Summary
在这里，描述了一个低成本、可访问的协议，以评估蝴蝶在环境条件下的冷休克恢复情况。
Abstract
生态生理学，特别是生态体生理学，在这个不断变化的世界中变得越来越重要，因为它使用物种和环境特征的测量来探索生物体与其周围环境之间的相互作用，以更好地了解它们的生存和健康。传统的热检测在时间、金钱和设备方面成本高昂，因此通常仅限于小样本量和少物种。这里介绍了一个新的协议，它使用蝴蝶的例子生成关于大型、大量陆地昆虫的个体行为和生理的详细数据。本文描述了在环境条件下可在现场进行的冷冲击恢复检测方法，不需要昂贵的实验室设备。该方法已用于了解对热带蝴蝶冷冲击的反应和恢复策略，从而在整个蝴蝶群落中生成单个级别数据。这些方法可用于远程现场设置和教室，并可用于生成与生态相关的生理数据并用作教学工具。
Introduction
20世纪70年代末80年代初热生理学与生态学的结合，启动了生态生理学领域。广泛开展的关于生态同源的热研究突出了不同生态进化环境的生态-生理协同效应。近来，面对气候变化和全球热环境的变化，对息科生物热生理学的研究重新受到关注。除了为生态生理学学术领域的研究提供信息外，研究人员还可以广泛接触热生理学分析，并可作为各级实践教学方法。热性能的组成部分，包括热极限和温度冲击的影响，是动物8，9的生态，行为和生命史的基础。
具体来说，生态同体用于解决生理学问题，因为内热决定了环境温度和生物温度之间不可分割的联系。生物体能够承受的温度范围（其临界热最低到最大热范围）及其行为和健身最大化的温度（热优化）往往植根于生态和进化过程。这些生理特征越来越重要，因为温度，无论是手段还是极端，都在增加10。例如，伴随栖息地破坏和破碎而发生的非生物变化，包括温度升高，已经影响到包括古人类在内的教会社区，将生理脆弱的物种（具有狭窄的热耐受性）限制在小残余栖息地补丁11，12。
评估热性能的关键部件在时间和资源方面都可能非常昂贵，传统上需要实验室设备和标准化条件。此外，常规的测定通常不能反映给定动物在自然界中经历的环境条件的广度，因为类似生理实验中的温度受到仔细控制，而且往往与动物所经历的环境条件无关。这种温度控制可以降低对个体反应变化的理解。生理学家依靠实验室的加热和冷却实验，使用可编程的水浴来稳定加热或冷却动物的环境，以告知热性能曲线15。
通常，动物被放置在带有热电偶的小瓶中，通过控制周围水浴的温度，它们的环境温度会稳步变化。研究人员测量实现生理状态变化（如寒昏迷、击倒）所需的时间，以及状态变化发生在16、17的温度。这些工具起价至少为 500 美元，体积大，重，需要额外的技术设备（如计算机、温库普）。因此，执行评估热性能的经典方法的基本工具是1）不经济地为所有人提供，2） 不适合将体积过大而不能包含在用于小型二重奏的习惯小瓶中的动物，3） 不便于在远程现场设置中使用。坚持共同的做法导致分类学和实验条件的代表性有限。
虽然完整的热性能曲线可以告知物种分布、生命历史特征和行为等特征，但较少和更简单的热指标的量化可以更高效，并且仍然非常翔实。生理检测，测量寒昏迷发作和随后的冷休克恢复，冷硬化，和纠正行为，是有效和可执行的代理，为生物体8的关键热最低。这里描述的是一种冷休克检测，可用于从大型陆地息热昆虫中获得生理数据。检测是负担得起的，可访问的，易于在野外条件下或在教室内执行。本协议产生的冷休克恢复数据可与物种或个人特征数据相结合，以追求有关生态生理学和/或用于向学生传授生理原理的问题。
Protocol
1. 确定感兴趣的物种
- 确定感兴趣的物种，以确定冷冲击恢复时间。请记住，每组在诱发寒昏迷所需的时间上都会有所不同（即昆虫仍然活着，但不移动且反应迟钝）。同样，根据生物体和数据的使用，选择不同的截止点，如果焦点个体不飞行，则停止实验（见第 4 节）。
注：此协议设计和开发用于莱皮多普泰拉。然而，它适用于大型、伏特、陆地昆虫，特别是那些可以平放在玻璃信封中限制运动和伤害的昆虫（例如蝴蝶和蝴蝶/蝴蝶/蝴蝶）。
2. 进行审前
- 对一小部分个体进行预审，以确定关键参数。按照以下协议的第 3 至 5 节操作，5-10 人进行审前。
- 测试冰上诱发寒昏迷（不动）所需的时间，但不要通过30分钟、60分钟和90分钟的治疗方法，按照第5.1步杀死焦点物种。
注意：诱发寒昏迷所需的时间将取决于个体的大小、位置和自然历史/行为。 - 根据步骤4.1-4.4的结果，并利用对焦点昆虫生态学的了解，选择一个时间，如果某一个体没有完全恢复，在试验结束时结束试验。基于这次切断的生态物种，以及记住，许多分钟后，无法飞行，许多昆虫是早产。
注：例如，如果大多数初步试验在 15 分钟后以飞行结束，则可以决定在 25 分钟后结束试验，以确保偶数异常值也有机会完全恢复（即飞行）。此协议基于 30 分钟的截止时间（步骤 5.4）。
- 测试冰上诱发寒昏迷（不动）所需的时间，但不要通过30分钟、60分钟和90分钟的治疗方法，按照第5.1步杀死焦点物种。
- 使用审前数据中的参数为实验的数据收集提供信息。根据焦点生物的需要修改下文所述的协议，包括冰浆中的时间、结束试验的时间以及数据表上记录的行为（例如，颤抖可能是选择昆虫的不当行为）。
- 定义这些数据需要回答的具体研究问题，同时改进参数。
注：例如，如果研究人员对长时间暴露对恢复的影响感兴趣，则冰中的时间是一个关键变量。如果研究人员对浅色和深色物种的生理差异感兴趣，他们可以选择两种颜色鲜明的物种，或者修改昆虫的翅膀颜色，以测量翅膀颜色对恢复时间的影响。重要的是，此方法非常可自定义所提出的需求和研究问题（参见讨论部分）。
- 定义这些数据需要回答的具体研究问题，同时改进参数。
3. 昆虫收藏
- 使用诱饵陷阱和昆虫网等适当方法收集昆虫（补充图1）。收集后，将每个人放在一个单独的玻璃信封中，并附有独特的身份证。
- 捕获后和接触冷冲击实验之前，将动物存放在阴凉、凉爽的地方。始终在捕获后 24 小时内使动物接受实验治疗，并尽可能在试验中标准化这一次。
- 虽然储存条件可能有所不同，但请远离直接的阳光。如果可能，将它们放在室内凉爽、黑暗的房间里。
- 在现场，确保它们在储存时被遮荫，并防止风（吹走）和其他可能进入信封的昆虫捕食者。
4. 设置冷冲击实验
- 用冰和水装满冷却器。确保有足够的冰持续至少一个小时，并根据需要定期添加冰，目标是在0°C的水中保持环境。
- 选择 1 到 4 个焦点个体进行一轮实验，确保每个个体均可识别。
- 如果使用多个物种，只需使用每个物种中的一个，以避免在数据表上混淆个人。如果只对一个物种进行实验，则只使用易于区分的个体，例如通过断翼或明显的标记。
- 如果实验的目标与机翼着色无关，则用独特的 ID（例如数字）标记机翼，并使用细腻的毛毡标记来区分个人。
- 如果实验不符合上述标准，则一次对一个人进行实验。
- 在数据表的行中填充与每种昆虫检测相关的信息，包括它们独特的 ID 和笔记中的有用标识符，如物种名称或区分字符（补充表 1）。
- 将所有焦点个体（仍放在其单独标记的信封中）放在一个有重量的密封塑料袋中（材料表），并将袋子放在冰水中60分钟（或直到导致寒流昏迷;见讨论）（补充图2）。
- 确保重量重（例如，大硬币、大垫圈或光滑的岩石），并保持足够大的昆虫袋淹没在冰水中，垂直于水面。使用不会导致密封塑料袋泄漏的重量。
注意：虽然昆虫在水下直接暴露在水中时仍然能够恢复，但湿信封使每个人的去除变得复杂。最好保持昆虫在袋子里干燥。
- 确保重量重（例如，大硬币、大垫圈或光滑的岩石），并保持足够大的昆虫袋淹没在冰水中，垂直于水面。使用不会导致密封塑料袋泄漏的重量。
- 记录温度和光数据。
- 使用数据记录器（参见 材料表）使用步骤 5.1 或 5.2 记录环境温度和光数据。
- 程序数据记录器收集温度和光数据在10s间隔，从昆虫将被释放的时间开始。
- 将数据记录器的启动时间建立在昆虫被放置在冰水中的时间上。确保数据记录器信息（日期、时间）同步，以便以后环境状况数据可以与每个焦点昆虫匹配。
- 使用简单的温度计用手（由第二个研究人员）以短时间记录温度和光数据。
- 决定实验参数，以便与无需数据记录器即可测量的恢复时间关联。使用不同的治疗方法：遮阳/阳光;暮色/中午。
- 使用数据记录器（参见 材料表）使用步骤 5.1 或 5.2 记录环境温度和光数据。
- 将昆虫的网状笼放在适当的位置，使笼内的温度和光环境尽可能均匀，从而提升笼子的底座，并可由观察者挖掘。
- 将数据记录器放在笼子外或笼子内，以免被撞倒或受到笼内小动作的影响。如果不使用数据记录器，则适当定位温度计并/或在适当的配置中设置笼子。
注意：必须放置数据记录器，以便记录的环境条件尽可能接近昆虫正在经历的环境条件。
5. 开始冷休克实验
- 60分钟后将动物从冰水浴中取出（或确定适当时间;见上文）。立即从塑料袋中取出昆虫，并尽快从信封中取出每个人，同时尽量减少处理（补充图3）。
- 动物一进网笼就开始秒表（见示例数据，补充表1）。
- 用铅笔敲击笼子的底座，搅动正在恢复的昆虫。
注：在恢复过程中提供刺激，确保焦点昆虫在生理能力（补充视频）后立即表现出恢复状态和行为。- 频繁而有力地点击，以确保动物在可能的情况下做出反应，但不会引起响应。
注：例如，当敲击笼子时，如果动物被弹射到空气中，直立降落，但不移动，以独立站立，这不被认为是一种"站立"行为，因为有机体确实没有独立站立。
- 频繁而有力地点击，以确保动物在可能的情况下做出反应，但不会引起响应。
- 将试用标记为在个人飞行后完成（即显示完全恢复）。结束试验，并考虑昆虫已经实现了完全恢复，如果它不移动后30分钟。
- 将昆虫从网状笼中取出，并将它们放回贴有标签的玻璃信封中。解放动物或饲养它们以进一步收集数据（例如，大小、重量的个体特征）。
- 如果使用数据记录器，请停止数据记录器数据收集，并在实验期间保存温度和光数据文件，并提供适当的日期/时间信息。
6. 数据处理
- 将数据表中显示的数据输入电子表格（例如，Ms Excel）。
- 如果使用数据记录器，则为每个被检测的响应添加温度和光数据。
- 计算每个人每个行为的温度和光的平均值和标准偏差。
注意：由于数据记录器每 10 s 记录数据一次，如果一种动物的站立行为需要 48 s 才能发生，请使用数据记录器中前 5 个条目进行该试验。 - 将每个人的每个恢复行为与数据记录者记录的非生物数据关联起来，必要时将向上或向下舍入到 10 s 间隔。
- 计算每个人每个行为的温度和光的平均值和标准偏差。
- 绘制和分析数据。例如， 图1可视化温度和光线对冷冲击恢复时间的影响。汇编其他相关数据（物种特征、区域栖息地特征），以检查被测试群体生理特征中的生态和进化模式。
注： 图1 是使用R中的ggplot2包绘制的。环境条件数据的详细程度将因用于测量环境条件的仪器而异。如果使用数据记录器，可以生成与 图 2 相媲美的详细信息的图形。如果使用温度计，研究人员将无法创建由环境光通知的绘图。同样，如果研究人员使用光或温度类别，这些散射图可以修改成框图或其他适当的模板来说明这些现象。
Representative Results
本协议中收集的数据允许检查和划分对生物体生理学至关重要的变量。例如，温度和光线条件都有助于蝴蝶从寒冷冲击中恢复（图1）。该图旨在探索环境条件与冷冲击恢复之间的相互作用。181种蝴蝶利用陷阱和网的野生捕获蝴蝶，从寒流引起的寒流昏迷中明显恢复（图2）。哥伦比亚安第斯人大约5个月 （2020年 1月、2月、5月至7月）收集了图2中提供的数据。实验总是在蝴蝶采集后的早晨进行。在最大效率下，两名观察者可以同时观察四只蝴蝶，每次重复七次（至少7.37小时），结果在一个上午对56个人进行了测试。这允许在整个蝴蝶社区收集大量数据，同时包括和考虑有关个体变异的数据。由于检测可以在环境条件下进行，因此恢复条件代表其栖息地，并反映自然界中生物体经历的自然变异。 图3 说明了冷休克恢复实验的温度和光线条件与采集一些经过测试的蝴蝶的牧场条件之间的重叠。
图1：在寒冷休克后（在几秒钟内）蝴蝶的恢复时间（在几秒钟内）的散射图。 物种是由家庭组织和着色的。总体而言，随着光线和温度的升高，冷冲击恢复时间缩短，显示不同税种的变异性。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：哥伦比亚安第斯海第181种蝴蝶的冷休克恢复检测结果示例。 这些数据表示从将蝴蝶从寒冷中移走以及它能够飞行的秒数。物种是由家庭组织和着色的。这个数字显示了这个实验可以成功应用的分类广度，以及不同物种的各种冷冲击恢复反应。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：在冷冲击恢复试验期间的环境温度和LUX。 放置在蝴蝶采集的牧场上的数据记录器记录的环境温度（蓝色）和LUX（浅强度、红色）图（浅色、条件跨越一整天）和冷休克恢复试验期间的情况（深色，仅上午时间）。绘制的环境场况和实验条件显示了蝴蝶在一周的野外取样和实验中经历的范围和平均条件。实验仅在凌晨（07：00-13：00 h）进行，而数据记录器则在现场部署了一周（显示为白天，06：00-18：00 h）。这里展示的是蝴蝶经历的实验条件和环境条件的重叠，显示了在环境条件下进行生理测定的生态相关性。 请单击此处查看此图的较大版本。
补充图1：收集焦点昆虫的程序 -在这种情况下，蝴蝶-使用诱饵范萨默伦陷阱和主动网。陷阱被腐烂的鱼和腐烂的水果饵诱饵。背景中的陷阱（无诱饵），前景是其独特的信封中与蓝色塑料收集盒对接的标本。请单击此处下载此文件。
补充 图2：最多有四只蝴蝶的袋子被淹没在冰水中的冷却器中。 塑料袋被标记为放置在冰水中的时间，这样冷休克实验就可以在早晨交错进行。塑料袋应密封，以防止标本变湿：然而，在这种情况下，袋和信封的泛滥对蝴蝶的恢复没有可衡量的影响。 请单击此处下载此文件。
补充 图3：两名观察员收集实地数据。 每个网状笼子包含四只从寒冷休克中恢复过来的独特蝴蝶。笼子里的聚氯乙烯T型接头容纳数据记录器，以防止直接阳光或雨水照射。每个观察者都有一个秒表，在蝴蝶释放到笼子里后立即启动。笼子被长凳抬高，允许观察者搅动笼子的底座，以确保蝴蝶在生理上尽快做出反应。 请单击此处下载此文件。
补充表 1：示例数据表。 该表显示了每只蝴蝶在字段中分配的独特 ID，并在笔记中区分字符（物种名称、关键颜色）。记录的还有蝴蝶在恢复期的支配地位（即翅膀的哪一侧暴露在阳光下），称为D（多萨尔）或V（腹腔）。 请单击此处下载此表。
补充视频1：敲击笼子进行冷休克恢复。 当蝴蝶恢复时，观察者会轻轻敲击笼子的底座，一旦蝴蝶有能力，就会诱导行为。 请点击这里下载此视频。
Discussion
热生理学研究结合了物种和环境特征的测量，以更好地了解生物体与其周围环境之间的相互作用，而这些相互作用是生存和健身的关键。在了解动植物的自然历史和生态的同时，面对景观和气候变化，热特征也越来越重要。几组系热陆地昆虫，特别是麻风病和奥多纳坦，相对较大和丰富，表现出独特的行为，并容易纵。这里概述的是一个高效和低成本的检测，以有效地测量这种昆虫的生理反应。该协议要求健康生物的来源进行检测，其实验前的处理时间有限。虽然一次测定的生物体数量灵活，但每个实验的焦点个体数量将因数据收集和/或观察者人数而异。
例如，制定此协议是为了收集整个社区的蝴蝶的详细个人数据。因此，具有代表性的结果表明，在与当地环境有关的各种条件下，努力最大限度地为尽可能多的物种的个人收集数据。无论焦点物种的数量如何，观察者都必须能够识别出笼子里经历复苏的每一个人。如果目标是只从一个物种收集数据，那么只有一两个人（如果根据不同的机翼磨损或如果单独标记可识别）应该立即进行检测。研究对象必须根据特定的研究问题或研究计划进行选择。根据提出的问题和数据收集的目的（例如研究或课堂），样本大小和其他特征的收集将有所不同。
为了说明本协议阐明的生理学的基本组成部分（诱导寒昏迷、恢复步骤、环境条件的作用），课堂教师可以选择两种不同的物种或单一物种的形态。如果焦点个体只在一个关键特征（如颜色）上有所不同，则需要较小的样本量，学生可以仔细研究该特征与有机体生理学之间的关系。对生态生理学感兴趣的研究人员可能会利用他们的实验数据来探索复杂的生态和进化问题。研究人员必须仔细选择直接解决其问题的焦点昆虫（例如，根据生命阶段、年龄、性别、位置），并根据所涉及的变量数量确定适当的样本量。复杂型号的样本量将大于上述型号。
在收集行为恢复数据时，笼子必须位于地面之上，因为观察者必须能够点击笼子底部才能引起恢复行为。这确保了生物体在生理上能够立即做出反应（站立，飞行），并且终端恢复行为（飞行）被记录下来。记录冷休克恢复期间的环境条件是热生理学研究不可或缺的一部分，因为该方案旨在研究和解开环境在有机体生理学中的作用。数据记录器（参见 材料表）可用于记录相关条件（例如温度、光线甚至湿度）的标准化测量。但是，如果这些工具不可用，则可以通过其他方式（如数字温度计）或简化环境条件变量以及使用遮阳和阳光等不同环境来测量相关条件。该协议为研究人员提供了根据研究的目的和范围测量冷休克恢复期间状况的选择。
虽然这种方法可以修改，以更好地适应特定的分类组，建议使用大，伏特昆虫。飞虫，恢复其独立飞行能力可能被认为是已经完成了全面恢复。如前所述，该方法成功地用于热带和亚热带的蝴蝶。根据给定区域的热趋势（即在会发生变化的地点经历的温度范围，从而影响基于海拔、纬度、树冠覆盖的预期），生物体可能需要在冰水浴中超过或少于一小时才能进入寒流昏迷状态。生物体的大小也可能影响进入寒冬昏迷所需的时间。关键是要找到寒冷暴露的时间，以诱发寒昏迷（不动），但不杀死焦点物种。诱发寒昏迷所需的时间将取决于个体的大小、位置和自然历史/行为。根据本文描述的冷休克实验结果，并利用对焦点昆虫生态学的了解，选择一个时间，如果某一个体没有完全恢复，则选择结束试验的时间。
根据研究人员的具体问题，该方法可分别应用于该领域或实验室，以允许自然环境变化和重要变量的控制。这种检测简单又便宜，有助于填补热生理学领域的现有空白。此协议的易用性使得它能够用于各种分类，为实验室友好型生物开放了该领域。进行标准化环境热测定的新颖性填补了实验室和现场结果之间的空白。利用环境条件进行生物体恢复将有助于研究人员划分环境和物种因素在生理学中的作用。最后，由于其成本低和缺乏所需的材料，该协议可用于该领域的偏远地点，而对于许多实地生物学家来说，设备很少，而且在教室中也很少，以便让年轻学生获得实践学习体验。
Disclosures
作者没有相互竞争的经济利益或其他利益冲突。
Acknowledgments
感谢贾雷特·丹尼尔斯、伊莎贝拉·普卢默、布雷特·舍弗斯和丹·哈恩对协议的首次开发。感谢海梅·哈格德、塞巴斯蒂安·杜兰和印第安纳·克里斯托瓦尔·里斯-马拉弗实施本议定书的几次迭代和对关键组成部分的投入。也感谢一个匿名评论者对手稿作为一个整体的反馈。支持由麦奎尔中心为Lepidoptera和生物多样性的出版基金，农业和生命科学学院，自然资源和环境学院，野生动物生态和保护部门在UF。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 x 24 x 36" Popup Rearing & Observation Cage | Bioquip | 1466PB | Ensure that the cage is slightly elevated from the ground to be able to tap the floor of the cage during experiments. |
| Cooler | Any | NA | |
| Glassine envelopes | Bioquip | 1130B | |
| HOBO Pendant Temperature/Light 8K Data Logger | Onset | UA-002-08 | If a datalogger is not accessible, researchers may choose to use a digital thermometer to record ambient temperatures at regular intervals. See protocol step 4.5 for additional information. |
| HOBO Optic USB Base Station | Onset | Base-U-1 | |
| Ice water | NA | NA | |
| Insects (focal taxa) | NA | Any | Collect sufficient samples to test, ensuring replication of experimental groups (e.g. species, sampling location) |
| PVC T-joint | Any | Any | |
| Sealable plastic bag | Any | NA | |
| Stopwatch/timer | Any | NA | |
| Weight | Any | NA | Large coins or small rocks to weigh down the plastic bags will ensure that specimens are submerged in ice water. A standardized weight is ideal. |
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