENA-78)), CCL-11 (eotaxin-1), eotaxin-2 (CCL-24), CX3CL1 (fractalkine), GM-CSF (CSF-2), CCL1, IFNγ (interferon gamma), IL-10 (interleukin-10), IL-16 (interleukin-16), IL-1β (interleukin-1 beta), IL-2 (interleukin-2), IL-4 (interleukin-4), IL-6 (interleukin-6), CXCL-10 (interferon gamma-induced protein 10 (IP-10)), CXCL11 (Interferon-gamma-inducible protein 9 (IP-9)), KC (keratinocyte chemoattractant), MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1), MCP-3 (monocyte chemoattractant protein-3), MCP-5 (monocyte chemoattractant protein-5), MDC (macrophage-derived chemokine (CCL22)), MIP-1α (macrophage inflammatory protein-1 alpha), MIP-1β (macrophage inflammatory protein-1 beta), MIP-2 (macrophage inflammatory protein-2), MIP-3α (macrophage inflammatory protein-3 alpha), MIP-3β (macrophage inflammatory protein-3 beta), RANTES (regulert ved aktivering, normal T-celle uttrykt og utskilt (CCL5)), CXCL-16, CXCL-12/SDF-1alpha (stromal celle-avledet faktor 1), TARC (thymus og aktiveringsregulert kjemokin (TARC)), TECK (Thymus-Uttrykt Chemokine (CCL25)) og TNFα (tumor nekrose).

4. Cytospin farging og lunge histologi

  1. Cytospin biokjemisk farging
    1. Omkrans cytospinene med en hydrofob penn for å inneholde kjemikalier for inkubasjon under prosedyren.
    2. Rehydrer cytospinene i PBS i 5 minutter.
    3. Fest cytospinprøvene i 2% paraformaldehyd i 10 minutter, vask tre ganger med PBS i 5 minutter hver.
    4. Permeabiliser med iskald 70% aceton i 7 minutter og vask igjen tre ganger med PBS i 5 minutter hver.
    5. Flekk for aktin og tubulin eller redusert Mitotracker (inkuber med en blanding av 2 μg/50 μL Alexa 488 konjugert falloidin vist i grønt, og 2 μg/μL Alexa 555 konjugert mus anti-α tubulin eller redusert Mitotracker vist i rødt, henholdsvis) i 15 minutter.
      MERK: Bruk mus IgG1 isotype kontroll antistoff, i en separat cytospin, for å validere tubulin farging protokollen. Utfør de samme trinnene som forklart fra 4.1.1 til 4.1.8, men for isotypekontroller.
    6. Fjern flekkene ved å vippe blandingen forsiktig fra lysbildet. Inkuber lysbildene med DAPI (4′,6-diamidino-2-fenylindole) i 5-10 min for å flekke kjerner.
    7. Vask cytospinnene 3 ganger med PBS i 5 minutter hver, deksler med anti-fade monteringsmedier og oppbevar over natten i mørket ved romtemperatur før avbildning.
    8. Skaff bilder under et bredt felt oppreist mikroskop utstyrt med et vitenskapelig kamera. Sørg for konsekvente kameraeksponeringstider som er angitt for de forskjellige fluorescerende kanalene når du ser på lysbilder.
  2. Cytospin immunfluorescerende farging:
    1. Omkrans cytospinene med en hydrofob penn for å inneholde kjemikalier for inkubasjon under prosedyren. Rehydrer cytospinene i PBS i 5 minutter.
    2. Fest cytospinprøvene ved å inkubere i 2% paraformaldehyd i 10 minutter, vask tre ganger med PBS i 5 minutter hver.
    3. Permeabiliser med 0,1% kald triton X-100 i 2 minutter, vask tre ganger med PBS i 5 minutter hver.
    4. Deretter blokkerer Fc i 15 minutter ved å inkubere cytospin med 1:50 fortynning av Fc blokk antistoff lager (for å sikre at den primære musen antistoff ikke kryssreagerer ikke-spesifikt med musen Fc antistoffer).
    5. Tips lysbildene for å fjerne Fc-blokken og bytt til 1% BSA for og inkuber cytospinnet med en blanding av 3 primære antistoffer av interesse (se tabell 1 for de forskjellige kombinasjonene) i 30 minutter.
      MERK: Sørg for å kjøre isotype kontroll antistoffer (inkubere med en blanding mus IgG1 og rotte IgG2b kappa primære antistoffer ved å utføre trinn 4.2.1 til 4.2.9 og erstatte antistoffene med isotype kontroller) parallelt med tilsvarende sekundære antistoffer som diskutert i vår nylige studie20.
    6. Vask 3 ganger med PBS i 5 min hver. Inkuber cytospinene med en blanding av riktig utformede sekundære antistoffer (se tabell 1 for detaljer).
    7. Fjern flekkene ved å vippe blandingen forsiktig fra lysbildet, inkuber med DAPI (4′,6-diamidino-2-fenylindole) i 5-10 min for å flekke kjerner. Vask 3 ganger med PBS i 5 min hver.
    8. Deksler med anti-fade monteringsmedier og oppbevar over natten i mørket ved romtemperatur før avbildning.
    9. Skaff bilder under et bredt felt oppreist mikroskop utstyrt med et vitenskapelig kamera. Sørg for konsekvente kameraeksponeringstider som er angitt for alle fluoroforkanalene når du ser på lysbilder.
  3. Hematoksylin og eosin (H&E) histologi
    1. Utfør modifisert H&E-farging3 på lungekryoseksjoner for alle grupper.
  4. Bildeanalyse
    1. Behandle og analysere bildedatafiler (.tiff) i Fiji ImageJ åpen programvare (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
    2. Kontroller de nødvendige parametrene (Område, Perimeter, Integrert tetthet, Figurbeskrivelser, Ferets diameter, Sirkularitet, Visningsetikett) som skal registreresi kategoriene Analyser og Angi mål .
    3. Bruk ROI Managertil å disponere rundt 50-200 celler manuelt i det sammenslåtte bildepanelet ved hjelp av verktøyet "frihåndsmarkeringer". Lagre områdene av interesse (ROI) med Ctrl + T kommando og kopier de lagrede ROIene for hver celle over til alle fluoroforkanalene.
    4. Trykk deretter ctrl+M for å måle de forhåndsinnstilte parametrene for alle fluorescerende kanaler (f.eks. 405 nm (DAPI eller ATPβ i blått), 488 nm (aktin eller NK1,1 eller Ki-67 i grønt), 568 nm (tubulin eller Gr1 eller CD61 i rødt) og 633 nm (CX3CR1 eller angiostatin i magenta)).
    5. Lagre filen Resultater som .csv med et passende navn som representerer analysen. Kopier resultatene fra .csv-filen til et regneark og del fluorescensintensiteten (FI) (som er kolonnen Raw Integrated Density fra Resultat-filen) til det fargede molekylet ved DAPI eller CD61 FI, i henhold til fargedesign. Disse forholdene kalles "DAPI- eller CD61-normaliserte FI-forhold".
    6. Deretter plotter du inn disse normaliserte forholdene, sirkulariteten, celleperimeteren og Feret-diameteren, for å evaluere eventuelle endringer i cellestørrelsen etter den kombinerte O3- og LPS-eksponeringen.
    7. Bruk passende statistisk programvare for å sjekke normaliteten til de innsamlede dataene og for å teste nullhypotesen (se den statistiske analyseseksjonen nedenfor).
  5. statistisk analyse
    1. Uttrykk resultater som gjennomsnittlig ± SEM. Minst tre mus ble brukt per gruppe.
    2. For cellegiftdataanalyse justerer du enveis ANOVA-p-verdier for falsk oppdagelsesrate i henhold til Benjamini- og Hoshberg-korreksjonen.
    3. Analyser bildeparametere, cellulæritet, Feret diameter, perimeter, DAPI eller CD61 normalisert fluorescensintensitetsforhold ved Mann-Whitney U-test (for sammenligning av to grupper) eller Kruskal Wallis-test (for sammenligning av flere grupper) da disse dataene normalt ikke ble distribuert.
    4. For resten av bildebehandlingseksperimentene analyserer du resultatene ved hjelp av en enveisvariasjon av varians etterfulgt av Sidaks mange sammenligninger. p-verdier <0,05 ble ansett som signifikante.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kombinert O3- og LPS-eksponering fører til systemisk betennelse og benmargsmobilisering ved 72 timer: Celletall i forskjellige rom viste betydelige endringer i perifert blod og femurbenmargens totale celletall ved kombinert O3- og LPS-eksponering. Selv om kombinerte O3- og LPS-eksponeringer ikke induserer noen endringer i den totale BAL- (figur 1A) eller LVP- (figur 1B) celleantall, polymorforukære celler presentert som den dominerende celletypen ved 24 (Figur 1F, Supplerende figur 1), 36 og 72 timer etter eksponering. Vær oppmerksom på fraværet av Siglec-f og CX3CR1 farging i polymorforukære celler ved 24 h BAL cytospin bilde (Figur 1F). Trippel DAPI/CD11b/Gr1 farging av BAL cytospiner viste tilstedeværelse av store CD11b- og Gr1-positive mononukleære celler som er makrofager ved 0 t, som endres til mindre polymorforukære celler som viser punctate Gr1staining, men blottet for CD11b farging ved 4 t (som vist i innsetting i Supplemental 1F). De fleste BAL-celler er polymorforukære og positive for både CD11b og Gr1, ved 24 timers posteksponering(tilleggs figur 1).

Musene viste systemisk leukocytose ved 24 timer (3,3 ganger vs. 0 t, p<0,05, figur 1C) etterfulgt av leukopeni ved 72 timer som var merket med 13 ganger lavere antall i perifert blod sammenlignet med 24 timer (p<0,01) og en 8,6 ganger lavere sammenlignet med 4 t (p<0,05) etter kombinertO3- og LPS-eksponering (figur 1C). De sternale benmargscellene var også uendret sammenlignet med 0 t eller etter kombinert O3- og LPS-eksponering (figur 1D). Lårbensmargstallene viste en sen 28,8 ganger spiker ved 72 timer sammenlignet med 0 h (p<0,01, figur 1E) samt andre tidspunkter (p<0,01, figur 1E). Visualisering av LVP, bryst- og lårbensmargceller viste også endringer i celletypene til overveiende polymorfoukære celler (Supplerende figur 1). De sternale benmargscellene viste tegn på skade som det fremgår av ekstracellulært kjernefysisk materiale. Lårbenmargen viste høyere antall cd11b og gr1 positive celler (Supplerende figur 1), som sammenfaller med celleantallet.

BAL totalt proteininnhold var høyest ved 36 timer etter kombinert O3- og LPS-eksponering: Kvantifisering av de totale proteinene i LVP- og BAL-rommene ble utført for å korrelere ozonindusert lungeødem, det vil si plasmaproteineksudasjon på grunn av resulterende vaskulær og epitelial barrierehemming på grunn av den kombinerte eksponeringen. BAL totalt protein var 4,5 ganger høyere ved 36 timer (p<0,05) sammenlignet med 4 t (Figur 2A). LVP-proteinet var imidlertid uendret etter eksponering (figur 2B).

Kombinert O3- og LPS-eksponering induserer sterke kjemokingradienter i lungevaskulært rom og ikke BAL: Kjemokin multipleksanalyser ble utført på både BAL- og LVP-supernatanter. Vær oppmerksom på at de relative forskjellene mellom disse to rommene representerer fortrinnsrett i et bestemt rom. eosinofil kjemoattractant eotaxin-2 var 4,3 ganger høyere ved 4 timer i LVP-rommet sammenlignet med 0 h (p<0,05, figur 3A). I BAL-rommet var eotaxin-2 3,2 ganger lavere ved 4 timer sammenlignet med 0 t (p<0,01, figur 3B). BAL eotaxin-2-nivåene fortsatte å synke konsekvent til 72 timer med 12,6 ganger reduksjon sammenlignet med 0 h (p<0,01, figur 3B). Lymfocytt chemoattractant IL-2 var 10,1 ganger høyere ved 4 timer i LVP-rommet sammenlignet med 0 h (p<0,05, figur 3C). I BAL-rommet var IL-2 5,0 ganger lavere ved 36 timer sammenlignet med 0 timer (p<0,05, figur 3D). BAL eotaxin-2 nivåer holdt på å redusere konsekvent 5.9 ganger reduksjon på 72 h sammenlignet med 0 h (p<0.05, Figur 3D).

Interessant nok ble mange kjemokiner endret ved 4 timer, i LVP og ikke BAL. De fleste av disse cellegiftene viste beskjeden, men likevel signifikant, økning i LVP-nivåer på 4 timer sammenlignet med senere tidspunkter. Selv om eotaxin-1-nivåene ikke var høye etter eksponeringene sammenlignet med 0 h, men nivåene var signifikant høye ved 4 h sammenlignet med 24 (2,7 ganger, p<0,05) og 72 h (5,0 ganger, p<0,01, figur 4A) etter kombinert eksponering. Nivåene av LVP TNFα var 3,4 ganger høyere ved 4 timer sammenlignet med 36 timer (p<0,05, figur 4B). Tilsvarende var LVP IFNγ 2,9 ganger høyere ved 4 timer sammenlignet med 72 timer (p<0,05, figur 4C). CX3CL1-nivåene var også høye ved 4 t sammenlignet med 24 (1,7 ganger, p<0,05), 36 (1,6 ganger, p<0,05) og 72 t (2,2 ganger, p<0,01) etter kombinert eksponering (figur 4D). CCL27-nivåene viste også høyere nivåer ved 4 t sammenlignet med 24 (2,7 ganger, p<0,05), 36 (3,9 ganger, p<0,01) og 72 t (2,9 ganger, p<0,05) etter kombinert eksponering (figur 4E).

Noen kjemokiner hadde en sterk tilstedeværelse i LVP ved 4 timer etter kombinert eksponering, og ikke endret i BAL før og etter eksponering, noe som indikerer en sterk kjemokinrespons fra lungekapillærene. Ved 4 timer, IL-16 LVP-nivåene var 3,4 ganger sammenlignet med 0 t (p<0,01), 3,2 ganger sammenlignet med 24 timer (p<0,01), 3,2 ganger 4,5 ganger sammenlignet med 36 timer (p<0,01) og 4,6 ganger sammenlignet med 72 timer (p<0,01) etter kombinert eksponering (figur 4F). Ved 4 timer, nøytrofil kjemokin, CXCL5 LVP-nivåene var 2,0 ganger sammenlignet med 0 h (p<0,01), 4,7 ganger sammenlignet med 24 timer (p<0,01), 2 sammenlignet med 36 timer (p<0,01) og 2,7 ganger sammenlignet med 72 timer (p<0,01) etter kombinert eksponering (figur 4G). Ved 4 timer, CXCL10 LVP-nivåene var 2,3 ganger sammenlignet med 0 h (p<0,01), 2,1 ganger sammenlignet med 24 timer (p<0,05), 2 sammenlignet med 36 timer (p<0,01) og 2,7 ganger sammenlignet med 72 timer (p<0,01) etter kombinert eksponering (figur 4H). Ved 36 h var nøytrofil chemokine, SDF1α LVP-nivåene 4,2 ganger sammenlignet med 0 h (p<0,01), 2,9 ganger sammenlignet med 24 h (p<0,05), 6,8 ganger sammenlignet med 72 h (p<0,01) etter kombinert eksponering (Figur 4I). Ved 4 t var MIP3β LVP-nivåene 2,3 ganger sammenlignet med 0 t (p<0,05) og 2,3 ganger sammenlignet med 72 timer (p<0,05) etter kombinert eksponering (figur 4J).

Kombinert O3- og LPS-eksponering induserer nekrose, forstyrrer cellulær cytoskeletal, plasmamembran og mitokondrieintegritet: Ettersom de kuperte leukocytttallene og proteininnholdet ikke korrelerte med LVP-kjemokingradientene, ble det viktigere å visualisere cellene som ble oppnådd fra disse rommene. Ex vivo aktin/tubulinfarging av baseline (0 h) BAL-celler viste tilstedeværelse av kortikale aktin, stressfibre samt lamellipodia (vist i grønt, figur 5 venstre øvre panel) og mikrotubulenettverk (vist i rødt, figur 5 venstre øvre panel) som sammenfalt med redusert mitotrackerfarging som indikerer tilstedeværelse av aktiv mitokondrier (vist i rødt, figur 5 venstre nedre panel). Mer enn 95% av BAL-cellene var mononukleære ved baseline. Ved 4 timer viste BAL-celler ekstracellulært kjernefysisk materiale, punktert cytoplasmisk aktinfarging blottet for lamellipodia og redusert kortikale aktinfarging (vist i grønt, figur 5 høyre øvre panel), viftet mikrotubulenettverk (vist i rødt, figur 5 høyre øvre panel) som ikke samsvarte med den reduserte mitotrackerfargingen (vist i rødt, figur 5 venstre høyre panel). DAPI normalisert aktin fluorescerende intensitetsanalyse viste en 3,7 ganger reduksjon i forholdet som indikerer reduksjon i aktinfarging ved 4 timer etter eksponering (p<0,01, figur 6A). På samme måte reduserte DAPI-normalisert tubulinfluorescerende intensitet også med 1,5 ganger etter eksponering (p<0,01, figur 6B), noe som indikerer en reduksjon i tubulinfarging. Tapet av lamellipodia var tydelig med en økning i sirkulariteten til BAL cellulær cytoskjelett umiddelbart, det vil si ved 2 t (s<0,01, Figur 6C) og 4 t (p<0,05, figur 6C) etter eksponering sammenlignet med 0 t og en reduksjon i cytoskeletal sirkularitet ved 24 (p<0,05) og 36 timer (p<0,01) etter eksponering, sammenlignet med 0 t (Figur 6C).

Opptil 24 timer var BAL-cellene fra den kombinerte eksponeringen dobbelt positive for calcein (i grønt, figur 7) som indikerer tilstedeværelse av aktiv esteraseaktivitet, og ethidium homodimer (i rødt, figur 7), noe som indikerer at selv om noen celler var døde (røde), var flertallet delvis kompromitterte celler. Ved 36 timer var BAL-cellene i stor grad levedyktige (grønne), noe som indikerer utskifting av de kompromitterte cellene av leukocytter rekruttert fra andre systemiske rom (figur 7).

Spesifikk ATPα- og Ly6G-farging av BAL-cellene viste diskret intracellulær lokalisering (Film 1 og 2) av både proteinene i alveolarmakrofager samt nøytrofiler etter eksponering (figur 7). Den kombinerte eksponeringen førte til reduksjon i DAPI-normalisert fluorescerende intensitetsforhold for ATPα (figur 7, 8A) og en økning i intracellulært Ly6G-proteininnhold (Figur 7, Figur 8B, Film 1 og 2). Reduksjon i ATPα farging, ved 24 timer etter eksponering, korrelert med lavere tubulin og til en viss grad redusert mitotracker farging. Vi observerte også anukære ATPα positive cellelegemer etter eksponering, som kan være blodplater. Vi bekreftet imidlertid ikke funnene våre. Ved 2 t observerte vi mindre mononukleære BAL-celler (p<0,01 figur 8C, p<0,01 figur 8D) sammenlignet med 0 h, men ved 4 t var de mononukleære cellene større (p<0,01 figur 8C, p<0,01 figur 8D) sammenlignet med 0 t. Ved 24 (p<0,01 figur 8C, p<0,01 figur 8D) og 36 t (p<0,01 figur 8C, p<0,01 figur 8D), ble BAL-cellene gradvis mindre på grunn av et skifte mot polymorforukære celler, sammenlignet med 0 h.

Immunofenotyping av BAL-celler avdekket forbigående uttrykk for NK1,1, ATP-β og Ki-67 og vedvarende uttrykk for Gr1, CX3CR1 og angiostatin positive BAL-celler etter kombinert O3- og LPS-eksponering: Immunfluorescent farging av det første settet med BAL cytospiner ble normalisert til DAPI-farging. Det var en økning i de cellulære NK1,1 positive cellene ved 24 timer (p<0,05 vs. 0 t, figur 9, 10A). Ved 36 timer hadde BAL-cellene lavere cellulær NK1,1 fluorescerende intensitet (p<0,01 vs. 0 og 24 timer, figur 9, 10A). Den cellulære Gr1 fluorescerende intensiteten var høyere ved 24 timer (p<0,01 vs. 0 t, figur 9, 10B) samt 36 timer (p<0,01 vs. 0 t, figur 9, 10B). På samme måte var den cellulære CX3CR1 fluorescerende intensiteten høyere ved 24 timer (p<0,01 vs. 0 t, figur 9, 10C) samt 36 timer (p<0,01 vs. 0 t, figur 9, 10C).

Når den normaliseres til mobil CD61, som også er allestedsnærværende i uttrykk, avslørte en økning i den cellulære ATPβ fluorescerende intensiteten ved 24 h (p<0,01 vs 0 h, figur 9, 10D) og en reduksjon i den cellulære ATPβ fluorescerende intensiteten ved 36 h (p<0,01 vs 0 og 24 t, figur 9, 10D). Spesielt viste ATPβ overveiende kjernefysisk lokalisering ved 24 timer sammenlignet med perifer lokalisering ved 36 timer (figur 9). Den cellulære fluorescerende intensiteten til BAL Ki-67, en indikator på cellulær spredning, var høyere ved 24 timer (p<0,01 vs. 36 timer, figur 9, 10E) sammenlignet med 0 og 36 timer. Nivåene var under baseline nivåer på 36 h (p<0.01, Figur 9, 10E), mest sannsynlig på grunn av høyere polymorpho-kjernefysisk CD61 vs Ki-67 uttrykk ved 36 h (Figur 9). Til slutt var den cellulære fluorescerende intensiteten til BAL angiostatin konsekvent høy ved både 24 og 36 timer (p<0,01 vs 0 h, figur 9, 10F), noe som indikerer en spesifikk økning i dette metalloproteinaseklynge plasminogenfragmentet, under lungeinflammatorisk respons.

Kombinerte eksponeringer gir omfattende lungeskader: Lunge histologi viste at de kombinerte eksponeringene gir langvarig skade på lungene sett i H&E-fargede kryoser (figur 11). Selv om bronkiolar og alveolar septal skade var forventet, var det surprizing å observere endotelial skade på større fartøy, ved 36 timer etter eksponering (Figur 11). Det var tilhenger intravaskulære leukocytter, flekker av leukocyttaggregater (inkludert nøytrofiler) i de skadede alveolar septal- og peri-bronchiolar-områdene (figur 11).

Figure 1
Figur 1: Antall kuperte leukocytter: A) Broncho-alveolar lavage (BAL) totalt leukocytt teller ved 0 (dvs. baseline), 4, 24, 36 og 72 timer etter kombinert 0,05 ppb ozon (O3) og 50 μg intranasal LPS eksponering for mus. B) Lungevaskulær perfusat (LVP) total leukocytkonsentrasjon ved 0 (dvs. baseline), 4, 24, 36 og 72 timer etter kombinert 0,05 ppb ozon (O3) og 50 μg intranasal LPS eksponering for mus. C) Perifert blod (PB) total leukocyttkonsentrasjon ved 0 (dvs. baseline), 4, 24, 36 og 72 timer etter kombinert 0,05 ppb ozon (O3) og 50 μg intranasal LPS eksponering for mus. D) Sternal benmarg (BM) total leukocyttkonsentrasjon ved 0 (dvs. baseline), 4, 24, 36 og 72 h etter kombinert 0,05 ppb ozon (O3) og 50 μg intranasal LPS eksponering for mus. E) Femur benmarg (BM) total leukocyttkonsentrasjon ved 0 (dvs. baseline), 4, 24, 36 og 72 h etter kombinert 0,05 ppb ozon (O3) og 50 μg intranasal LPS eksponering for mus. For grafene A-E er 0 t representert i blått, 4 t i rødt, 24 timer i grønt, 36 timer i lilla og 72 timer i oransje datapunkter; * p<0,05 og ** p<0,01. F) Representativ BAL cytospin lysbilde fra 24 h eksponering, viser mononukleære og polymorphonuclear celler når farget for kjerner med DAPI (i blått), CX3CR1 (i grønt) og Siglec-F (i rødt). Vær oppmerksom på at sammenslåingen av CX3CR1 og Siglec-F vises som oransje-gul. Flertallet av mononukleære celler er positive for Siglec-F, som er karakteristisk for alveolar makrofager. Skalalinje = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Total protein kvantifisering: A) Bronchoalveolar lavage (BAL) totalt proteininnhold og B) Lungevaskulær perfusat (LVP) total proteinkonsentrasjon ble estimert avPierce 660 nm proteinanalyse (Thermoscientific, IL, US). For grafene A-B er 0 t representert i blått, 4 t i rødt, 24 timer i grønt, 36 timer i lilla og 72 timer i oransje datapunkter; * p<0,05. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Lunge Eotaxin-2 og IL-2 kjemokingradienter: Ut av de 33 kjemokinene, to kjemokiner som ble signifikant endret i lungevaskulær perfusat (LVP) og bronkoalveolar lavage (BAL) og væske etter kombinert 0,05 ppb ozon (O3) og 50 μg intranasal LPS eksponering for mus A) LVP eotaxin-2, B) BAL eotaxin-2, C) LVP IL-2 og D) BAL IL-2. Data ble analysert av enveis anova, og p-verdien for falsk oppdagelsesrate for flere variabler ble justert i henhold til Benjamini og Hoshberg korreksjon. For grafene A-D er 0 t representert i blått, 4 t i rødt, 24 timer i grønt, 36 timer i lilla og 72 timer i oransje datapunkter. Parvise sammenligninger ble analysert etter Bonferronis korreksjon. * representerer p<0,05, ** representerer p<0,01. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Lungevaskulære perfusate kjemokinkonsentrasjoner: Konsentrasjoner på ti cellegifter ble endret, men bare i lungevaskulært perfusat (LVP) rom. A) Eotaxin-1, B) TNFα, C) IFNγ, D) CX3CL1, E) CCL27, F) IL-16, G) CXCL5, H) CXCL10, I) SDF1α og J) MIP3β. For grafene A-J er 0 t representert i blått, 4 t i rødt, 24 timer i grønt, 36 timer i lilla og 72 timer i oransje datapunkter. Parvise sammenligninger ble analysert etter Bonferronis korreksjon. * representerer p<0,05, ** representerer p<0,01. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Bronchoalveolar lavage (BAL) cytospin aktin/tubulin og redusert mitotrackerfarging: Representative bilder avactin/tubulinfargede BAL cytospiner fra A) 0 h og B) 4 h etter kombinert 0,05 ppb ozon (O3) og 50 μg intranasal LPS eksponering for mus. Vær oppmerksom på at DAPI vises i blått, aktin i grønt og tubulin i rødt. Representative bilder av mitotracker farget BAL cytospins fra A) 0 h og B) 4 h etter kombinert 0,05 ppb ozon (O3) og 50 μg intranasal LPS eksponering for mus. Vær oppmerksom på at DAPI vises i blått og redusert mitotracker i rødt. Skalalinje = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Bronchoalveolar lavage (BAL) cytoskeletal protein- og sirkularitetsanalyse: BAL cytospiner farget for aktin og tubulin ble analysert for DAPI-normaliserte parametere, det vil si A) Actin til DAPI fluorescerende intensitet (FI) ved 0 og 4 t, B) Forholdet mellom tubulin og DAPI fluorescerende intensitet (FI) ved 0 og 4 t og C) BAL cellecellulæritet ved 0 (n =75 celler), 2 (n = 105 celler), 4 (n = 66 celler), 24 (n = 31 celler), 36 (n = 154 celler) h. Som noen få pilotforsøk ble også utført umiddelbart etter O3- og LPS-eksponeringer, det vil si ved 2 timers tidspunkt, inkluderte vi også noen svært tidlige BAL-cellulæritetsanalyser fra 2-timers tidspunktet for å markere de umiddelbare effektene av O3. For grafene A-C er 0 t representert i blått, 2 t i rødt, 4 t i grønt, 24 timer i lilla og 36 timer i oransje datapunkter. * representerer p<0,05, ** representerer p<0,01. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Bronchoalveolar lavage (BAL) intracellulær og plasmamembranstatus: BAL-celler ble farget for vitale flekker, calcein (i grønt) og eteri homodimers/EthHD (i rødt) som vist i representative øvre bildepaneler ved A) 0, B) 24 og C) 36 timer etter O3- og LPS-eksponeringer. Skalastang = 200 μm. BAL cytospiner ble immunostert for DAPI (i blått), ATPα (i grønt) og Ly6G (i rødt). Representative bilder vises i de nedre bildepanelene ved A) 0 og B) 24 timer etter O3- og LPS-eksponering. Skalalinje = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Bronchoalveolar lavage (BAL) mitokondrieprotein ATPα, lysosomalt protein Ly6G og cellestørrelsesanalyse: Immundeponerte BAL-celler ble normalisert for DAPI til databehandling A) ATPα til DAPI fluorescerende intensitet (FI) og B) Ly6G til DAPI FI-forhold, ved 0 og 24 timer etterO3- og LPS-eksponeringer. Immunblokkerte BAL-celler ble også analysert for deres A) lengste dvs. ferretdiameter og B) omkrets, ved 0, 2, 4, 24 og 36 timer etter O3 og LPS eksponeringer. For grafene A-D representeres 0 t (n=119 celler) i blått, 2 t (n=105 celler) i rødt, 4 t (n=66 celler) i grønt, 24 t (n=309 celler) i lilla og 36 t (n=154 celler) i oransje datapunkt. * representerer p<0,05, ** representerer p<0,01. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: Bronchoalveolar lavage (BAL) intracellulær fenotyping: BAL-celler ble immunostained for DAPI (i blått), NK1.1 (i grønt), Gr1 (i rødt) og CX3CR1 (i magenta) som vist i representative øvre bildepaneler ved A) 0, B) 24 og C) 36 h etter O3 og LPS eksponeringer. Skalastang = 50 μm. BAL cytospiner ble immunostert for ATPβ (i blått), Ki-67 (i grønt), CD61 (i rødt) og angiostatin (i magenta). Representative bilder vises i de nedre bildepanelene ved A) 0, B) 24 og C) 36 timer etter O3- og LPS-eksponering. Skalalinje = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 10
Figur 10: Bronchoalveolar lavage (BAL) mitokondrieprotein ATPβ, lysosomalt protein Gr1, intracellulær CX3CR1 og angiostatinanalyse: Immunosterte BAL-celler ble normalisert for DAPI til databehandling A) NK1,1 til DAPI fluorescerende intensitet (FI) forhold, B) Gr1 til DAPI FI-forhold og C) CX3CR1 til DAPI FI-forhold, ved 0, 24 og 36 timer etterO3- og LPS-eksponeringer. Immunosterte BAL-celler ble normalisert for CD61 til databehandling A) ATPβ til DAPI fluorescerende intensitet (FI) ratio B) Ki-67 til DAPI FI ratio og B) Angiostatin (ANG) til DAPI FI ratio, ved 0, 24 og 36 timer etter O3 og LPS eksponeringer. For grafene A-F representeres 0 t (n=21 celler) i blått, 24 t (n=796 celler) i rødt og 36 t (n=2692 celler) i grønne datapunkt. * representerer p<0,05, ** representerer p<0,01. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 11
Figur 11: Lunge hematoksylin og eosin (H&E) histologi. Ozon (O3) og LPS induserte lungekryoseksjon H&E histologi ved 0, 24 og 36 timer etter kombinert O3- og LPS-eksponering. Regioner med alveolar epitelial skade er preget av solide svarte piler og endotelial skade av svarte pilhoder. Gule stjerner (*) representerer flekker av leukocytter i alveolar septalområdene. A = alveolarrom, B = bronchus, V = vaskulatur, skalalinje = 100 μm for venstre bildepaneler og 50 μm for bildepaneler på høyre side. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

S.No. Primært antistoff Invitrogen sekundært antistoff
1 Mus anti-NK1.1 IgG2a kappa (klone PK136), Invitrogen Katalog Nr. 16-5941-82 Alexa 488 konjugert geit antimus IgG (H +L), katalognr. A11002
2 Rotte anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (klone RB6-8C5), Invitrogen Katalog Nr. 53-5931-82 Alexa 568 konjugert geit anti-rotte IgG (H +L), Katalog Nr. A11077
3 Kanin anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880), Invitrogen Katalog Nr. 14-6093-81 Alexa 633 konjugert geit anti-kanin IgG (H +L), katalognr. A21070
4 Mus anti-ATP5A1 IgG2b (klone 7H10BD4F9), Invitrogen Katalog Nr. 459240 Alexa 488 konjugert geit antimus IgG (H +L), katalognr. A11002
5 Rotte anti-Ly6G IgG2a kappa (klone 1A8), Invitrogen Katalog Nr. 16-9668-82 Alexa 568 konjugert geit anti-rotte IgG (H +L), Katalog Nr. A11077
6 Mus anti-ATP5β IgG2b (klone 3D5AB1), Thermofisher Katalog Nr. A-21351 Alexa 350 konjugert geit antimus IgG (H +L), katalognr. A11045
7 Rotte anti-Ki-67 (klone SolA15) IgG2a kappa, Invitrogen Katalog Nr. 14-5698-82 Alexa 568 konjugert geit anti-rotte IgG (H +L), Katalog Nr. A11077
8 Armensk hamster anti-CD61 (klone 2C9. G2) IgG1 kappa, BD Katalog Nr. 553343 Alexa 568 konjugert geit anti-hamster IgG (H +L), Katalog Nr. A21112
9 Kanin anti-angiostatin (mus aa 98-116) IgG, Abcam Katalog Nr. ab2904 Alexa 633 konjugert geit anti-kanin IgG (H +L), katalognr. A21070

Tabell 1: Primære og sekundære antistoffkombinasjoner som brukes til å flekke cytospiner fremstilt fra prøvene.

Avlesning Bal LVP Pb SBM FBM
Tlc * * + ved 24 timer; - ved 36, 72 timer + ved 72 timer
Nøytrofile + ved 24, 36, 72 timer + ved 24 timer * + ved 4, 24, 36, 72 timer + ved 4, 24, 36, 72 timer
protein + ved 36 timer * n.d. n.d. n.d.
Chemokine-profil - For eotaxin-2, IL-2 ved 4, 24, 36, 72 h + for Eotaxin-1/2, IL-2, TNFα, IFNγ, CX3CL1, CCL27, IL-16, CXCL5, CXCL10, MIP3β ved 4 timer; + for SDF1α ved 36 timer n.d. n.d. n.d.
Cellestørrelse + ved 4 timer; - ved 24, 36 timer n.d. n.d. n.d. n.d.
ATPα - ved 24 timer n.d. n.d. n.d. n.d.
NK1.1/Ki-67 + ved 24 timer n.d. n.d. n.d. n.d.
ATPβ/Gr1/CX3CR1/ANG + ved 24, 36 timer n.d. n.d. n.d. n.d.

Tabell 2: En omfattende oppsummering av hovedfunnene i studien i ulike rom. * betyr ingen endring, + betegner en økning og - betegner en reduksjon i de målte parametrene. BAL betegner bronko-alveolar lavagevæske, LVP betegner lungevaskulær perfusat, PB betegner perifert blod, SBM betegner brystbenmarg og FBM betegner lårbenmargrom.

Supplerende figur 1: Gr1- og CD11b-immunoppfatning: Representative bilder fra DAPI (i blått), Gr1 (i grønt) og CD11b (i rødt) fluorescerende immunostained cytospin lysbilder av lungevaskulær perfusat (LVP), sternal benmarg (BM) og lårbenmarg (BM) rom ved 0, 4 og 24 h etter kombinert O3 og LPS eksponeringer. Skalalinje = 50 μm. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende film 1 Tredimensjonalt gjengitt volum av BAL-makrofager fra 0 t tidspunkt (dvs. baseline), som viser kjerne (vist i blått) og immunostert for ATPα (vist i grønt) og Ly6G (vist i rødt). Klikk her for å laste ned denne filmen.

Supplerende film 2: Tredimensjonalt gjengitt volum av BAL makrofager fra 24 h tidspunkt etter kombinert O3 og LPS eksponering, viser kjerne (vist i blått) og immunostained for ATPα (vist i grønt) og Ly6G (vist i rødt). Legg merke til tilstedeværelsen av anukære ATPα positive kropper samt en fragmentert celle. Klikk her for å laste ned denne filmen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metodene som presenteres i den nåværende studien fremhever nytten av multippel romanalyse for å studere flere cellulære hendelser under lungebetennelse. Vi har oppsummert funnene i tabell 2. Vi og mange laboratorier har i stor grad studert murinresponsen på intranasal LPS-instillasjon, som er preget av rask rekruttering av lungenøytrofiler, som topper mellom 6-24 timer, oppløsning sparker inn. Og nylig har vi vist at sub-klinisk O3 (ved 0,05 ppm i 2 timer) alene kan indusere betydelig lungeskade i C57BL / 6NJ-understammen15, som er preget av partisjonering av nøytrofiler i lungevaskulære rommet, mens skadede makrofager og rusk ble observert i BAL, og dermed indikerer det inflammatoriske potensialet til O3. I den modellen observerte vi fravær av nøytrofiler i alveolarrommet som følge av O3 indusert alveolar epitelskade og resulterende fagocytose av alveolar makrofager. Ikke bare observerte vi ekstracellulært DNA og rusk i O3-modellen, BAL-makrofagene var dysmorfiske som korrelerer med høye IL-16-nivåer, et alarmin som vanligvis frigjøres av døende nøytrofiler. Derfor er det viktig å forstå om disse sub-kliniske O3-nivåene kan påvirke immunresponsen i ellers robust C57BL / 6J-understamme, som nevnt med supra-fysiologisk O3 nivåer21. Vi observerte at kombinert O3 og intranasal bakteriell endotoksin indusert nøytrofil rekruttering i lunge samt systemiske rom, preget av tilstedeværelse av skadede nøytrofiler i BAL, lungevaskulær perfusat, sternal og lårben marg rom starter på 4 timer som forble høy på 24, 36 og 72 h. Cellulær skade var representert som tap av kortikale aktin og lamellipodia og økning i cellestørrelse i BAL leukocytter; nøytrofiler, analysert i BAL-rommet, viste betydelig redusert positiv reaktivitet til mikrotubul, ATP-syntasekompleks V-underenhet α (ATPα) og aktiv mitokondrieflekk. Lungene tilpasser seg denne kombinerte eksponeringen ved å oppregulere uttrykket av cellulær ATP-syntasekompleks V-underenhet β (ATPβ) samt ATPβ-liganden, angiostatin (tabell 2).

Et viktig aspekt ved å studere betennelse er å forstå cellulær nekrose sammen med kjemokin gradienter. Det var interessant å merke seg at de totale leukocytttallene ikke var forskjellige bortsett fra i perifert blod og lårbenmargrommet. Disse observasjonene førte oss til å undersøke cellulære cytoskeletale mønstre, størrelse og immunofenotyping. Vi observerte tap av lamellipodia og aktive mitokondrier i BAL-celler som indikerer cellulær skade. Kortikale aktinorganisasjon er et viktig trekk ved inter-cellulær signalering og de resulterende barriereegenskapene. Cytoskeletal disorganisering er dermed en god markør for celleskade når nekrose ikke er så åpenbar å vurdere. Selv ved 36 timer hadde BAL-cellene kompromittert plasmamembranen som indikert av ethidium homodimerfarging. Umiddelbart etter de kombinerte eksponeringene viste nøytrofiler i BAL Gr1 positivitet, men en i hovedsak negativ farging for CD11b, som lokaliserer mot forkant og hjelper til med alveolar septal crawling22. Dermed fører de kombinerte eksponeringene til akkumulering av atypiske nøytrofiler uten CD11b-proteinet. LPS induserer ikke downregulering av CD11b. Dermed er denne funksjonen sannsynligvis et resultat av O3 indusert skade på nøytrofiler.

BAL-cellene hadde en unik proteinsignatur med høyere NK1,1, Ki-67 og ATPβ farging ved 24 timer sammenlignet med 0 h (Tabell 2). BAL-cellene hadde høyere uttrykk for Gr1, CX3CR1 samt angiostatin, ved 24 samt 36 timer sammenlignet med 0 h (Tabell 2). Disse funnene ble bekreftet av tilstedeværelsen av gradvis flere Gr1-positive nøytrofiler i BAL, ved 24 og 36 timer, etter eksponering (tabell 2). Tilstedeværelsen av NK1.1, CX3CR1 og Gr1 positive celler, ved 24 h, indikerer rekruttering av både mononukleære og polymorforukære celler i BAL. Blant de mononukleære cellene, CX3CR1 positive celler dominert ved 36 h indikerer tilstedeværelse av enten interstitielle makrofager, blodplater eller monocytt avledet makrofager. Inkluderingen av både Ki-67 og angiostatin som markører informerte oss om henholdsvis det proliferative vs anti-angiogene miljøet i BAL. Dermed fører de kombinerte O3- og LPS-eksponeringene til spredning av sannsynligvis makrofager etterfulgt av et anti-angiogent miljø på grunn av nøytrofil infiltrasjon. Den forbigående økningen i ATPβ farging kan indikere en viktig tilpasning til en økt overlevelse av BAL leukocytter ved 24 timer. Det må bemerkes at ATPβ kan binde seg til angiostatin og hemme langvarig overlevelse6,23, som faktisk gjenspeiles i den nedre Ki-67-indeksen ved 36 timers posteksponering.

Selv om BAL-proteinet var høyest ved 36 timer, og ikke andre tidspunkter, viste lungevaskulær perfusat ingen endringer i proteinkonsentrasjonen før eller etter eksponering. Det er mulig at det vaskulære rommet ikke ble påvirket, men dette er mest sannsynlig forvirret på grunn av oksidasjon av elektronrike aminosyrer som metionin, histidin og cystein av O3 induserte frie radikaler og resulterende overflateaktive proteiner (SP-A, SP-B) nedbrytning samt vaskulær lekkasje24,25,26. Kvantifisering av BAL IgM, BAL overflateaktive proteiner, BAL-albumin eller fargestoff ekstravasasjon (ved hjelp av Evans blå eller fluorescein iso-thiocyanate (FITC) dextran) er alternative metoder for å vurdere epitelial og endotelial integritet.

Interessant nok ble lungevaskulære perfusatnivåer av eotaxin-2 og IL-2 akutt hevet ved 4-timers tidspunktet. BAL eotaxin-2- og IL-2-nivåene ble betydelig redusert etter eksponering, noe som indikerer enten nedbrytning i alveolarrommet eller entrapment i lungevaskulaturen. Flere kjemokiner analysert i lungevaskulær perfusat viste høyere nivåer av eosinofil kjemokin (eotaxin-1), TNFα, IFNγ, lymfeknutert mononukleære celle kjemokiner (CX3CL1, CXCL10, CCL27, MIP3β), epitelavledede nøytrofile kjemokin (CXCL5) og alarminet (IL-16) utgitt etter sekundær nekrose av nøytrofiler27, men bare ved 4 timer etter eksponering. Ved 36 timer var benmargen avledet pan-leukocytt kjemokin, SDF1α28, høyere i lungevaskulær perfusat. Benmargen avledede SDF1α-konsentrasjoner korrelerer med cytologifunn der CD11b og Gr1 positive celler er rikelig ved 24 og 36 timer etter eksponering. Dermed reflekterer kjemokin- og cytologiske profiler betydelig leukocyttmobilisering fra benmargsrommene (tabell 2).

Vår dyremodell og forskningsfunn er avgjørende med tanke på den virkelige verden situasjoner der levende vesener i urbane omgivelser er sannsynlig utsatt for slike sub-kliniske O3 og smittsomme stoffer8. Vår murine modell fungerer som en lett tilgjengelig prototype som kan reproduseres i nivå 2 inneslutningslaboratorier for å studere lunge- og ekstrapulmonale mekanismer for invasiv celledød og infeksjoner, som det er tilfelle med COVID-19-infeksjoner29. Fremtidige studier bør rettes mot visualisering av reparasjon eller senfaseoppfølging samt kronisk eksponering for å undersøke de langsiktige cellulære tilpasningene. For omfattende lungebetennelsesstudier som involverer levende organ15 og dyr16,30,31 avbildningsteknikker, kan den nåværende end-point studiedesignen gi viktig innsikt i vertsresponsen på kombinert lavdose O3 (celledød) og LPS (immunstimulering), og dermed dechiffrere mekanismene for akutt lungeskade.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter eller avsløringer å komme med.

Acknowledgments

Forskningen som utføres er finansiert av presidentens NSERC-tilskudd samt oppstartsmidler fra Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation. Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation er finansiert av Innovation Saskatchewan. Fluorescensavbildning ble utført ved WCVM Imaging Centre, som er finansiert av NSERC. Jessica Brocos (MSc Student) og Manpreet Kaur (MSc Student) ble finansiert av oppstartsfondene fra Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
33-plex Bioplex chemokine panel Biorad 12002231
63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives Leica HCX PL APO CS (11506188)
Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Invitrogen A11045
Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Invitrogen A11002
Alexa 488 conjugated phalloidin Invitrogen A12370
Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1A Millipore 05-829X-555
Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L) Invitrogen A21112
Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L) Invitrogen A11077
Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen A21070
Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa BD Pharmingen 553343
C57BL/6 J Mice Jackson Laboratories 64
Confocal laser scanning microscope Leica Leica TCS SP5
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) Invitrogen D1306 aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C
Inverted fluorescent wide field microscope Olympus Olympus IX83
Ketamine (Narketan) Vetoquinol 100 mg/ml Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock
Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit Invitrogen L3224
Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9) Invitrogen 459240
Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1) Invitrogen A-21351
Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136) Invitrogen 16-5941-82
Pierce 660 nm protein assay Thermoscientific 22660
Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG Abcam ab2904
Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880) Invitrogen 14-6093-81
Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa Invitrogen 14-5698-82
Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8) Invitrogen 16-9668-82
Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5) Invitrogen 53-5931-82
Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2) BD Pharmingen 553142
Reduced mitotracker orange Invitrogen M7511
Xylazine (Rompun) Bayer 20 mg/ml Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhattacharya, J., Matthay, M. A. Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury. Annual Review of Physiology. 75, 593-615 (2013).
  2. Aulakh, G. K. Neutrophils in the lung: "the first responders". Cell Tissue Research. , (2017).
  3. Aulakh, G. K., Suri, S. S., Singh, B. Angiostatin inhibits acute lung injury in a mouse model. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (1), 58-68 (2014).
  4. Schneberger, D., Aulakh, G., Channabasappa, S., Singh, B. Toll-like receptor 9 partially regulates lung inflammation induced following exposure to chicken barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 11 (1), 1-10 (2016).
  5. Shah, D., Romero, F., Stafstrom, W., Duong, M., Summer, R. Extracellular ATP mediates the late phase of neutrophil recruitment to the lung in murine models of acute lung injury. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 152-161 (2014).
  6. Aulakh, G. K., Balachandran, Y., Liu, L., Singh, B. Angiostatin inhibits activation and migration of neutrophils. Cell Tissue Research. , (2013).
  7. Cakmak, S., et al. Associations between long-term PM2.5 and ozone exposure and mortality in the Canadian Census Health and Environment Cohort (CANCHEC), by spatial synoptic classification zone. Environment International. 111, 200-211 (2018).
  8. Dauchet, L., et al. Short-term exposure to air pollution: Associations with lung function and inflammatory markers in non-smoking, healthy adults. Environment International. 121, Pt 1 610-619 (2018).
  9. Delfino, R. J., Murphy-Moulton, A. M., Burnett, R. T., Brook, J. R., Becklake, M. R. Effects of air pollution on emergency room visits for respiratory illnesses in Montreal, Quebec. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 568-576 (1997).
  10. Peterson, M. L., Harder, S., Rummo, N., House, D. Effect of ozone on leukocyte function in exposed human subjects. Environmental Research. 15 (3), 485-493 (1978).
  11. Rush, B., et al. Association between chronic exposure to air pollution and mortality in the acute respiratory distress syndrome. Environmental Pollution. 224, 352-356 (2017).
  12. Rush, B., Wiskar, K., Fruhstorfer, C., Celi, L. A., Walley, K. R. The Impact of Chronic Ozone and Particulate Air Pollution on Mortality in Patients With Sepsis Across the United States. Journal of Intensive Care Medicine. , (2018).
  13. Stieb, D. M., Burnett, R. T., Beveridge, R. C., Brook, J. R. Association between ozone and asthma emergency department visits in Saint John, New Brunswick, Canada. Environmental Health Perspectives. 104 (12), 1354-1360 (1996).
  14. Thomson, E. M., Pilon, S., Guenette, J., Williams, A., Holloway, A. C. Ozone modifies the metabolic and endocrine response to glucose: Reproduction of effects with the stress hormone corticosterone. Toxicology and Applied Pharmacology. 342, 31-38 (2018).
  15. Aulakh, G. K., Brocos Duda, J. A., Guerrero Soler, C. M., Snead, E., Singh, J. Characterization of low-dose ozone-induced murine acute lung injury. Physiological Reports. 8 (11), 14463 (2020).
  16. Aulakh, G. K., et al. Quantification of regional murine ozone-induced lung inflammation using [18F]F-FDG microPET/CT imaging. Scientific Reports. 10 (1), 15699 (2020).
  17. Charavaryamath, C., Keet, T., Aulakh, G. K., Townsend, H. G., Singh, B. Lung responses to secondary endotoxin challenge in rats exposed to pig barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 3, London, England. 24 (2008).
  18. Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation. Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).
  19. Southam, D. S., Dolovich, M., O'Byrne, P. M., Inman, M. D. Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position, and anesthesia. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 282 (4), 833-839 (2002).
  20. Aulakh, G. K. Lack of CD34 produces defects in platelets, microparticles, and lung inflammation. Cell Tissue Research. , (2020).
  21. Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone. Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).
  22. Yipp, B. G., et al. The Lung is a Host Defense Niche for Immediate Neutrophil-Mediated Vascular Protection. Science Immunology. 2 (10), (2017).
  23. Lee, T. Y., et al. Angiostatin regulates the expression of antiangiogenic and proapoptotic pathways via targeted inhibition of mitochondrial proteins. Blood. 114 (9), 1987-1998 (2009).
  24. Hawkins, C. L., Davies, M. J. Detection, identification, and quantification of oxidative protein modifications. Journal of Biological Chemistry. 294 (51), 19683-19708 (2019).
  25. Hemming, J. M., et al. Environmental Pollutant Ozone Causes Damage to Lung Surfactant Protein B (SP-B). Biochemistry. 54 (33), 5185-5197 (2015).
  26. Oosting, R. S., et al. Exposure of surfactant protein A to ozone in vitro and in vivo impairs its interactions with alveolar cells. American Journal of Physiology. 262 (1), Pt 1 63-68 (1992).
  27. Roth, S., et al. Secondary necrotic neutrophils release interleukin-16C and macrophage migration inhibitory factor from stores in the cytosol. Cell Death & Discovery. 1, 15056 (2015).
  28. Kawaguchi, N., Zhang, T. T., Nakanishi, T. Involvement of CXCR4 in Normal and Abnormal Development. Cells. 8 (2), (2019).
  29. Gupta, A., et al. Extrapulmonary manifestations of COVID-19. Nature Medicine. 26 (7), 1017-1032 (2020).
  30. Aulakh, G. K., Kuebler, W. M., Singh, B., Chapman, D. 2017 IEEE Nuclear Science Symposium and Medical Imaging Conference (NSS/MIC). , 1-2 (2017).
  31. Aulakh, G. K., et al. Multiple image x-radiography for functional lung imaging. Physics in Medicine & Biology. 63 (1), 015009 (2018).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 169 ozon LPS akutt lungebetennelse F1F0 ATP-syntase (kompleks V) underenheter immunfluorescerende cytologi IL-16
Visualisering av lungecelletilpasninger under kombinert ozon og LPS indusert Murine akutt lungeskade
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Duda, J. A. B., Kaur, M., Aulakh, G. … More

Duda, J. A. B., Kaur, M., Aulakh, G. K. Visualizing Lung Cellular Adaptations during Combined Ozone and LPS Induced Murine Acute Lung Injury. J. Vis. Exp. (169), e62097, doi:10.3791/62097 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter