Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Визуализация клеточной адаптации легких во время комбинированного озона и ЛПС-индуцированного острого повреждения легких

Published: March 21, 2021 doi: 10.3791/62097
Automatic Translation
1, 1, 1
1Small Animal Clinical Sciences, Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan

Summary

Комбинированные мыши, подвергшиеся воздействию озона и бактериального эндотоксина, демонстрируют широко распространенную гибель клеток, в том числе нейтрофилов. Мы наблюдали клеточные адаптации, такие как нарушение цитоскелетной ламеллиподии, повышенная клеточная экспрессия комплекса V АТФ-синтазы субъединиц β и ангиостатина в бронхо-альвеолярном лаваже, подавление иммунного ответа легких и задержка набора нейтрофилов.

Abstract

Легкие постоянно сталкиваются с прямыми и косвенными инсультами в виде стерильных (частицы или реактивные токсины) и инфекционных (бактериальных, вирусных или грибковых) воспалительных состояний. Подавляющая реакция хозяина может привести к скомпрометированному дыханию и острому повреждению легких, которое характеризуется рекрустацией нейтрофилов легких в результате пато-логического ответа хозяина на иммунную, коагулятивную и тканевую реакцию ремоделирования. Чувствительные микроскопические методы визуализации и количественной оценки клеточных адаптаций легких мыша в ответ на низкие дозы (0,05 ppm) озона, мощного загрязнителя окружающей среды в сочетании с бактериальным липополисахаридом, агонистом TLR4, имеют решающее значение для понимания воспалительных и восстановительных механизмов хозяина. Описан комплексный флуоресцентный микроскопический анализ различных легочных и системных компартментов тела, а именно бронхо-альвеолярной лаважной жидкости, перфузата сосудов легких, криосекций левого легкого и перфусата грудинного костного мозга. Показаны повреждения альвеолярных макрофагов, нейтрофилов, паренхималенной ткани легких, а также клеток костного мозга в корреляции с замедленным (до 36-72 ч) иммунным ответом, который характеризуется дискретными градиентами хемокина в анализируемых компартментах. Кроме того, представлены внеклеточные матриксы легких и клеточные цитоскелетные взаимодействия (актин, тубулин), митохондриальные и реактивные формы кислорода, антикоагулятивный плазминоген, его антиангиогенный пептидный фрагмент ангиостатин, субъединицы митохондриального АТФ-синтазы V, α и β. Эти суррогатные маркеры, когда они дополняются адекватными клеточными анализами in vitro и методами визуализации животных in vivo, такими как прижизальная микроскопия, могут предоставить жизненно важную информацию для понимания реакции легких на новые иммуномодулирующие агенты.

Introduction

Острое повреждение легких (АЛИ) является важнейшей патологической реакцией легких на инфекционные или другие вредные раздражители, которая характеризуется одновременной активацией коагулятивной, фибринолитической и врожденной иммуннойсистем1. Нейтрофилы быстро ощущают микробные, а также внутриклеточные повреждения через семейство Toll-подобных рецепторов (TLR)2,3,4. Нейтрофилы высвобождают предварительно сформированные цитокины и цитотоксическое содержимое гранул, которые затем могут вызвать повреждение коллатерального ткани. Последующее альвеолярное повреждение омрачается вторичной гибелью клеток, приводящей к высвобождению молекул, таких как аденозинтрифосфат (АТФ)5,тем самым устанавливая порочный круг иммунной дисрегуляции.

Нерешенная проблема в понимании АЛИ связана с вопросом о том, как инициируется травма внутри альвеолярной мембраны. Электронный транспортный комплекс V, F1F0 АТФ-синтаза, представляет собой митохондриальный белок, который, как известно, экспрессируется повсеместно на клеточной (включая эндотелиальную, лейкоцитарную, эпителиальную) плазматической мембране во время воспаления. Клеточный цитоскелет, который состоит из актина и тубулина, содержит много клеточной формы и модуляции функции, а также митохондриальных белков, соответственно. Недавно мы показали, что блокада АТФ-синтазы эндогенной молекулой, ангиостатином, заглушает рекрут нейтрофилов, активацию и липополисахарид (ЛПС) индуцирует воспаление легких6. Таким образом, как биохимические (АТФ-синтаза), так и иммунные (TLR4) механизмы могут регулировать альвеолярный барьер во время воспаления легких.

Воздействие озона (O3),загрязнителя окружающей среды, ухудшает функцию легких, повышает восприимчивость к легочным инфекциям, а короткие низкие уровни воздействия O3 увеличивают риск смертности у людей с основными кардиореспираторными состояниями7,8,9,10,11,12,13,14. Таким образом, воздействие физиологически значимых концентрацийО3 обеспечивает содержательную модель АЛИ для изучения фундаментальных механизмов воспаления7,8. Наша лаборатория недавно установила мышиную модель низкодозного Индуцированного O3 ALI15. После выполнения дозы и временного ответа на низкие концентрации O3 мы наблюдали, что воздействие 0,05 ppm O 3 в течение2 ч вызывает острое повреждение легких, которое характеризуется субъединицей β субъединица V атфсинтазы легких (ATPβ) и экспрессией ангиостатина, аналогично модели ЛПС. Прижизненная визуализация легких выявила дезорганизацию альвеолярных актиновых микрофиламентов, указывающих на повреждение легких, и абляцию альвеолярных септальных активных форм кислорода (АФК) (что указывает на отмену исходной клеточной сигнализации) и митохондриального мембранного потенциала (указывающего на острую гибель клеток) после 2 ч воздействия 0,05 ppm O315, что коррелировало с гетерогенным легочным 18удержанием FDG16,рекрутированием нейтрофилов и высвобождением цитокинов, в первую очередь IL-16 и SDF-1α. Вывод из наших недавних исследований заключается в том, что O3 вызывает экспоненциально высокую токсичность при воздействии в концентрациях ниже допустимых пределов 0,063 ppm в течение 8 ч (в день) для воздействия на человека. Важно отметить, что не существует четкого понимания того, могут ли эти субклинические воздействия O3 модулировать TLR4-опосредованные механизмы, такие как бактериальный эндотоксин17. Таким образом, мы изучили модель воздействия O3 и LPS с двойным ударом и наблюдали иммунную и неиммунные клеточные адаптации.

Мы описываем комплексный флуоресцентный микроскопический анализ различных легочных и системных компартментов тела, а именно бронхо-альвеолярной лаважной жидкости (т.е. BAL), которая пробует альвеолярные пространства, перфусат сосудов легких (т.е. LVP), который пробует легочную сосудистую сосудистую систему и альвеолярную перегородку интерстиций в случае компрометированного эндотелиального барьера, криосекций левого легкого, чтобы изучить резидентные паренхиматозные и адгезивные лейкоциты, оставшиеся в лавированной легочной ткани , периферическая кровь, которая представляет собой циркулирующие лейкоциты и перфузаты грудины и бедренного мозга, которые пробуют проксимальные и дистальные участки мобилизации кроветворных клеток во время воспаления, соответственно.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Дизайн исследования был одобрен Советом по этике исследований животных Университета Саскачевана и соответствовал руководящим принципам Канадского совета по уходу за животными для гуманный использование животных. Были приобретены шести-восьминедельные самцы мышей C57BL/6J. ПРИМЕЧАНИЕ: Усыпьте любых животных, у которых развивается тяжелая летаргия, респираторный дистресс или другие признаки тяжелого дистресса до запланированной конечной точки.

ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте следующее: 27-18 г иглы с затуплением (будет зависеть от диаметра трахеи мыши), полиэтиленовую трубку соответствующего размера, чтобы соответствовать тупой игле (сделайте ПЭ-канюлю для каждой мыши), канюлю, 2 острых ножница, 2 тупых щипца (маленькие), 1 острый щипц (маленький), 3 шприца 1 мл, меченые микрофузионные трубки (для сбора перфусата BAL, крови, сосудов и костного мозга) и маркированные флаконы (для фиксации тканей), пакеты для образцов / криовиалы для сбора тканей, рулон хлопчатобумажной нити мясника (разрезанный на лигатуры соответствующего размера). Все химические вещества, используемые для экспериментов, указаны в Таблице материалов.

1. Воздействие озона и ЛПС для индукции повреждения легких мысей

  1. Воздействие озона
    1. Подготовьте собственную индукционную коробку O3. Добавьте корм для мышей, бутылку с водой, игрушки для обогащения и чистую подстилку, чтобы имитировать среду содержания мышей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги обеспечат мышам свободный доступ к пище и воде при размещении в специальном индукционном ящике и помогут облегчить чрезмерный стресс.
    2. Включите калибратор/генератор O3 (расположенный по направлению к входному порту) для стабилизации УФ-лампы перед рукой (примерно за 15 минут до экспозиции) и подключитесь к встроенному монитору O3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Монитор O3 должен считывать в среднем 0,05 ppm, как проба взята из выходного отверстия при постоянной температуре воздуха в камере (72 ±3 °F) и относительной влажности (50±15%).
    3. Для воздействияO3 осторожно поместите мышей в специальный индукционный ящик и непрерывно подвергайте мышей воздействию 0,05 ppm O3 в течение 2 ч.
  2. Анестезия и интраназальное введение ЛПС
    1. Подготовьте 10 мг/мл для кетамина и ксилазина отдельно.
    2. Приготовьте коктейль, смешав 20 частей кетамина и 1 часть ксилазина. Если мышь весит X г, введите (X/200) мл коктейля кетамина/ксилазина в брюшинную полость. Для одной мыши приготовьте 1 мл коктейля, состоящего из 1000 мкл запаса кетамина 10 мг/мл и 50 мкл запаса ксилазина. Хорошо перемешайте, пипеткой вверх и вниз в микрофунке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Запасы кетамина и ксилазина могут быть приготовлены за неделю.
    3. Обезболивают мышей под легкой внутрибрюшинной (IP) смесью кетамина (50 мг/кг)/ксилазина (1 мг/кг) (например, для мыши с 25 г вводят 0,125 мл коктейля).
    4. Приготовьте 1 мг/мл раствора ЛПС в физиологическом растворе и заполните 50 мкл раствора в пипетке.
    5. Держите мышь вертикально спиной/спинной стороной на ладони, держа уши той же рукой. Теперь поместите 50 мкл раствора LPS18 осторожно вне ноздрей (т. Е. 25 мкл на каждую ноздрю или 50 мкл в одну ноздрю; не имеет значения, пока процедура быстрая) и позвольте мышам вдохнуть раствор LPS.
    6. Закапывать контрольным мышам 50 мкл стерильного физиологического раствора.
      Внимание:Не превышайте более 100 мкл для инстилляции, которая может привести к летальному исходу. Слишком меньший объем (т.е. <50 мкл) и существует риск только носового отложения.
    7. После введения ЛПС осторожно уложите мышей либо на живот, либо на спину на насыпь подстилки с головой, слегка наклонено вниз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Такая ориентация продлевает удержание раствора в носовой полости19.
    8. Через 0, 2, 4, 24, 36 и 72 ч после воздействия обезболивают мышей, т.п., полной дозой кетамина (200 мг/кг)/ксилазина (4 мг/кг) (т.е. Х/50 мл коктейля, где X - вес мыши в граммах или 0,50 мл для мыши весом 25 г).
    9. Наблюдайте за мышью до тех пор, пока она не потеряет сознание и правый рефлекс (т.е. не поворачивается назад при укладке в лежачем положении). Теперь проверьте мышь на глубину анестезии, контролируя дыхание (ритмичные экскурсии грудной клетки) и частоту сердечных сокращений, которая должна заметно упасть, через 1-2 минуты.
    10. Затем проверьте наличие педальных рефлексов, то есть зажмите любой из пальцей задних конечностей и наблюдайте за втягиванием конечности, как рефлекс. Если мышь реагирует, пополните их дополнительными инъекциями 0,1 мл или более, по мере необходимости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы достичь глубокой анестезии, имейте в виду, что определенные штаммы или мыши с ожирением обычно имеют больший объем распределения и, таким образом, могут быть легко передюзоированы, если не допускается достаточное время для полной анестезии (которая может составлять около 10 минут или более). Соответственно, некоторые штаммы могут быть устойчивыми к анестезии и, следовательно, требуют большего пополнения. Эти знания приобретаются после многих практических наблюдений и опыта работы с мышами разных штаммов и возраста. Поскольку несколько пилотных экспериментов также были проведены сразу после воздействия O3 и LPS (т. Е. В точке времени 2 часа), мы также включили некоторый очень ранний анализ клеток BAL из этих экспериментов, чтобы подчеркнуть непосредственные эффекты комбинированного воздействия O3и LPS.

2. Сбор образцов

  1. Поместите мышь на хирургический лоток. Теперь аккуратно наденьте смазывающую глазную мазь на оба глаза, чтобы избежать потери жидкости, и продезинфицируйте мышь с помощью 70% этанолового спрея.
    1. Сделайте ножницами небольшие надрези через верхнюю и нижнюю оболочки кожи, обнажите трахею и грудную клетку.
    2. Сделайте разрез чуть ниже грудины и обнажите сердце.
  2. Пункция сердца
    1. Поместите иглу 25G, прикрепленную к гепаринизированному шприцу, в правый желудочек и проколите кровь путем пункции сердца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кровь обычно черпает с минимальным плунжерным вытягиванием, если время от воздействия сердца на прокол сердца составляет менее минуты. После сбора около 0,4-0,5 мл может потребоваться пауза на несколько секунд, прежде чем собирать оставшуюся кровь. Это делается для того, чтобы позволить сердцу перекачивать любой оставшийся объем в правую желудочковую камеру. К концу сбора крови сердце перестает качать.
    2. Соберите кровь и храните в микрофьюжных пробирках для дальнейшей обработки.
  3. Трахеостомия
    1. Осторожно используйте пинцет / тупые щипцы, чтобы очистить область трахеи от вышележдающей ткани. Используйте руки в перчатках больше, чем хирургические инструменты, чтобы избежать кровотечения. Если сочится много крови, существует риск заражения образцов BAL. Используйте ватные тампоны, если это необходимо, хотя и не предпочтительно. Kimwipes - лучшие альтернативы.
    2. Теперь прорежьте грудную клетку, чтобы обнажить легкие. Опять же, будьте осторожны, чтобы не перерезать грудину и межребрюшные артерии или восходящую аорту; делать меньшие надрезы при продвижении через грудную клетку)
    3. Пропустите ватную лигатуру ниже среза трахеи и оставьте как таковую на время.
    4. Срежьте трахею в подходящем месте в дистальной 1/3-й части, указывая на легкие, чтобы обеспечить доступ для трахеальной канюли 28 г.
    5. Вставьте в трахею канюлю 28 г ПЭ (минимальная длина 3-5 мм и дистальный конец, обрезанный для удобства введения). Следите за концом трахеи перед бифуркацией, а затем потяните около миллиметра назад, чтобы избежать отбора проб только одной доли.
    6. Прочно завяжите хлопчатобумажную лигатуру, чтобы удерживать канюлю на месте. Не разрушайте канюлю.
  4. Бронхо-альвеолярное лаваж (BAL)
    1. Заполните 0,5 мл PBS в шприц 1 мл.
    2. Теперь постепенно вводят 0,5 мл ПБС в канюлю с помощью шприца 1 мл.
    3. После инъекции PBS аспирировать шприц до тех пор, пока он не сопротивляется всасыванию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если есть сопротивление при аспирации жидкости BAL, это указывает на коллапс альвеолярной или бронхиальной ткани. В этом случае оттяните канюлю крошечным способом, чтобы отсоединать канюлю от стенок ткани.
    4. Соберите аспирированную жидкость в меченую микрофьюжную трубку и поместите на лед.
    5. Выполните еще два промывания аналогичным образом, собирая в один и тот же флакон (т.е. в общей сложности 0,5 X 3 = 1,5 мл лаважа).
    6. Измерьте объем собранной жидкости BAL. Восстановление лаважа должно быть близко к 90%.
  5. Перфусат сосудов легких (LVP)
    1. Разрезайте нисходящую грудную аорту в месте между грудной и брюшной половинами, чтобы избежать любого резервирования перфузата в легких при перфузии через правый желудочек.
    2. Промокните полость возле разрезанной аорты, свободной от крови.
    3. Затем перфузировать легкие 0,5 мл гепаринизированного физиологического раствора комнатной температуры, вводимого через правый желудочек.
    4. Соберите сосудистую перфусат из полости на разрезанном конце нисходящей грудной аорты, в микрофьюжную трубку, помещенную на лед и измерьте ее объем.
    5. Обливать правый бронх проксимально к его ответвлениям от трахеи (хлопчатобумажной нитью).
  6. Фиксация in situ левого легкого
    1. Подключите шприц 1 мл к канюле трахеи, который достаточно длинный, чтобы вставить через предыдущий разрез трахеи.
    2. Оттягивайте воздух в шприц до отметки 0,6 мл.
    3. Затем заполните оставшийся шприц (до самого конца) 2% параформальдегидом при комнатной температуре. Убедитесь, что плунжер готов выскочить, не всасывая обратно воздух из канюли.
    4. Теперь прикрепите шприц скотчем, к вертикальному контейнеру, высотой до 20 см.
    5. Осторожно вытяните поршень наружу, чтобы фиксатор тек к трахее. Если в канюле есть несколько пузырьков воздуха, аккуратно поместите поршень поверх шприца, и жидкость начнет течь через несколько секунд.
    6. Дайте левому легкому надуться до общей емкости insitu, в течение 5 минут, с высоты 20 см, образуя 20 см водяной столб.
    7. Во время этой процедуры обязательно защитите правые доли легких от контакта с параформальдегидом, так как это повлияет на последующие анализы.
    8. Поместите сложенные лабораторные ткани, чтобы поглотить любой параформальдегид, который может вступить в контакт с правыми долями легких.
      ВНИМАНИЕ: Параформальдегид очень токсичен. Поэтому не вдыхайте и не контактизовывайте с какими-либо открытыми частями тела. Соблюдайте крайнюю осторожность при обращении.
    9. Во время закапывания параформальдегида дезинфицируют живот.
    10. Отрежьте правые доли легких от трахеи, обязательно удалив любую нить, и немедленно поместите доли в меченый криовиал и опустите его в жидкий азот для последующего молекулярного / биохимического анализа цитокинов / ОТ-ПЦР / анализа вестерн-блотта гомогената легких.
    11. Осторожно обрежьте левое легкое для любой соединительной ткани или плевральных мембран и окуните его в 2% параформальдегид в течение 24 ч при 4 °C.
    12. Встраивание фиксированного легкого в парафин в соответствии со стандартным протоколом встраивания.
      Внимание:Не перегревайте образцы легких.
    13. Отрежьте брюшную часть и скиньте ее с тазовой (тазобедренной) кости.
    14. Отделите левую и правую бедренные кости от тазовой части, в заполненной физиологическим раствором чашке Петри, хранятся на льду.
  7. Сбор аспиратов грудинального и бедренного костного мозга
    1. Очистите ткани и мышцы от костей с помощью лабораторных тканей.
    2. Соберите вентральную грудную клетку и грудину в наполненную физиологическим раствором чашку Петри, храняшуюся на льду.
    3. Разрезают дистальные и проксимальные кончики грудинных и бедренных костей.
    4. Перфьмизировать кости 4 раза 0,5 мл физиологического раствора, используя хорошо подогнанные иглы (от 24 до 28 г) на шприцах по 1 мл, и собрать фракции из каждой кости в меченые трубки, снабженные фильтрами и помещенные на лед.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Игольчатый датчик варьируется в зависимости от размера животного. После покраснения бедренная кость должна быть прозрачной.
    5. После того, как образцы были собраны, поместите мышь в пластиковый пакет и поместите в морозильную камеру туши животного для надлежащей утилизации в соответствии с руководящими принципами институционального учреждения для животных.

3. Обработка образцов

  1. Общее (TLC) и дифференциальное (DLC) количество лейкоцитов
    1. Центрифуги периферической крови, БАЛ, легочного сосудистого перфузата и костного мозга (грудины и бедренной) пробы в течение 10 мин по 500 г.
    2. Соберите супернатанты, заморозьте их и храните при -80 °C до дальнейшего анализа.
    3. Восстановить клетки в минимальном 200 мкл PBS.
    4. Выполняют ТЛЦ путем подсчета БАЛ, крови, перфузата сосудов легких и клеток костного мозга на гемоцитометре.
    5. Окрашивают еще 9 мкл аликвоты БАЛ смесью 1 мкл кальцеина зеленого и красного этидия гомодимера-1 для количественной оценки живых (зеленых) клеток из-за активности внутриклеточной эстеразы и любых поврежденных клеток БАЛ (красным цветом) из-за потери целостности плазматической мембраны.
    6. Добавьте 2% уксусной кислоты для лиза эритроцитов в соотношении 1:10 для TLC крови и 1:2 для сосудистогоperfusate TLC в легких.
      ВНИМАНИЕ: Отрегулируйте концентрацию клеток путем разбавления в PBS, если концентрация составляет более 1x106 клеток на мл (очень важно для образцов костного мозга).
    7. Центрифугируйте клетки для получения цитоспинов на слайдах и окрашиваниях, как описано ниже для DLC. Подсчитайте минимум 100 клеток для дифференциального количества лейкоцитарных клеток (DLC).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, можно приготовить два цитоспина на одном слайде. А после 10-15 минут воздушной сушки приступают к этапу окрашивания.
    8. Разделите собранный BAL от трех пилотных мышей в группе на два цитоспина в каждой и окрашивание актина/ тубулина и митохондрий с активным окислительным фосфорилированием (восстановленный митотрекер). Используйте BAL еще от трех мышей, чтобы разделить их на два цитоспина каждая, для окрашенных слайдов NK1.1 / Gr1 / CX3CR1 и ATPβ / Ki-67 / CD61 / Angiostatin. Разделите BAL еще от трех мышей на два цитоспина каждая, чтобы окрасить для ATPα / Ly6G и CX3CR1 / Siglec-F.
  2. Бронхоальвеолярный лаваж (BAL) и суммарный анализ белка перфузата сосудов легких (LVP)
    1. Чтобы количественно оценитьвозмущения сосудистого барьера или относительного онкотического давления в двух легочных компартментах (т.е. альвеолярных перегородочных (интерстициальных) и легочных сосудистых перфузатных (сосудистых) компартментах), измерьте общее содержание белка в собранных жидкостях.
    2. Проанализируйте размороженные фракции супернатантов на их общую концентрацию белка с использованием стандартного колориметрического анализа, устойчивого к моющим средствам.
    3. Анализ бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) и перфузата сосудов легких (LVP) хемоцина
      1. Затем проанализируйте хемокины в СУПЕРНАТАНТАХ BAL и легочном сосудистом перфусате (LVP) с использованием 33-плексного магнитного иммуноанализа на основе шариков. Это позволит получить информацию о направленности градиентов дыхательных путей/интерстиций по сравнению с сосудистыми хемоцинами, установленными после комбинированных воздействий.
      2. Проанализируйте следующую панель хемокинов: CXCL13 (хемоаттактант В-лимфоцитов), CCL27 (IL-11 R-альфа-локус хемокин (ILC)), CXCL5 (эпителиальный нейтрофильный активирующий пептид 78 (ENA-78)), CCL-11 (эотаксин-1), эотаксин-2 (CCL-24), CX3CL1 (фракталкин), GM-CSF (CSF-2), CCL1, IFNγ (интерферон гамма), IL-10 (интерлейкин-10), IL-16 (интерлейкин-16), IL-1β (интерлейкин-1 бета), IL-2 (интерлейкин-2), IL-4 (интерлейкин-4), IL-6 (интерлейкин-6), CXCL-10 (интерферон гамма-индуцированный белок 10 (IP-10)), CXCL11 (интерферон-гамма-индуцируемый белок 9 (IP-9)), KC (кератиноцитарный хемоатрактант), MCP-1 (моноцитарный хемоаттактант-белок-1), MCP-3 (моноцитарный хемоаттрактант-белок-3), MCP-5 (моноцитарный хемоаттрактант-белок-5), MDC (макрофаговый хемокин (CCL22)), MIP-1α (макрофаг воспалительный белок-1 альфа), MIP-1β (макрофаговый воспалительный белок-1 бета), MIP-2 (макрофаговый воспалительный белок-2), MIP-3α (воспалительный белок макрофагов-3 альфа), MIP-3β (макрофаг воспалительный белок-1 бета), MIP-2 (воспалительный белок макрофагов-3 альфа), MIP-3β (макрофаг воспалительный воспалительный белок-3 белок-3 бета), RANTES (регулируется по активации, нормальные Т-клетки экспрессированы и секретированы (CCL5)), CXCL-16, CXCL-12 / SDF-1альфа (стромальный клеточный фактор 1), TARC (тимус и активация регулируемых хемоцин (TARC)), TECK (Thymus-экспрессированный хемоцин (CCL25)) и TNFα (фактор некроза опухоли альфа).

4. Окрашивание цитоспином и гистология легких

  1. Биохимическое окрашивание цитоспином
    1. Окружите цитоспины гидрофобной ручкой, чтобы содержать химические вещества для инкубации во время процедуры.
    2. Регидратировать цитоспины в PBS в течение 5 минут.
    3. Зафиксируйте образцы цитоспина в 2% параформальдегиде в течение 10 минут, промывайте три раза PBS в течение 5 минут каждый.
    4. Пермеабилизировать ледяным холодом 70% ацетона в течение 7 минут и снова трижды промыть PBS по 5 минут каждый.
    5. Окрашивание для актина и тубулина или восстановленного Митотрекера (инкубировать со смесью 2 мкг/50 мкл конъюгированного фаллоидина Alexa 488, показанного зеленым цветом, и 2 мкг/мкл Alexa 555 конъюгированного мышиного противоиндивного α тубулина или восстановленного Митотрекера, показанного красным цветом, соответственно) в течение 15 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте контрольное антитело к изотипу IgG1 мыши в отдельном цитоспине для проверки протокола окрашивания тубулина. Выполните те же действия, что и в разделе 4.1.1 -4.1.8, но для элементов управления изотипами.
    6. Удалите пятна, аккуратно опрокинули смесь с слайда. Инкубируют слайды с DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол) в течение 5-10 мин для окрашивания ядер.
    7. Промыть цитоспины 3 раза pBS в течение 5 мин каждый, обтекать анти-выцветшим монтажным носителем и хранить на ночь в темноте при комнатной температуре перед визуализацией.
    8. Получайте изображения под широкоугольным вертикальным микроскопом, оснащенным научной камерой. Обеспечьте стабильное время экспозиции камеры, установленное для различных флуоресцентных каналов при скольжении изображения.
  2. Иммунофлуоресцентное окрашивание цитоспином:
    1. Окружите цитоспины гидрофобной ручкой, чтобы содержать химические вещества для инкубации во время процедуры. Регидратировать цитоспины в PBS в течение 5 минут.
    2. Зафиксируйте образцы цитоспина, инкубируя в 2% параформальдегиде в течение 10 минут, промывайте три раза PBS в течение 5 минут каждый.
    3. Пермеабилизировать 0,1% холодным тритоном Х-100 в течение 2 минут, трижды промыть PBS по 5 мин каждый.
    4. Затем Fc блокируют в течение 15 минут путем инкубации цитоспина с развежением 1:50 запаса антител к блоку Fc (чтобы гарантировать, что первичное мышиное антитело не вступает в перекрестную реакцию не-специфически с антителами Fc мыши).
    5. Опрокидывайте слайды, чтобы удалить блок Fc и изменить до 1% BSA для и инкубировать цитоспин со смесью 3 первичных антител, представляющих интерес (см. Таблицу 1 для различных комбинаций) в течение 30 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно запускайте контрольные антитела изотипа (инкубируйте с помощью смеси мышиных IgG1 и крысиных IgG2b каппа первичных антител, выполняя шаги 4.2.1 - 4.2.9 и заменяя антитела контролем изотипов) параллельно с соответствующими вторичными антителами, как обсуждалось в нашем недавнем исследовании20.
    6. Промыть 3 раза PBS по 5 мин каждый. Инкубируйте цитоспины смесью надлежащим образом разработанных вторичных антител (см. Таблицу 1 для получения подробной информации).
    7. Удалите пятна, осторожно опрокинув смесь с горки, инкубируйте с DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол) в течение 5-10 мин до окрашивания ядер. Промыть 3 раза PBS по 5 мин каждый.
    8. Крышка с антивярающей монтажной средой и хранится на ночь в темноте при комнатной температуре перед визуализацией.
    9. Получайте изображения под широкоугольным вертикальным микроскопом, оснащенным научной камерой. Обеспечьте стабильное время экспозиции камеры, установленное для всех флуорофорных каналов при скольжении изображения.
  3. Гематоксилин и эозин (H&E) гистология
    1. Выполните модифицированное окрашивание H&E3 на крио-секциях легких для всех групп.
  4. Анализ изображений
    1. Обработка и анализ файлов данных изображений (.tiff) в открытом программном обеспечении Fiji ImageJ (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
    2. Проверьте необходимые параметры (Площадь, Периметр, Интегрированная плотность, Дескрипторы формы, Диаметр Фере, Цикличность, Метка дисплея), которые будут записаны на вкладке Анализ и Установить измерения.
    3. Используя менеджер ROI,вручную наметьте около 50-200 ячеек на объединенной панели изображений с помощью инструмента «выбор от руки». Сохраните интересующих области (ROI) с помощью команды Ctrl+T и скопируйте сохраненные ROI для каждой ячейки во все флуорофорные каналы.
    4. Затем нажмите Ctrl+M для измерения заданных параметров для всех флуоресцентных каналов (например, 405 нм (DAPI или ATPβ синим), 488 нм (актин или NK1.1 или Ki-67 зеленым), 568 нм (тубулин или Gr1 или CD61 красный) и 633 нм (CX3CR1 или ангиостатин в пурпурном цвете)).
    5. Сохраните файл Результаты как .csv под соответствующим именем, представляющим анализ. Скопируйте результаты из файла .csv в электронную таблицу и разделите интенсивность флуоресценции (FI) (которая является столбцом «Необработанная интегрированная плотность» из файла результатов) окрашенной молекулы на интенсивность DAPI или CD61 FI в соответствии с дизайном окрашивания. Эти соотношения называются «нормализованными соотношениями FI DAPI или CD61».
    6. Затем постройте график этих нормализованных соотношений, циркулярности, периметра ячейки и диаметра Ферета, чтобы оценить любое изменение размера ячейки после комбинированного воздействия O3 и LPS.
    7. Используйте соответствующее статистическое программное обеспечение для проверки нормальности собранных данных и проверки нулевой гипотезы (см. раздел статистического анализа ниже).
  5. статистический анализ
    1. Выражают результаты как среднее ± SEM. Минимум три мыши использовались в группе.
    2. Для анализа данных хемокина скорректируйте односторонние p-значения ANOVA для скорости ложного обнаружения в соответствии с поправкой Бенджамини и Хошберга.
    3. Анализируйте параметры изображения, клеточность, диаметр Ферета, периметр, dapi или CD61 нормализованные коэффициенты интенсивности флуоресценции с помощью теста Манна-Уитни U (для сравнения двух групп) или теста Крускала Уоллиса (для сравнения нескольких групп), поскольку эти данные обычно не распределялись.
    4. Для остальных экспериментов по визуализации проанализируйте результаты, используя односторонний анализ дисперсии, за которым последуют множественные сравнения Сидака. p-значения <0,05 были признаны значительными.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Комбинированноевоздействие O3 и LPS приводит к системному воспалению и мобилизации костного мозга через 72 ч: количество клеток в разных компартментах выявило значительные изменения в периферической крови и общем количестве клеток бедренного костного мозга при комбинированных воздействиях O3 и LPS. Хотя комбинированные воздействия O3 и LPS не индуцировали каких-либо изменений в общем количестве клеток BAL(Рисунок 1A)или LVP(Рисунок 1B),полиморфноядерные клетки, представленные как преобладающий тип клеток через 24(Рисунок 1F,Дополнительный рисунок 1),36 и 72 ч после воздействия. Обратите внимание на отсутствие окрашивания Siglec-f и CX3CR1 в полиморфноядерных клетках при 24 ч BAL цитоспиновом изображении(рисунок 1F). Тройное окрашивание цитоспинов BAL DAPI/CD11b/Gr1 показало наличие крупных CD11b- и Gr1-положительных мононуклеарных клеток, которые являются макрофагами через 0 ч, которые изменяются в более мелкие полиморфноядерные клетки, показывающие окрашивание пунктата Gr1, но лишенные окрашивания CD11b через 4 ч (как показано во вставке в Дополнительном 1F). Большинство клеток BAL являются полиморфонядерными и положительными как для CD11b, так и для Gr1, через 24 ч после воздействия(дополнительный рисунок 1).

У мышей наблюдался системный лейкоцитоз через 24 ч (в 3,3 раза против 0 ч, p<0,05, рисунок 1C),за которым следовала лейкопения через 72 ч, которая была отмечена 13-кратным снижением количества в периферической крови по сравнению с 24 ч (p<0,01) и в 8,6 раза ниже по сравнению с 4 ч (p<0,05) после комбинированного воздействия O3 и LPS(Рисунок 1C). Клетки грудиного костного мозга также не изменились по сравнению с 0 ч или после комбинированного воздействия O3 и LPS(рисунок 1D). Подсчет костного мозга бедренной кости показал поздний 28,8-кратный всплеск через 72 ч по сравнению с 0 ч (p<0,01, рисунок 1E),а также другими временными точками (p<0,01, рисунок 1E). Визуализация LVP и стернальных, а также бедренных клеток костного мозга также показала изменения типов клеток до преимущественно полиморфноядерных клеток(дополнительный рисунок 1). Клетки грудинчатого костного мозга показали признаки повреждения, о чем свидетельствует внеклеточный ядерный материал. Бедренный костный мозг показал более высокое количество CD11b и Gr1 положительных клеток(дополнительный рисунок 1),которые совпадают с количеством клеток.

Общее содержание белка BAL было самым высоким через 36 ч после комбинированного воздействия O3 и LPS: Количественная оценка общих белков в компартментах LVP и BAL была проведена для корреляции озоноиндуцированного отека легких, т.е. экссудации белка плазмы из-за результирующего нарушения сосудистого и эпителиального барьера из-за комбинированного воздействия. Общий белок BAL был в 4,5 раза выше через 36 ч (p<0,05) по сравнению с 4 ч(рисунок 2A). Однако белок LVP не изменился после воздействия(рисунок 2B).

Комбинированное воздействие O3 и LPS индуцирует сильные градиенты хемоцина в сосудистом компартменте легких, а не BAL: анализы мультиплекса Chemokine проводились как на супернатантах BAL, так и на LVP. Обратите внимание, что относительные различия между этими двумя отсеками представляют собой предпочтительное удержание в конкретном отсеке. Эозинофил хемоаттрактантант эотаксин-2 был в 4,3 раза выше через 4 ч в отсеке LVP по сравнению с 0 ч (p<0,05, рисунок 3A). В отсеке BAL эотаксин-2 был в 3,2 раза ниже через 4 ч по сравнению с 0 ч (p<0,01, рисунок 3B). Уровни бейл-эотаксина-2 продолжали последовательно снижаться до 72 ч с 12,6-кратным снижением по сравнению с 0 ч (p<0,01, рисунок 3B). Лимфоцитарный хемоаттрактант IL-2 был в 10,1 раза выше через 4 ч в отсеке LVP по сравнению с 0 ч (p<0,05, рисунок 3C). В отсеке BAL Ил-2 был в 5,0 раза ниже через 36 ч по сравнению с 0 ч (стр<0,05, рисунок 3D). Уровни бейл-эотаксина-2 продолжали последовательно снижаться в 5,9 раза через 72 ч по сравнению с 0 ч (p<0,05, рисунок 3D).

Интересно, что многие хемокины были изменены через 4 ч, в LVP, а не в BAL. Большинство из этих хемокинов показали скромное, но значительное увеличение уровня LVP через 4 ч по сравнению с более поздними временными точками. Хотя уровни эотаксина-1 не были высокими после воздействия по сравнению с 0 ч, но уровни были значительно высокими через 4 ч по сравнению с 24 (в 2,7 раза, p<0,05) и 72 ч (в 5,0 раза, p<0,01, рисунок 4A)после комбинированного воздействия. Уровни LVP TNFα были в 3,4 раза выше через 4 ч по сравнению с 36 ч (p<0,05, рисунок 4B). Аналогичным образом, LVP IFNγ был в 2,9 раза выше через 4 ч по сравнению с 72 ч (p<0,05, рисунок 4C). Уровни CX3CL1 также были высокими через 4 ч по сравнению с 24 (1,7-кратными, p<0,05), 36 (1,6-кратными, p<0,05) и 72 ч (2,2-кратными, p<0,01) после комбинированных воздействий(рисунок 4D). Уровни CCL27 также показали более высокие уровни через 4 ч по сравнению с 24 (в 2,7 раза, p<0,05), 36 (в 3,9 раза, p<0,01) и 72 ч (в 2,9 раза, p<0,05) после комбинированных воздействий(рисунок 4E).

Некоторые хемокины имели сильное присутствие в LVP через 4 ч после комбинированных воздействий и не изменялись в BAL до и после воздействия, что указывает на сильный хемокиновый ответ от легочных капилляров. Через 4 ч уровни IL-16 LVP были в 3,4 раза больше по сравнению с 0 ч (p<0,01), в 3,2 раза по сравнению с 24 ч (p<0,01), в 4,5 раза по сравнению с 36 ч (p<0,01) и в 4,6 раза по сравнению с 72 ч (p<0,01) после комбинированных воздействий(рисунок 4F). Через 4 ч уровни нейтрофильного хемокина CXCL5 LVP были в 2,0 раза по сравнению с 0 ч (p<0,01), в 4,7 раза по сравнению с 24 ч (p<0,01), в 2,2 раза по сравнению с 36 ч (p<0,01) и в 2,7 раза по сравнению с 72 ч (p<0,01) после комбинированных воздействий(рисунок 4G). Через 4 ч уровни CXCL10 LVP были в 2,3 раза больше по сравнению с 0 ч (p<0,01), в 2,1 раза по сравнению с 24 ч (p<0,05), в 2,5 раза по сравнению с 36 ч (p<0,01) и в 2,7 раза по сравнению с 72 ч (p<0,01) после комбинированных воздействий(рисунок 4H). Через 36 ч уровни нейтрофильного хемокина SDF1α LVP были в 4,2 раза больше по сравнению с 0 ч (p<0,01), в 2,9 раза по сравнению с 24 ч (p<0,05), в 6,8 раза по сравнению с 72 ч (p<0,01) после комбинированных воздействий(рисунок 4I). Через 4 ч уровни MIP3β LVP были в 2,3 раза больше по сравнению с 0 ч (p<0,05) и в 2,3 раза по сравнению с 72 ч (p<0,05) после комбинированных воздействий(рисунок 4J).

Комбинированное воздействие O3 и LPS вызывает некроз, нарушает клеточную цитоскелетную, плазматическую мембрану и митохондриальную целостность: поскольку количество компартментальных лейкоцитов и содержание белка не коррелировали с градиентами хемокина LVP, стало более важным визуализировать клетки, полученные из этих компартментов. Окрашивание ex vivo актином/тубулином исходных (0 ч) клеток BAL показало наличие кортикального актина, стрессовых волокон, а также ламеллиподий (показано зеленым цветом, рисунок 5, левая верхняя панель) и сети микротрубочек (показано красным, рисунок 5 левая верхняя панель), что совпало с уменьшением окрашивания митотрекера, указывающего на наличие активных митохондрий (показано красным, рисунок 5 левой нижней панели). Более 95% клеток BAL были мононуклеарными на исходном уровне. Через 4 ч клетки BAL показали внеклеточный ядерный материал, пунктатное цитоплазматическое окрасление актином, лишенное ламеллиподии и уменьшенное окрашивание кортикального актина (показано зеленым цветом, рисунок 5, правая верхняя панель), раздуваемая сеть микротрубочек (показана красным цветом, рисунок 5 правая верхняя панель), что не соответствовало уменьшенному окрашиванию митотокера (показано красным, рисунок 5 левая правая панель). Анализ нормализованной интенсивности флуоресцентной интенсивности актина DAPI показал снижение соотношения в 3,7 раза, что указывает на снижение окрашивания актина через 4 ч после воздействия (p<0,01, рисунок 6A). Аналогичным образом, DAPI нормализовала интенсивность флуоресцентной лампы тубулина, также снизилась в 1,5 раза после воздействия (p<0,01, рисунок 6B),что указывает на снижение окрашивания тубулина. Потеря ламеллиподии проявлялась при увеличении циркулярности цитоскелета BAL клеточного цитоскелета сразу, т.е. через 2 ч (p<0,01, фиг.6C)и 4 ч (p<0.05, Фиг.6C)после воздействия по сравнению с 0 ч и снижение циркулярности цитоскелета через 24 (p<0.05) и 36 ч (p<0.01) после воздействия, по сравнению с 0 ч(Фиг.6С).

До 24 ч клетки BAL от комбинированного воздействия были вдвойне положительными для кальцеина (зеленым цветом, рисунок 7),что указывает на наличие активной активности эстеразы, и гомодимера этидия (красным цветом, рисунок 7),что указывает на то, что, хотя некоторые клетки были мертвы (красные), большинство из них были частично скомпрометированы клетками. Через 36 ч клетки BAL были в значительной степени жизнеспособными (зеленый), что указывает на замену скомпрометированных клеток лейкоцитами, набранными из других системных компартментов(рисунок 7).

Специфическое окрашивание КЛЕТОК BAL АТФα и Ly6G выявило дискретную внутриклеточную локализацию(фильмы 1 и 2)как белков в альвеолярных макрофагах, так и нейтрофилов после воздействия(рисунок 7). Комбинированное воздействие привело к снижению нормализованного коэффициента интенсивности флуоресцентной интенсивности DAPI АТФα(Фиг.7,8А)и увеличению внутриклеточного содержания белка Ly6G(Фиг.7, Фиг.8В,Фильмы 1 и 2). Снижение окрашивания АТФα через 24 ч после воздействия коррелировало с более низким тубулином и в некоторой степени уменьшало окрашивание митотрекером. Мы также наблюдали ануклеарные АТФα-положительные клеточные тела после воздействия, которые могут быть тромбоцитами. Однако мы не подтвердили наши выводы. Через 2 ч мы наблюдали меньшие мононуклеарные клетки BAL (p<0,01 Рисунок 8C,p<0,01 Рисунок 8D)по сравнению с 0 ч, но через 4 ч моноядерные клетки были больше (p<0,01 Рисунок 8C,p<0,01 Рисунок 8D)по сравнению с 0 ч. При 24 (p<0.01 Рисунок 8C,p<0.01 Рисунок 8D)и 36 ч (p<0.01 Рисунок 8C,p<0.01 Рисунок 8D)клетки BAL постепенно уменьшились из-за сдвига в сторону полиморфноядерных клеток по сравнению с 0 ч.

Иммунофенотипирование клеток BAL выявило переходные экспрессии NK1.1, АТФ β и Ki-67 и устойчивые экспрессии Gr1, CX3CR1 и ангиостатин-положительных BAL-клеток после комбинированных воздействий O3 и LPS: иммунофлуоресцентное окрашивание первого набора цитоспинов BAL было нормализовано до окрашивания DAPI. Наблюдалось увеличение клеточных NK1.1 положительных клеток через 24 ч (р<0,05 против 0 ч, рисунок 9,10А). Через 36 ч клетки BAL имели более низкую клеточную интенсивность флуоресценции NK1.1 (p<0,01 против 0 и 24 ч, рисунок 9,10A). Клеточная интенсивность флуоресцентной энергии Gr1 была выше через 24 ч (p<0,01 против 0 ч, рисунок 9,10B),а также 36 ч (p<0,01 против 0 ч, рисунок 9,10B). Аналогичным образом, клеточная интенсивность флуоресцентной связи CX3CR1 была выше через 24 ч (p<0,01 против 0 ч, рисунок 9,10C),а также 36 ч (p<0,01 против 0 ч, рисунок 9,10C).

При нормализации до клеточного CD61, который также вездесущ по экспрессии, выявлено увеличение клеточной атфβ-флуоресцентной интенсивности через 24 ч (p<0,01 против 0 ч,фиг.9,10D)и снижение клеточной интенсивности флуоресцентной атфузии через 36 ч (p<0,01 против 0 и 24 ч, фиг.9,10D). Примечательно, что ATPβ показал преимущественно ядерную локализацию через 24 ч по сравнению с периферической локализацией через 36 ч(рисунок 9). Клеточная флуоресцентная интенсивность BAL Ki-67, индикатора клеточной пролиферации, была выше через 24 ч (р<0,01 против 36 ч, рисунок 9,10E)по сравнению с 0 и 36 ч. Уровни были ниже исходных уровней через 36 ч (p<0,01, рисунок 9,10E),скорее всего, из-за более высокой полиморфоядерной экспрессии CD61 против Ki-67 через 36 ч(рисунок 9). Наконец, клеточная флуоресцентная интенсивность ангиостатина BAL была неизменно высокой как через 24, так и через 36 ч (p<0,01 против 0 ч, рисунок 9,10F),что указывает на специфическое увеличение этого фрагмента плазминогена, расщепленного металлопротеиназы, во время воспалительной реакции легких.

Комбинированные воздействия приводят к широко распространенному повреждению легких: Гистология легких показала, что комбинированные воздействия вызывают длительное повреждение легких, как видно из окрашенных криосекции H & E(рисунок 11). Хотя ожидалось повреждение бронхиолярной и альвеолярной перегородки, наблюдение за эндотелиальным повреждением более крупных сосудов наблюдалось через 36 ч после воздействия(рисунок 11). Наблюдались адгезивные внутрисосудистые лейкоциты, участки лейкоцитарных агрегатов (включая нейтрофилы) в поврежденных альвеолярных перегородках и перибронхиолярных областях(рисунок 11).

Figure 1
Рисунок 1:Компартментальное количество лейкоцитов: А) Бронхо-альвеолярный лаваж (БАЛ) общее количество лейкоцитов при 0 (т.е. исходном уровне), 4, 24, 36 и 72 ч после комбинированного воздействия 0,05 ppb озона (O3)и 50 мкг интраназального воздействия ЛПС на мышей. B) Общая концентрация лейкоцитов в сосудистом перфусате легких (LVP) при 0 (т.е. исходном уровне), 4, 24, 36 и 72 ч после комбинированного воздействия 0,05 ppb озона (O3)и 50 мкг интраназального ЛПС на мышей. C) Общая концентрация лейкоцитов в периферической крови (ПБ) при 0 (т.е. исходном уровне), 4, 24, 36 и 72 ч после комбинированного воздействия 0,05 ppb озона (O3)и 50 мкг интраназального ЛПС на мышей. D) Общая концентрация лейкоцитов в грудинальном костном мозге (БМ) при 0 (т.е. исходном уровне), 4, 24, 36 и 72 ч после комбинированного воздействия на мышей 0,05 ppb озона (O3)и 50 мкг интраназального ЛПС. E) Общая концентрация лейкоцитов в бедренном костном мозге (BM) при 0 (т.е. исходном уровне), 4, 24, 36 и 72 ч после комбинированного воздействия 0,05 ppb озона (O3)и 50 мкг интраназального ВОЗДЕЙСТВИЯ ЛПС на мышей. Для графиков A-E 0 ч представлено синим цветом, 4 ч - красным, 24 ч - зеленым, 36 ч - фиолетовым и 72 ч - оранжевыми точками данных; * п<0,05 и ** с<0,01. F) Репрезентативный слайд BAL cytospin от 24-ч экспозиции, показывающий моноядерные и полиморфноядерные клетки при окрашивании ядер DAPI (синий), CX3CR1 (зеленый) и Siglec-F (красный). Обратите внимание, что слияние CX3CR1 и Siglec-F отображается как оранжево-желтое. Большинство мононуклеарных клеток положительны на Siglec-F, что характерно для альвеолярных макрофагов. Шкала = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:Количественная оценка общего белка: A) Содержание общего белка в бронхоальвеолярном лаваже (BAL) и B) Концентрация белка перфузата сосудов легких (LVP) оценивалась с помощью анализа белка 660 нм (Thermoscientific, IL, US). Для графиков A-B 0 ч представлено синим цветом, 4 ч - красным, 24 ч - зеленым, 36 ч - фиолетовым и 72 ч - оранжевыми точками данных; * с<0.05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3:Градиенты хемокина эотаксина-2 и IL-2 легких: Из 33 хемокинов два хемокина, которые были значительно изменены в перфусате сосудов легких (LVP) и бронхоальвеолярном лаваже (BAL) и жидкости после комбинированного 0,05 ppb озона (O3)и 50 мкг интраназального воздействия LPS на мышей A) LVP eotaxin-2, B) BAL eotaxin-2, C) LVP IL-2 и D) BAL IL-2. Данные были проанализированы односторонней ановой, и p-значение для скорости ложного обнаружения нескольких переменных было скорректировано в соответствии с поправкой Бенджамини и Хошберга. Для графиков A-D 0 ч представлено синим цветом, 4 ч красным, 24 ч зеленым, 36 ч фиолетовым и 72 ч оранжевыми точками данных. Парные сравнения были проанализированы после коррекции Бонферрони. * обозначает p<0,05, ** представляет p<0,01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4:Концентрации хемокина перфузата в сосудах легких: Концентрации еще десяти хемокинов были изменены, но только в отделении перфузата сосудов легких (LVP). А) Эотаксин-1, Б) TNFα, В) ИФНγ, Г) CX3CL1, Е) CCL27, F) IL-16, G) CXCL5, H) CXCL10, I) SDF1α и J) MIP3β. Для графиков A-J 0 h представлен синим цветом, 4 h - красным, 24 h - зеленым, 36 h - фиолетовым и 72 h - оранжевыми точками данных. Парные сравнения были проанализированы после коррекции Бонферрони. * обозначает p<0,05, ** представляет p<0,01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5:Бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ) цитоспин актин/тубулин и восстановленное окрашивание митотрекером: Репрезентативные изображения цитоспинов БАЛ/тубулин окрашенных цитоспинов из А) через 0 ч и В) через 4 ч после комбинированного воздействия 0,05 ppb озона (O3)и 50 мкг интраназального воздействия ЛПС на мышей. Обратите внимание, что DAPI показан синим, актин зеленым и тубулин красным. Репрезентативные изображения восстановленного митотрекера окрашивали BAL цитоспинами из А) 0 ч и В) через 4 ч после комбинированного воздействия 0,05 ppb озона (O3)и 50 мкг интраназального ЛПС на мышей. Обратите внимание, что DAPI показан синим цветом, а уменьшенный митотрекер — красным. Шкала = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6:Анализ цитоскелетного белка и циркулярности бронхоальвеолярного лаважа (BAL): цитоспины BAL, окрашенные для актина и тубулина, были проанализированы для нормализованных параметров DAPI, т.е. A) отношение актина к интенсивности флуоресцентной энергии DAPI (FI) через 0 и 4 ч, B) отношение тубулина к интенсивности флуоресцентной энергии DAPI (FI) через 0 и 4 ч и C) клеточность BAL-клеток при 0 (n=75 клеток), 2 (n=105 клеток), 4 (n=66 клеток), 24 (n=31 клетки), 36 (n=154 клетки) ч. Поскольку несколько пилотных экспериментов также были выполнены сразу после воздействия O3 и LPS, то есть в точке времени 2 часа, мы также включили некоторый очень ранний анализ клеточности BAL с 2-часовой временной точки, чтобы подчеркнуть непосредственные эффекты O3. Для графиков A-C 0 ч представлено синим цветом, 2 ч - красным, 4 ч - зеленым, 24 ч - фиолетовым и 36 ч - оранжевыми точками данных. * обозначает p<0,05, ** представляет p<0,01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7:Внутриклеточный и плазматический мембранный статус бронхоальвеолярного лаважа (BAL): клетки BAL окрашивали для жизненно важных пятен, кальцеина (зеленым цветом) и гомодимеров этидия / EthHD (красным), как показано на репрезентативных верхних панелях изображения на A) 0, B) 24 и C) через 36 ч после воздействия O3 и LPS. Шкала = 200 мкм. Цитоспины BAL были иммуноокражены для DAPI (синий), ATPα (зеленый) и Ly6G (красный). Репрезентативные изображения отображаются на нижних панелях изображения через A) 0 и B) 24 ч после экспозиций O3 и LPS. Шкала = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 8
Рисунок 8:Бронхоальвеолярный лаваж (BAL) митохондриальный белок ATPα, лизосомальный белок Ly6G и анализ размера клеток: Иммуноокрашивые клетки BAL были нормализованы для DAPI для расчета A) атфα к daPI флуоресцентной интенсивности (FI) и B) Ly6G к DAPI FI, через 0 и 24 ч после воздействия O3 и LPS. Иммуноокрашие КЛЕТКИ BAL также были проанализированы на их A) самый длинный, т.е. диаметр хорька и B) периметр, через 0, 2, 4, 24 и 36 ч после воздействия O3 и LPS. Для графиков A-D 0 h (n=119 ячеек) представлено синим цветом, 2 ч (n=105 ячеек) красным, 4 ч (n=66 ячеек) зеленым, 24 ч (n=309 ячеек) фиолетовым и 36 ч (n=154 ячейки) в оранжевых точках данных. * обозначает p<0,05, ** представляет p<0,01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 9
Рисунок 9:Внутриклеточное фенотипирование бронхоальвеолярного лаважа (BAL): клетки BAL были иммуноокрашены для DAPI (в синем), NK1.1 (в зеленом), Gr1 (в красном) и CX3CR1 (в пурпурном), как показано на репрезентативных верхних панелях изображения при A) 0, B) 24 и C) через 36 ч после экспозиций O3 и LPS. Шкала шкалы = 50 мкм. Цитоспины BAL были иммуноокражены для ATPβ (в синем), Ki-67 (в зеленом), CD61 (в красном) и ангиостатина (в пурпурном). Репрезентативные изображения отображаются на нижних панелях изображений в A) 0, B) 24 и C) 36 ч после экспозиций O3 и LPS. Шкала = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 10
Рисунок 10:Бронхоальвеолярный лаваж (BAL) митохондриальный белок ATPβ, лизосомальный белок Gr1, внутриклеточный CX3CR1 и анализ ангиостатина: Иммуноокрашенные клетки BAL были нормализованы для DAPI для вычисления A) NK1.1 к DAPI флуоресцентной интенсивности (FI), B) Gr1 к DAPI FI ratio и C) CX3CR1 к DAPI FI ratio, через 0, 24 и 36 ч после воздействия O3 и LPS. Иммуноокрашивые КЛЕТКИ BAL были нормализованы для CD61 для вычисления A) ATPβ к коэффициенту флуоресцентной интенсивности (FI) B) Ki-67 к DAPI FI и B) Ангиостатина (ANG) к DAPI FI, через 0, 24 и 36 ч после воздействия O3 и LPS. Для графиков A-F 0 h (n=21 ячейка) представлена синим цветом, 24 ч (n=796 ячеек) красным и 36 ч (n=2692 ячейки) зелеными точками данных. * обозначает p<0,05, ** представляет p<0,01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 11
Рисунок 11:Гистология гематоксилина легких и эозина (H&E). Озон (O3)и ЛПС, индуцированная криосекцией легких H&E гистология через 0, 24 и 36 ч после комбинированного воздействия O3 и LPS. Области повреждения альвеолярного эпителия отмечены сплошными черными стрелами, а эндотелиальные повреждения — черными наконечниками стрел. Желтые звездочки (*) представляют собой пятна лейкоцитов в альвеолярных септальных областях. A = альвеолярное пространство, B = бронх, V = сосудистая гамма, шкала = 100 мкм для левых панелей изображений и 50 мкм для панелей изображений с правой стороны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

S.No. Первичное антитело Вторичные антитела инвитрогена
1 Мышь анти-NK1.1 IgG2a каппа (клон PK136), Каталог Инвитрогена No 16-5941-82 Alexa 488 конъюгированный козий антимыший IgG (H+L), Каталог No. А11002
2 Крысиный анти-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b каппа (клон RB6-8C5), Инвитроген Каталог No 53-5931-82 Alexa 568 конъюгированная коза против крыс IgG (H+L), Каталог No. А11077
3 Кролик анти-CX3CR1 IgG (RRID 467880), Инвитроген Каталог No 14-6093-81 Alexa 633 конъюгированная коза против кролика IgG (H+L), Каталог No. А21070
4 Мышь анти-ATP5A1 IgG2b (клон 7H10BD4F9), Инвитроген Каталог No 459240 Alexa 488 конъюгированный козий антимыший IgG (H+L), Каталог No. А11002
5 Крысиный анти-Ly6G IgG2a каппа (клон 1A8), Инвитроген Каталог No 16-9668-82 Alexa 568 конъюгированная коза против крыс IgG (H+L), Каталог No. А11077
6 Мышь анти-ATP5β IgG2b (клон 3D5AB1), Термофишер Каталог No. А-21351 Alexa 350 конъюгированная коза против мыши IgG (H+L), Каталог No. А11045
7 Крысиный анти-Ki-67 (клон SolA15) IgG2a каппа, Инвитроген Каталог No 14-5698-82 Alexa 568 конъюгированная коза против крыс IgG (H+L), Каталог No. А11077
8 Армянский хомяк анти-CD61 (клон 2C9. G2) IgG1 каппа, BD Каталог No 553343 Alexa 568 конъюгированный козий антихомяк IgG (H+L), Каталог No. А21112
9 Антиангиостатин кролика (мышиный aa 98-116) IgG, Abcam Каталог No. аб2904 Alexa 633 конъюгированная коза против кролика IgG (H+L), Каталог No. А21070

Таблица 1: Первичные и вторичные комбинации антител, используемые для окрашивания цитоспинов, полученных из образцов.

Считывание БАЛ ЛВП ПБ СБМ ФБМ
ТЛЦ * * + в 24 ч; - в 36, 72 ч + в 72 ч
Нейтрофилов + в 24, 36, 72 ч + в 24 ч * + в 4, 24, 36, 72 ч + в 4, 24, 36, 72 ч
белок + в 36 ч * н.д. н.д. н.д.
Профиль Хемоцин - для эотаксина-2, Ил-2 в 4, 24, 36, 72 ч + для Эотаксина-1/2, IL-2, TNFα, IFNγ, CX3CL1, CCL27, IL-16, CXCL5, CXCL10, MIP3β через 4 ч; + для SDF1α через 36 ч н.д. н.д. н.д.
Размер ячейки + через 4 ч; - в 24, 36 ч н.д. н.д. н.д. н.д.
АТПα - в 24 ч н.д. н.д. н.д. н.д.
НК1.1/Ки-67 + в 24 ч н.д. н.д. н.д. н.д.
АТФβ/Гр1/CX3CR1/АНГ + в 24, 36 ч н.д. н.д. н.д. н.д.

Таблица 2: Всестороннее резюме основных выводов исследования в различных компартментах. * обозначает отсутствие изменений, + обозначает увеличение и - обозначает уменьшение измеряемых параметров. BAL обозначает бронхо-альвеолярную лаважную жидкость, LVP обозначает перфусат сосудов легких, PB обозначает периферическую кровь, SBM обозначает костный мозг грудины и FBM обозначает отсек бедренного костного мозга.

Дополнительный рисунок 1: Иммуноокрашивание Gr1 и CD11b: Репрезентативные изображения из DAPI (в синем), Gr1 (в зеленом) и CD11b (в красном) флуоресцентных иммуноокраженных слайдах цитоспина легочного сосудистого перфузата (LVP), грудинального костного мозга (BM) и бедренного костного мозга (BM) через 0, 4 и 24 ч после комбинированных воздействий O3 и LPS. Шкала = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный фильм 1 Трехмерный визуализированный объем макрофагов BAL от 0-часовой точки времени (т.е. исходного уровня), показывающий ядро (показано синим цветом) и иммуноокраженное для ATPα (показано зеленым) и Ly6G (показано красным). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.

Дополнительный фильм 2: Трехмерный визуализированный объем макрофагов BAL от 24-часовой временной точки после комбинированных воздействий O3 и LPS, показывающий ядро (показано синим цветом) и иммуноокрашивое для ATPα (показано зеленым) и Ly6G (показано красным). Обратите внимание на наличие ануклеарных АТФα-положительных тел, а также фрагментированной клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Методы, представленные в текущем исследовании, подчеркивают полезность анализа нескольких компартментов для изучения множественных клеточных событий во время воспаления легких. Мы обобщили выводы в таблице 2. Мы и многие лаборатории тщательно изучили реакцию мыша на интраназальную инстилляцию ЛПС, которая характеризуется быстрым набором нейтрофилов легких, который достигает пика между 6-24 ч, после чего начинается разрешение. И недавно мы показали, что субклинический O3 (при 0,05 ppm в течение 2 ч) сам по себе может индуцировать значительное повреждение легких у подстадиа C57BL/6NJ15,которое характеризуется разделением нейтрофилов в сосудистом компартменте легких, в то время как поврежденные макрофаги и мусор наблюдались в BAL, что указывает на воспалительный потенциал O3. В этой модели мы наблюдали отсутствие нейтрофилов в альвеолярном компартменте в результате индуцированногоO3 повреждения альвеолярного эпителия и, как следствие, фагоцитоза альвеолярными макрофагами. Мало того, что мы наблюдали внеклеточную ДНК и мусор в модели O3, макрофаги BAL были дисморфными, которые коррелируют с высокими уровнями IL-16, сигнал тревоги, обычно выделяемый умирающими нейтрофилами. Поэтому важно понять, могут ли эти субклинические уровни O3 влиять на иммунный ответ у надежного суб-штамма C57BL/6J, как отмечено в супрафизиологическом уровне O3 21. Мы наблюдали, что комбинированныйO3 и интраназальный бактериальный эндотоксин индуцировали рекрутирование нейтрофилов в легочных, а также системных компартментах, отмеченных наличием поврежденных нейтрофилов в BAL, перфусате сосудов легких, стернальных и бедренных отсеках костного мозга, начиная с 4 ч, которые оставались высокими через 24, 36 и 72 ч. Клеточное повреждение было представлено как потеря кортикального актина и ламеллиподии и увеличение размера клеток в лейкоцитах BAL; Нейтрофилы, проанализированные в компартменте BAL, показали значительно сниженную положительную реакционную способность к микротрубочкам, АТФ-синтазному комплексу V субъединой α (АТФα) и активному митохондриальному окрашиванию. Легкие адаптируются к этому комбинированной экспозиции путем упреждения экспрессии клеточного АТФ-синтазного комплекса V субъединой β (АТФβ), а также экспрессии лиганда АТФβ, ангиостатина(таблица 2).

Важным аспектом изучения воспаления является понимание клеточного некроза вместе с градиентами хемокина. Было интересно отметить, что общее количество лейкоцитов не отличалось, за исключением периферической крови и отсека бедренного костного мозга. Эти наблюдения привели нас к исследованию клеточных цитоскелетных паттернов, размера и иммунофенотипирования. Мы наблюдали потерю ламеллиподий и активных митохондрий в клетках BAL, что указывает на повреждение клеток. Кортикальная организация актина является существенной особенностью межклеточной сигнализации и вытекающих из этого барьерных свойств. Таким образом, дезорганизация цитоскелета является хорошим маркером повреждения клеток, когда некроз не так очевиден для оценки. Даже через 36 ч клетки BAL имели компрометированную плазматическую мембрану, о чем свидетельствует окрашивание гомодимером этидия. Сразу после комбинированных воздействий нейтрофилы в BAL показали положительность Gr1, но по существу отрицательное окрашивание для CD11b, которое локализуется к переднему краю и помогает в альвеолярной перегородкеползание 22. Таким образом, комбинированные воздействия приводят к накоплению атипичных нейтрофилов, лишенных белка CD11b. ЛПС не вызывает понижения регуляции CD11b. Таким образом, эта особенность, вероятно, является результатом повреждения нейтрофилов, вызванногоО3.

Клетки BAL имели уникальную белковую сигнатуру с более высоким окрашиванием NK1.1, Ki-67 и ATPβ через 24 ч по сравнению с 0 ч(таблица 2). Клетки BAL имели более высокую экспрессию Gr1, CX3CR1, а также ангиостатина через 24, а также 36 ч по сравнению с 0 ч(таблица 2). Эти результаты были подтверждены присутствием все большего количества положительных нейтрофилов Gr1 в BAL через 24 и 36 ч после воздействия(таблица 2). Наличие положительных клеток NK1.1, CX3CR1 и Gr1 через 24 ч указывает на рекрутирование как мононуклеарных, так и полиморфноядерных клеток в BAL. Среди мононуклеарных клеток положительные клетки CX3CR1 доминировали через 36 ч, что указывает на наличие интерстициальных макрофагов, тромбоцитов или макрофагов, полученных из моноцитов. Включение как Ki-67, так и ангиостатина в качестве маркеров сообщило нам о пролиферативной и антиангиогенной среде, соответственно, в BAL. Таким образом, комбинированное воздействие O3 и LPS приводит к пролиферации вероятно макрофагов с последующей антиангиогенной средой из-за нейтрофильной инфильтрации. Преходящее увеличение окрашивания АТФβ может указывать на важную адаптацию к увеличению выживаемости лейкоцитов BAL через 24 ч. Необходимо отметить, что АТФβ может связываться с ангиостатином и ингибировать длительную выживаемость6,23,что фактически отражается на более низком индексе Ki-67 через 36 ч после воздействия.

Хотя белок BAL был самым высоким через 36 ч, а не в другие временные точки, перфусат сосудов легких не показал каких-либо изменений в концентрации белка до или после воздействия. Возможно, что сосудистый компартмент не был затронут, но это, скорее всего, связано с окислением богатых электронами аминокислот, таких как метионин, гистидин и цистеин, индуцированными свободными радикаламиO3 и результирующей деградацией белков поверхностно-активных веществ (SP-A, SP-B), а также сосудистой утечкой24,25,26. Количественная оценка bal IgM, белков ПОВЕРХНОСТНО-активных веществ BAL, альбумина BAL или экстравазации красителя (с использованием синего эванса или флуоресцеина изо-тиоцианата (FITC) декстрана) являются альтернативными методами оценки целостности эпителия и эндотелия.

Интересно, что уровни перфузата в легких сосудах эотаксина-2 и IL-2 были остро повышены в 4-часовой временной точке. Уровни BAL эотаксина-2 и IL-2 были значительно снижены после воздействия, что указывает либо на деградацию альвеолярного пространства, либо на ловушку в сосудистой сети легких. Другие хемокины, проанализированные в перфузате сосудов легких, выявили более высокие уровни эозинофилов хемокина (эотаксин-1), TNFα, IFNγ, хемокинов мононуклеарных клеток, полученных из лимфатических узлов (CX3CL1, CXCL10, CCL27, MIP3β), эпителиального хемокина нейтрофилов (CXCL5) и алармина (IL-16), высвобождаемого после вторичного некроза нейтрофилов27,но только через 4 ч после воздействия. Через 36 ч панлейкоцитарный хемоцин, полученный из костного мозга, SDF1α28,был выше в перфусате сосудов легких. Концентрации SDF1α, полученные из костного мозга, коррелируют с результатами цитологии, в соответствии с которыми CD11b и Gr1 положительные клетки в изобилии присутствуют через 24 и 36 ч после воздействия. Таким образом, хемоциновые и цитологические профили отражают значительную мобилизацию лейкоцитов из компартментов костного мозга (табл. 2).

Наша модель на животных и результаты исследований имеют жизненно важное значение с учетом реальных ситуаций, когда живые существа в городских условиях, вероятно, подвергаются воздействию таких субклинических O3 и инфекционных агентов8. Наша мышиная модель служит легкодоступным прототипом, который может быть воспроизведен в лабораториях сдерживания уровня 2 для изучения легочных и внелегочных механизмов инвазивной гибели клеток и инфекций, как в случае с инфекциями COVID-1929. Будущие исследования должны быть направлены на визуализацию последующего наблюдения за восстановлением или поздней фазой, а также хронического воздействия для изучения долгосрочных клеточных адаптаций. Таким образом, для комплексных исследований воспаления легких с участием методов визуализацииживого органа 15 и животных 16, 30, 31 текущий дизайн исследования конечной точки может обеспечить жизненно важную информацию о реакции хозяина на комбинированные низкие дозы O3 (гибель клеток) и LPS (иммунная стимуляция) и, таким образом, расшифровать механизмы острого повреждения легких.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов или раскрытия информации.

Acknowledgments

Проводимые исследования финансируются за счет гранта президента NSERC, а также стартовых фондов Канадского центра ядерных инноваций Сильвии Федорук. Канадский центр ядерных инноваций Сильвии Федорук финансируется innovation Saskatchewan. Флуоресцентная визуализация была выполнена в Центре визуализации WCVM, который финансируется NSERC. Джессика Брокос (MSc Student) и Манприт Каур (MSc Student) финансировались за счет стартовых фондов Канадского центра ядерных инноваций Сильвии Федорук.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
33-plex Bioplex chemokine panel Biorad 12002231
63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives Leica HCX PL APO CS (11506188)
Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Invitrogen A11045
Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Invitrogen A11002
Alexa 488 conjugated phalloidin Invitrogen A12370
Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1A Millipore 05-829X-555
Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L) Invitrogen A21112
Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L) Invitrogen A11077
Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen A21070
Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa BD Pharmingen 553343
C57BL/6 J Mice Jackson Laboratories 64
Confocal laser scanning microscope Leica Leica TCS SP5
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) Invitrogen D1306 aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C
Inverted fluorescent wide field microscope Olympus Olympus IX83
Ketamine (Narketan) Vetoquinol 100 mg/ml Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock
Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit Invitrogen L3224
Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9) Invitrogen 459240
Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1) Invitrogen A-21351
Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136) Invitrogen 16-5941-82
Pierce 660 nm protein assay Thermoscientific 22660
Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG Abcam ab2904
Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880) Invitrogen 14-6093-81
Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa Invitrogen 14-5698-82
Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8) Invitrogen 16-9668-82
Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5) Invitrogen 53-5931-82
Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2) BD Pharmingen 553142
Reduced mitotracker orange Invitrogen M7511
Xylazine (Rompun) Bayer 20 mg/ml Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhattacharya, J., Matthay, M. A. Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury. Annual Review of Physiology. 75, 593-615 (2013).
  2. Aulakh, G. K. Neutrophils in the lung: "the first responders". Cell Tissue Research. , (2017).
  3. Aulakh, G. K., Suri, S. S., Singh, B. Angiostatin inhibits acute lung injury in a mouse model. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (1), 58-68 (2014).
  4. Schneberger, D., Aulakh, G., Channabasappa, S., Singh, B. Toll-like receptor 9 partially regulates lung inflammation induced following exposure to chicken barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 11 (1), 1-10 (2016).
  5. Shah, D., Romero, F., Stafstrom, W., Duong, M., Summer, R. Extracellular ATP mediates the late phase of neutrophil recruitment to the lung in murine models of acute lung injury. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 152-161 (2014).
  6. Aulakh, G. K., Balachandran, Y., Liu, L., Singh, B. Angiostatin inhibits activation and migration of neutrophils. Cell Tissue Research. , (2013).
  7. Cakmak, S., et al. Associations between long-term PM2.5 and ozone exposure and mortality in the Canadian Census Health and Environment Cohort (CANCHEC), by spatial synoptic classification zone. Environment International. 111, 200-211 (2018).
  8. Dauchet, L., et al. Short-term exposure to air pollution: Associations with lung function and inflammatory markers in non-smoking, healthy adults. Environment International. 121, Pt 1 610-619 (2018).
  9. Delfino, R. J., Murphy-Moulton, A. M., Burnett, R. T., Brook, J. R., Becklake, M. R. Effects of air pollution on emergency room visits for respiratory illnesses in Montreal, Quebec. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 568-576 (1997).
  10. Peterson, M. L., Harder, S., Rummo, N., House, D. Effect of ozone on leukocyte function in exposed human subjects. Environmental Research. 15 (3), 485-493 (1978).
  11. Rush, B., et al. Association between chronic exposure to air pollution and mortality in the acute respiratory distress syndrome. Environmental Pollution. 224, 352-356 (2017).
  12. Rush, B., Wiskar, K., Fruhstorfer, C., Celi, L. A., Walley, K. R. The Impact of Chronic Ozone and Particulate Air Pollution on Mortality in Patients With Sepsis Across the United States. Journal of Intensive Care Medicine. , (2018).
  13. Stieb, D. M., Burnett, R. T., Beveridge, R. C., Brook, J. R. Association between ozone and asthma emergency department visits in Saint John, New Brunswick, Canada. Environmental Health Perspectives. 104 (12), 1354-1360 (1996).
  14. Thomson, E. M., Pilon, S., Guenette, J., Williams, A., Holloway, A. C. Ozone modifies the metabolic and endocrine response to glucose: Reproduction of effects with the stress hormone corticosterone. Toxicology and Applied Pharmacology. 342, 31-38 (2018).
  15. Aulakh, G. K., Brocos Duda, J. A., Guerrero Soler, C. M., Snead, E., Singh, J. Characterization of low-dose ozone-induced murine acute lung injury. Physiological Reports. 8 (11), 14463 (2020).
  16. Aulakh, G. K., et al. Quantification of regional murine ozone-induced lung inflammation using [18F]F-FDG microPET/CT imaging. Scientific Reports. 10 (1), 15699 (2020).
  17. Charavaryamath, C., Keet, T., Aulakh, G. K., Townsend, H. G., Singh, B. Lung responses to secondary endotoxin challenge in rats exposed to pig barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 3, London, England. 24 (2008).
  18. Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation. Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).
  19. Southam, D. S., Dolovich, M., O'Byrne, P. M., Inman, M. D. Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position, and anesthesia. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 282 (4), 833-839 (2002).
  20. Aulakh, G. K. Lack of CD34 produces defects in platelets, microparticles, and lung inflammation. Cell Tissue Research. , (2020).
  21. Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone. Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).
  22. Yipp, B. G., et al. The Lung is a Host Defense Niche for Immediate Neutrophil-Mediated Vascular Protection. Science Immunology. 2 (10), (2017).
  23. Lee, T. Y., et al. Angiostatin regulates the expression of antiangiogenic and proapoptotic pathways via targeted inhibition of mitochondrial proteins. Blood. 114 (9), 1987-1998 (2009).
  24. Hawkins, C. L., Davies, M. J. Detection, identification, and quantification of oxidative protein modifications. Journal of Biological Chemistry. 294 (51), 19683-19708 (2019).
  25. Hemming, J. M., et al. Environmental Pollutant Ozone Causes Damage to Lung Surfactant Protein B (SP-B). Biochemistry. 54 (33), 5185-5197 (2015).
  26. Oosting, R. S., et al. Exposure of surfactant protein A to ozone in vitro and in vivo impairs its interactions with alveolar cells. American Journal of Physiology. 262 (1), Pt 1 63-68 (1992).
  27. Roth, S., et al. Secondary necrotic neutrophils release interleukin-16C and macrophage migration inhibitory factor from stores in the cytosol. Cell Death & Discovery. 1, 15056 (2015).
  28. Kawaguchi, N., Zhang, T. T., Nakanishi, T. Involvement of CXCR4 in Normal and Abnormal Development. Cells. 8 (2), (2019).
  29. Gupta, A., et al. Extrapulmonary manifestations of COVID-19. Nature Medicine. 26 (7), 1017-1032 (2020).
  30. Aulakh, G. K., Kuebler, W. M., Singh, B., Chapman, D. 2017 IEEE Nuclear Science Symposium and Medical Imaging Conference (NSS/MIC). , 1-2 (2017).
  31. Aulakh, G. K., et al. Multiple image x-radiography for functional lung imaging. Physics in Medicine & Biology. 63 (1), 015009 (2018).

Tags

Иммунология и инфекции Выпуск 169 Озон ЛПС острое воспаление легких субъединицы F1F0 АТФ-синтазы (комплекс V) иммунная флуоресцентная цитология IL-16
Визуализация клеточной адаптации легких во время комбинированного озона и ЛПС-индуцированного острого повреждения легких
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Duda, J. A. B., Kaur, M., Aulakh, G. … More

Duda, J. A. B., Kaur, M., Aulakh, G. K. Visualizing Lung Cellular Adaptations during Combined Ozone and LPS Induced Murine Acute Lung Injury. J. Vis. Exp. (169), e62097, doi:10.3791/62097 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter