Summary
ここでは、遺伝子コード拡張を用いてアセチル化ヒストンタンパク質を発現し、再構成されたヌクレオソームをインビトロで組み立てる方法を紹介する。
Abstract
アセチル化ヒストンタンパク質は、変異体をコードする大腸菌、N ε-アセチルリジン(AcK)特異的メタノサルシナマジピロリシンtRNA合成酵素(MmAcKRS1)およびその同系tRNA(tRNAPyl)を組み立てるために容易に発現することができる。MmAcKRS1 および tRNAPylは、大腸菌での翻訳中に選択した mRNA の中で、黄色の変異部位で AcK を送達します。この技術は、H3リジンサイトでAcKを組み込むために広く使用されています.ピロリシル-tRNA合成酵素(PylRS)は、部位特異的なタンパク質修飾または機能化のために他の非カノニカルアミノ酸(ncAAs)を組み込むために容易に進化させることができる。ここでは、MmAcKRS1システムを用いたAcKをヒストンH3に組み込み、アセチル化H3タンパク質を再構成された単核球体に統合する方法を詳述する。アセチル化再構成単核体は、生化学的および結合アッセイ、構造決定、およびよりに使用することができる。新しい相互作用の発見やエピジェネティクスの理解に関連する実験を設計するには、改変単核体を得ることが重要です。
Introduction
我々は、PylRSおよびtRNAPylを利用して、部位特異的アセチル化ヒストンを有する再構成単核体を合成および組み立てる。PylRSは、翻訳後修飾(PTM)を用いてタンパク質を産生する遺伝コード拡張ツールとして非常に価値があることが証明されており、約200の異なるncAAを組み込むために遺伝的に進化してきました。PylRSは、アンバーストップコドンで組み込み、翻訳中に他のアミノ酸との競合を除去します。PylRSは、メタノジェニック古風で初めて発見され、その後、新しい反応性化学基をタンパク質1,2に組み込むために化学生物学に利用されている。
MmAcKRS1はメタノサルシナ・メイジ・ピルスから進化し、アセチル化タンパク質3、4、5、6の合成のために私たちの研究室で頻繁に使用されました。MmAcKRS1は、大腸菌での翻訳中に選択したmRNAの中で、黄色の突然変異部位でAcKを提供する。この技術は、以前にK4、K9、K14、K18、K23、K27、K36、K56、K64、およびK79ヒストンH3リシン部位にAcKを組み込み、アセチル化単核体4、5、6にサーチュイン1、2、6、および7の活性を研究するために使用されてきた。ここでは、アセチル化ヒストンを発現し、アセチル化ヌクレオソームを再構成するこの方法を詳述する。
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Protocol
1. プラスミド建設
- まず、ヒストンタンパク質がアセチル化され、どのリジン部位でアセチル化されるか決定します。サイト指向変異誘発を用いて、サイトをアンバーストップコドン(TAG)に変異させる。
注:ヒストンタンパク質の発現に利用される4つの以前に設計されたプラスミドがあります。4つのヒストンタンパク質はすべて、N末端ヒスチジンタグを用いてpETDuet-1ベクターにクローン化された。ヒストンH4はまた、SUMOタグ、約40のコピー数を有する複製 colE1 の起源、アンピシリン耐性、およびT7プロモーターを含む。- 4つのヒストンタンパク質プラスミドの1つで、目的の部位にTAG突然変異を含む前方および逆プライマー(既存のリジンコドンをアンバーストップコドンに置き換える)を設計します。
- プラスミドを含むタグを増幅するために、全プラスミドPCRを使用してください。プライマーに適したアニーリング温度を決定します。一般に、プライマーから5°Cを引いた融解温度(Tm)で十分です。PCR産物の入手が困難な場合、T m~5°C付近の温度勾配を使用して、アニーリング温度を最適化して増幅することができます。
注:この実験では、30 sの94°C(変性)、30秒のアニーリング温度、6分間(またはキロベースペアあたり1分)の72°Cの条件で、30サイクルに対して、社内で表現されたPFUポリメラーゼを使用しました。このタイプの PCR 方法の詳細については、劉とネイスミス7を参照してください。 - メーカーのプロトコルに従って PCR クリーンアップ キットを使用して PCR 製品をクリーンアップします。アガロースゲル電気泳動とそれに続く臭化エチジウム染色によりPCR産物を分析します。
- プラスミドを16°Cで一晩T4リガーゼでインキュベートしてリゲートする。
- まず、プラスミド(AmpR)を含むTAGを化学的に有能な 大腸菌に変換します。変換から最低4コロニーを選び、プラスミドを浄化します。標準的な方法を使用してグリセロールでそれぞれの細胞ストックを作り、-80°Cで保存します。 必要な TAG 変異を確認するために、シーケンス処理のために送信します。
- 配列が確認されたら、TAG含有プラスミド(AmpR)をpEVOL-AckRS(ChlR)と共に化学的に有能なCobB( 大腸菌で知られている唯一のヒストンリシンデアセチラーゼ)をヒートショック法を用いてBL21細胞を欠失させる。pEVOL は、コピー番号が低いコピー番号 p15A 原点に中間コピー番号を持つプラスミドです。
注:プラスミドのpEVOLシリーズは、直交aaaRS/tRNATyr ペアの発現増加を示す以前の研究に基づいて構築され、タンパク質の切り捨てを減少させ、変異タンパク質の全体的な収量を増加させる効果があった8。CobB欠失細胞がアクセスできない場合は、化学的に有能なBL21細胞を使用して進みます。CobBは、サーチュイン様ヒストンリシンデアセチラーゼおよびニコチンアミドをヒストンタンパク質発現中に5mMの最終濃度で添加して、代替アプローチ9としてCobBを阻害することができる。 - セルストックを作り、-80°Cで保管してください。
2. アセチル化ヒストンタンパク質発現
- 1 Lのオートクレーブ2YT培地(または選択量)を培養フラスコに調製する。
- 2YT培地の20mLを、TAG含有プラスミド(AmpR)およびpEVOL-AckRS(ChlR)を有する共形細胞ストックと共形化した細胞ストックを含む20mLを接種し、37°CでOD=0.6(4-6h)に成長する。
- 1 Lのオートクレーブ2YT培地に適切な抗生物質を加え、20 mLスターター培養液で接種します。37°CでOD = 0.6-0.8(2-3 h)に成長します。
- 誘導剤およびアセチルリシン(AcK)をIPTG 1 mM、0.2%アラビノース、およびAcK 5 mMの最終濃度に加えます。
- 37°Cで6〜8時間培養します。
- ペレット細胞は2,700 x g で15分間用いた。
- 細胞ペレットを-80 °Cで一晩保管してください。
- このステップ以降は、常に氷の上にサンプルを保ちます。培養液1L当たりヒストン溶解バッファーの50mLに細胞ペレットを溶解する。
- 次のサイクルに従ってソニッケート:1 sオン、1 sオフ、時間通りに合計:60%振幅で3分。
- 41,600 x g で45分間ペレット包包体。
- 上清を捨て、ヒストンリシスバッファーの30 mLで封入体を再中断します。ペレットインクルージョンは41,600 x g で30分間です。
- 上清を捨て、30 mLのペレット洗浄バッファーに封入体を再中断します。ペレット包包体は41,600 x g で30分間です。
- 上清を捨て、含包体を6Mグアニジン塩酸塩(GuHCl)緩衝液の25 mLに溶解する。37°Cで1時間撹拌してインキュベートする。
注:必要に応じて、封入体は4°Cで一晩攪拌してインキュベーションすることができます。 - ペレットインクルージョンは41,600 x g で45分間です。上清を1 mLのNi-NTA樹脂で2時間6M GuHClバッファーと平衡化してインキュベートします。
- 変性条件下でのNi-NTAの精製を進めます。カラム洗浄バッファーの3桁のボリュームでカラムを洗浄します。溶出緩衝液の10 mLでヒストンタンパク質をアセチル化した。
注:ここでタンパク質を濃縮しようとすることはオプションですが、アセチル化ヒストンは非常に予測不可能であり、容易に沈殿することができます。2mLを超えて総量に集中することはお勧めできません。 - アセチル化ヒストンタンパク質を5%の酢酸緩衝液に対して広範囲に透析し、塩を除去する。4°Cで一度に3時間の透析液を、最低6回の新鮮な緩衝液と交換する。
注:タンパク質の純度を向上させるために、純水に対して透析するオプションがあります。しかし、これは、低収量のアセチル化ヒストンタンパク質にとって望ましくない可能性がある有意な沈殿および収量の低下を引き起こす。 - アリコートと凍結乾燥タンパク質を、-80°Cで無期限に保存する。 野生型ヒストンタンパク質は一般に10〜50mg/Lを生成し、アセチル化ヒストンタンパク質は特定のリジン部位に応じて10mg/L未満の収量を示します。例えば、H3K79Acは5mg/Lの平均値を示す。
3. 野生型ヒストンタンパク質発現
- 完全なヌクレオソームを組み立てるには、4つのヒストンタンパク質すべてを発現する。野生型ヒストンを表現して浄化する場合、プロトコルは以下を除いてアセチル化されたヒストンと同じです。
- 共変換を実行しないでください。野生型ヒストン表現には pEVOL-AcKRS を使用しないでください。それに応じて抗生物質を調整します。
- 細胞の発現の誘導時に、CobB欠失細胞株を使用したり、ニコチンアミド、AcK、またはアラビノースを添加したりしないでください。
4. 601DNAの作成
注:以前に設計された最適化されたDNA配列は、ヒストンオクターで組み立てられ、高効率で単核組を生成します。この配列は、601 DNAまたはWidom配列と呼ばれる。この配列は、クロマチンリモデリングアッセイから単一分子測定10までのヌクレオソームのインビトロ研究のための標準的なDNA配列となっている。
- ヌクレオソームアセンブリ用に601 DNAのかなりの量を調製するには、pGEM-3z/601をトップ10細胞に変換し、プラスミド増幅および抽出のために10 mLの培養を増殖させます。プラスミド抽出キットを使用し、メーカーの推奨に従ってください。
- この増幅プロトコルには、社内で表現されたPFUポリメラーゼ(より効率的)を使用してください。PCR反応を設定する:250 μL反応の場合、207.5 μL オートクレーブMQ H2O、25 μL 10x PFUバッファー、5 μLフォワードプライマー:ctggagaatcccgggcgccg、5 μL リバースプライマー:アサガタタタタトガカック、5 μLNTPミックス、2.5μL PFU酵素を使用します。私たちは通常、組み立てるのに十分なDNAを得るために一度に60の反応を実行します。
- PFUポリメラーゼを使用する場合は、30 sで52°Cのアニーリング温度と延長時間30sを使用してください。それ以外の場合は、メーカーの推奨条件に従ってください。
- PCR が完了したら、PCR 製品を精製するために、選択した PCR クリーンアップ キットを使用します。
5. ヒストン・オクターマーの組み立て
- ヒストンタンパク質ペレットH2A、H2B、H3、およびH4のアリコートを溶解し、総体積100μLのGuHClバッファ内にヒストンタンパク質のそれぞれ別々のストックが存在するようにします。
- A280吸光度を測定して、ヒストンタンパク質の濃度を計算します。
- 吸光度がタンパク質に対して1より大きい場合は、より正確な濃度を得るためにGuHClバッファーで希釈する。
- H2AとH2Bのタンパク質を1:1モル比で組み合わせ、合計4μg/μLのタンパク質濃度に希釈します。
- 2 M TE バッファーに対して 4 °C で連続して 2 M TE バッファー 2 時間、0.5 M TE バッファー 5 時間。
注:透析の第2および第3のステップは、タンパク質の不安定な立体構造を引き起こし、沈殿します。これらのステップでは大きな降水量が予想されます。 - 4°Cで16,800 x g で遠心分離により沈殿物を除去する。
- 再度、A280 吸光度を測定するヒストンダイマー(H2A/H2B混合物)と四量体(H3/H4混合物)の濃度を計算する。
- 1:1モル比でダイマーと四量体を混合し、固体NaClを加えてNaClを2Mに調整します。
- ヒストン・オクターマーは4°Cで保存でき、ダイマーやテトラマーよりも安定しています。これは分解を引き起こす可能性がありますので、ヒストンオクタマーを凍結しないでください。
- アセチル化ヒストンで組み立てる場合は、野生型タンパク質を手順中のアセチル化タンパク質に置き換えるだけです。
6. 核組立体
- 100x TE バッファーと固体 NaCl を使用して、601 DNA を 2M TE バッファーに調整します。2M TE バッファーの 601 DNA をヒストンオクタマーに 0.85:1 ~ 0.90:1 のモル比で加えます。遊離DNAがゲルシフト解析に存在する場合、DNAの比率が低くなる可能性があります。
- DNA-ヒストン混合物を透析袋に移し、2M TEバッファーの約200 mL(または複数のサンプルを組み立てる場合は複数)に入れ、4°Cで非常に穏やかにかき混ぜます。
- 塩TEバッファーをゆっくりと滴下するためにパージする蠕動ポンプを設定します。ボリュームがおよそ2倍になったら、半分のボリュームを注ぎます。これを合計で少なくとも4回実行します。ポンプを使用すると、開始体積に応じて4-8時間かかることがあります。ヌクレオソームは、塩濃度が150mM(塩分濃度計で測定)に減少すると形成される。
- 塩濃度が150mMに低下した後、透析は一晩で20mMのTEバッファーに対して。
- 遠心分離により沈殿物を除去し、プレートリーダーを用いてA260 読み取りによるヌクレオソームの濃度を測定する。
- His-TEVプロテアーゼ(TEV:ヌクレオソーム1:30、w:w)を加え、4°Cで一晩インキュベートしてヒスチジンタグをすべて除去します。ニNTA樹脂プルダウンにより、核組液からヒスチジンタグ不純物を除去します。
- ヌクレオソームを位置決めし、試料を均質化し、60°Cで1時間インキュベートする。
注: 特に不安定なアセチル化されたサイトでは、この手順は推奨されない場合があります。 - 4 °Cで、短期間(数週間)のヌクレオソームを保管する。
- 長期保存のために、透析用ヌクレオソームは貯蔵バッファーに対して、-80°Cで保存します。
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Representative Results
ダイマー、テトラマー、および八重差は、12% SDS PAGEゲルを実行することによって評価できます (図 1および図 2)。ここでは、アセチル化四量体の一部が他のテトラマーよりも低い収率を持っていることがわかります(図1)。実際、コア領域に近いほど、収率は低く見られます。これは、アセチル化が四量体の組み立てに干渉するため、コア領域に近づく可能性が最も高いです。オクタマーを組み立てた後も同様の影響が認められる(図2)。601 DNA配列を有するオクターマーを組み立てた後、ヌクレオソームは、5%1x TBE Native PAGEゲルを用いて、臭化エチジウムによる染色を行い、それを用いて評価することができる(図3)。TEV消化前に、10k基底対マーク付近ではヌクレオソームバンドが観察される。TEV消化後、ヌクレオソームバンドははしごに対してシフトダウンする。熱測位の前に、観察されたヌクレオソームバンドは非常に広く、おそらくストリークになる(図4)。
図1:ヒストンダイマーと四量体 代表12%のSDS PAGEゲルの野生型ヒストンダイマー(レーン2)及びH3アセチル化四量体(レーン3-9)を含む。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ヒストン八重奏機 代表12%のH3アセチル化ヒストンオクターマー(レーン2-11)のSDS PAGEゲルを表す。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:タグ付きH3K64Acヌクレオソーム複合体を組み立てた。H3K64Acヌクレオソーム複合体(レーン2)の代表1x TBEネイティブPAGEゲルは、エチジウムブロマイドで視覚化された遊離601DNA(レーン4)と比較した。レーン3は、60°Cで1時間インキュベーションした後のH3K64Acヌクレオソームを示す。レーン3では全てのヌクレオソームが分解されたことが観察される。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:組み立てられたTEV消化型ヌクレオソーム複合体 代表1x TBEネイティブPAGEゲルは、野生型TEV消化ヌクレオソーム複合体、及び遊離601DNAを消化した。ヌクレオソーム熱測位前後の比較。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
実験中にこのプロトコルを詳細に従うことは不可欠です。ヌクレオソームは非常に安定しておらず、多くの試行錯誤がこのプロトコルを決定することに入っています。粒子状物は容易に組み立てプロセスを妨げる可能性があるので、すべてのステップ(または観察されるたびに)で沈殿物を除去することが重要です。常にヒストンサンプルを氷の上に置いてください。ヌクレオソームが4°Cで長時間保存されている場合、自発的に分解することができます。実験で使用する前に2週間以上4°Cで保存されている場合は、ネイティブPAGEでサンプルを確認してください。これはまた、それらを分解する原因となる可能性がありますので、渦オクターやヌクレオソームを避けてください。ダイマー、テトラマー、または八重奏体の組み立てに問題が発生した場合、これは通常、タンパク質の質が悪いという指標です。タンパク質の品質を15%SDS-PAGEで確認してください。タンパク質の純度が低い場合の1つの選択肢は、純粋な水に対してタンパク質を透析することです。これは、重い沈殿を引き起こし、タンパク質の収量を大幅に減少させるが、より純粋なサンプルを生成します。ヒストンアセチル化部位の組み込みおよびヌクレオソーム安定性は大きく異なる。一般に、部位がN末端ドメインに近いほど、ヒストンタンパク質発現中の収率は低くなる。ヌクレオソーム安定性のため、アセチル化部位が核コアまたはDNA結合部位に近いほど、組み立てられたヌクレオソームは安定性が低い。安定性の問題が発生した場合、常に核組み合いのサンプルを氷の上に保つことが重要です。分解または沈殿を引き起こす可能性があるため、60°Cでのヌクレオソーム位置決め工程を省略する必要がある場合がある。アセチル化ヌクレオソームの主な制限は、その不安定性である。ヌクレオソーム沈殿を引き起こさずに、37°Cなどのより高い温度でアッセイをプリフォームすることができない場合があります。実験手順が許せば、4°Cでアセチル化ヌクレオソームの沈殿を防止するように行う。
このヌクレオソームの製造方法は、結合実験および構造決定のための修飾ヌクレオソームの製造に特に有用である。この方法は、より高い純度と既知のヌクレオソームDNA配列を有するヌクレオソームを生成し、より良い制御実験およびより高い解像度画像をもたらす交結合変数を排除する。ヌクレオソームサンプルが既知のDNA配列と同質であることが構造決定にとって非常に重要であり、そうでなければ高解像度の画像を得ることは不可能です。
この方法には、潜在的な用途が豊富にあります。具体的には、エピジェネティクスの分野で。改変タンパク質を得ることは非常に困難な場合があります。修飾タンパク質の入手は、あまり理解されていない多くのエピジェネティック経路における作家、読者、消しゴムの構造と機能を調査する上で極めて重要です。我々は以前、この技術を用いて、H3アセチル化部位K18、K36、K56でヌクレオソームDNAのアクセシビリティを調査し、各変異オクタマーを、Pst1消化部位を含む改変601DNA配列で組み立てることによって行った。この技術は、AcK. PylRS以外の NCAA を組み込むためにさらに変更することができ、他の NCAA のホストを組み込むために設計することができます。また、いくつかのアセチル化部位でのSIRT7のヒストン脱アシル化活性を調べるため、エシェリヒア大腸菌のアンバーコドンによるN ε-(7-アジドヘプタノイル)-L-リジン(AzHeK)を組み込み、SIRT7のヒストン脱アシル化活性を調べた。 このアプローチにより、SIRT7はH3K36の脱アシル化に向けて高い活性を有し、またH3K37を脱アシル化するために触媒的に活性であることを明らかにした。H3K36脱アシル化は、ヌクレオソーム依存性であることがさらに示され、天然クロマチン6におけるヌクレオソーム間のつなぎDNAを模倣するアシルヌクレオソーム基質に短い二本鎖DNAを付加することによって有意に増強することができる。
この方法は、さまざまなシナリオで有用であり得る変更のない野生型ヌクレオソームを生成するように変更することもできます。我々のグループは最近、第2のDNA結合部位11を介してヒストンH2A及びH2Bによって形成された負電荷を有する酸性パッチへの環状GMP-AMP合成酵素(cGAS)の緊密な結合を示すPingwei Li博士のグループと共同で構造を発表した。cGASは、サイクリックジヌクレオチドcGAMPの合成を触媒するdsDNAセンサであり、Sting-TBK1-IRF3シグナル伝達軸12、13、14、15、16を介してI型インターフェロンの誘導を媒介する。
完全に組み立てられたヌクレオソームを使用することの利点は、エピジェネティック関連タンパク質の活動または結合能力を調査するより良いモデルとして機能するヌクレオソームのネイティブ状態によく似ている。ヌクレオソーム基質でプローブすると結果が大幅に変化する、裸のDNAまたはヒストンペプチド基質に対する酵素活性が限定または完全に存在しない例が数多く存在する。上記の例と同様に、SIRT7の新しい脱アシル化部位は、未知であったであろう核組み基質を用いて発見された。これらのタイプのシステムを調査する際には、ネイティブ基板を使用することが重要です。この技術は、ピロリジン遺伝コード拡張技術によって組み込むことができるあらゆる修飾の読み取り、書き込み、および活性または結合能力を探査するために使用することができる。ピロリシル-tRNA合成酵素は、すでにネイティブに無差別であり、研究者の創造性を主な制限要因にする任意の数のシステムでこの技術を使用するための扉を既に開いている他の基質のホストのために設計されています。
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Disclosures
著者の誰かによって宣言する競合する財政的利益はありません。
Acknowledgments
この議定書と彼の貴重な指導の基礎を築いてくれたウェスリー・ワン博士に感謝します。この研究は、国立衛生研究所(グランツR01GM127575およびR01GM121584)およびウェルチ財団(グラントA-1715)によって部分的に支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M TE Buffer | NA | NA | 0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 1 M TE Buffer | NA | NA | 1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 100x TE Buffer | NA | NA | |
| 2 M TE Buffer | NA | NA | 2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 20 mM TE Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 6 M GuHCl | 6M guanidinium chloride, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0 | ||
| Acetyllysine | |||
| Column Wash Buffer | NA | NA | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazole pH 7.8 |
| Elution Buffer | NA | NA | |
| Fisherbrand Variable-Flow Chemical Transfer Pump | Fischer Scientific | 15-077-67 | |
| His-TEV protease | |||
| Histone Lysis Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0 |
| Ni-NTA Resin | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 7.8 | ||
| PCR Clean-Up Kit | Epoch Life Sicences | 2360050 | |
| Pellet Wash Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0 |
| petDUET-His-SUMO-TEV-H4 | |||
| petDUET-His-TEV-H2A | |||
| petDUET-His-TEV-H2B | |||
| petDUET-His-TEV-H3 | |||
| pEVOL-AckRS | Addgene | 137976 | |
| pGEM-3z/601 | Addgene | 26656 | |
| Storage Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glycerol, pH 7.8 |
| Thermocycler |
References
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