Summary
Her præsenterer vi en metode til at udtrykke acetylerede histoneproteiner ved hjælp af genetisk kodeudvidelse og samle rekonstituerede nukleosomer in vitro.
Abstract
Acetylerede histoneproteiner kan let udtrykkes i Escherichia coli, der omslutter en mutant, N ε-acetylklysin(AcK)-specifik Methanosarcina mazi pyrrolysin tRNA-synthetase (MmAcKRS1) og dets cognate tRNA (tRNAPyl)for at samle rekonstituerede mononukleosomer med stedspecifik acetyleret histon. MmAcKRS1 og tRNAPyl leverer AcK på et ravmutationssted i det valgte mRNA under oversættelsen i Escherichia coli. Denne teknik er blevet brugt i vid udstrækning til at indarbejde AcK på H3 lysin steder. Pyrrolysyl-tRNA-synthetase (PylRS) kan også let udvikles til at inkorporere andre noncanonical aminosyrer (ncAAs) til stedspecifik proteinmodifikation eller funktionalisering. Her beskriver vi en metode til at inkorporere AcK ved hjælp af MmAcKRS1-systemet i histone H3 og integrere acetylerede H3-proteiner i rekonstituerede mononukleosomer. Acetylerede rekonstituerede mononukleosomer kan bruges i biokemiske og bindende assays, strukturbestemmelse og meget mere. Opnåelse af modificerede mononukleosomer er afgørende for at designe eksperimenter relateret til at opdage nye interaktioner og forstå epigenetik.
Introduction
Vi har udnyttet PylRS og tRNAPyl til at syntetisere og samle rekonstituerede mononukleosomer med stedspecifikke acetylerede histoner. PylRS har vist sig uvurderlig som et genetisk kodeudvidelsesværktøj til fremstilling af proteiner med postoversættelsesændringer (PTMs) og er blevet genetisk udviklet til at inkorporere omkring 200 forskellige NCAAs. PylRS inkorporerer ved et ravstop codon, hvilket fjerner konkurrencen fra andre aminosyrer under oversættelsen. PylRS blev først opdaget i methanogenisk archaea, og er siden blevet brugt i kemisk biologi til at indarbejde nye reaktive kemiske grupper i proteiner1,2.
MmAcKRS1 blev udviklet fra Methanosarcina mazei PylRS og bruges ofte i vores laboratorium til syntese af acetylerede proteiner3,4,5,6. MmAcKRS1 leverer AcK på et ravmutationssted i det valgte mRNA under oversættelse i Escherichia coli. Denne teknik har tidligere været brugt til at indarbejde AcK på K4, K9, K14, K18, K23, K27, K36, K56, K64, og K79 histone H3 lysin steder at studere aktiviteten af Sirtuin 1, 2, 6 og 7 på acetyleret mononukleosomer4,5,6. Her beskriver vi denne metode til at udtrykke acetylerede histoner og rekonstituere acetylerede nukleosomer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plasmid konstruktion
- Begynd med at beslutte, hvilken histoneprotein der skal acetyleres, og på hvilket lysinsted. Mutere stedet til rav stop codon (TAG) ved hjælp af site rettet mutagenesis.
BEMÆRK: Der er fire tidligere designede plasmider, der anvendes til udtryk for histoneproteiner. Alle fire histone proteiner blev klonet ind i pETDuet-1 vektor med en N-terminal histidin tag. Histone H4 indeholder også en SUMO tag, oprindelsen af replikation colE1 med et kopinummer på ca 40, ampicillin resistente, og en T7 promotor.- Design frem og tilbage primere, der indeholder en TAG mutation på det ønskede sted (erstatte en eksisterende lysin codon med rav stop codon) i en af de fire histone protein plasmider.
- Brug hel-plasmid PCR til at forstærke TAG, der indeholder plasmid. Bestem en passende udglødningstemperatur for primerne. Generelt vil primernes smeltetemperatur (Tm)minus 5 °C være tilstrækkelig. Hvis der er problemer med at få et PCR-produkt, kan en temperaturgradient omkring Tm - 5 °C bruges til at optimere glødetemperaturen til forstærkning.
BEMÆRK: I dette forsøg blev der anvendt en intern udtrykt PFU-polymerase i 30 cyklusser med følgende betingelser: 94 °C for 30 s (denaturering), glødetemperatur i 30 s og 72 °C i 6 min. (eller 1 min pr. kilobasepar). Du kan finde flere oplysninger om denne type PCR-metode under Liu og Naismith7. - Ryd op i PCR-produktet med et PCR-oprydningssæt ved at følge producentens protokol. Analyse af PCR-produktet ved agarosegelelektroforese og efterfølgende ethidiumbromid farvning.
- 16 °C. Ligate plasmid ved inkubation med T4 ligase natten over ved 16 °C.
- Først omdanne TAG indeholder plasmid (AmpR)til kemisk kompetente Escherichia coli. Vælg mindst 4 kolonier fra transformationen og rense plasmid. Der fremstilles cellelagre af hver med glycerol ved hjælp af standardmetoder, og opbevar ved -80 °C. Send til sekventering for at bekræfte den ønskede TAG mutation.
- Når sekvensen er bekræftet, skal du medindstille den TAG-holdige plasmid (AmpR)med pEVOL-AckRS (ChlR)til kemisk kompetent CobB (den eneste histone lysinafacetylase, der kendes i E. coli.) sletning AF BL21-celler ved hjælp af varmechokmetoden. pEVOL er et plasmid med mellemnummer til lavkopieret p15A-oprindelse.
BEMÆRK: PEVOL-serien af plasmider blev konstrueret på grundlag af tidligere undersøgelser, der viste et øget udtryk for det ortogonale aaRS/tRNATyr-par var effektive til at reducere proteinafkortning og til at øge det samlede udbytte af mutantproteiner8. Hvis CobB-sletningsceller ikke er tilgængelige, skal du fortsætte med kemisk kompetente BL21-celler. CobB er en Sirtuin-lignende histone lysin deacetylase og Nicotinamid kan tilsættes ved en 5 mM endelig koncentration under histoneproteinudtryk for at hæmme CobB som en alternativ tilgang9. - Lav en celle lager og opbevares ved -80 °C.
2. Acetyleret histoneproteinudtryk
- Forbered 1 L autoklaveret 2YT-medier (eller valgfrihed) i en dyrkningskolbe.
- Pod 20 mL 2YT-medier, der indeholder de relevante antibiotika, med den co-transformerede cellebestand, der har den TAG-holdige plasmid (AmpR)og pEVOL-AckRS (ChlR)og vokser ved 37 °C til OD = 0,6 (4-6 h).
- Tilsæt de relevante antibiotika til 1 L autoklaveret 2YT medier og pod med 20 mL starter kultur. Vokse ved 37 °C til OD = 0,6-0,8 (2-3 timer).
- Der tilsættes inducerende midler og acetylkolin (AcK) til de endelige koncentrationer af IPTG 1 mM, 0,2% arabinose og AcK 5 mM.
- Kulturen dyrkes ved 37 °C i 6-8 timer.
- Pellet celler på 2.700 x g i 15 min.
- Cellepillen opbevares ved -80 °C natten over.
- Fra dette trin og fremefter holde prøven på is hele tiden. Cellepillen opløses i 50 mL histone lysis buffer pr. 1 L kultur.
- Sonicate i henhold til følgende cyklus: 1 s på, 1 s off, i alt til tiden: 3 min ved 60% amplitude.
- Pellet inklusion organer på 41.600 x g i 45 min.
- Den supernatant og genindsættelseskroppe kasseres i 30 mL histone lysis buffer. Pellet integration lover på 41.600 x g i 30 min.
- Det supernatant og genanvendelige inklusionsorganer kasseres i 30 mL pelletvaskbuffer. Pellet inklusion organer på 41.600 x g i 30 min.
- Supernatanten kasseres, og inklusionsorganerne opløses i 25 ml 6 M Guanidin Hydrochloridbuffer (GuHCl). Inkuber med omrøring ved 37 °C i 1 time.
BEMÆRK: Hvis det er nødvendigt, kan inklusionsorganer inkuberes med omrøring natten over ved 4 °C. - Pellet optagelse lover på 41.600 x g i 45 min. Inkuber supernatanten med 1 mL Ni-NTA harpiks ekvilibreret med 6 M GuHCl buffer i 2 timer.
- Fortsæt med Ni-NTA rensning under denaturerede forhold. Vask kolonnen med 3 kolonnemængder af kolonnevaskbuffer. Elute acetyleret histoneprotein med 10 ml elueringsbuffer.
BEMÆRK: Forsøg på at koncentrere proteinet her er en mulighed, men acetylerede histoner er meget uforudsigelige og kan let bundfældes. Det anbefales ikke at koncentrere sig forbi 2 mL i samlet volumen. - Omfattende dialyze acetyleret histone protein mod 5% eddikesyre buffer til at fjerne salte. Dialyze i 3 timer ad gangen ved 4 °C, ombytning til frisk buffer mindst 6 gange.
BEMÆRK: For forbedret proteinrenhed er der mulighed for at dialyze mod rent vand. Dette medfører imidlertid betydelig nedbør og reduktion i udbyttet, som kan være uønsket for lavtydende acetylerede histoneproteiner. - Aliquot og lyophilize protein, og opbevares på ubestemt tid ved -80 °C. Histoneproteiner af vild type giver generelt 10-50 mg/l, mens acetylerede histoneproteiner giver mindre end 10 mg/l afhængigt af det specifikke lysinsted. H3K79Ac har f.eks.
3. Histoneproteinudtryk af vild type
- For at samle fulde nukleosomer, udtrykke alle 4 histone proteiner. Når der udtrykkes og renses vilde type histoner, er protokollen den samme som de acetylerede histoner, bortset fra følgende:
- Udfør ikke co-transformation. Brug ikke pEVOL-AcKRS til wild type histone-udtryk. Justere antibiotika i overensstemmelse hermed.
- Brug ikke en CobB-sletningscellelinje, eller tilføj Nicotinamid, AcK eller arabinose under induktion af cellulært udtryk.
4. Forberedelse af 601 DNA
BEMÆRK: En tidligere designet optimeret DNA-sekvens til direkte nukleosome positionering er samlet med histone octamers at producere mononukleosome med høj effektivitet. Denne sekvens kaldes 601 DNA eller Widom-sekvensen. Denne sekvens er blevet standard DNA-sekvensen for in vitro-undersøgelser af nukleosomer fra chromatin remodeling assays til enkeltmolekylemålinger10.
- For at forberede betydelige mængder 601 DNA til nukleosommontering skal pGEM-3z/601 omdannes til Top 10-celler og dyrkes 10 mL kultur til plasmidforstærkning og ekstraktion. Brug et plasmidudtrækssæt, og følg producentens anbefaling.
- Brug en internt udtrykt PFU polymerase (mere effektiv) til denne forstærkningsprotokol. Opsæt en PCR-reaktion: For 250 μL reaktion, 207,5 μL autoklaveret MQ H2O, 25 μL 10x PFU-buffer, 5 μL Fremad primer: ctggagaatcccggtgccg, 5 μL Omvendt primer: acaggatatagttatctgacacg, 5 μL dNTP-blanding, 2,5 μL PFU-enzym. Vi kører typisk 60 reaktioner på én gang for at få nok DNA til at samle.
- Brug en udglødningstemperatur på 52 °C i 30 s og en forlængelsestid på 30 s, hvis du bruger PFU-polymerase. Ellers skal du følge producenternes anbefalede betingelser.
- Når PCR er færdig, skal du bruge et PCR-oprydningssæt efter eget valg til at rense PCR-produktet.
5. Samling af histone octamer
- Aliquots opløses af histoneproteinpiller H2A, H2B, H3 og H4, således at der er en separat bestand af hvert histoneprotein i GuHCl Buffer med et samlet volumen på 100 μL.
- Koncentrationen af hvert histoneprotein beregnes ved at måle A280-absorbansen.
- Hvis absorbansen er større end 1 for ethvert protein, fortyndes med GuHCl buffer for at få en mere nøjagtig koncentration.
- H2A- og H2B-proteiner kombineres i et molarforhold på 1:1 og fortyndes til en samlet proteinkoncentration på 4 μg/μL. Gentages for H3 og H4.
- Dialyze sekventielt ved 4 °C mod 2 M TE-buffer natten over, 1 M TE-buffer i 2 timer og 0,5 M TE-buffer i 5 timer.
BEMÆRK: Det andet og tredje trin i dialyse forårsager ustabile konformationer af protein til at udfælde. Det forventes at se kraftig nedbør på disse trin. - Udfældet fjernes ved centrifugering ved 16.800 x g ved 4 °C.
- Igen beregne koncentrationen af histone dimers (H2A/H2B blanding) og tetramere (H3/H4 blanding) måling af A280 absorbans.
- Bland dimers og tetramere i et 1:1 molarforhold og juster NaCl til 2 M ved tilsætning af fast NaCl.
- Histone octamer kan opbevares ved 4 °C og er mere stabil end dimers og tetramere. Frys aldrig histone octamer, da dette kan forårsage demontering.
- Hvis du samler med acetylerede histoner, skal du blot erstatte det vilde typeprotein med det acetylerede protein i proceduren.
6. Nukleosom samling
- Brug 100x TE-buffer og solid NaCl til at justere 601 DNA til 2M TE-buffer. Tilføj 601 DNA i 2M TE buffer til histone octamer i et molarforhold på 0,85:1 til 0,90:1. Der kan tilføjes et lavere forhold mellem DNA, hvis der er frit DNA til stede i gelskiftanalysen.
- Dna-histoneblandingen overføres en dialysepose, og der anbringes ca. 200 mL 2M TE-buffer (eller mere, hvis der samles flere prøver) og omrøres meget forsigtigt ved 4 °C.
- Indstil en peristaltisk pumpe til at rense til langsomt dryppe i ingen salt TE buffer. Når lydstyrken er omtrent fordoblet, hældes halvdelen af volumenet ud. Gør dette mindst 4 gange i alt. Med en pumpe kan dette tage 4-8 timer afhængigt af startvolumen. Nukleosomer dannes, når saltkoncentrationen reduceres til 150 mM (målt ved saltholdighedsmåler).
- Når saltkoncentrationen er reduceret til 150 mM, dialyze mod en 20 mM TE buffer natten over.
- Fjern bundfald ved centrifugering, og mål koncentrationen af nukleosomer vedhjælp af en pladelæser.
- Tilføj His-TEV protease (TEV: nukleosome 1:30, w:w ) og inkuber natten over ved 4 °C for at fjerne alle histidin tags. Fjern histidin tag urenheder fra nukleosome opløsning af Ni-NTA harpiks trække ned.
- For at placere kernen og homogenisere prøven inkuberes ved 60 °C i 1 time.
BEMÆRK: For acetylerede steder, der er særligt ustabile, er dette trin muligvis ikke tilrådeligt. - Opbevar nukleosomer på kort sigt (et par uger) ved 4 °C.
- Til langtidsopbevaring skal du dialyzekerner mod lagerbuffer og opbevare ved -80 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dimers, tetramere og octamers kan vurderes ved at køre en 12% SDS PAGE gel(Figur 1 og Figur 2). Her kan du se, at nogle af de acetylerede tetramere har et lavere udbytte end andre(figur 1). Faktisk, jo tættere på kerneregionen, jo lavere observerede udbytte. Dette skyldes sandsynligvis, at acetylering forstyrrer samlingen af tetrameren, jo tættere du kommer på kerneregionerne. En lignende påvirkning observeres efter montering af oktamere (figur 2). Efter at have samlet octamers med 601 DNA-sekvens, kan nukleosomet vurderes ved hjælp af en 5% 1x TBE Native PAGE gel efterfulgt med farvning med ethidiumbromid (Figur 3). Før TEV fordøjelsen observeres det nukleosombånd nær 10k baseparmærket. Efter TEV fordøjelser det nukleosome bandet skifter ned i forhold til stigen. Før termisk positionering vil de observerede nukleosombånd være meget brede og muligvis stribe (figur 4).
Figur 1: Histone dimers og tetramere. Repræsentant 12% SDS PAGE gel af vild type histone dimer (bane 2) og H3 acetyleret tetramere (bane 3-9). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:Histone octamers. Repræsentant 12% SDS PAGE gel af H3 acetyleret histone octamers (baner 2-11). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Samlede sit mærkede H3K64Ac-kernekompleks. Repræsentativ 1x TBE Native PAGE gel af H3K64Ac nukleosome kompleks (lane 2) sammenlignet med gratis 601 DNA (Lane 4) visualiseret af ethidium bromid. Vognbane 3 viser H3K64Ac-kerne efter inkubation ved 60 °C i en time. Det observeres i bane 3, at alle kerner er demonteret. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Samlet TEV fordøjet nukleosom kompleks. Repræsentant 1x TBE Native PAGE gel af vild type TEV fordøjet nukleosome kompleks, og gratis 601 DNA. En sammenligning af før og efter nukleosome termisk positionering. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er vigtigt at følge denne protokol i alle detaljer under et eksperiment. Nukleosomer er ikke særlig stabile, og meget trial and error er gået ind i fastsættelsen af denne protokol. Det er vigtigt at fjerne bundfald på hvert trin (eller når det observeres), fordi partikler let kan forstyrre samlingsprocesserne. Hold altid histoneprøverne på is. Hvis nukleosomer opbevares ved 4 °C for længe, kan de spontant skilles ad. Sørg for at kontrollere eventuelle prøver fra Native PAGE, hvis de opbevares ved 4 °C i mere end 2 uger før brug i et forsøg. Undgå hvirvlende oktamere og nukleosomer, da dette også kan få dem til at skille ad. Hvis der opstår problemer med at samle dimers, tetramere eller octamers, er dette normalt tegn på dårlig proteinkvalitet. Tjek proteinkvaliteten med 15% SDS-PAGE. En mulighed, hvis protein renhed er lav, er at dialyze proteinet mod rent vand. Dette vil medføre kraftig nedbør og i høj grad reducere proteinudbyttet, men vil producere en renere prøve. Inkorporeringen og den nukleosomale stabilitet på hvert histoneacetyleringssted varierer meget. Generelt er jo tættere stedet er på N-terminaldomænet, jo lavere udbytte under histoneproteinudtryk. For nukleosom stabilitet, jo tættere acetylering site er at kernen kerne eller DNA bindende steder, jo mindre stabil den samlede nukleosome. Hvis der opstår stabilitetsproblemer, er det vigtigt altid at holde den nukleosomprøve på is. Det kan være nødvendigt at udelade det nukleosompositionstrin ved 60 °C, da dette kan forårsage demontering eller nedbør. En væsentlig begrænsning af acetylerede nukleosomer er deres ustabilitet. Det kan være umuligt at præforme assays ved højere temperaturer som f.eks. Hvis forsøgsprocedurerne tillader det, skal de udføres ved 4 °C for at forhindre udfældning af acetyleret nukleosom.
Denne metode til fremstilling af nukleosomer er særlig nyttig til fremstilling af modificerede nukleosomer til bindingseksperimenter og strukturbestemmelser. Denne metode producerer nukleosomer med højere renhed og en kendt nukleosomal DNA-sekvens, som eliminerer forvirrende variabler, hvilket resulterer i bedre kontrollerede eksperimenter og billeder med højere opløsning. Det er afgørende for strukturbestemmelsen, at den nukleosome prøve er homogen med en kendt DNA-sekvens, ellers vil det være næsten umuligt at opnå billeder i høj opløsning.
Der er en overflod af potentielle anvendelser af denne metode. Specifikt inden for epigenetik. Det kan være utroligt svært at opnå modificerede proteiner. Opnåelse af modificerede proteiner er afgørende for sondering af strukturen og funktionen af forfattere, læsere og viskelædere i de mange epigenetiske veje, der er dårligt forstået. Vi har tidligere brugt denne teknik til at undersøge tilgængeligheden af nukleosomal DNA til Pst1 fordøjelsen på H3 acetyleringsstederne K18, K36 og K56 ved at samle hver mutant octamer med en modificeret 601 DNA-sekvens, der indeholder et Pst1-fordøjelsessted. Denne teknik kan ændres yderligere for at indarbejde andre ikke-konkurrencemyndigheder end AcK. PylRS kan konstrueres til at inkorporere en lang række andre ikke-europæiske konkurrencemyndigheder. Vi har også indarbejdet Nε-(7-azidoheptanoyl)-L-lysin (AzHeK) af rav codon i Escherichia coli for rekombinant udtryk for flere AzHeK-holdige histone H3 proteiner til at undersøge histone deacylation aktivitet SIRT7 på flere acetyleringssteder. Denne fremgangsmåde viste, at SIRT7 har høj aktivitet i retning af deacylering af H3K36 og også katalytisk aktiv for at deacylere H3K37. H3K36 deacylation viste sig yderligere at være nukleosomafhængig og kan forbedres betydeligt ved at tilføje et kort dobbeltstrenget DNA til acyl-nukleosomsubstratet, der efterligner det brorende DNA mellem nukleosomer i indfødte chromatin6.
Denne metode kan også ændres til at producere vilde type nukleosomer uden ændringer, som kan være nyttige i en række scenarier. Vores gruppe offentliggjorde for nylig en struktur i samarbejde med Dr. Pingwei Li's gruppe, der viser den stramme binding af cyklisk GMP-AMP-synthase (cGAS) til en negativt ladet sur plaster dannet af histone H2A og H2B via sit andet DNA-bindingssted11. cGAS er en dsDNA sensor, der katalyserer syntesen af en cyklisk dinukleotid cGAMP, som formidler induktion af type I interferoner gennem STING-TBK1-IRF3 signalering akse12,13,14,15,16.
Fordelen ved at bruge fuldt samlede nukleosomer er, at det mere ligner den oprindelige tilstand af nukleosomer, der tjener som en bedre model til at undersøge aktiviteterne eller bindingsevnerne hos et vilkårligt antal epigenetiske relaterede proteiner. Der er talrige eksempler på begrænset eller helt fraværende enzymaktivitet mod nøgne DNA eller histone peptid substrater, at når probed med nukleosome substrater drastisk ændrer resultaterne. Som med ovennævnte eksempel blev der fundet et nyt deacylationssted for SIRT7 ved hjælp af et nukleosomt substrat, der ellers ville have været ukendt. Det er vigtigt at bruge indfødte substrater, når sondering disse typer af systemer. Denne teknik kan bruges til at undersøge læsning, skrivning og sletning aktivitet eller bindende evne til enhver ændring, der kan indarbejdes af pyrrolysin genetisk kode ekspansion teknik. Pyrrolysyl-tRNA-synthetasen er allerede indbygget promiskuøs og er blevet konstrueret til en lang række andre substrater, der allerede åbner døren for at bruge denne teknik i et vilkårligt antal systemer, hvilket gør den primære begrænsende faktor forskerens kreativitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der er ingen konkurrerende finansielle interesser at erklære af nogen af forfatterne.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Dr. Wesley Wang for at lægge grunden til denne protokol og hans værdifulde mentorskab. Dette arbejde blev delvist støttet af National Institutes of Health (Grants R01GM127575 og R01GM121584) og Welch Foundation (Grant A-1715).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M TE Buffer | NA | NA | 0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 1 M TE Buffer | NA | NA | 1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 100x TE Buffer | NA | NA | |
| 2 M TE Buffer | NA | NA | 2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 20 mM TE Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 6 M GuHCl | 6M guanidinium chloride, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0 | ||
| Acetyllysine | |||
| Column Wash Buffer | NA | NA | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazole pH 7.8 |
| Elution Buffer | NA | NA | |
| Fisherbrand Variable-Flow Chemical Transfer Pump | Fischer Scientific | 15-077-67 | |
| His-TEV protease | |||
| Histone Lysis Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0 |
| Ni-NTA Resin | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 7.8 | ||
| PCR Clean-Up Kit | Epoch Life Sicences | 2360050 | |
| Pellet Wash Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0 |
| petDUET-His-SUMO-TEV-H4 | |||
| petDUET-His-TEV-H2A | |||
| petDUET-His-TEV-H2B | |||
| petDUET-His-TEV-H3 | |||
| pEVOL-AckRS | Addgene | 137976 | |
| pGEM-3z/601 | Addgene | 26656 | |
| Storage Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glycerol, pH 7.8 |
| Thermocycler |
References
- Srinivasan, G., James, C. M., Krzycki, J. A. Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: Charging of a UAG-Decoding specialized tRNA. Science. 296 (5572), 1459-1462 (2002).
- Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochimica Et Biophysica Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
- Umehara, T., et al. N-Acetyl lysyl-tRNA synthetases evolved by a CcdB-based selection possess N-acetyl lysine specificity in vitro and in vivo. FEBS Letters. 586 (6), 729-733 (2012).
- Hsu, W. W., Wu, B., Liu, W. R. Sirtuins 1 and 2 are universal histone deacetylases. ACS Chemical Biology. 11 (3), 792-799 (2016).
- Wang, W. W., Zeng, Y., Wu, B., Deiters, A., Liu, W. R. A chemical biology approach to reveal Sirt6-targeted histone H3 sites in nucleosomes. ACS Chemical Biology. 11 (7), 1973-1981 (2016).
- Wang, W. W., et al. A click chemistry approach reveals the chromatin-dependent histone H3K36 deacylase nature of SIRT7. Journal of the American Chemical Society. 141 (6), 2462-2473 (2019).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8 (1), 91 (2008).
- Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
- Gallego-Jara, J., Écija Conesa, A., de Diego Puente, T., Lozano Terol, G., Cánovas Díaz, M. Characterization of CobB kinetics and inhibition by nicotinamide. PLoS One. 12 (12), 0189689 (2017).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
- Zhao, B., et al. The molecular basis of tight nuclear tethering and inactivation of cGAS. Nature. 587 (7835), 673-677 (2020).
- Burdette, D. L., Vance, R. E. STING and the innate immune response to nucleic acids in the cytosol. Nature Immunology. 14 (1), 19-26 (2013).
- Barber, G. N. Innate immune DNA sensing pathways: STING, AIMII and the regulation of interferon production and inflammatory responses. Current Opinion in Immunology. 23 (1), 10-20 (2011).
- Ablasser, A., et al. cGAS produces a 2'-5'-linked cyclic dinucleotide second messenger that activates STING. Nature. 498 (7454), 380-384 (2013).
- Gao, P., et al. Cyclic [G(2',5')pA(3',5')p] is the metazoan second messenger produced by DNA-activated cyclic GMP-AMP synthase. Cell. 153 (5), 1094-1107 (2013).
- Zhao, B., et al. A conserved PLPLRT/SD motif of STING mediates the recruitment and activation of TBK1. Nature. 569 (7758), 718-722 (2019).
