Summary
Hier präsentieren wir eine Methode, um acetylierte Histonproteine mittels genetischer Codeerweiterung auszudrücken und rekonstituierte Nukleosomen in vitro zusammenzusetzen.
Abstract
Acetylatierte Histonproteine können leicht in Escherichia coli exprimiert werden, die eine Mutante, Nε-Acetyl-Lysin (AcK)-spezifische Methanosarcina mazi pyrrolysinttRNA-Synthetase (MmAcKRS1) und ihre kognade tRNA (tRNAPyl) zur Zusammenstellung rekonstituierter Mononukleosomen mit MmAcKRS1 und tRNAPyl liefern AcK an einer Bernsteinmutationsstelle in der mRNA der Wahl während der Translation in Escherichia coli. Diese Technik wurde ausgiebig verwendet, um AcK an H3-Lysin-Standorten zu integrieren. Pyrrolysyl-tRNA-Synthetase (PylRS) kann auch leicht entwickelt werden, um andere nichtkanonische Aminosäuren (ncAAs) für die standortspezifische Proteinmodifikation oder -funktionalisierung zu integrieren. Hier beschreiben wir eine Methode, AcK mit dem MmAcKRS1-System in Histon H3 zu integrieren und acetylierte H3-Proteine in rekonstituierte Mononukleosomen zu integrieren. Acetylierte rekonstituierte Mononukleosomen können in biochemischen und verbindlichen Assays, Strukturbestimmung und mehr verwendet werden. Die Beschaffung modifizierter Mononukleosomen ist entscheidend für die Entwicklung von Experimenten im Zusammenhang mit der Entdeckung neuer Wechselwirkungen und dem Verständnis der Epigenetik.
Introduction
Wir haben PylRS und tRNAPyl verwendet, um rekonstituierte Mononukleosomen mit standortspezifischen acetylierten Histonen zu synthetisieren und zusammenzusetzen. PylRS hat sich als genetisches Codeerweiterungstool zur Herstellung von Proteinen mit posttranslationalen Modifikationen (PTMs) als unschätzbar erwiesen und wurde genetisch weiterentwickelt, um etwa 200 verschiedene ncAAs zu integrieren. PylRS enthält an einem Bernstein-Stop-Codon, wodurch die Konkurrenz von anderen Aminosäuren während der Übersetzung entfernt wird. PylRS wurde zuerst in methanogenen Archaeen entdeckt und wird seitdem in der chemischen Biologie verwendet, um neuartige reaktive chemische Gruppen in Proteine1,2zu integrieren.
MmAcKRS1 wurde aus Methanosarcina mazei PylRS entwickelt und häufig in unserem Labor für die Synthese von acetylierten Proteinen3,4,5,6verwendet. MmAcKRS1 liefert AcK an einer Bernsteinmutationsstelle in der mRNA der Wahl während der Übersetzung in Escherichia coli. Diese Technik wurde bisher verwendet, um AcK an K4, K9, K14, K18, K23, K27, K36, K56, K64 und K79 Histon H3 Lysin-Sites zu integrieren, um die Aktivität von Sirtuin 1, 2, 6 und 7 auf acetylierten Mononukleosomen4,5,6zu untersuchen. Hier beschreiben wir diese Methode, um acetylierte Histone auszudrücken und acetylierte Nukleosomen zu rekonstruieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plasmidkonstruktion
- Beginnen Sie mit der Entscheidung, welches Histonprotein acetyliert wird und an welcher Lysin-Stelle. Mutieren Sie die Seite zum Bernstein-Stop-Codon (TAG) mit Website gerichtet Etagenese.
HINWEIS: Es gibt vier zuvor entwickelte Plasmide, die für die Expression von Histonproteinen verwendet werden. Alle vier Histonproteine wurden mit einem N-terminalen Histidin-Tag in den pETDuet-1-Vektor geklont. Histone H4 enthält auch ein SUMO-Tag, den Ursprung der Replikation colE1 mit einer Kopiernummer von etwa 40, Ampicillin-resistent, und ein T7-Promoter.- Entwerfen Sie Vorwärts- und Rückwärtsprimer, die eine TAG-Mutation an der gewünschten Stelle enthalten (ersetzen eines vorhandenen Lysin-Codons durch das Bernstein-Stop-Codon) in einem der vier Histonproteinplasmide.
- Verwenden Sie Vollplasmid-PCR, um das TAG-haltige Plasmid zu verstärken. Bestimmen Sie eine geeignete Glühtemperatur für die Primer. Im Allgemeinen reicht die Schmelztemperatur (Tm) der Primer minus 5 °C aus. Bei Schwierigkeiten bei der Herstellung eines PCR-Produkts kann ein Temperaturgradient um Tm - 5 °C verwendet werden, um die Glühtemperatur für die Amplifikation zu optimieren.
HINWEIS: In diesem Experiment wurde eine hauseigene pFU-Polymerase für 30 Zyklen mit folgenden Bedingungen verwendet: 94 °C für 30 s (Denaturierung), Glühtemperatur für 30 s und 72 °C für 6 min (oder 1 min pro Kilobase-Paar). Weitere Informationen zu dieser Art von PCR-Methode finden Sie unter Liu und Naismith7. - Bereinigen Sie das PCR-Produkt mit einem PCR-Bereinigungskit, indem Sie das Herstellerprotokoll befolgen. Analysieren Sie das PCR-Produkt durch Agarose-Gel-Elektrophorese und anschließende Ethidiumbromidfärbung.
- Ligate das Plasmid durch Inkubieren mit T4 Ligase über Nacht bei 16 °C.
- Verwandeln Sie zunächst das TAG-haltige Plasmid (AmpR) in chemisch kompetente Escherichia coli. Wählen Sie mindestens 4 Kolonien aus der Transformation und reinigen Sie das Plasmid. Machen Sie Zellbestände mit Glycerin nach Standardmethoden und lagern Sie bei -80 °C. Senden Sie zur Sequenzierung, um die gewünschte TAG-Mutation zu bestätigen.
- Sobald die Sequenz bestätigt ist, transformieren Sie das TAG-haltige Plasmid (AmpR) mit pEVOL-AckRS (ChlR) in chemisch kompetentes CobB (das einzige in E. coli.) bekannte Histonlysin-Deacetylase, das BL21-Zellen mit der Wärmeschockmethode löscht. pEVOL ist ein Plasmid mit einer Mittleren Kopierzahl bis zum Ursprung p15A mit niedriger Kopiernummer.
HINWEIS: Die pEVOL-Reihe von Plasmiden wurde auf der Grundlage früherer Studien erstellt, die zeigten, dass eine erhöhte Expression des orthogonalen AaRS/tRNATyr-Paares wirksam bei der Verringerung der Proteinkürzung und bei der Erhöhung der Gesamtausbeute mutierter Proteine8war. Wenn CobB-Deletionszellen nicht zugänglich sind, fahren Sie mit chemisch kompetenten BL21-Zellen fort. CobB ist ein Sirtuin-ähnliches Histon-Lysin-Deacetylase und Nicotinamid kann in einer Endkonzentration von 5 mM während der Histonproteinexpression zugesetzt werden, um CobB als alternativen Ansatz zu hemmen9. - Machen Sie einen Zellbestand und lagern Sie bei -80 °C.
2. Acetylatierte Histonproteinexpression
- Bereiten Sie 1 L autoklavierte 2YT-Medien (oder Volumen ihrer Wahl) in einem Kulturkolben vor.
- 20 ml 2YT-Medien mit den entsprechenden Antibiotika mit dem kotransformierten Zellbestand, der das TAG-haltige Plasmid (AmpR) und pEVOL-AckRS (ChlR) enthält, impfen und bei 37 °C bis OD = 0,6 (4-6 h) wachsen.
- Fügen Sie die entsprechenden Antibiotika zu den 1 L autoklavierten 2YT-Medien hinzu und impfen Sie mit der 20 ml-Starterkultur. Wachsen bei 37 °C bis OD = 0,6-0,8 (2-3 h).
- Fügen Sie induzierende Mittel und Acetyllysin (AcK) zu den Endkonzentrationen von IPTG 1 mM, 0,2% Arabinose und AcK 5 mM hinzu.
- Wachsen Sie die Kultur bei 37 °C für 6-8 h.
- Pelletzellen bei 2.700 x g für 15 min.
- Lagern Sie das Zellpellet über Nacht bei -80 °C.
- Ab diesem Schritt halten Sie die Probe immer auf Eis. Lösen Sie das Zellpellet in 50 ml Histonlysepuffer pro 1 L Kultur.
- Beschallen nach dem folgenden Zyklus: 1 s an, 1 s aus, gesamtzeit: 3 min bei 60% Amplitude.
- Pellet-Einschlusskörper bei 41.600 x g für 45 min.
- Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Einschlusskörper in 30 ml Histonlysepuffer wieder aus. Pellet-Einschluss verheißt bei 41.600 x g für 30 min.
- Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Einschlusskörper in 30 ml Pelletwaschpuffer wieder aus. Pellet-Einschlusskörper bei 41.600 x g für 30 min.
- Entsorgen Sie den Überstand und lösen Sie die Einschlüsse in 25 ml von 6 M Guanidinhydrochlorid (GuHCl) Puffer auf. Mit Rührung bei 37 °C für 1 h inkubieren.
HINWEIS: Bei Bedarf können Einschlusskörper über Nacht bei 4 °C mit Rührung inkubiert werden. - Pellet-Einschluss verheißt 45 min. 41.600 x g. Inkubieren Sie den Überstand mit 1 ml Ni-NTA Harz, der mit 6 M GuHCl Puffer für 2 h ausgeglichen wird.
- Fahren Sie mit der Ni-NTA-Reinigung unter denaturierten Bedingungen fort. Waschen Sie die Spalte mit 3 Spaltenvolumen des Spaltenwaschpuffers. Elute acetylierte Stonprotein mit 10 ml Elutionspuffer.
HINWEIS: Der Versuch, das Protein hier zu konzentrieren, ist eine Option, aber acetylierte Histone sind sehr unvorhersehbar und können leicht ausfallen. Es wird nicht empfohlen, sich über 2 ml gesamtvolumen zu konzentrieren. - Extensiv dialysieren das acetylierte Histonprotein gegen 5% Essigsäurepuffer, um Salze zu entfernen. Dialyse für 3 h zu einer Zeit bei 4 °C, Austausch gegen frischen Puffer mindestens 6 mal.
HINWEIS: Für eine verbesserte Proteinreinheit gibt es eine Option, gegen reines Wasser zu dialysieren. Dies führt jedoch zu einer erheblichen Niederschlagsmenge und Ertragsminderung, die bei ertragsarmen acetylierten Histonproteinen unerwünscht sein kann. - Aliquot und Lyophilize Protein, und speichern sie unbegrenzt bei -80 °C. Wildtyp-Histonproteine ergeben in der Regel 10-50 mg/L, während acetylierte Histonproteine je nach spezifischer Lysin-Site weniger als 10 mg/L ergeben. H3K79Ac durchschnittlich 5 mg/L.
3. Wildtyp-Histonproteinexpression
- Um vollständige Nukleosomen zu montieren, drücken Sie alle 4 Histonproteine aus. Beim Ausdrücken und Reinigen von Wildtyphistonen ist das Protokoll mit den acetylierten Histonen identisch, mit Ausnahme der folgenden:
- Führen Sie keine Co-Transformation durch. Verwenden Sie pEVOL-AcKRS nicht für den Typ Histone-Ausdruck. Passen Sie Antibiotika entsprechend an.
- Verwenden Sie keine CobB-Deletionszelllinie oder fügen Sie Nicotinamid, AcK oder Arabinose während der Induktion der zellulären Expression hinzu.
4. Herstellung von 601 DNA
HINWEIS: Eine zuvor entwickelte optimierte DNA-Sequenz zur direkten Nukleosompositionierung wird mit Histon-Okimatoren zusammengesetzt, um Mononukleosom mit hoher Effizienz zu produzieren. Diese Sequenz wird als 601 DNA oder die Widom-Sequenz bezeichnet. Diese Sequenz ist zur Standard-DNA-Sequenz für In-vitro-Studien von Nukleosomen von Chromatin-Remodeling-Assays bis hin zu Einzelmolekülmessungen10geworden.
- Um signifikante Mengen von 601 DNA für die Nukleom-Montage vorzubereiten, transformieren Sie pGEM-3z/601 in Top 10 Zellen und wachsen 10 ml Kultur für die Plasmidverstärkung und Extraktion. Verwenden Sie ein Plasmid-Extraktionskit und folgen Sie der Empfehlung des Herstellers.
- Verwenden Sie für dieses Amplifikationsprotokoll eine im Eigenen Haus ausgedrückte PFU-Polymerase (effizienter). Einrichten einer PCR-Reaktion: Verwenden Sie für die 250-L-Reaktion 207,5 l autoklaviertes MQ H2O, 25 l 10x PFU-Puffer, 5 l Vorwärts-Primer: ctggagaatcccggtgccg, 5 l Reverse Primer: acaggatgtatatatctgacacg, 5 l dNTP-Mix, 2,5 l PFU-Enzym. Wir führen in der Regel 60 Reaktionen auf einmal aus, um genügend DNA zu erhalten, um sich zusammenzusetzen.
- Verwenden Sie eine Glühtemperatur von 52 °C für 30 s und eine Verlängerungszeit von 30 s bei Verwendung von PFU-Polymerase. Ansonsten folgen Sie den empfohlenen Bedingungen des Herstellers.
- Sobald PCR fertig ist, verwenden Sie ein PCR-Reinigungskit ihrer Wahl, um das PCR-Produkt zu reinigen.
5. Montage des Histon-Oktobeers
- Lösen Sie Aliquots der Histonproteinpellets H2A, H2B, H3 und H4 auf, so dass es einen separaten Vorrat an jedem Histonprotein in GuHCl Buffer mit einem Gesamtvolumen von 100 l gibt.
- Berechnen Sie die Konzentration jedes Histonproteins, indem Sie die A280-Absorption messen.
- Wenn die Absorption für jedes Protein größer als 1 ist, verdünnen Sie mit GuHCl-Puffer, um eine genauere Konzentration zu erhalten.
- Kombinieren Sie H2A- und H2B-Proteine in einem 1:1-Molarenverhältnis und verdünnen Sie sie auf eine Gesamtproteinkonzentration von 4 g/l. Wiederholen Sie dies für H3 und H4.
- Dialyse sequenziell bei 4 °C gegen 2 M TE Puffer über Nacht, 1 M TE Puffer für 2 h und 0,5 M TE Puffer für 5 h.
HINWEIS: Der zweite und dritte Schritt der Dialyse bewirkt, dass instabile Konformationen des Proteins ausfallen. Es wird erwartet, dass es an diesen Stufen starke Niederschläge gibt. - Ausscheide durch Zentrifugation bei 16.800 x g bei 4 °C entfernen.
- Berechnen Sie erneut die Konzentration von Histondimermen (H2A/H2B-Gemisch) und Tetrameren (H3/H4-Gemisch), die die A280-Absorption messen.
- Mischen Sie Dimere und Tetramere in einem 1:1-Molarenverhältnis und stellen Sie NaCl durch Zugabe von festem NaCl auf 2 M ein.
- Histon-Oktomater kann bei 4 °C gelagert werden und ist stabiler als Dimere und Tetramere. Niemals Histone-Okamer einfrieren, da dies zu Einer Demontage führen kann.
- Wenn Sie sich mit acetylierten Histonen zusammensetzen, ersetzen Sie einfach das Wildtyp-Protein durch das acetylierte Protein im Verfahren.
6. Nukleosom-Montage
- Verwenden Sie 100x TE-Puffer und soliden NaCl, um 601 DNA auf 2M TE-Puffer einzustellen. Fügen Sie die 601 DNA in 2M TE Puffer zu Histon-Okamer in einem Molaren-Verhältnis von 0,85:1 bis 0,90:1 hinzu. Ein niedrigeres Verhältnis von DNA kann hinzugefügt werden, wenn freie DNA in der Gelverschiebungsanalyse vorhanden ist.
- Das DNA-Histon-Gemisch einen Dialysebeutel übertragen und in ca. 200 ml 2M TE-Puffer (oder mehr bei der Montage mehrerer Proben) platzieren und bei 4 °C sehr sanft umrühren.
- Stellen Sie eine peristaltische Pumpe ein, um langsam in keinen SalzTE-Puffer zu tropfen. Wenn sich das Volumen ungefähr verdoppelt hat, gießen Sie die Hälfte des Volumens aus. Tun Sie dies mindestens 4 Mal insgesamt. Bei einer Pumpe kann dies je nach Startvolumen 4-8 h dauern. Nukleosomen bilden sich, wenn die Salzkonzentration auf 150 mM reduziert wird (gemessen am Salzgehaltsmesser).
- Nachdem die Salzkonzentration auf 150 mM reduziert wurde, dialysieren Sie gegen einen 20 mM TE Puffer über Nacht.
- Ausscheidungen durch Zentrifugation entfernen und die Konzentration der Nukleosomen miteinem Plattenleser messen.
- Fügen Sie His-TEV Protease (TEV: Nukleosome 1:30, w:w ) und inkubieren über Nacht bei 4 °C, um alle Histidin-Tags zu entfernen. Entfernen Sie die Histidin-Tag-Verunreinigungen aus der Nukleosomlösung durch Ni-NTA-Harz nach unten ziehen.
- Um das Nukleosom zu positionieren und die Probe zu homogenisieren, bei 60 °C für 1 h inkubieren.
HINWEIS: Für acetylierte Standorte, die besonders instabil sind, ist dieser Schritt möglicherweise nicht ratsam. - Nukleosomen kurzfristig (einige Wochen) bei 4 °C lagern.
- Zur Langzeitlagerung Nukleosomen gegen Speicherpuffer dialysieren und bei -80 °C lagern.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dimere, Tetramere und Okmamer können mit einem 12% SDS PAGE Gel bewertet werden (Abbildung 1 und Abbildung 2). Hier können Sie sehen, dass einige der acetylierten Tetramere eine geringere Ausbeute haben als andere (Abbildung 1). In der Tat, je näher an der Kernregion, desto niedriger der Ertrag beobachtet. Dies ist höchstwahrscheinlich auf die Acetylierung zurückzuführen, die die Zusammenstellung des Tetramers stört, je näher man den Kernregionen kommt. Ein ähnlicher Effekt wird nach der Montage von Okdomaden beobachtet (Abbildung 2). Nach der Montage von Okdomen mit 601 DNA-Sequenz kann das Nukleosom mit einem 5% 1x TBE Native PAGE Gel gefolgt mit Färbung mit Ethidiumbromid beurteilt werden (Abbildung 3). Vor der TEV-Verdauung wird das Nukleosomband in der Nähe der 10k-Basispaarmarke beobachtet. Nach den TEV-Verdauungen verschiebt sich das Nukleosomband relativ zur Leiter nach unten. Vor der thermischen Positionierung werden die beobachteten Nukleosombänder sehr breit und möglicherweise streifen (Abbildung 4).
Abbildung 1:Histon-Dimere und Tetramere. Repräsentativ12% SDS PAGE Gel des wilden Typs Histondimer (Lane 2) und H3 acetylierte Tetramere (Lanes 3-9). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Histone-Okimatoer. Repräsentativ12% SDS PAGE Gel von H3 acetylierte Histon-Okamer (Bahnen 2-11). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Zusammengebaut seine getaggte H3K64Ac Nukleosom-Komplex. Repräsentativ 1x TBE Native PAGE Gel von H3K64Ac Nukleosom-Komplex (Lane 2) im Vergleich zu freien 601 DNA (Lane 4) visualisiert durch Ethidiumbromid. Lane 3 zeigt H3K64Ac Nukleosom nach inkubationszeit bei 60 °C für eine Stunde. In Spur 3 wird beobachtet, dass sich das gesamte Nukleosom zerlegt hat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4:Montierter TEV-verdautes Nukleosom-Komplex. Repräsentativ 1x TBE Native PAGE Gel von Wil-Typ TEV verdaut Nukleosom-Komplex, und freie 601 DNA. Ein Vergleich der thermischen Positionierung vor und nach dem Nukleosom. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Es ist wichtig, dieses Protokoll während eines Experiments bis ins kleinste Detail zu befolgen. Nukleosomen sind nicht sehr stabil und viel Versuch und Irrtum ist in die Bestimmung dieses Protokolls gegangen. Es ist der Schlüssel, um Ausscheidungen bei jedem Schritt (oder wann immer beobachtet) zu entfernen, da Partikel leicht die Montageprozesse stören können. Halten Sie seine Tonproben immer auf Eis. Werden Nukleosomen zu lange bei 4 °C gelagert, können sie sich spontan zerlegen. Achten Sie darauf, alle Proben von Native PAGE zu überprüfen, wenn sie bei 4 °C für mehr als 2 Wochen vor der Verwendung in einem Experiment gelagert werden. Vermeiden Sie Wirbel-Oktomen und Nukleosomen, da dies auch dazu führen kann, dass sie zerlegen. Wenn Probleme bei der Montage von Dimern, Tetramern oder Okimern auftreten, ist dies in der Regel ein Hinweis auf eine schlechte Proteinqualität. Überprüfen Sie die Proteinqualität um 15% SDS-PAGE. Eine Option, wenn die Proteinreinheit niedrig ist, ist das Protein gegen reines Wasser zu dialysieren. Dies wird zu starken Niederschlägen führen und den Proteinertrag stark reduzieren, aber eine reinere Probe produzieren. Die Einbeziehung und nukleosomale Stabilität jeder Histon-Acetylierungsstelle variiert stark. Im Allgemeinen gilt: Je näher der Standort an der N-Terminal-Domäne liegt, desto geringer ist der Ertrag während der Histonproteinexpression. Für die Nukleosomenstabilität gilt: Je näher die Acetylierungsstelle an den Nukleosomenkern- oder DNA-Bindungsstellen liegt, desto weniger stabil ist das montierte Nukleosom. Wenn Stabilitätsprobleme auftreten, ist es wichtig, die Nukleosomenprobe immer auf Eis zu halten. Es kann notwendig sein, den Nukleosomen-Positionierschritt bei 60 °C wegzulassen, da dies zu Demontage oder Niederschlag führen kann. Eine wesentliche Einschränkung der acetylierten Nukleosomen ist ihre Instabilität. Es kann unmöglich sein, Assays bei höheren Temperaturen wie 37 °C zu preformen, ohne nukleosomale Niederschläge zu verursachen. Wenn experimentelle Verfahren es zulassen, führen Sie sie bei 4 °C durch, um eine Ausfällung des acetylierten Nukleosomes zu verhindern.
Diese Methode zur Herstellung von Nukleosomen ist besonders nützlich für die Herstellung modifizierter Nukleosomen für Bindungsexperimente und Strukturbestimmung. Diese Methode produziert Nukleosomen mit höherer Reinheit und einer bekannten nukleosomalen DNA-Sequenz, die verwirrende Variablen eliminiert, was zu besser kontrollierten Experimenten und Bildern mit höherer Auflösung führt. Für die Strukturbestimmung ist entscheidend, dass die Nukleosomenprobe mit einer bekannten DNA-Sequenz homogen ist, da es sonst fast unmöglich ist, hochauflösende Bilder zu erhalten.
Es gibt eine Fülle von möglichen Anwendungen dieser Methode. Insbesondere im Bereich der Epigenetik. Es kann unglaublich schwierig sein, modifizierte Proteine zu erhalten. Die Gewinnung modifizierter Proteine ist entscheidend für die Untersuchung der Struktur und Funktion der Autoren, Leser und Rasser in den vielen epigenetischen Bahnen, die schlecht verstanden werden. Wir haben diese Technik bereits verwendet, um die Zugänglichkeit der nucleleosomalen DNA zur Pst1-Verdauung an den H3-Acetylierungsstellen K18, K36 und K56 zu untersuchen, indem wir jeden mutierten Oktomier mit einer modifizierten 601 DNA-Sequenz zusammenbauen, die eine Pst1-Vergärungsstelle enthält. Diese Technik kann weiter modifiziert werden, um andere NCAAs als AcK zu integrieren. PylRS kann so konstruiert werden, dass sie eine Vielzahl anderer NCAAs enthält. Wir haben auch Nε-(7-azidoheptanoyl)-L-Lysin (AzHeK) von Bernsteincodon in Escherichia coli zur rekombinanten Expression mehrerer AzHeK-haltiger Histon-H3-Proteine aufgenommen, um die Histon-Deacylierungsaktivität von SIRT7 an mehreren Acetylierungsstellen zu untersuchen. Dieser Ansatz zeigte, dass SIRT7 eine hohe Aktivität in Richtung Deacylation von H3K36 hat und auch katalytisch aktiv ist, um H3K37 zu deacylatieren. Die H3K36-Deacylierung erwies sich weiter als nukleosomabhängig und kann signifikant verbessert werden, indem dem Acylnukleosomsubstrat eine kurze doppelsträngige DNA hinzugefügt wird, die die überbrückende DNA zwischen Nukleosomen in nativem Chromatin6imitiert.
Diese Methode kann auch geändert werden, um wilde TypNukleosomen ohne Modifikationen zu produzieren, die in einer Vielzahl von Szenarien nützlich sein können. Unsere Gruppe hat vor kurzem eine Struktur in Zusammenarbeit mit der Gruppe von Dr. Pingwei Li veröffentlicht, die die enge Bindung der zyklischen GMP-AMP-Synthase (cGAS) an ein negativ geladenes saures Pflaster zeigt, das durch Histon H2A und H2B über seine zweite DNA-Bindungsstelle11gebildet wird. cGAS ist ein dsDNA-Sensor, der die Synthese eines zyklischen Dinukleotids cGAMP katalysiert, der die Induktion von Interferonen vom Typ I durch die STING-TBK1-IRF3-Signalachse12,13,14,15,16vermittelt.
Der Vorteil der Verwendung von vollständig zusammengesetzten Nukleosomen ist, dass es dem nativen Zustand von Nukleosomen, die als besseres Modell dienen, um die Aktivitäten oder Bindungsfähigkeiten einer beliebigen Anzahl von epigenetischen Proteinen zu untersuchen, eher ähnelt. Es gibt zahlreiche Beispiele für begrenzte oder völlig fehlende Enzymaktivität gegenüber nackter DNA oder Histonpeptidsubstraten, die bei Sonden mit Nukleosomsubstraten die Ergebnisse drastisch verändern. Wie beim oben genannten Beispiel wurde für SIRT7 eine neuartige Deakylierungsstelle mit einem Nukleosossubstrat entdeckt, das sonst unbekannt gewesen wäre. Es ist wichtig, native Substrate zu verwenden, wenn diese Arten von Systemen untersucht werden. Diese Technik kann verwendet werden, um die Lese-, Schreib- und Löschaktivität oder Bindungsfähigkeit jeder Modifikation zu untersuchen, die durch die Pyrrolysin-Gencodeerweiterungstechnik integriert werden kann. Die Pyrrolysyl-tRNA-Synthetase ist bereits nativ promiscuous und wurde für eine Vielzahl von anderen Substraten entwickelt, die bereits die Tür für die Verwendung dieser Technik in einer beliebigen Anzahl von Systemen öffnen, was den primären begrenzenden Faktor der Kreativität des Forschers macht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Es gibt keine konkurrierenden finanziellen Interessen, die von einem der Autoren zu erklären sind.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Wesley Wang für die Grundlagen für dieses Protokoll und seine wertvolle Mentorenschaft. Diese Arbeit wurde teilweise von den National Institutes of Health (Grants R01GM127575 und R01GM121584) und der Welch Foundation (Grant A-1715) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M TE Buffer | NA | NA | 0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 1 M TE Buffer | NA | NA | 1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 100x TE Buffer | NA | NA | |
| 2 M TE Buffer | NA | NA | 2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 20 mM TE Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 6 M GuHCl | 6M guanidinium chloride, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0 | ||
| Acetyllysine | |||
| Column Wash Buffer | NA | NA | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazole pH 7.8 |
| Elution Buffer | NA | NA | |
| Fisherbrand Variable-Flow Chemical Transfer Pump | Fischer Scientific | 15-077-67 | |
| His-TEV protease | |||
| Histone Lysis Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0 |
| Ni-NTA Resin | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 7.8 | ||
| PCR Clean-Up Kit | Epoch Life Sicences | 2360050 | |
| Pellet Wash Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0 |
| petDUET-His-SUMO-TEV-H4 | |||
| petDUET-His-TEV-H2A | |||
| petDUET-His-TEV-H2B | |||
| petDUET-His-TEV-H3 | |||
| pEVOL-AckRS | Addgene | 137976 | |
| pGEM-3z/601 | Addgene | 26656 | |
| Storage Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glycerol, pH 7.8 |
| Thermocycler |
References
- Srinivasan, G., James, C. M., Krzycki, J. A. Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: Charging of a UAG-Decoding specialized tRNA. Science. 296 (5572), 1459-1462 (2002).
- Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochimica Et Biophysica Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
- Umehara, T., et al. N-Acetyl lysyl-tRNA synthetases evolved by a CcdB-based selection possess N-acetyl lysine specificity in vitro and in vivo. FEBS Letters. 586 (6), 729-733 (2012).
- Hsu, W. W., Wu, B., Liu, W. R. Sirtuins 1 and 2 are universal histone deacetylases. ACS Chemical Biology. 11 (3), 792-799 (2016).
- Wang, W. W., Zeng, Y., Wu, B., Deiters, A., Liu, W. R. A chemical biology approach to reveal Sirt6-targeted histone H3 sites in nucleosomes. ACS Chemical Biology. 11 (7), 1973-1981 (2016).
- Wang, W. W., et al. A click chemistry approach reveals the chromatin-dependent histone H3K36 deacylase nature of SIRT7. Journal of the American Chemical Society. 141 (6), 2462-2473 (2019).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8 (1), 91 (2008).
- Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
- Gallego-Jara, J., Écija Conesa, A., de Diego Puente, T., Lozano Terol, G., Cánovas Díaz, M. Characterization of CobB kinetics and inhibition by nicotinamide. PLoS One. 12 (12), 0189689 (2017).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
- Zhao, B., et al. The molecular basis of tight nuclear tethering and inactivation of cGAS. Nature. 587 (7835), 673-677 (2020).
- Burdette, D. L., Vance, R. E. STING and the innate immune response to nucleic acids in the cytosol. Nature Immunology. 14 (1), 19-26 (2013).
- Barber, G. N. Innate immune DNA sensing pathways: STING, AIMII and the regulation of interferon production and inflammatory responses. Current Opinion in Immunology. 23 (1), 10-20 (2011).
- Ablasser, A., et al. cGAS produces a 2'-5'-linked cyclic dinucleotide second messenger that activates STING. Nature. 498 (7454), 380-384 (2013).
- Gao, P., et al. Cyclic [G(2',5')pA(3',5')p] is the metazoan second messenger produced by DNA-activated cyclic GMP-AMP synthase. Cell. 153 (5), 1094-1107 (2013).
- Zhao, B., et al. A conserved PLPLRT/SD motif of STING mediates the recruitment and activation of TBK1. Nature. 569 (7758), 718-722 (2019).
