Summary
כאן אנו מציגים שיטה לבטא חלבוני histone אצטילאט באמצעות הרחבת קוד גנטי להרכיב נוקלאוזומים מחדש במבחנה.
Abstract
חלבוני histone אצטילאט יכול לבוא לידי ביטוי בקלות ב Escherichia coli קידוד מוטציה, Nε-אצטיל-ליצין (AcK) ספציפי מתנוסרצ'ינה מזי פירוסין tRNA-סינתטאז (MmAcKRS1) ו tRNA קוגנטיבי שלה (tRNAPyl)להרכיב מונונוקלאוזומים משוחזרים עם היסטון אצטילאט ספציפי לאתר. MmAcKRS1 ו- tRNAPyl מספקים AcK באתר מוטציה ענבר ב mRNA של בחירה במהלך התרגום ב Escherichia coli. טכניקה זו שימשה בהרחבה כדי לשלב AcK באתרי ליזין H3. סינתזת Pyrrolysyl-tRNA (PylRS) ניתן גם להתפתח בקלות לשלב חומצות אמינו לא קאנוניות אחרות (ncAAs) עבור שינוי חלבון ספציפי לאתר או פונקציונליזציה. כאן אנו מפרטים שיטה לשלב AcK באמצעות מערכת MmAcKRS1 לתוך H3 histone ולשלב חלבוני H3 אצטילאט לתוך mononucleosomes מחדש. מונונוקלאוזומים משוחזרים אצטילאטים יכולים לשמש מבחנים ביוכימיים ומחייבים, קביעת מבנה ועוד. השגת מונונוקלאוזומים מותאמים היא חיונית לתכנון ניסויים הקשורים לגילוי אינטראקציות חדשות והבנת אפיגנטיקה.
Introduction
השתמשנו ב-PylRS וב-tRNAPyl כדי לסנתז ולהרכיב מונונוקלאוזומים משוחזרים עם היסטוני אצטילציה ספציפיים לאתר. PylRS הוכיחה את עצמה ככלי להרחבת קוד גנטי לייצור חלבונים עם שינויים לאחר תרגום (PTMs) והתפתחה גנטית כדי לשלב כ -200 ncAAs שונים. PylRS משלבת בקודון עצירת ענבר, הסרת תחרות מחומצות אמינו אחרות במהלך התרגום. PylRS התגלה לראשונה בארכיאולוגיה מתנוגנית, ומאז נוצל בביולוגיה כימית כדי לשלב קבוצות כימיות תגובתיות חדשניות לחלבונים1,2.
MmAcKRS1 התפתח מ מתנוזרצ'ינה mazei PylRS ומשמש לעתים קרובות במעבדה שלנו לסינתזה של חלבונים acetylated3,4,5,6. MmAcKRS1 מספק AcK באתר מוטציה ענבר mRNA של בחירה במהלך התרגום ב Escherichia קולי. טכניקה זו שימשה בעבר לשלב AcK ב K4, K9, K14, K18, K23, K27, K36, K56, K64, ו K79 היסטון H3 לידין אתרים ללמוד את הפעילות של Sirtuin 1, 2, 6, ו 7 על מונונוקלאוזומים acetylated4,5,6. כאן אנו מפרטים שיטה זו כדי להביע היסטונים אצטילאטים ו לבנות מחדש נוקלאוזומים acetylated.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בניית פלסמיד
- התחילו בהחלטה איזה חלבון היסטון יהיה אצטילאט ובאיזה אתר ליסטין. מוטציה האתר כדי לעצור ענבר קודון (TAG) באמצעות mutagenesis מכוון האתר.
הערה: ישנם ארבעה פלסמידים שתוכננו בעבר מנוצלים לביטוי של חלבוני היסטון. כל ארבעת חלבוני ההיסטון שוכפלו לווקטור pETDuet-1 עם תג היסטידין N-terminal. Histone H4 כולל גם תג SUMO, המקור של colE1 שכפול עם מספר עותק של כ 40, אמיטצילין עמיד, ו מקדם T7.- עצבו פריימרים קדמיים ומתהווכים המכילים מוטציית TAG באתר הרצוי (החלפת קודון ליצין קיים בקודון עצירת הענבר) באחד מארבעת פלסמידי החלבון של היסטון.
- השתמש ב- PCR שלם כדי להגביר את התג המכיל פלסמיד. קבעו טמפרטורת חישול מתאימה לפריימרים. באופן כללי, טמפרטורת ההיתוך (Tm)של פרייומרים מינוס 5 מעלות צלזיוס יהיה מספיק. אם יש קושי בהשגת מוצר PCR, ניתן להשתמש במעבר טמפרטורה סביב Tm - 5 °C (60 °F) כדי למטב את טמפרטורת חישול להגברה.
הערה: בניסוי זה פולימראז PFU מבוטא בתוך הבית שימש במשך 30 מחזורים עם התנאים הבאים: 94 °C (94 °C (30 s (denaturation), חישול טמפרטורה עבור 30 s, ו 72 °C (6 דקות (או 1 דקה לקילו-בייס-זוגות). לפרטים נוספים על סוג זה של שיטת PCR ראו ליו ונייסמית'7. - נקה את מוצר ה- PCR באמצעות ערכת ניקוי PCR על-ידי ביצוע פרוטוקול היצרן. לנתח את מוצר PCR על ידי אלקטרופורזה ג'ל agarose וכתמים אתידיום ברומיד הבאים.
- Ligate פלסמיד על ידי דגירה עם T4 ligase לילה ב 16 °C (66 °F).
- ראשית להפוך את תג המכיל פלסמיד (AmpR)לתוך כימית מוסמך Escherichia coli. בחר מינימום של 4 מושבות מהשינוי ולטהר את הפלסמיד. הפוך את מלאי התאים של כל אחד עם גליצרול בשיטות סטנדרטיות ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס. שלח רצף כדי לאשר את המוטציה הרצויה TAG.
- לאחר שהרצף מאושר, הפוך במשותף את הפלסמיד המכיל תג (AmpR)עם pEVOL-AckRS (ChlR)לקובB בעל יכולת כימית (הליסין deacetylase ההיסטון היחיד הידוע בתאי BL21 E. coli). pEVOL הוא פלסמיד עם מספר עותק בינוני למקור p15A בעל העתקה נמוכה.
הערה: סדרת pEVOL של פלסמידים נבנו בהתבסס על מחקרים קודמים שהראו ביטוי מוגבר של זוג aaRS / tRNATyr אורתוגונלי היה יעיל בהפחתת חיתוך חלבון ובהגדלת התפוקה הכוללת של חלבונים מוטנטים8. אם תאי מחיקה של CobB אינם נגישים, המשך עם תאי BL21 בעלי יכולת כימית. CobB הוא ליצרין ליצרין דמוי סירטואין וניקוטינמיד ניתן להוסיף בריכוז סופי של 5 מ"מ במהלך ביטוי חלבון היסטון כדי לעכב את CobB כגישה חלופית9. - הפוך מלאי תא ולאחסן ב -80 °C (69 °F).
2. ביטוי חלבון histone אצטילאט
- הכן 1 L של מדיה 2YT autoclaved (או נפח של בחירה) בבקבוק תרבות.
- לחסן 20 מ"ל של 2YT מדיה המכילה את האנטיביוטיקה המתאימה עם מלאי תאים טרנספורמציה משותפת כי יש פלסמיד המכיל תג (AmpR)ו pEVOL-AckRS (ChlR)ולגדול ב 37 °C (70 °F) כדי OD = 0.6 (4-6 שעות).
- הוסיפו את האנטיביוטיקה המתאימה ל-1 ליטר של מדיה 2YT אוטומטית וחסן עם תרבות המתנע של 20 מ"ל. לגדול ב 37 °C (70 °F) כדי OD = 0.6-0.8 (2-3 שעות).
- הוסף סוכני גרימת אצטיליסין (AcK) לריכוזים הסופיים של IPTG 1 מ"מ, 0.2% arabinose, ו AcK 5 mM.
- לגדל את התרבות ב 37 °C (67 °F) עבור 6-8 שעות.
- כדורי תאים ב 2,700 x g במשך 15 דקות.
- לאחסן את גלולת התא ב -80 מעלות צלזיוס לילה.
- מצעד זה ואילך לשמור את המדגם על הקרח כל הזמן. להמיס את גלולת התא ב 50 מ"ל של מאגר תמוגה היסטון לכל 1 L של תרבות.
- Sonicate על פי המחזור הבא: 1 s על, 1 הנחה, סה"כ בזמן: 3 דקות ב 60% משרעת.
- גופי הכללה גלולה ב 41,600 x g במשך 45 דקות.
- השלך את גופי ההכללה העל-טבעיים וההתחדשות ב- 30 מ"ל של מאגר תמוגה של היסטון. גלולה הכללה bodes ב 41,600 x g במשך 30 דקות.
- השלך את גופי הכללה supernatant ו resuspend ב 30 מ"ל של חיץ לשטוף גלולה. גופי הכללה גלולה ב 41,600 x g במשך 30 דקות.
- להשליך את גופי הכללה supernatant ולהמיס ב 25 מ"ל של 6 M Guanidine הידרוכלוריד (GuHCl) חיץ. דגירה עם עצבנות ב 37 °C (69 °F) עבור 1 שעות.
הערה: במידת הצורך, גופי הכללה ניתן לדגור עם עצבנות לילה ב 4 מעלות צלזיוס. - גלולה הכללה bodes ב 41,600 x g במשך 45 דקות. דגירה supernatant עם 1 מ"ל של שף Ni-NTA שווה עם 6 M GuHCl חיץ עבור 2 שעות.
- המשך עם טיהור Ni-NTA בתנאים מפורקים. שטפו את העמודה עם נפח של 3 עמודות של מאגר שטיפת עמודות. חלבון histone Elute עם 10 מ"ל של חיץ אלוטיון.
הערה: ניסיון לרכז את החלבון כאן הוא אופציה אבל היסטוני אצטילציה הם מאוד בלתי צפויים והוא יכול בקלות לזרז. לא מומלץ להתרכז מעבר ל-2 מ"ל בנפח הכולל. - דיאליז נרחב חלבון histone אצטילאט נגד 5% חומצה אצטית חוצץ כדי להסיר מלחים. Dialyze עבור 3 שעות בכל פעם ב 4 מעלות צלזיוס, החלפת חיץ טרי מינימום של 6 פעמים.
הערה: לשיפור טוהר החלבון, קיימת אפשרות לחייג נגד מים טהורים. עם זאת, זה גורם משקעים משמעותיים וירידה בתפוקה אשר עשוי להיות לא רצוי עבור חלבונים histone אצטילציה בתשואה נמוכה. - Aliquot ו lyophilize חלבון, ולאחסן ללא הגבלת זמן ב -80 מעלות צלזיוס. חלבוני היסטון מסוג פראי מניבים בדרך כלל 10-50 מ"ג/ל' ואילו חלבוני היסטון עם אצטילאט מניבים פחות מ-10 מ"ג/ליטר בהתאם לאתר הליצין הספציפי. לדוגמה, H3K79Ac ממוצעים 5 מ"ג / ליטר.
3. ביטוי חלבון היסטון מסוג פראי
- להרכבת נוקלאוזומים מלאים, יש לבטא את כל 4 חלבוני ההיסטון. כאשר מבטאים ומטהרים היסטונים מסוג פראי הפרוטוקול זהה להיסטוני האצטילאט למעט הדברים הבאים:
- אל תבצע המרה משותפת. אין להשתמש ב- pEVOL-AcKRS עבור ביטוי histone מסוג בר. התאימו אנטיביוטיקה בהתאם.
- אין להשתמש בקו תא מחיקה של CobB או להוסיף Nicotinamide, AcK או arabinose במהלך אינדוקציה של ביטוי תאי.
4. הכנת 601 DNA
הערה: רצף דנ"א ממוטב שתוכנן בעבר למיקום נוקלאוזום ישיר מורכב עם תמנוני היסטון כדי לייצר מונונוקלאוזום ביעילות גבוהה. רצף זה נקרא 601 DNA או רצף Widom. רצף זה הפך לרצף הדנ"א הסטנדרטי למחקרי חוץ גופיות של נוקלאוזומים ממסיעות שיפוץ כרומטין למדידות מולקולה אחת10.
- כדי להכין כמויות משמעותיות של 601 DNA להרכבה גרעינית, להפוך pGEM-3z/601 לתוך למעלה 10 תאים ולגדול 10 מ"ל של תרבות עבור הגברה פלסמיד ומיצוי. השתמש בערכת חילוץ פלסמיד ופעל בהתאם להמלצת היצרן.
- השתמש בפולימראז PFU מבוטא בתוך הארגון (יעיל יותר) עבור פרוטוקול הגברה זה. הגדר תגובת PCR: לתגובת 250 μL, להשתמש 207.5 μL autoclaved MQ H2O, 25 μL 10x PFU Buffer, 5 μL קדימה פריימר: ctggagaatccctggccg, 5 μL הפוך פריימר: acaggatgtatatatctctgacacg, 5 μL dNTP לערבב, 2.5 מיקרול PFU אנזים. אנחנו בדרך כלל רצים 60 תגובות בבת אחת כדי לקבל מספיק DNA להרכיב.
- השתמש בטמפרטורת חישול של 52 °C (70 °F) עבור 30 s וזמן הארכה של 30 s אם באמצעות פולימראז PFU. אחרת, פעל בהתאם לתנאים המומלצים על-ידי היצרנים.
- לאחר ש- PCR נעשה, השתמש בערכת ניקוי PCR לבחירתך כדי לטהר את מוצר PCR.
5. הרכבה של אוקטמר היסטון
- להמיס aliquots של כדורי חלבון histone H2A, H2B, H3, ו H4 כך שיש מלאי נפרד של כל חלבון histone במאגר GuHCl עם נפח כולל של 100 μL.
- לחשב את הריכוז של כל חלבון histone על ידי מדידת ספיגת A280.
- אם הספיגה גדולה מ-1 עבור חלבון כלשהו, יש לדלל עם מאגר GuHCl כדי לקבל ריכוז מדויק יותר.
- ערבבו חלבוני H2A ו-H2B ביחס טוחנת של 1:1 ודללו לריכוז חלבון כולל של 4 מיקרוגרם/μL. חזרו על הפעולה עבור H3 ו-H4.
- חייג ברצף ב- 4 °C (70 °F) מול מאגר TE של 2 M למשך לילה, מאגר TE M אחד עבור 2 שעות ומאגר TE של 0.5 M למשך 5 שעות.
הערה: השלב השני והשלישי של הדיאליזה גורם קונפורמציות לא יציבות של חלבון לזרז החוצה. הוא צפוי לראות משקעים כבדים בשלבים אלה. - הסר משקעים על ידי צנטריפוגה ב 16,800 x g ב 4 מעלות צלזיוס.
- שוב, לחשב את הריכוז של דימרים histone (תערובת H2A / H2B) ו tetramers (תערובת H3/H4) מדידת ספיגת A280.
- מערבבים דימרים וטטרמה ביחס טוחנת של 1:1 ומתאימים את NaCl ל-2 מ' על ידי תוספת של NaCl מוצק.
- תמנון Histone ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס והוא יציב יותר מאשר dimers ו tetramers. לעולם אל תקפיא את תמנון היסטון מכיוון שזה יכול לגרום לפירוק.
- אם הרכבה עם היסטוני אצטילאט, פשוט להחליף את החלבון סוג הבר עם חלבון אצטילאט בהליך.
6. הרכבה נוקלאוזום
- השתמש במאגר TE 100x וב- NaCl מלא כדי להתאים 601 דנ"א למאגר TE של 2M. הוסף את ה- DNA של 601 במאגר TE של 2M לתמנון histone ביחס טוחנת של 0.85:1 ל- 0.90:1. ניתן להוסיף יחס נמוך יותר של דנ"א אם קיים דנ"א חופשי בניתוח משמרת הג'ל.
- מעבירים את תערובת הדנ"א-histone לשקית דיאליזה ומניחים כ-200 מ"ל של מאגר TE 2M (או יותר אם מרכיבים דגימות מרובות) ומערבבים בעדינות רבה ב-4 מעלות צלזיוס.
- הגדר משאבה פריסטלית לטיהור כדי לטפטף באיטיות ללא מאגר TE מלח. כאשר עוצמת הקול הוכפלה בערך, שפוך חצי מעוצמת הקול. עשה זאת לפחות 4 פעמים בסך הכל. עם משאבה זה יכול לקחת 4-8 שעות בהתאם לנפח ההתחלה. גרעינים נוצרים כאשר ריכוז המלח מצטמצם ל-150 מ"ר (נמדד על ידי מד מליחות).
- לאחר ריכוז המלח מצטמצם ל 150 מ"מ, dialyze נגד מאגר TE 20 מ"מ לילה.
- הסר משקעים על ידי צנטריפוגה ולמדוד את הריכוז של הגרעינים על ידי קריאהA 260 באמצעות קורא צלחת.
- הוסף פרוטאז His-TEV (TEV: נוקלאוזום 1:30, w:w) ודגר לילה ב 4 מעלות צלזיוס כדי להסיר את כל תגי היסטידין. הסר את זיהומים תג היסטידין מתמיסת הגרעין על ידי שף Ni-NTA למשוך למטה.
- כדי למקם את הגרעין הומוגנית המדגם, דגירה ב 60 °C (60 °F) במשך 1 שעות.
הערה: עבור אתרים עם אצטילאט שאינם יציבים במיוחד, ייתכן שצעד זה לא מומלץ. - יש לאחסן גרעינים לטווח קצר (כמה שבועות) ב-4 מעלות צלזיוס.
- לאחסון לטווח ארוך, נוקלאוזומים dialyze נגד מאגר אחסון ולאחסן ב -80 °C (60 °F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניתן להעריך דימרים, טטרמרים ושמיניות על ידי הפעלת ג'ל SDS PAGE של 12%(איור 1 ואיור 2). כאן ניתן לראות שלחלק מהטטרמרים בעלי האצטילאט יש תשואה נמוכה יותר מאחרים (איור 1). למעשה, ככל שאזור הליבה קרוב יותר לאזור הליבה, כך התשואה נצפתה נמוך יותר. זה ככל הנראה בשל אצטילציה להפריע להרכבה של tetramer קרוב יותר אתה מקבל לאזורי הליבה. השפעה דומה נצפית לאחר הרכבת תמנונים (איור 2). לאחר הרכבת אוקטמרים עם רצף דנ"א 601, ניתן להעריך את הגרעין באמצעות ג'ל 5% 1x TBE Native PAGE ואחריו כתמים עם אתידיום ברומיד(איור 3). לפני עיכול TEV רצועת הגרעין נצפתה ליד סימן זוג בסיס 10k. לאחר עיכול TEV הלהקה הגרעינית נעה למטה יחסית לסולם. לפני המיקום התרמי, להקות הגרעין שנצפו יהיו רחבות מאוד, ואולי גם פסים(איור 4).
איור 1: דימרים וטטרמה של היסטון. נציג 12% SDS PAGE ג'ל של סוג פראי histone דימר (נתיב 2) ו H3 אצטילאט tetramers (נתיבים 3-9). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: אוקטמרים של היסטון. נציג 12% SDS PAGE ג'ל של אצטילאט H3 אוקטמרים histone (נתיבים 2-11). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: אסף את קומפלקס הגרעין H3K64Ac המתויג שלו. נציג 1x TBE ג'ל דף מקורי של קומפלקס נוקלאוזום H3K64Ac (נתיב 2) לעומת חינם 601 DNA (ליין 4) דמיינו על ידי אתידיום ברומיד. נתיב 3 מראה גרעין H3K64Ac לאחר הדגירה ב 60 °C (60 °F) במשך שעה אחת. הוא ציין בנתיב 3 כי כל הגרעין יש התפרק. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מורכב TEV מתעכל קומפלקס נוקלאוזום. נציג 1x TBE ג'ל דף מקורי מסוג TEV מעוכל קומפלקס נוקלאוזום, חינם 601 DNA. השוואה של מיקום תרמי לפני ואחרי נוקלאוזום. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
זה חיוני כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה בכל פרט במהלך ניסוי. Nucleosomes אינם יציבים מאוד הרבה ניסוי וטעייה נכנסה לתוך קביעת פרוטוקול זה. זה המפתח להסרת משקעים בכל שלב (או בכל פעם שנצפה) כי חלקיקים יכולים בקלות להפריע לתהליכי ההרכבה. תמיד לשמור דגימות היסטון על קרח. אם נוקלאוזומים מאוחסנים ב 4 מעלות צלזיוס במשך זמן רב מדי, הם יכולים לפרק באופן ספונטני. הקפד לבדוק את כל הדגימות על ידי דף מקורי אם מאוחסן ב 4 °C (70 °F) במשך יותר מ 2 שבועות לפני השימוש בכל ניסוי. הימנע תמציות מערבולת ונוקלאוזומים כמו זה יכול גם לגרום להם לפרק. אם נתקלים בבעיות בהרכבת דימרים, טטרמרים או תמניות, הדבר מעיד בדרך כלל על איכות חלבון ירודה. בדקו את איכות החלבון ב-15% SDS-PAGE. אפשרות אחת אם טוהר החלבון נמוך היא לחייג את החלבון נגד מים טהורים. זה יגרום משקעים כבדים ולהפחית מאוד את תפוקת החלבון, אבל יפיק מדגם טהור יותר. ההתאגדות והיציבות הגרעינית של כל אתר אצטילציה של היסטון משתנה מאוד. באופן כללי, ככל שהאתר קרוב יותר לתחום N-terminal, כך התפוקה נמוכה יותר במהלך ביטוי חלבון היסטון. ליציבות גרעינית, ככל שאתר האצטילציה קרוב יותר לליבת הגרעין או לאתרי מחייב הדנ"א, כך הגרעין המורכב פחות יציב. אם נתקלים בבעיות יציבות, חיוני תמיד לשמור את דגימת הגרעין על הקרח. ייתכן שיהיה צורך להשמיט את שלב מיקום הגרעין ב 60 °C (60 °F) כמו זה עלול לגרום פירוק או משקעים. מגבלה עיקרית של נוקלאוזומים אצטילטיים היא חוסר היציבות שלהם. זה יכול להיות בלתי אפשרי preform מבחנים בטמפרטורות גבוהות יותר כגון 37 °C (69 °F) מבלי לגרום משקעים נוקליאוסומליים. אם הליכים ניסיוניים מאפשרים, לבצע אותם ב 4 מעלות צלזיוס כדי למנוע משקעים של נוקלאוזום acetylated.
שיטה זו של ייצור נוקלאוזומים שימושית במיוחד לייצור נוקלאוזומים מותאמים לניסויים מחייבים וקביעות מבנה. שיטה זו מייצרת נוקלאוזומים עם טוהר גבוה יותר ורצף דנ"א גרעיני ידוע, אשר מבטל משתנים מבלבלים וכתוצאה מכך ניסויים מבוקרים טובים יותר ותמונות ברזולוציה גבוהה יותר. זה חיוני עבור קביעות מבנה כי מדגם הגרעין הוא הומוגני עם רצף DNA ידוע, אחרת זה יהיה כל אבל בלתי אפשרי להשיג תמונות ברזולוציה גבוהה.
יש שפע של יישומים פוטנציאליים של שיטה זו. באופן ספציפי, בתחום האפיגנטיקה. זה יכול להיות קשה מאוד להשיג חלבונים מותאמים. השגת חלבונים מותאמים חיונית לבדיקת המבנה והתפקוד של הכותבים, הקוראים והמחקים במסלולים האפיגנטיים הרבים שאינם מובנים כהלכה. השתמשנו בעבר בטכניקה זו כדי לחקור את הנגישות של DNA נוקליאוסומלי לעיכול Pst1 באתרי אצטילציה H3 K18, K36, ו K56 על ידי הרכבת כל אוקטמר מוטנט עם רצף DNA שונה 601 המכיל אתר עיכול Pst1. טכניקה זו ניתן לשנות עוד יותר לשלב NCAAs מלבד AcK. PylRS ניתן להנדס לשלב שורה של NCAAs אחרים. שילבנו גם N ε-(7-azidoheptanoyl)-L-לידין (AzHeK) על ידי קודון ענבר ב Escherichia coli עבור ביטוי רקומביננטי של כמה חלבונים H3 Histone המכילים AzHeK לחקור את פעילות deacylation histone של SIRT7 בכמה אתרי אצטילציה. גישה זו חשפה כי SIRT7 יש פעילות גבוהה לקראת deacylation של H3K36 והוא גם פעיל באופן קטלטי כדי deacylate H3K37. Deacylation H3K36 הוכח עוד יותר להיות תלוי נוקלאוזום והוא יכול להיות משופר באופן משמעותי על ידי הוספת DNA קצר כפול גדילים למצע acyl-nucleosome המחקה את ה- DNA גישור בין גרעינים בכרומטין יליד6.
שיטה זו יכולה גם להיות שונה כדי לייצר נוקלאוזומים מסוג בר ללא שינויים אשר יכול להיות שימושי במגוון רחב של תרחישים. הקבוצה שלנו פרסמה לאחרונה מבנה בשיתוף עם הקבוצה של ד"ר Pingwei לי מראה את הכריכה ההדוקה של סינתאז GMP-AMP מחזורי (cGAS) לתיקון חומצי טעון שלילית שנוצר על ידי H2A היסטון ו H2B באמצעות אתר מחייב DNA השני שלה11. cGAS הוא חיישן dsDNA המזרז את הסינתזה של cGAMP דינקלאוטיד מחזורי, המתווך את האינדוקציה של סוג אני אינטרפרונים דרך STING-TBK1-IRF3 איתות ציר12,13,14,15,16.
היתרון של שימוש בגרעין שהורכב במלואו הוא שהוא דומה יותר למצב הילידי של נוקלאוזומים המשמשים מודל טוב יותר לבדיקת הפעילויות או יכולות האיגוד של כל מספר של חלבונים הקשורים לאפיגנטיקה. ישנן דוגמאות רבות של פעילות אנזים מוגבלת או נעדר לחלוטין כלפי DNA עירום או מצעים פפטיד histone כי כאשר נחקר עם מצעים נוקלאוזום משנה באופן דרסטי את התוצאות. כמו בדוגמה שהוזכרה לעיל, אתר deacylation רומן התגלה עבור SIRT7 באמצעות מצע גרעין שאחרת לא היה ידוע. זה חיוני כדי להשתמש מצעים מקוריים בעת חיטוט סוגים אלה של מערכות. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור את הקריאה, הכתיבה, ומחיקת פעילות או יכולת מחייבת של כל שינוי שניתן לשלב על ידי טכניקת הרחבת הקוד הגנטי pyrrolysine. סינתזת pyrrolysyl-tRNA כבר מופקרת באופן מקורי והונדסה עבור שורה של מצעים אחרים שכבר פותחים את הדלת לשימוש בטכניקה זו בכל מספר של מערכות מה שהופך את הגורם המגביל העיקרי ליצירתיות של החוקר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין אינטרסים כלכליים מתחרים להצהיר על ידי אף אחד מהכותבים.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לד"ר ווסלי וונג על הנחת היסודות לפרוטוקול הזה ולחונכותו החשובה. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (מענקים R01GM127575 ו R01GM121584) וקרן וולש (גרנט A-1715).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M TE Buffer | NA | NA | 0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 1 M TE Buffer | NA | NA | 1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 100x TE Buffer | NA | NA | |
| 2 M TE Buffer | NA | NA | 2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 20 mM TE Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 6 M GuHCl | 6M guanidinium chloride, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0 | ||
| Acetyllysine | |||
| Column Wash Buffer | NA | NA | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazole pH 7.8 |
| Elution Buffer | NA | NA | |
| Fisherbrand Variable-Flow Chemical Transfer Pump | Fischer Scientific | 15-077-67 | |
| His-TEV protease | |||
| Histone Lysis Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0 |
| Ni-NTA Resin | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 7.8 | ||
| PCR Clean-Up Kit | Epoch Life Sicences | 2360050 | |
| Pellet Wash Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0 |
| petDUET-His-SUMO-TEV-H4 | |||
| petDUET-His-TEV-H2A | |||
| petDUET-His-TEV-H2B | |||
| petDUET-His-TEV-H3 | |||
| pEVOL-AckRS | Addgene | 137976 | |
| pGEM-3z/601 | Addgene | 26656 | |
| Storage Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glycerol, pH 7.8 |
| Thermocycler |
References
- Srinivasan, G., James, C. M., Krzycki, J. A. Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: Charging of a UAG-Decoding specialized tRNA. Science. 296 (5572), 1459-1462 (2002).
- Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochimica Et Biophysica Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
- Umehara, T., et al. N-Acetyl lysyl-tRNA synthetases evolved by a CcdB-based selection possess N-acetyl lysine specificity in vitro and in vivo. FEBS Letters. 586 (6), 729-733 (2012).
- Hsu, W. W., Wu, B., Liu, W. R. Sirtuins 1 and 2 are universal histone deacetylases. ACS Chemical Biology. 11 (3), 792-799 (2016).
- Wang, W. W., Zeng, Y., Wu, B., Deiters, A., Liu, W. R. A chemical biology approach to reveal Sirt6-targeted histone H3 sites in nucleosomes. ACS Chemical Biology. 11 (7), 1973-1981 (2016).
- Wang, W. W., et al. A click chemistry approach reveals the chromatin-dependent histone H3K36 deacylase nature of SIRT7. Journal of the American Chemical Society. 141 (6), 2462-2473 (2019).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8 (1), 91 (2008).
- Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
- Gallego-Jara, J., Écija Conesa, A., de Diego Puente, T., Lozano Terol, G., Cánovas Díaz, M. Characterization of CobB kinetics and inhibition by nicotinamide. PLoS One. 12 (12), 0189689 (2017).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
- Zhao, B., et al. The molecular basis of tight nuclear tethering and inactivation of cGAS. Nature. 587 (7835), 673-677 (2020).
- Burdette, D. L., Vance, R. E. STING and the innate immune response to nucleic acids in the cytosol. Nature Immunology. 14 (1), 19-26 (2013).
- Barber, G. N. Innate immune DNA sensing pathways: STING, AIMII and the regulation of interferon production and inflammatory responses. Current Opinion in Immunology. 23 (1), 10-20 (2011).
- Ablasser, A., et al. cGAS produces a 2'-5'-linked cyclic dinucleotide second messenger that activates STING. Nature. 498 (7454), 380-384 (2013).
- Gao, P., et al. Cyclic [G(2',5')pA(3',5')p] is the metazoan second messenger produced by DNA-activated cyclic GMP-AMP synthase. Cell. 153 (5), 1094-1107 (2013).
- Zhao, B., et al. A conserved PLPLRT/SD motif of STING mediates the recruitment and activation of TBK1. Nature. 569 (7758), 718-722 (2019).
