Summary
Kombinerade ozon- och bakteriella endotoxinexponerade möss uppbar bred celldöd, inklusive neutrofiler. Vi observerade cellulära anpassningar såsom störningar av cytoskeletal lamellipodia, ökat cellulära uttryck av komplexa V ATP syntas underavdelning β och angiostatin i broncho-alveolar lavage, undertryckande av lung immun svar och fördröjd neutrophil rekrytering.
Abstract
Lungor står ständigt inför direkta och indirekta förolämpningar i form av sterila (partiklar eller reaktiva toxiner) och infektiösa (bakteriella, virala eller svamp) inflammatoriska tillstånd. En överväldigande värd svar kan resultera i komprometterad andning och akut lungskada, som kännetecknas av lung neutrophil rekrytering som ett resultat av pato-logiska värd immun, koagulativ och vävnad remodeling svar. Känsliga mikroskopiska metoder för att visualisera och kvantifiera cellulära anpassningar av murin lungor, som svar på ozon med låg dos (0,05 ppm), en potent miljöförorening i kombination med bakteriell lipopolysackarid, en TLR4-agonist, är avgörande för att förstå värdens inflammatoriska mekanismer och reparationsmekanismer. Vi beskriver en omfattande fluorescerande mikroskopisk analys av olika lungor och systemiska kroppsfack, nämligen broncho-alveolar lavage vätska, lung vaskulär perfusate, vänster lung cryosections och sternal benmärg perfusate. Vi visar skador på alveolära makrofager, neutrofiler, lungparenkymal vävnad, liksom benmärgsceller i samband med ett fördröjt (upp till 36-72 h) immunsvar som kännetecknas av diskreta kemokingradienter i de analyserade facken. Dessutom presenterar vi lungextracellulära matris och cellulära cytoskeletala interaktioner (aktin, tubulin), mitokondriell och reaktiv syre art, anti-koagulativ plasminogen, dess anti-angiogenic peptid fragment angiostatin, mitokondriell ATP syntas komplexa V underenheter, α och β. Dessa surrogatmarkörer, när de kompletteras med adekvata in vitro-cellbaserade analyser och in vivo-djuravbildningstekniker som intravital mikroskopi, kan ge viktig information för att förstå lungsvaret på nya immunmodulerande medel.
Introduction
Akut lungskada (ALI) är ett avgörande patologiskt svar från lungor på infektiösa eller andra skadliga stimuli som kännetecknas av samtidig aktivering av koagulerings-, fibrinolytiska och medfödda immunsystem1. Neutrofiler känner omedelbart av mikrobiella såväl som intracellulära skademönster genom den tollliknande receptorn (TLR)familjen 2,3,4. Neutrofiler frigör förformade cytokiner och cytotoxiskt granulatinnehåll, vilket sedan kan orsaka skador på vävnaden. Den efterföljande alveolära skadan är kantad med sekundär celldöd som leder till frisättning av molekyler som adenosin triphosphate (ATP)5, vilket sätter in en ond cirkel av immun-dysregulation.
Ett olöst problem i förståelsen av ALI gäller frågan om hur skadan initieras inom alveolarmembranet. Elektrontransportkomplexet V, F1F0 ATP-syntas, är ett mitokondriellt protein som är känt för att uttryckas allestädes närvarande, på cell (inklusive endotel, leukocyt, epitelialt) plasmamembran under inflammation. Cellcytoskeletonen som består av aktin och tubulin, har många cellforms- och funktionsmodulerande samt mitokondriella proteiner. Vi har nyligen visat att blockad av ATP-syntasen av en endogen molekyl, angiostatin, tystar neutrofilrekrytering, aktivering och lipopolysackarid (LPS) inducerad lunginflammation6. Således kan både biokemiska (ATP-syntas) och immunmekanismer (TLR4) reglera alveolärbarriären under lunginflammation.
Exponering för ozon (O3),en miljöförorening, försämrar lungfunktionen, ökar mottagligheten för lunginfektioner, och korta låga nivåer av O3-exponeringar ökar risken för dödlighet hos personer med underliggande kardiorespiratoriskatillstånd 7,8,9,10,11,12,13,14. Exponering för fysiologiskt relevanta koncentrationer av O3 ger således en meningsfull modell av ALI för att studera grundläggande mekanismer för inflammation7,8. Vårt labb har nyligen etablerat en murinmodell av låg dos O3 inducerad ALI15. Efter att ha utfört en dos och tidssvar på låga O3 koncentrationer observerade vi att exponering för 0,05 ppm O3 för 2 h inducerar akut lungskada som kännetecknas av lunga ATP syntas komplexa V underavdelning β (ATPβ) och angiostatin uttryck, liknar LPS modellen. Intravital lung imaging visade disorganization av alveolar aktin mikrofilament som anger lungskador, och ablation av alveolära septala reaktiva syrearter (ROS) nivåer (som indikerar överföring av baslinjecellsignalering) och mitokondriell membranpotential (som indikerar akut celldöd) efter 2 h exponering för 0, 05 ppm O315 som korrelerade med en heterogen lunga 18FDG retention16, neutrofil rekrytering och cytokinfrisättning, framför allt IL-16 och SDF-1α. Budskapet från våra senaste studier är att O 3 producerar exponentiellt högtoxicitet när den exponeras vid koncentrationer under de tillåtna gränserna på 0,063 ppm över 8 timmar (per dag) för mänsklig exponering. Det är viktigt att det inte finns någon klar förståelse för om dessa subkliniska O3-exponeringar kan modulera TLR4-medierade mekanismer såsom genom bakteriellt endotoxin17. Således studerade vi en dubbel-hit O3 och LPS exponering modell och observerade immun och icke-immun cellulära anpassningar.
Vi beskriver en omfattande fluorescerande mikroskopisk analys av olika lung- och systemiska kroppsutrymmen, nämligen broncho-alveolär lavagevätska (dvs. BAL) som tar prov på de alveolära utrymmena, lungvaskulärt perfusat (dvs. LVP) som tar prov på lungvaskulaturen och det alveolära septala interstitiumet i händelse av en komprometterad endotelbarriär, vänster lung cryosections, för att undersöka bosatta parenkymala och vidhäftande leukocyter kvar i den lavaged lungvävnaden , perifert blod som representerar de cirkulerande leukocyterna och sternal- och lårbensmärgper som provar de proximala och distala platserna för hematopoetisk cellmobilisering under inflammation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studiens design godkändes av University of Saskatchewan's Animal Research Ethics Board och följde Canadian Council on Animal Care riktlinjer för humant djurbruk. Sex-åtta veckor gamla manliga C57BL/6J möss upphandlades. OBS: Avliva djur som utvecklar svår slöhet, andningsbesvär eller andra tecken på allvarlig nöd före planerad slutpunkt.
OBS: Förbered följande: 27-18 G nål trubbig (beror på musens trakealdiameter), lämpligt storlek PE-slangar för att passa den trubbiga nålen (gör en PE-kanyl för varje mus), kanyl, 2 vassa saxar, 2 trubbiga tångar (små), 1 vassa tångar (små), 3 1 ml sprutor, märkta mikrofugerör (för BAL, blod, kärl- och benmärgsperfusatsamling) och märkta injektionsflaska (för vävnadsfixering), provpåsar/kryovialer för vävnadsinsamling, slaktarens bomullstrådrulle (skuren i tillräckligt stora ligaturer). Alla kemikalier som används för experimenten anges i materialförteckningen.
1. Ozon- och LPS-exponeringar för induktion av murin lungskada
- Ozonexponering
- Förbered en anpassad O 3-induktionslåda. Tillsätt musmatning, vattenflaska, anrikningsleksaker och rena sängkläder för att och efterlikna mössens bostadsmiljö.
OBS: Dessa steg säkerställer att mössen har fri tillgång till mat och vatten när de är inrymda i den anpassade induktionslådan och hjälper till att lindra onödig stress. - Slå på O 3-kalibratorn/generatorn "ON" (placerad mot inloppsporten) för att stabilisera UV-lampan före hand (cirka 15 min före exponering) och anslut med in-line O3-monitor.
OBS: O3-monitorn ska avläsa i genomsnitt 0,05 ppm, som provtas från utloppet vid konstant kammares lufttemperatur (72 ±3 °F) och relativ luftfuktighet (50±15%). - För O3-exponeringar, placera försiktigt möss i den anpassade induktionslådan och exponera kontinuerligt mössen för 0,05 ppm O3 i 2 timmar.
- Förbered en anpassad O 3-induktionslåda. Tillsätt musmatning, vattenflaska, anrikningsleksaker och rena sängkläder för att och efterlikna mössens bostadsmiljö.
- Anestesi och intranasal LPS-administrering
- Förbered 10 mg/ml lager för ketamin och xylazin, separat.
- Förbered en cocktail genom att blanda 20 delar ketamin och 1 del av xylazin. Om musen väger X g, injicera (X/200) ml ketamin/xylazincocktail i bukhörshålan. För en mus, förbered 1 ml cocktail bestående av 1000 μL av 10 mg/ml ketaminbuljong och 50 μL av xylazinbeståndet. Blanda väl genom att leda upp och ner i ett mikrofugerör.
OBS: Ketamin- och xylazinlagren kan beredas en vecka i förväg. - Bedöva mössen under lätt intraperitoneal (IP) ketamin (50 mg/kg)/xylazinblandning (1 mg/kg) (t.ex. för en 25 g mus, injicera 0,125 ml av cocktailen).
- Förbered en 1 mg/ml lösning av LPS, i saltlösning, och fyll 50 μL av lösningen i en pipett.
- Håll musen upprätt med ryggen/ryggsidan på handflatan och håll öronen med samma hand. Placera nu 50 μL avLPS-lösningen 18 försiktigt utanför näsborrarna (dvs. 25 μL på varje näsborre eller 50 μL i en näsborre; spelar ingen roll så länge proceduren är snabb) och låt mössen andas in LPS-lösningen.
- Kontrollera möss med 50 μL steril saltlösning.
Varning: Överskrid inte mer än 100 μL för instillation, vilket kan vara dödligt. För mindre volym (dvs. < μL) och det finns risk för endast nasal nedfall. - Efter LPS-administrering, lägg försiktigt ner mössen, antingen på magen eller ryggen på högen av sängkläder med huvudet vinklat något nedåt.
OBS: Denna orientering förlänger kvarhållningen av lösningen i näshålan19. - Vid 0, 2, 4, 24, 36 och 72 h efter exponeringen, bedöva mössen dvs med full dos ketamin (200 mg/kg)/xylazinblandning (4 mg/kg) (dvs. X/50 ml av cocktailen, där X är musvikten i gram eller 0,50 mL för en 25 g mus).
- Observera musen tills den förlorar medvetandet och den högra reflexen (dvs. vänder inte tillbaka när den läggs i supine position). Kontrollera nu musen för anestesidjup, genom att övervaka andningen (rytmiska bröstutflykter) och hjärtfrekvensen, som bör falla märkbart, efter 1-2 minuter.
- Kontrollera sedan om det finns pedalreflexer, t.ex. nypa någon av bakbenssiffrorna och observera för tillbakadragning av lemmen, som en reflex. Om musen svarar, på fylla på med ytterligare 0,1 ml injektioner eller mer, efter behov.
OBS: För att uppnå djup anestesi, kom ihåg att vissa stammar eller feta möss vanligtvis har en större distributionsvolym och därmed lätt kan överdilas, om det inte är tillräckligt med tid om det inte är tillåtet för full anestesi (som kan vara cirka 10 minuter eller mer). Följaktligen kan vissa stammar vara resistenta mot anestesi och därmed kräva fler pås påsar. Denna kunskap förvärvas efter många praktiska observationer och erfarenheter med möss av olika stammar och ålder. Eftersom några pilotexperiment också utfördes omedelbart efter O3- och LPS-exponeringar (dvs. vid 2 h-tidpunkten) inkluderade vi också en mycket tidig BAL-cellanalys från dessa experiment för att belysa de omedelbara effekterna av den kombinerade O3- ochLPS-exponeringen.
2. Provtagning
- Placera musen på operationsbrickan. Sätt nu försiktigt smörjande ögonsalva på båda ögonen för att undvika vätskeförlust och sanera musen med 70% etanolspray.
- Gör små snitt genom övre och nedre hudmembranen med sax, för att exponera luftstrupen och bröstkorgen.
- Skär precis under bröstbenet och exponera hjärtat.
- Hjärt punktering
- Placera en 25G nål fäst vid hepariniserad spruta i rätt ventrikel och dra blod genom hjärtpunktion.
OBS: Blodet drar vanligtvis med minimal kolvdragning, om tiden från att utsätta hjärtat för hjärtpunktion är under en minut. Efter att ha samlat runt 0,4-0,5 ml kan man behöva pausa i några sekunder innan man samlar in det återstående blodet. Detta görs för att låta hjärtat pumpa in eventuell återstående volym i rätt ventrikulära kammare. I slutet av blodsamlingen stannar hjärtat för att pumpa. - Samla blodet och förvara i mikrofugerör för vidare bearbetning.
- Placera en 25G nål fäst vid hepariniserad spruta i rätt ventrikel och dra blod genom hjärtpunktion.
- Trakeostomi
- Använd försiktigt pincett/trubbiga tång för att rensa bort luftstruperegionen från överytningsvävnad. Använd handskhänder mer än de kirurgiska instrumenten för att undvika blödning. Om mycket blod sipprar ut finns det risk för att BAL-proverna kontamineras. Använd bomullspinne om det behövs, men inte att föredra. Kimwipes är bättre alternativ.
- Skär genom bröstkorgen för att exponera lungorna. Återigen, var försiktig så att du inte skär bröstbenet och de interkostala artärerna eller den stigande stora kroppspulsådern; göra mindre snitt medan du avancerar genom revbensburen)
- Passera en bomullsligatur under trakeal snip och lämna som sådan för tillfället.
- Klipp luftstrupen på en lämplig plats i den distala 1/3rd-delen, som pekar mot lungorna, för att ge tillgång till en 28 G trakeal kanyl.
- Sätt in en 28 G PE-kanyl (en minimal längd på 3-5 mm och distala änden trimmad för enkel införing) i luftstrupen. Se upp för änden av luftstrupen före bifurcation och dra sedan ca en mm tillbaka för att undvika provtagning endast en enda lob.
- Knyt bomullsklaturen ordentligt för att hålla kanylen på plats. Kollapsa inte kanylen.
- Broncho-alveolär lavage (BAL)
- Fyll 0,5 ml PBS i en 1 ml spruta.
- Injicera nu gradvis 0,5 ml PBS i kanylen med hjälp av 1 ml spruta.
- Efter injektion av PBS, aspirera ut sprutan så länge den inte motstår sugningen.
OBS: Om det finns motstånd när balvätskan aspireras ut, indikerar det kollaps av alveolär eller bronkialvävnad. I så fall, dra tillbaka kanylen med en miniscule för att lossa kanylen bilda väggarna i vävnaden. - Samla den insugna vätskan i ett märkt mikrofugerör och lägg den på is.
- Utför ytterligare två lavages på liknande sätt samla i samma flaska (dvs totalt 0,5 X 3 = 1,5 mL lavage).
- Mät volymen insamlad BAL-vätska. Lavage återhämtning bör vara nära 90%.
- Lungvaskulärt perfusat (LVP)
- Skär den fallande bröstaortan på en plats mellan bröst- och bukhalvorna, för att undvika uppbackning av perfusat i lungorna medan du perfuserar genom rätt ventrikel.
- Fläcka håligheten nära den skurna aortan, fri från blod.
- Därefter, granska lungorna med 0,5 ml rumstemperatur hepariniserad saltlösning injiceras genom rätt ventrikel.
- Samla vaskulärperfusate från håligheten vid den fallande bröstaortan, i ett mikrofugerör, placeras på is och mät dess volym.
- Ligate rätt bronchus proximal till dess förgrening från luftstrupe (med bomull tråd).
- In situ vänster lungfixering
- Anslut en 1 ml spruta till trakeal cannula, som är tillräckligt lång för att sätta in genom föregående luftstrupe snitt.
- Dra tillbaka luft i sprutan upp till 0,6 ml-märke.
- Fyll sedan den återstående sprutan (upp till slutet) med 2% paraformaldehyd vid rumstemperatur. Se till att kolven är redo att hoppa ut utan att suga tillbaka luft från kanylen.
- Fäst sprutan nu med en scotch tejp, på en upprätt behållare, mätt upp till 20 cm höjd.
- Dra försiktigt ut kolven för att låta fixeringsflödet mot luftstrupen. Om det finns några luftbubblor i kanylen, placera försiktigt kolven ovanpå sprutan så börjar vätskan flöda efter några sekunder.
- Låt vänster lunga blåsa upp till sin totala kapacitet på plats, i 5 minuter, från en 20 cm höjd som bildar en 20 cm vattenpelare.
- Under denna procedur, se till att skydda rätt lungloberna från att komma i kontakt med paraformaldehyd eftersom detta kommer att påverka nedströmsanalyserna.
- Placera vikta laboratorievävnader för att absorbera paraformaldehyd som kan komma i kontakt med rätt lungloberna.
VARNING: Paraformaldehyd är mycket giftigt. Andas därför inte in eller placera kontakt med några exponerade delar av kroppen. Var mycket försiktig vid hantering. - Under tiden för paraformaldehyd instillation, sanera buken.
- Skär av de högra lungloberna från luftstrupen och se till att ta bort någon tråd och sätt omedelbart loberna i en märkt kryovial och släpp den i flytande kväve för nedströms molekylär/ biokemisk cytokinanalys / RT-PCR / western blot analys av lunghomogenat.
- Trimma försiktigt den vänstra lungan för bindväv eller pleuramembran och doppa den i 2% paraformaldehyd i 24 timmar vid 4 °C.
- Bädda in den fasta lungan i paraffin enligt standardinbäddningsprotokollet.
Varning: Överhetta inte lungproverna. - Skär bukdelen och ta bort huden från bäckenbenet .
- Separera vänster och höger lårben från bäckendelen, i en saltlösning fylld petriskål som hålls på is.
- Bröst- och lårbensmärgsaspiratsamling
- Rengör vävnaden och musklerna från benen med hjälp av laboratorievävnader.
- Samla ventralt revben och bröstben i en saltlösning fylld Petri skål som hålls på is.
- Skär de distala och proximala spetsarna på bröstbenen och lårbenen.
- Granska benen 4 gånger med 0,5 ml saltlösning med välmonterade nålar (24 till 28 G) på till 1 ml sprutor och samla fraktionerna från varje ben i märkta rör försedda med filter och placerade på is.
OBS: Nålmätaren varierar mellan djurens storlek. Efter spolning bör lårbenet dyka upp transparent. - När proverna har samlats in, packa musen i en plastpåse och lägg i en djurkroppsfrys för korrekt bortskaffande, i enligt riktlinjerna för den institutionella djuranläggningen.
3. Provtagning
- Totalt antal leukocyter (TLC) och differentiella (DLC)
- Centrifugera perifert blod, BAL, lungvaskulär perfusat och benmärg (sternal och lårben) prover i 10 min vid 500 g.
- Samla supernatanter, flash frysa dem och lagra dem vid -80 °C tills vidare analys.
- Rekonstruera cellerna i minst 200 μL PBS.
- Utför TLC genom att räkna BAL-, blod-, lungvaskulära perfusat- och benmärgsceller på en hemocytometer.
- Färga ytterligare 9 μL alikvot bal med en 1 μL blandning av kalceingrönt och rött ethidium homodimer-1 för att kvantifiera levande (gröna) celler på grund av intracellulär esterasaktivitet och eventuella skadade BAL-celler (i rött) på grund av förlust av plasmamembranintegritet.
- Tillsätt 2% ättiksyra för att lysa RBCs, i ett 1:10-förhållande för blod TLC och 1:2-förhållande för lungvaskulärtperfusat TLC.
VARNING: Justera cellkoncentrationerna genom att späda i PBS om koncentrationen är mer än 1x106 celler per ml (mycket viktigt för benmärgsproverna). - Centrifugera cellerna för att förbereda cytospiner på diabilder och fläckar enligt nedan för DLCs. Räkna minst 100 celler för differentiella leukocytcellantal (DLCs).
OBS: Vanligtvis kan man förbereda två cytospiner på en bild. Och efter 10-15 minuters lufttorkning, fortsätt med färgningssteg. - Dela upp den insamlade BAL från tre pilotmöss per grupp i två cytospiner vardera och fläck för aktin/tubulin och mitokondrier med aktiv oxidativ fosforylering (reducerad mitotracker). Använd BAL från ytterligare tre möss för att dela upp i två cytospiner vardera, för NK1.1/Gr1/CX3CR1 och ATPβ/Ki-67/CD61/Angiostatin färgade diabilder. Dela BAL från ytterligare tre möss i två cytospiner vardera för att fläcka för ATPα/Ly6G och CX3CR1/Siglec-F.
- Bronkolveolär lavage (BAL) och Lung Vaskulär perfusat (LVP) total protein kvantifiering
- För att kvantifiera O3 och LPS framkallade krämningar av kärlbarriären eller det relativa onkotiska trycket i de två lungfacken (dvs. alveolar septal (interstitiell) och lungvaskulärt perfusat (vaskulär) fack), mät den totala proteinhalten i de insamlade vätskorna.
- Analysera de tinade supernatantfraktionerna för deras totala proteinkoncentration med hjälp av en standard tvättmedelsbeständig kolorimetrisk analys.
- Bronkolveolär lavage (BAL) och lungvaskulär perfusat (LVP) kemokinanalys
- Analysera därefter kemokinerna i BAL och lungvaskulärt perfusat (LVP) supernatanter med hjälp av en 33-plex magnetisk pärla-baserad immunoassay. Detta kommer att informera om riktningen av luftvägarna/interstitium vs vaskulär kemokine gradienter fastställs efter kombinerade exponeringar.
- Analyze the following panel of chemokines : CXCL13 (B-lymphocyte chemoattractant), CCL27 (IL-11 R-alpha-locus chemokine (ILC)), CXCL5 (epithelial-derived neutrophil-activating peptide 78 (ENA-78)), CCL-11 (eotaxin-1), eotaxin-2 (CCL-24), CX3CL1 (fractalkine), GM-CSF (CSF-2), CCL1, IFNγ (interferon gamma), IL-10 (interleukin-10), IL-16 (interleukin-16), IL-1β (interleukin-1 beta), IL-2 (interleukin-2), IL-4 (interleukin-4), IL-6 (interleukin-6), CXCL-10 (interferon gamma-induced protein 10 (IP-10)), CXCL11 (Interferon-gamma-inducible protein 9 (IP-9)), KC (keratinocyte chemoattractant), MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1), MCP-3 (monocyte chemoattractant protein-3), MCP-5 (monocyte chemoattractant protein-5), MDC (macrophage-derived chemokine (CCL22)), MIP-1α (macrophage inflammatory protein-1 alpha), MIP-1β (macrophage inflammatory protein-1 beta), MIP-2 (macrophage inflammatory protein-2), MIP-3α (macrophage inflammatory protein-3 alpha), MIP-3β (macrophage inflammatory protein-3 beta), RANTES (regleras vid aktivering, normal T-cell uttryckt och utsöndrad (CCL5)), CXCL-16, CXCL-12/SDF-1alpha (stromal cell-härledd faktor 1), TARC (tymus och aktivering reglerad kemokin (TARC)), TECK (Thymus-Uttryckt Chemokine (CCL25)) och TNFα (tumör nekrosfaktor alfa).
4. Cytospinfärgning och lung histologi
- Cytospin biokemisk färgning
- Omslut cytospinerna med en hydrofobisk penna för att innehålla kemikalierna för inkubation under proceduren.
- Återfukta cytospinerna i PBS i 5 minuter.
- Fixera cytospinproverna i 2% paraformaldehyd i 10 minuter, tvätta tre gånger med PBS i 5 minuter vardera.
- Permeabilize med iskall 70% aceton i 7 minuter och tvätta igen tre gånger med PBS i 5 minuter vardera.
- Fläck för aktin och tubulin eller reducerad Mitotracker (inkubera med en blandning av 2 μg/50 μL Alexa 488 konjugerat falloidin visat i grönt och 2 μg/μL Alexa 555 konjugerad α tubulin eller reducerad Mitotracker visas i rött) i 15 minuter.
OBS: Använd mus IgG1 isotyp kontroll antikroppar, i en separat cytospin, för att validera tubulin färgning protokollet. Utför samma steg som förklaras från 4.1.1 till 4.1.8, men för isotypkontroller. - Ta bort fläckarna genom att försiktigt tippa blandningen från bilden. Inkubera diabilderna med DAPI (4′,6-diamidino-2-fenylindole) i 5-10 min för att färga atomkärnor.
- Tvätta cytospinerna 3 gånger med PBS i 5 min vardera, täcklip med anti-bleka monteringsmedier och förvara över natten i mörker vid rumstemperatur före avbildning.
- Skaffa bilder under ett brett fält upprätt mikroskop utrustat med en vetenskaplig kamera. Se till att konsekventa exponeringstider för kameran ställs in för de olika fluorescerande kanalerna när du avbildar bilder.
- Cytospin immun-fluorescerande färgning:
- Omslut cytospinerna med en hydrofobisk penna för att innehålla kemikalierna för inkubation under proceduren. Återfukta cytospinerna i PBS i 5 minuter.
- Fixa cytospinproverna genom att inkubera i 2% paraformaldehyd i 10 minuter, tvätta tre gånger med PBS i 5 minuter vardera.
- Permeabilize med 0,1% kall triton X-100 i 2 minuter, tvätta tre gånger med PBS i 5 min vardera.
- Därefter, Fc block i 15 minuter genom att inkubera cytospin med 1:50 utspädning av Fc block antikroppar lager (för att säkerställa att den primära mus antikroppar inte kors-reagera icke-specifikt med musen Fc antikroppar).
- Tippa bilderna för att ta bort Fc-blocket och byt till 1% BSA för och inkubera cytospinen med en blandning av 3 primära antikroppar av intresse (se tabell 1 för de olika kombinationerna) i 30 minuter.
OBS: Se till att köra isotypkontrollantikroppar (inkubera med en blandningsmus IgG1 och råtta IgG2b kappa primära antikroppar genom att utföra steg 4.2.1 till 4.2.9 och ersätta antikropparna med isotyp kontroller) parallellt med motsvarande sekundära antikroppar som diskuteras i vår senaste studie20. - Tvätta 3 gånger med PBS i 5 minuter vardera. Inkubera cytospinerna med en blandning av lämpligt utformade sekundära antikroppar (se tabell 1 för mer information).
- Ta bort fläckarna genom att försiktigt tippa blandningen från bilden, inkubera med DAPI (4′,6-diamidino-2-fenylindol) i 5-10 min till fläckkärnor. Tvätta 3 gånger med PBS i 5 minuter vardera.
- Täcklip med anti-bleka monteringsmedier och förvara över natten i mörker vid rumstemperatur före avbildning.
- Skaffa bilder under ett brett fält upprätt mikroskop utrustat med en vetenskaplig kamera. Se till att konsekventa exponeringstider för kameran ställs in för alla fluorforkanaler när du avbildar bilder.
- Hematoxylin och eosin (H&E) histologi
- Utför modifierad H&E-färgning 3 på lung cryo-sektioner för alla grupper.
- Bildanalys
- Bearbeta och analysera bilddatafiler (.tiff) i Fiji ImageJ öppen programvara (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
- Kontrollera de parametrar (Område, Omkrets, Integrerad densitet, Formbeskrivningar, Ferets diameter, Cirkularitet, Displayetikett) som ska registreras under fliken Analysera och Ange mått.
- Använd ROI-chefenoch skissera manuellt cirka 50-200 celler på den kopplade bildpanelen med verktyget "frihandsval". Spara intresseregionerna (ROI) med kommandot Ctrl+T och kopiera de sparade ROM-områdena för varje cell till alla fluoroforkanaler.
- Tryck sedan på Ctrl+M för att mäta de förinställta parametrarna för alla fluorescerande kanaler (t.ex. 405 nm (DAPI eller ATPβ i blått), 488 nm (aktin eller NK1,1 eller Ki-67 i grönt), 568 nm (tubulin eller Gr1 eller CD61 i rött) och 633 nm (CX3CR1 eller angiostatin i magenta)).
- Spara resultaten som .csv filen under ett lämpligt namn som representerar analysen. Kopiera resultaten från .csv-filen till ett kalkylblad och dela fluorescensintensiteten (FI) (som är raw integrated density-kolumnen från resultatfilen) för den färgade molekylen med DAPI eller CD61 FI, enligt färgningsdesign. Dessa nyckeltal kallas "DAPI- eller CD61-normaliserade FI-förhållanden".
- Därefter ritar du dessa normaliserade förhållanden, cirkularitet, cellomkrets och feretdiameter, för att utvärdera eventuella förändringar i cellstorlek efter den kombinerade O3- och LPS-exponeringen.
- Använd lämplig statistisk programvara för att kontrollera normaliteten hos de insamlade uppgifterna och för att testa nollhypotesen (se avsnittet om statistisk analys nedan).
- statistisk analys
- Expressresultat som medelvärde ± SEM. Minst tre möss användes per grupp.
- För kemokine dataanalys, justera enkelriktade ANOVA p-värden för falsk upptäcktsfrekvens enligt Benjamini och Hoshberg korrigering.
- Analysera bildparametrar, celluläritet, feretdiameter, omkrets, DAPI eller CD61 normaliserade fluorescensintensitetsförhållanden genom Mann-Whitney U-test (för jämförelse av två grupper) eller Kruskal Wallis-test (för jämförelse av flera grupper) eftersom dessa data normalt inte distribuerades.
- För resten av bildexperimenten analyserar du resultaten med hjälp av en enkelvägsanalys av varians följt av Sidaks flera jämförelser. p-värden <0,05 ansågs signifikanta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kombinerad O3- och LPS- exponering leder till systemisk inflammation och benmärgsmobilisering vid 72 h: Cellantal i olika fack visade betydande förändringar i perifert blod och lårbensmärgens totala cellantal vid kombinerade O3- och LPS- exponeringar. Även om kombinerade O3- och LPS- exponeringar inte medförde några förändringar i det totala antalet balceller(figur 1A)eller LVP-celler (figur1B),presenterades polymorfukleära celler som den dominerande celltypen vid 24 (figur 1F, kompletterande figur 1),36 och 72 timmar efter exponering. Observera att Siglec-f- och CX3CR1-färgning i polymorfonukleära celler vid 24 h BAL cytospinbild (Figur 1F). Trippel DAPI/CD11b/Gr1 färgning av BAL cytospiner visade närvaro av stora CD11b- och Gr1-positiva mononukleära celler som är makrofager vid 0 h, som ändras till mindre polymorfonukleära celler som visar punctate Gr1staining men saknar CD11b färgning vid 4 h (som visas i inset i kompletterande 1F). Majoriteten av BAL-cellerna är polymorfonukleära och positiva för både CD11b och Gr1, vid 24 h efter exponering(kompletterande figur 1).
Mössen uppvisade systemisk leukocytos vid 24 h (3,3 gånger jämfört med 0 h, p<0,05, figur 1C) följt av leukopeni vid 72 timmar, vilket markerades med 13 gånger lägre antal perifert blod jämfört med 24 timmar (p<0,01) och en 8,6 gånger lägre än 4 timmar (p<0,05) efter kombinerad O3- och LPS-exponering (figur 1C). Sternala benmärgsceller var också oförändrade jämfört med 0 h eller efter kombinerad O3- och LPS- exponering (figur 1D). Antalet lårbensmärg visade en sen 28,8-faldig spik vid 72 h jämfört med 0 h (p<0,01, figur 1E)samt andra tidpunkter (p<0,01, figur 1E). Visualisering av LVP och sternala samt lårbensmärgsceller visade också förändringar i celltyperna till övervägande polymorfonukleära celler (Kompletterande figur 1). Sternala benmärg celler visade tecken på skador som framgår av extracellulärt kärnämne. Lårbensmärgen visade högre antal positiva cd11b- och gr1-celler (kompletterande figur 1), vilket sammanfaller med cellantalet.
BAL totala proteinhalten var högst på 36 h efter kombinerad O3- och LPS-exponering: Kvantifiering av de totala proteinerna i LVP- och BAL-avdelningarna utfördes för att korrelera ozoninducerat lungödem, dvs. plasmaproteinutsöndring på grund av resulterande kärl- och epitelbarriärnedsättning på grund av den kombinerade exponeringen. BAL-totalproteinet var 4,5 gånger högre vid 36 h (p<0,05) jämfört med 4 timmar (figur 2A). LVP-proteinet var dock oförändrat efter exponering (figur 2B).
Kombinerad O3- och LPS- exponering inducerar starka kemokingradienter i lungvaskulärt utrymme och inte BAL: Chemokine multiplexanalyser utfördes på både BAL- och LVP-supernatanter. Observera att de relativa skillnaderna mellan dessa två avdelningar utgör förmånsbevarande i ett visst fack. Eosinofil chemoattractant eotaxin-2 var 4,3 gånger högre vid 4 h i LVP-facket jämfört med 0 h (p<0,05, figur 3A). I BAL-facket var eotaxin-2 3,2 gånger lägre vid 4 h jämfört med 0 h (p<0,01, figur 3B). BAL-eotaxin-2-nivåerna fortsatte att minska konsekvent fram till 72 timmar med 12,6-faldig minskning jämfört med 0 h (p<0,01, figur 3B). Lymfocyt chemoattractant IL-2 var 10,1 gånger högre vid 4 h i LVP-facket jämfört med 0 h (p<0,05, figur 3C). I BAL-facket var IL-2 5,0 gånger lägre vid 36 h jämfört med 0 h (p<0,05, figur 3D). BAL-eotaxin-2-nivåerna fortsatte att minska konsekvent 5,9 gånger sänkningen vid 72 h jämfört med 0 h (p<0,05, figur 3D).
Intressant nog ändrades många kemokiner vid 4 h, i LVP och inte BAL. De flesta av dessa kemokiner visade blygsam, men ändå betydande, ökning av LVP nivåer på 4 h jämfört med senare tidpunkter. Även om eotaxin-1-nivåerna inte var höga efter exponeringarna jämfört med 0 h, men nivåerna var signifikant höga vid 4 h jämfört med 24 (2, 7- faldiga, p<0,05) och 72 h (5, 0 gånger, p<0,01, figur 4A)efter kombinerad exponering. Halterna av LVP TNFα var 3,4 gånger högre vid 4 h jämfört med 36 timmar (p<0,05, figur 4B). På samma sätt var LVP IFNγ 2,9 gånger högre vid 4 h jämfört med 72 h (p<0,05, figur 4C). CX3CL1-nivåerna var också höga vid 4 h jämfört med 24 (1,7-faldiga, p<0,05), 36 (1,6-faldiga, p<0,05) och 72 h (2,2-faldiga, p<0,01) efter kombinerade exponeringar(figur 4D). CCL27-nivåerna visade högre nivåer vid 4 h också jämfört med 24 (2,7-faldiga, p<0,05), 36 (3,9-faldiga, p<0,01) och 72 h (2,9-faldiga, p<0,05) efter kombinerade exponeringar (Figur 4E).
Vissa kemokiner hade en stark närvaro i LVP vid 4 h efter kombinerade exponeringar, och inte ändras i BAL före och efter exponering, vilket indikerar ett starkt kemokine svar från pulmonell kapillärer. Vid 4 h, IL-16 LVP-nivåerna var 3,4 gånger jämfört med 0 h (p<0,01), 3,2 gånger jämfört med 24 h (p<0,01), 2 4,5 gånger jämfört med 36 timmar (p<0,01) och 4,6 gånger jämfört med 72 timmar (p<0,01) efter kombinerade exponeringar(figur 4F). Vid 4 h, neutrofila chemokin, CXCL5 LVP-nivåerna var 2,0 gånger jämfört med 0 h (p<0,01), 4,7 gånger jämfört med 24 h (p<0,01), 2 2 gånger jämfört med 36 timmar (p<0,01) och 2,7 gånger jämfört med 72 timmar (p<0,01) efter kombinerade exponeringar(figur 4G). Vid 4 h, CXCL10 LVP-nivåerna var 2,3 gånger jämfört med 0 h (p<0,01), 2,1 gånger jämfört med 24 h (p<0,05), 2 5 gånger jämfört med 36 timmar (p<0,01) och 2,7 gånger jämfört med 72 timmar (p<0,01) efter kombinerade exponeringar(figur 4H). Vid 36 h var neutrofilkemin, SDF1α LVP- nivåerna 4, 2 gånger jämfört med 0 h (p<0,01), 2,9 gånger jämfört med 24 h (p<0,05), 6, 8 gånger jämfört med 72 h (p<0,01) efter kombinerade exponeringar (figur 4I). Vid 4 h var MIP3β LVP-nivåerna 2, 3 gånger jämfört med 0 h (p<0,05) och 2,3 gånger jämfört med 72 h (p<0,05) efter kombinerade exponeringar(figur 4J).
Kombinerad O3- och LPS- exponering inducerar nekros, stör cellulär cytoskelettal, plasmamembran och mitokondriell integritet: Eftersom antalet cellulära leukocyter och proteininnehållet inte korrelerade med LVP-kemokingradienterna blev det viktigare att visualisera cellerna som erhållits från dessa fack. Ex vivo-nan/tubulinfärgning av baslinje (0 h) BAL-celler visade förekomst av näraktin, stressfibrer samt lamellipodi (visas i grönt, figur 5 vänster övre panel) och mikrotubulenätverk (visas i rött, figur 5 vänster övre panel) som sammanföll med minskad mitotrackerfärgning som indikerar närvaro av aktiv mitokondrier (visas i rött, figur 5 vänster nedre panel). Mer än 95% av BAL-cellerna var mononukleära vid baslinjen. Vid 4 h visade BAL-celler extracellulärt kärnämne, punktlig cytoplasmisk aktinfärgning utan lamellipodi och minskad kortikal aktinfärgning (visas i grönt, figur 5 höger övre panel), fanned microtubule nätverk (visas i rött, figur 5 höger övre panel) som inte motsvarade den reducerade mitotracker färgning (visas i rött, figur 5 vänster höger panel). DAPI normaliserad aktinfluensa intensitet analys visade en 3,7-faldig minskning av förhållandet som indikerar minskning av aktin färgning vid 4 h efter exponering (p<0,01, figur 6A). På samma sätt minskade DAPI-normaliserad tubulinfluorescerande intensitet också med 1, 5 gånger efter exponering (p<0,01, figur 6B), vilket indikerar en minskning av tubulinfärgning. Förlusten av lamellipodia var uppenbar med en ökning av cirkulariteten i BAL cellulära cytoskeleton omedelbart, dvs. vid 2 h (p<0,01, Figur 6C) och 4 h (p<0,05, figur 6C) efter exponering jämfört med 0 timmar och en minskning av cytoskeletal cirkulariteten vid 24 (p<0,05) och 36 timmar (p<0,01) efter exponering, jämfört med 0 h (figur 6C).
Upp till 24 timmar var BAL-cellerna från den kombinerade exponeringen dubbelt positiva för kalcein (i grönt, figur 7) som indikerar förekomst av aktiv esterasaktivitet och ethidium homodimer (i rött, figur 7), vilket indikerar att även om vissa celler var döda (röda), var majoriteten delvis komprometterade celler. Vid 36 h var BAL-cellerna till stor del livskraftiga (gröna), vilket indikerar att de komprometterade cellerna ersätts av leukocyter som rekryterats från andra systemiska fack (figur 7).
Specifik ATPα- och Ly6G-färgning av BAL-cellerna visade diskret intracellulärlokalisering (filmer 1 och 2)av både proteinerna i alveolära makrofager samt neutrofiler efter exponering (figur 7). Den kombinerade exponeringen ledde till en minskning av det normaliserade fluorescerande intensitetsförhållandet för DAPI för ATPα(figur 7,8A) och en ökning av intracellulärt Ly6G-proteininnehåll(figur 7, figur 8B,filmer 1 och 2). Minskning av ATPα färgning, vid 24 h efter exponering, korrelerad med lägre tubulin och i viss mån minskad mitotracker färgning. Vi observerade också anuclear ATPα positiva cellkroppar efter exponering, som kan vara trombocyter. Vi bekräftade dock inte våra resultat. Vid 2 h observerade vi mindre mononukleära BAL-celler (p<0,01 Figur 8C, p<0,01 Figur 8D) jämfört med 0 h men vid 4 h var de mononukleära cellerna större (p<0,01 Figur 8C,p<0,01 Figur 8D) jämfört med 0 h. Vid 24 (p<0,01 figur 8C,p<0,01 figur 8D) och 36 timmar (p<0,01 figur 8C,p<0,01 figur 8D)blev BAL-cellerna gradvis mindre på grund av en övergång till polymorfonukleära celler, jämfört med 0 h.
Immunophenotypning av BAL celler visade övergående uttryck för NK1,1, ATP β och Ki-67 och ihållande uttryck av Gr1, CX3CR1 och angiostatin positiva BAL celler efter kombinerade O3 och LPS exponeringar: Immunofluorescent färgning av den första uppsättningen BAL cytospiner normaliserades till DAPI färgning. Det fanns en ökning av de cellulära NK1,1 positiva cellerna vid 24 h (p<0,05 vs 0 h, figur 9, 10A). Vid 36 h hade BAL-cellerna lägre cellulär NK1,1 fluorescerande intensitet (p<0,01 vs 0 och 24 h, figur 9, 10A). Den cellulära gr1 fluorescerande intensiteten var högre vid 24 h (p<0,01 vs 0 h, figur 9, 10B) samt 36 timmar (p<0,01 vs 0 h, figur 9, 10B). På samma sätt var den cellulära fluorescerande CX3CR1-intensiteten högre vid 24 h (p<0,01 vs 0 h, figur 9, 10C) samt 36 h (p<0,01 vs 0 h, figur 9, 10C).
När den normaliseras till cellulär CD61 som också är allestädes närvarande i uttryck, visade en ökning av cellulära ATPβ fluorescerande intensitet vid 24 h (p<00.01 vs 0 h, figur 9, 10D) och en minskning av cellulära ATPβ fluorescerande intensitet vid 36 h (p<0.01 vs 0 och 24 h, Figur 9,10D). I synnerhet visade ATPβ huvudsakligen kärn- lokalisering på 24 h jämfört med perifer lokalisering på 36 h (Figurerar 9). Den cellulära fluorescerande intensiteten hos BAL Ki-67, en indikator på cellulär spridning, var högre vid 24 h (p<0,01 vs 36 h, figur 9, 10E) jämfört med 0 och 36 h. Nivåerna låg under baslinjenivåerna vid 36 h (p<0,01, figur 9, 10E),troligen på grund av högre polymorfo-nukleär CD61 vs Ki-67 uttryck vid 36 h (Figur 9). Slutligen var den cellulära fluorescerande intensiteten i BAL angiostatin genomgående hög vid både 24 och 36 h (p<0,01 vs 0 h, figur 9, 10F), vilket indikerar en specifik ökning av detta metalloproteinas klyvda plasminogenfragment, under lunginflammatoriska svaret.
Kombinerade exponeringar ger omfattande lungskador: Lung histologi visade att de kombinerade exponeringarna ger långvariga skador på lungor som ses i H&E-färgade cryosections (Figur 11). Även om bronkiolära och alveolära septal skador förväntades, var det surprizing att observera endotelskador av större fartyg, vid 36 h efter exponering (Figur 11). Det fanns vidhäftande intravaskulära leukocyter, fläckar av leukocytaggregat (inklusive neutrofiler) i de skadade alveolära septal- och peri-bronkiolära regionerna (figur 11).
Figur 1: Antal leukocyter i avdelningarna: A) Bronchoalveolar lavage (BAL) totala antalet leukocyter vid 0 (dvs. baslinjen), 4, 24, 36 och 72 h efter kombinerad 0, 05 ppb ozon (O3)och 50 μg intranasal LPS exponering för möss. B) Lungvaskulärt perfusat (LVP) total leukocytkoncentration vid 0 (dvs. baslinje), 4, 24, 36 och 72 timmar efter kombinerad 0, 05 ppb ozon (O3)och 50 μg intranasal LPS exponering för möss. C) Perifert blod (PB) total leukocytkoncentration vid 0 (dvs. baslinje), 4, 24, 36 och 72 timmar efter kombinerad 0, 05 ppb ozon (O3)och 50 μg intranasal LPS exponering för möss. D) Sternal benmärg (BM) total leukocytkoncentration vid 0 (dvs. baslinje), 4, 24, 36 och 72 h efter kombinerad 0, 05 ppb ozon (O3)och 50 μg intranasal LPS exponering för möss. E) Lårbensmärg (BM) total leukocytkoncentration vid 0 (dvs. baslinje), 4, 24, 36 och 72 h efter kombinerad 0,05 ppb ozon (O3)och 50 μg intranasal LPS exponering för möss. För graferna A-E representeras 0 h i blått, 4 h i rött, 24 timmar i grönt, 36 timmar i lila och 72 h i orange datapunkter; * p<0.05 och ** p<0.01. F) Representativ BAL cytospin glidning från 24 h exponering, visar mononukleära och polymorphonuclear celler när de färgas för atomkärnor med DAPI (i blått), CX3CR1 (i grönt) och Siglec-F (i rött). Observera att sammanfogning av CX3CR1 och Siglec-F visas som orangegula. Majoriteten av mononukleära celler är positiva för Siglec-F, som är ett kännetecken för alveolära makrofager. Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Total proteinklikifiering: A) Bronkolveolär lavage (BAL) total proteinhalt och B) Lungvaskulärt perfusat (LVP) total proteinkoncentration uppskattades avPierce 660 nm proteinanalys (Thermoscientific, IL, US). För diagrammen A-B representeras 0 h i blått, 4 h i rött, 24 timmar i grönt, 36 timmar i lila och 72 timmar i orange datapunkter; * p<0.05. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Lung Eotaxin-2 och IL-2 kemokingradienter: Av de 33 kemokinerna, Två kemokiner som har förändrats avsevärt i lungvaskulärt perfusat (LVP) och bronkolalveolär lavage (BAL) och vätska efter kombinerat ozon på 0,05 ppb (O3)och 50 μg intranasal LPS exponering för möss A) LVP eotaxin-2, B) BAL eotaxin-2, C) LVP IL-2 och D) BAL IL-2. Data analyserades av enkelriktad anova och p-värdet för falsk identifieringshastighet för flera variabler justerades enligt Benjamini- och Hoshberg-korrigering. För graferna A-D representeras 0 h i blått, 4 h i rött, 24 h i grönt, 36 h i lila och 72 h i orange datapunkter. Par-wise jämförelser analyserades efter Bonferronis korrigering. * representerar p<0,05, ** representerar p<0,01. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Lungvaskulära perfusatkemiska koncentrationer: Koncentrationerna av ytterligare tio kemokiner ändrades, men endast i lungvaskulärt perfusat (LVP) fack. A) Eotaxin-1, B) TNFα, C) IFNγ, D) CX3CL1, E) CCL27, F) IL-16, G) CXCL5, H) CXCL10, I) SDF1α och J) MIP3β. För graferna A-J representeras 0 h i blått, 4 h i rött, 24 h i grönt, 36 h i lila och 72 h i orange datapunkter. Par-wise jämförelser analyserades efter Bonferronis korrigering. * representerar p<0,05, ** representerar p<0,01. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5:Bronchoalveolar lavage (BAL) cytospin aktin/tubulin och minskad mitotrackerfärgning: Representativa bilder av tektin/tubulinfärgade BAL-cytospiner från A) 0 h och B) 4 timmar efter kombinerad 0,05 ppb ozon (O3)och 50 μg intranasal LPS exponering för möss. Observera att DAPI visas i blått, i grönt och tubulin i rött. Representativa bilder avreducerade mitotracker färgade BAL cytospiner från A) 0 h och B) 4 h efter kombinerade 0,05 ppb ozon (O3)och 50 μg intranasal LPS exponering för möss. Observera att DAPI visas i blått och reducerad mitotracker i rött. Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6:Bronchoalveolar lavage (BAL) cytoskeletal protein och cirkularitet analys: BAL cytospiner färgas för aktin och tubulin analyserades för DAPI normaliserade parametrar dvs. A) Actin till DAPI fluorescerande intensitet (FI) förhållandet vid 0 och 4 h, B) Tubulin till DAPI fluorescerande intensitet (FI) förhållande vid 0 och 4 h och C) BAL celluläritet vid 0 (n=75 celler), 2 (n=105 celler), 4 (n=66 celler), 24 (n=31 celler), 36 (n=154 celler) h. Eftersom några pilotexperiment utfördes också omedelbart efter O3- och LPS-exponeringar, dvs. vid 2 h tidpunkt, inkluderade vi också några mycket tidiga BAL-celluläritetsanalyser från 2 h-tidpunkten för att belysa de omedelbara effekterna av O3. För graferna A-C representeras 0 h i blått, 2 h i rött, 4 h i grönt, 24 timmar i lila och 36 timmar i orange datapunkter. * representerar p<0,05, ** representerar p<0,01. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 7:Bronchoalveolar lavage (BAL) intracellulär och plasma membran status: BAL celler var färgade för vitala fläckar, calcein (i grönt) och ethidium homodimers/EthHD (i rött) som visas i representativa övre bildpaneler vid A) 0, B) 24 och C) 36 h efter O3 och LPS exponeringar. Skala bommar för = 200 μm. BAL cytospins immunostaineds för DAPI (i blått), ATPα (i gräsplan) och Ly6G (i rött). Representativa bilder visas i de nedre bildpanelerna vid A) 0 och B) 24 timmar efter O3- och LPS-exponeringar. Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8:Bronchoalveolar lavage (BAL) mitokondriellt protein ATPα, lysosomalprotein Ly6G och cellstorleksanalys: Immunostained BAL-celler normaliserades för DAPI till beräkning A) ATPα till DAPI fluorescerande intensitet (FI) och B) Ly6G till DAPI FI-förhållande, vid 0 och 24 h efter O3- och LPS-exponeringar. Immunostained BAL celler analyserades också för deras A) längsta dvs. iller diameter och B) omkrets, vid 0, 2, 4, 24 och 36 h efter O3 och LPS exponeringar. För diagrammen A-D representeras 0 h (n=119 celler) i blått, 2 h (n=105 celler) i rött, 4 h (n=66 celler) i grönt, 24 h (n=309 celler) i lila och 36 timmar (n=154 celler) i orangea datapunkter. * representerar p<0,05, ** representerar p<0,01. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 9:Bronchoalveolar lavage (BAL) intracellulär fenotypning: BAL-celler var immunstained för DAPI (i blått), NK1.1 (i grönt), Gr1 (i rött) och CX3CR1 (i magenta) som visas i representativa övre bildpaneler vid A) 0, B) 24 och C) 36 h efter O3 och LPS exponeringar. Skala stång = 50 μm. BAL cytospiner var immunostained för ATPβ (i blått), Ki-67 (i grönt), CD61 (i rött) och angiostatin (i magenta). Representativa bilder visas i de nedre bildpanelerna vid A) 0, B) 24 och C) 36 timmar efter O3- och LPS-exponeringar. Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10: Bronchoalveolar lavage (BAL) mitokondriellt protein ATPβ. Lysosomalprotein Gr1, intracellulär CX3CR1- och angiostatinanalys: Immunostained BAL-celler normaliserades för DAPI till beräkning A) förhållandet mellan NK1,1 och DAPI fluorescerande intensitet (FI), B) Gr1 till DAPI FI-förhållande och C) CX3CR1 till DAPI FI-förhållande, vid 0, 24 och 36 h efter O3- och LPS- exponeringar. Immunostained BAL celler normaliserades för CD61 att beräkna A) ATPβ till DAPI fluorescerande intensitet (FI) förhållande B) Ki-67 till DAPI FI förhållande och B) Angiostatin (ANG) till DAPI FI förhållandet, vid 0, 24 och 36 h efter O3 och LPS exponeringar. För diagrammen A-F representeras 0 h (n=21 celler) i blått, 24 timmar (n=796 celler) i rött och 36 h (n=2692 celler) i gröna datapunkter. * representerar p<0,05, ** representerar p<0,01. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 11: Lung hematoxylin och eosin (H&E) histologi. Ozon (O3)och LPS inducerad lung cryosection H&E histologi vid 0, 24 och 36 h efter kombinerade O3 och LPS exponeringar. Regioner med alveolära epitelskador kännetecknas av solida svarta pilar och endotelskador av svarta pilhuvuden. Gula asterisker (*) representerar fläckar av leukocyter i de alveolar septal regionerna. A = alveolärt utrymme, B = bronk, V = vaskulatur, skalstång = 100 μm för vänster bildpaneler och 50 μm för bildpaneler på höger sida. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| S.No. | Primär antikropp | Invitrogen sekundär antikropp |
| 1 | Mus anti-NK1.1 IgG2a kappa (klon PK136), Invitrogen Katalog nr 16-5941-82 | Alexa 488 konjugerade get antimus IgG (H+L), katalog nr. A11002 (på 11002) |
| 2 | Råtta anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (klon RB6-8C5), Invitrogen Katalog nr 53-5931-82 | Alexa 568 konjugerade get anti-rat IgG (H+L), Katalog nr. A11077 (på 11077) |
| 3 | Kanin anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880), Invitrogen Katalog nr 14-6093-81 | Alexa 633 konjugerade get antikanin IgG (H+L), Katalog nr. A21070 (på 21070) |
| 4 | Mus anti-ATP5A1 IgG2b (klon 7H10BD4F9), Invitrogen Katalog nr 459240 | Alexa 488 konjugerade get antimus IgG (H+L), katalog nr. A11002 (på 11002) |
| 5 | Råtta anti-Ly6G IgG2a kappa (klon 1A8), Invitrogen Katalog nr 16-9668-82 | Alexa 568 konjugerade get anti-rat IgG (H+L), Katalog nr. A11077 (på 11077) |
| 6 | Mus anti-ATP5β IgG2b (klon 3D5AB1), Thermofisher Katalog nr. A-21351 | Alexa 350 konjugerad get antimus IgG (H+L), katalog nr. A11045 (på 11045) |
| 7 | Råtta anti-Ki-67 (klon SolA15) IgG2a kappa, Invitrogen Katalog nr 14-5698-82 | Alexa 568 konjugerade get anti-rat IgG (H+L), Katalog nr. A11077 (på 11077) |
| 8 | Armenisk hamster anti-CD61 (klon 2C9. G2) IgG1 kappa, BD Katalog nr 553343 | Alexa 568 konjugerade get anti-hamster IgG (H+L), Katalog nr. A21112 (på 21112) |
| 9 | Kanin anti-angiostatin (mus aa 98-116) IgG, Abcam Katalog nr. ab2904 (på 2904) | Alexa 633 konjugerade get antikanin IgG (H+L), Katalog nr. A21070 (på 21070) |
Tabell 1: Primära och sekundära antikroppskombinationer som används för att färga cytospiner som framställs från proverna.
| Avläsning | Bal | LVP (på LVP) | Pb | SBM (SBM) | FBM (på FBM) |
| Tlc | * | * | + vid 24 timmar, - vid 36, 72 h | + vid 72 h | |
| Neutrofiler | + vid 24, 36, 72 h | + vid 24 h | * | + vid 4, 24, 36, 72 h | + vid 4, 24, 36, 72 h |
| protein | + vid 36 h | * | n.d. | n.d. | n.d. |
| Kemokine profil | - För eotaxin-2, IL-2 vid 4, 24, 36, 72 h | + för Eotaxin-1/2, IL-2, TNFα, IFNγ, CX3CL1, CCL27, IL-16, CXCL5, CXCL10, MIP3β vid 4 h; + för SDF1α vid 36 h | n.d. | n.d. | n.d. |
| Cellstorlek | + vid 4 h, - vid 24, 36 h | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. |
| ATPα (atpα) | - vid 24 h | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. |
| NK1.1/Ki-67 | + vid 24 h | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. |
| ATPβ/Gr1/CX3CR1/ANG | + vid 24, 36 h | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. |
Tabell 2: En omfattande sammanfattning av studiens huvudresultat i olika delområde. * betecknar ingen förändring, + betecknar en ökning och - betecknar en minskning av de uppmätta parametrarna. BAL betecknar broncho-alveolar lavagevätska, LVP betecknar lungvaskulärt perfusat, PB betecknar perifert blod, SBM betecknar bröstbenmärg och FBM betecknar lårbensmärgsfacket.
Kompletterande figur 1: Gr1 och CD11b immunostaining: Representativa bilder från DAPI (i blått), Gr1 (i grönt) och CD11b (i rött) fluorescerande immunostained cytospin diabilder av lung vaskulär perfusat (LVP), sternala benmärg (BM) och lårbenmärg (BM) fack vid 0, 4 och 24 h efter kombinerade O3 och LPS exponeringar. Skala bar = 50 μm. Klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande film 1 Tredimensionell återges volym BAL-makrofager från 0 h tidpunkt (dvs. baslinje), som visar kärnan (visas i blått) och immunostained för ATPα (visas i grönt) och Ly6G (visas i rött). Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Kompletterande film 2: Tredimensionell återges volym BAL-makrofager från 24 h tidpunkt efter kombinerade O3- och LPS-exponeringar, som visar kärnan (visas i blått) och immunostained för ATPα (visas i grönt) och Ly6G (visas i rött). Observera närvaron av anuclear ATPα positiva kroppar samt en fragmenterad cell. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De metoder som presenteras i den aktuella studien belyser nyttan av multipel fackanalys för att studera flera cellulära händelser under lunginflammation. Vi har sammanfattat resultaten i tabell 2. Vi och många laboratorier har studerat murinsvaret på intranasal LPS-instillation, vilket kännetecknas av snabb rekrytering av lung neutrofiler, som toppar mellan 6-24 h varefter upplösningen sparkar in. Och nyligen har vi visat att subkliniska O3 (vid 0,05 ppm för 2 h) ensam kan inducera betydande lungskador i C57BL/6NJ sub-stam15, som kännetecknas av partitionering av neutrofiler i lungvaskulära kupé, medan skadade makrofager och skräp observerades i BAL, vilket indikerar den inflammatoriska potentialen hos O3. I den modellen observerade vi en avsaknad av neutrophils i alveolar utrymmet till följd av O3 inducerad alveolar epitelial skada och resulterande fagocytosis av de alveolar makrofager. Inte bara observerade vi extracellulärt DNA och skräp i O3-modellen, BAL-makrofager var dysmorfa som korrelerar med höga IL-16-nivåer, ett alarmin som vanligtvis frigörs genom döende neutrofiler. Därför är det viktigt att förstå om dessa subkliniska O3-nivåer kan påverka immunsvaret i annars robust C57BL/6J-substam, som noterats med suprafysiologiska O3-nivåer 21. Vi observerade att kombinerade O3 och intranasal bakteriell endotoxin inducerad neutrofil rekrytering i pulmonell samt systemiska fack, kännetecknas av förekomsten av skadade neutrophils i BAL, lung vaskulär perfusate, sternal och lårbenmärg fack börjar vid 4 h som förblev hög vid 24, 36 och 72 h. Cellulära skador representerades som förlust av när aktin och lamellipodia och ökning av cellstorlek i BAL leukocyter. neutrofiler, analyseras i BAL-facket, visade betydligt minskad positiv reaktivitet mot mikrotubule, ATP syntas komplexa V underavdelning α (ATPα) och aktiva mitokondriell fläck. Lungorna anpassar sig till denna kombinerade exponering genom att uppreglera uttrycket av cellulära ATP-syntaskomplex V-underenheter β (ATPβ) samt ATPβ ligand, angiostatin (tabell 2).
En viktig aspekt av att studera inflammation är att förstå cellulär nekros tillsammans med kemokingradienter. Det var intressant att notera att de totala leukocyträkningarna inte var olika förutom i perifert blod och lårbensmärgsfacket. Dessa observationer ledde oss att undersöka cellulära cytoskeletal mönster, storlek och immunophenotyping. Vi observerade en förlust av lamellipodi och aktiva mitokondrier i BAL celler som anger cellulära skador. När aktin organisation är en viktig egenskap hos inter-cellular signalering och de resulterande barriär egenskaper. Cytoskeletal oorganisering är således en bra markör för cellskador när nekros inte är lika uppenbart att bedöma. Även vid 36 h hade BAL-cellerna äventyrat plasmamembranet som indikeras av ethidium homodimer färgning. Omedelbart efter de kombinerade exponeringarna visade neutrofiler i BAL Gr1-positivitet men en i huvudsak negativ färgning för CD11b, som lokaliserar mot framkanten och hjälper till i alveolar septal crawlning22. Således leder de kombinerade exponeringarna till ackumulering av atypiska neutrofiler utan CD11b-proteinet. LPS inducerar inte nedreglering av CD11b. Således är denna funktion sannolikt ett resultat av O3 inducerad skada på neutrofiler.
BAL-cellerna hade en unik proteinsignatur med högre NK1,1-, Ki-67- och ATPβ-färgning vid 24 h jämfört med 0 h (tabell 2). BAL-cellerna hade högre uttryck för Gr1, CX3CR1 samt angiostatin, vid 24 samt 36 timmar jämfört med 0 h (tabell 2). Dessa resultat bekräftades av förekomsten av gradvis mer Gr1 positiva neutrofiler i BAL, vid 24 och 36 h, efter exponering (tabell 2). Förekomsten av positiva celler NK1.1, CX3CR1 och Gr1 vid 24 h indikerar rekrytering av både mononukleära och polymorfaukleära celler i BAL. Bland de mononukleära cellerna dominerade CX3CR1-positiva celler vid 36 h vilket indikerar förekomst av antingen interstitiella makrofager, trombocyter eller monocyt härledda makrofager. Införandet av både Ki-67 och angiostatin som markörer informerade oss om den proliferativa vs anti-angiogenic miljön, respektive i BAL. Således leder de kombinerade O3 och LPS exponeringar till spridning av förmodligen makrofager följt av en anti-angiogenic miljö på grund av att neutrophilic infiltration. Den övergående ökningen av ATPβ färgning kan indikera en viktig anpassning mot en ökad överlevnad av BAL leukocyter vid 24 h. Det måste noteras att ATPβ kan binda till angiostatin och hämma långvarigöverlevnad 6,23, vilket faktiskt återspeglas i det lägre Ki-67-indexet vid 36 h efter exponering.
Även om BAL-proteinet var högst vid 36 h, och inte andra tidpunkter, visade lungvaskulärt perfusat inga förändringar i proteinkoncentrationen före eller efter exponering. Det är möjligt att kärlutrymmet inte påverkades men detta är troligtvis förvirrat på grund av oxidation av elektronrika aminosyror som metionin, histidin och cystein av O3 inducerade fria radikaler och resulterande tensidproteiner (SP-A, SP-B) nedbrytning samt vaskulär läcka24,25,26. Kvantifiering av BAL IgM, BAL-tensidproteiner, BAL-albumin eller färgextravasation (med Evans blå eller fluorescein iso-tiocyanat (FITC) dextran) är alternativa metoder för att bedöma epitel- och endotelintegritet.
Intressant nog höjdes lung vaskulär perfusat nivåer av eotaxin-2 och IL-2 akut vid 4 h tidpunkt. BAL eotaxin-2- och IL- 2- nivåerna minskade signifikant efter exponering, vilket indikerar antingen nedbrytning i det alveolära utrymmet eller entrapment i lungvaskulaturen. Fler kemokiner som analyserats i lungvaskulärt perfusat visade högre nivåer av eosinofilt kemokin (eotaxin-1), TNFα, IFNγ, lymfkörtel härledda mononukleära cellkemikasin (CX3CL1, CXCL10, CCL27, MIP3β), epitelial härledd neutrofila chemokine (CXCL5) och alarmin (IL-16) släppt efter sekundär nekros av neutrofiler27, men endast vid 4 h efter exponering. Vid 36 h var benmärgen härledd pan-leukocyt chemokine, SDF1α28, högre i lung vaskulär perfusate. De benmärg härledda SDF1α koncentrationerna korrelerar med cytologi resultat där CD11b och Gr1 positiva celler är rikliga vid 24 och 36 h efter exponering. Således återspeglar kemokin och cytologiska profiler betydande leukocyt mobilisering från benmärgsfacken (tabell 2).
Vår djurmodell och forskningsresultat är avgörande med tanke på de verkliga situationerna där levande varelser i urbana miljöer sannolikt utsätts för sådana subkliniska O3 och smittämnen8. Vår murinmodell fungerar som en lättillgänglig prototyp som kan reproduceras i nivå-2 inneslutningslaboratorier för att studera lung- och extrapulmonella mekanismer för invasiv celldöd och infektioner, som är fallet med COVID-19-infektioner29. Framtida studier bör inriktas på att visualisera reparation eller uppföljning av sena faser samt kronisk exponering för att undersöka de långsiktiga cellulära anpassningarna. Således, för omfattande lunginflammation studier som involverar levande organ15 och djur16,30,31 bildframställning tekniker, den nuvarande slutpunktsstudiedesignen kan ge viktiga insikter i värd svaret på kombinerade lågdos O3 (celldöd) och LPS (immunstimulering), och därmed dechiffrera mekanismerna för akut lungskada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter eller upplysningar att göra.
Acknowledgments
Den forskning som bedrivs finansieras av presidentens NSERC-anslag samt startfonder från Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation. Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation finansieras av Innovation Saskatchewan. Fluorescensavbildning utfördes vid WCVM Imaging Centre, som finansieras av NSERC. Jessica Brocos (MSc Student) och Manpreet Kaur (MSc Student) finansierades av start-up-medlen från Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 33-plex Bioplex chemokine panel | Biorad | 12002231 | |
| 63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives | Leica | HCX PL APO CS (11506188) | |
| Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11045 | |
| Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11002 | |
| Alexa 488 conjugated phalloidin | Invitrogen | A12370 | |
| Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1A | Millipore | 05-829X-555 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L) | Invitrogen | A21112 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | |
| Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21070 | |
| Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa | BD Pharmingen | 553343 | |
| C57BL/6 J Mice | Jackson Laboratories | 64 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | Leica TCS SP5 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Invitrogen | D1306 | aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C |
| Inverted fluorescent wide field microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Ketamine (Narketan) | Vetoquinol | 100 mg/ml | Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock |
| Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit | Invitrogen | L3224 | |
| Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9) | Invitrogen | 459240 | |
| Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1) | Invitrogen | A-21351 | |
| Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136) | Invitrogen | 16-5941-82 | |
| Pierce 660 nm protein assay | Thermoscientific | 22660 | |
| Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG | Abcam | ab2904 | |
| Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880) | Invitrogen | 14-6093-81 | |
| Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa | Invitrogen | 14-5698-82 | |
| Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8) | Invitrogen | 16-9668-82 | |
| Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 53-5931-82 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2) | BD Pharmingen | 553142 | |
| Reduced mitotracker orange | Invitrogen | M7511 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | 20 mg/ml | Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock |
References
- Bhattacharya, J., Matthay, M. A. Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury. Annual Review of Physiology. 75, 593-615 (2013).
- Aulakh, G. K.
- Aulakh, G. K., Suri, S. S., Singh, B. Angiostatin inhibits acute lung injury in a mouse model. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (1), 58-68 (2014).
- Schneberger, D., Aulakh, G., Channabasappa, S., Singh, B. Toll-like receptor 9 partially regulates lung inflammation induced following exposure to chicken barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 11 (1), 1-10 (2016).
- Shah, D., Romero, F., Stafstrom, W., Duong, M., Summer, R. Extracellular ATP mediates the late phase of neutrophil recruitment to the lung in murine models of acute lung injury. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 152-161 (2014).
- Aulakh, G. K., Balachandran, Y., Liu, L., Singh, B. Angiostatin inhibits activation and migration of neutrophils. Cell Tissue Research. , (2013).
- Cakmak, S., et al. Associations between long-term PM2.5 and ozone exposure and mortality in the Canadian Census Health and Environment Cohort (CANCHEC), by spatial synoptic classification zone. Environment International. 111, 200-211 (2018).
- Dauchet, L., et al. Short-term exposure to air pollution: Associations with lung function and inflammatory markers in non-smoking, healthy adults. Environment International. 121, Pt 1 610-619 (2018).
- Delfino, R. J., Murphy-Moulton, A. M., Burnett, R. T., Brook, J. R., Becklake, M. R. Effects of air pollution on emergency room visits for respiratory illnesses in Montreal, Quebec. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 568-576 (1997).
- Peterson, M. L., Harder, S., Rummo, N., House, D. Effect of ozone on leukocyte function in exposed human subjects. Environmental Research. 15 (3), 485-493 (1978).
- Rush, B., et al. Association between chronic exposure to air pollution and mortality in the acute respiratory distress syndrome. Environmental Pollution. 224, 352-356 (2017).
- Rush, B., Wiskar, K., Fruhstorfer, C., Celi, L. A., Walley, K. R. The Impact of Chronic Ozone and Particulate Air Pollution on Mortality in Patients With Sepsis Across the United States. Journal of Intensive Care Medicine. , (2018).
- Stieb, D. M., Burnett, R. T., Beveridge, R. C., Brook, J. R. Association between ozone and asthma emergency department visits in Saint John, New Brunswick, Canada. Environmental Health Perspectives. 104 (12), 1354-1360 (1996).
- Thomson, E. M., Pilon, S., Guenette, J., Williams, A., Holloway, A. C. Ozone modifies the metabolic and endocrine response to glucose: Reproduction of effects with the stress hormone corticosterone. Toxicology and Applied Pharmacology. 342, 31-38 (2018).
- Aulakh, G. K., Brocos Duda, J. A., Guerrero Soler, C. M., Snead, E., Singh, J. Characterization of low-dose ozone-induced murine acute lung injury. Physiological Reports. 8 (11), 14463 (2020).
- Aulakh, G. K., et al. Quantification of regional murine ozone-induced lung inflammation using [18F]F-FDG microPET/CT imaging. Scientific Reports. 10 (1), 15699 (2020).
- Charavaryamath, C., Keet, T., Aulakh, G. K., Townsend, H. G., Singh, B. Lung responses to secondary endotoxin challenge in rats exposed to pig barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 3, London, England. 24 (2008).
- Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation. Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).
- Southam, D. S., Dolovich, M., O'Byrne, P. M., Inman, M. D. Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position, and anesthesia. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 282 (4), 833-839 (2002).
- Aulakh, G. K. Lack of CD34 produces defects in platelets, microparticles, and lung inflammation. Cell Tissue Research. , (2020).
- Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone. Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).
- Yipp, B. G., et al. The Lung is a Host Defense Niche for Immediate Neutrophil-Mediated Vascular Protection. Science Immunology. 2 (10), (2017).
- Lee, T. Y., et al. Angiostatin regulates the expression of antiangiogenic and proapoptotic pathways via targeted inhibition of mitochondrial proteins. Blood. 114 (9), 1987-1998 (2009).
- Hawkins, C. L., Davies, M. J. Detection, identification, and quantification of oxidative protein modifications. Journal of Biological Chemistry. 294 (51), 19683-19708 (2019).
- Hemming, J. M., et al. Environmental Pollutant Ozone Causes Damage to Lung Surfactant Protein B (SP-B). Biochemistry. 54 (33), 5185-5197 (2015).
- Oosting, R. S., et al. Exposure of surfactant protein A to ozone in vitro and in vivo impairs its interactions with alveolar cells. American Journal of Physiology. 262 (1), Pt 1 63-68 (1992).
- Roth, S., et al. Secondary necrotic neutrophils release interleukin-16C and macrophage migration inhibitory factor from stores in the cytosol. Cell Death & Discovery. 1, 15056 (2015).
- Kawaguchi, N., Zhang, T. T., Nakanishi, T. Involvement of CXCR4 in Normal and Abnormal Development. Cells. 8 (2), (2019).
- Gupta, A., et al.
- Aulakh, G. K., Kuebler, W. M., Singh, B., Chapman, D. 2017 IEEE Nuclear Science Symposium and Medical Imaging Conference (NSS/MIC). , 1-2 (2017).
- Aulakh, G. K., et al. Multiple image x-radiography for functional lung imaging. Physics in Medicine & Biology. 63 (1), 015009 (2018).
