Summary
Her beskrives en rimelig, tilgjengelig protokoll for å evaluere kald sjokkgjenvinning av sommerfugler under omgivelsesmiljøforhold.
Abstract
Økologisk fysiologi, spesielt av ectotherms, blir stadig viktigere i denne skiftende verden, da den bruker mål på arter og miljøegenskaper for å utforske samspillet mellom organismer og deres omgivelser for bedre å forstå deres overlevelse og kondisjon. Tradisjonelle termiske analyser er kostbare når det gjelder tid, penger og utstyr og er derfor ofte begrenset til små utvalgsstørrelser og få arter. Presentert her er en ny protokoll som genererer detaljerte data om individuell oppførsel og fysiologi av store, volant, terrestriske insekter, ved hjelp av eksempelet på sommerfugler. Dette dokumentet beskriver metodene for en kald sjokkgjenvinningsanalyse som kan utføres i feltet under omgivelsesmiljøforhold og ikke krever kostbart laboratorieutstyr. Denne metoden har blitt brukt til å forstå respons- og gjenopprettingsstrategien til kaldt sjokk av tropiske sommerfugler, og genererer data på individnivå på tvers av hele sommerfuglsamfunn. Disse metodene kan brukes i både fjernfeltmiljøer og klasserom og kan brukes til å generere økologisk relevante fysiologiske data og som undervisningsverktøy.
Introduction
Integrasjonen av termisk fysiologi og økologi på slutten av 1970-tallet og begynnelsen av 1980-tallet1,2 lanserte feltet økologisk fysiologi. Omfattende termiske studier utført på ectotherms fremhever økologisk-fysiologiske synergier på tvers av ulike øko-evolusjonære sammenhenger3,4,5. Forskning på termisk fysiologi av ektotermiske organismer har fått oppmerksomhet nylig i møte med klimaendringer og endret termiske landskap over hele verden6,7. I tillegg til å informere studier innen det akademiske feltet økologisk fysiologi, kan termiske fysiologianalyser være bredt tilgjengelige for forskere og kan fungere som en praktisk undervisningstilnærming for alle nivåer. Komponenter av termisk ytelse, inkludert termiske grenser og effekter av temperatursjokk, er grunnleggende for økologien, oppførselen og livshistorien til dyr8,9.
Nærmere bestemt brukes økotothermer til å ta opp spørsmål om fysiologi, da endotomi dikterer en uløselig kobling mellom omgivelses- og organismetemperatur. Temperaturområdet som organismer tåler (deres kritiske termiske minimum til maksimal termisk rekkevidde) og temperaturene der deres oppførsel og kondisjon er maksimert (termisk optima) er ofte forankret i økologiske og evolusjonære prosesser. Disse fysiologiske egenskapene er av økende betydning ettersom temperaturer, både midler og ekstremer, øker10. For eksempel har de abiotiske endringene, inkludert temperaturøkninger, som følger med ødeleggelse av habitater og fragmentering påvirket samfunn av ectotherms, inkludert anuraner, som begrenser fysiologisk skjøre arter (med smal termisk toleranse) til små rester habitatplaster11,12.
Vurdering av viktige komponenter i termisk ytelse kan være dyrt både når det gjelder tid og ressurser og krever tradisjonelt laboratorieutstyr og standardiserte forhold. Videre gjenspeiler konvensjonelle analyser ofte ikke bredden av omgivelsesforhold som oppleves i naturen av et gitt dyr13, da temperaturen i lignende fysiologiforsøk er nøye kontrollert og ofte ikke relatert til omgivelsesforhold som oppleves av et dyr. Denne temperaturkontrollen kan redusere forståelsen av variasjon i individuelle responser2,14. Fysiologer har stolt på laboratoriebaserte oppvarmings- og kjøleforsøk, ved hjelp av programmerbare vannbad for å varme eller avkjøle et dyrs miljø for å informere termiske ytelseskurver15.
Vanligvis plasseres dyr i hetteglass med en termokobling, og omgivelsestemperaturen endres jevnt ved å kontrollere temperaturen på det omkringliggende vannbadet. Forskere måler tiden det tar å oppnå en endret fysiologisk tilstand (f.eks. chill coma, knockdown) og temperaturen der statusendringen skjedde16,17. Fra minimum USD 500 er disse verktøyene store, tunge og krever ekstra teknisk utstyr (f.eks. datamaskin, termokoblinger). Derfor er de grunnleggende verktøyene for å utføre klassiske metoder for å vurdere termisk ytelse 1) ikke økonomisk tilgjengelige for alle, 2) ikke egnet for å analyse av dyr som er for store til å være inneholdt i vanlige hetteglass som brukes til små difterier, og 3) ikke bærbare for bruk i eksterne feltinnstillinger. Overholdelse av vanlig praksis har resultert i begrenset representasjon på tvers av taksonomi og eksperimentelle forhold18,19,20.
Selv om komplette termiske ytelseskurver kan informere artsfordeling, livshistorieegenskaper og oppførsel, blant annet egenskaper, kan kvantifiseringen av færre og enklere termiske beregninger være mer effektiv og fortsatt ekstremt informativ. Fysiologiske analyser, måling av chill coma-utbrudd og påfølgende kald sjokkgjenoppretting, kaldherding og riktig oppførsel, er effektive og kjørbare proxyer for det kritiske termiske minimumet av en organisme8. Beskrevet her er en kald sjokkanalyse nyttig for å fremkalle fysiologiske data fra store terrestriske ekttermiske insekter. Analysen er rimelig, tilgjengelig og enkel å utføre under feltforhold eller i klasserommet. Data om kaldsjokkgjenvinning generert av denne protokollen kan kombineres med arter eller individuelle trekkdata for å forfølge spørsmål om økologisk fysiologi og / eller brukes til å lære studenter om fysiologiske prinsipper.
Protocol
1. Identifisering av arter av interesse
- Identifiser arter av interesse for å bestemme kuldesjokk utvinning tid. Husk at hver gruppe vil variere i tiden det tar å indusere en chill koma (dvs. punktet der insektet fortsatt er i live, men ikke beveger seg og ikke svarer). På samme måte, basert på organismen og bruken av data, velg forskjellige avskjæringspunkter for å stoppe eksperimentet hvis fokuspersonen(e) ikke flyr (se avsnitt 4).
MERK: Denne protokollen er utformet og utviklet for bruk på Lepidoptera. Det gjelder imidlertid store, volante, terrestriske insekter, spesielt de som kan lagres flatt i glasskonvolutter som begrenser bevegelse og skade (f.eks. sommerfugler og dragonflies / damselflies).
2. Gjennomføre en pretrial
- Utfør en pretrial på et lite utvalg av individer for å bestemme nøkkelparametrene. Følg avsnitt 3 til og med 5 i protokollen nedenfor med 5-10 personer for en pretrial.
- Test tiden som kreves på is for å indusere en chill koma (ikke flytte), men ikke drepe fokal art ved å følge trinn 5.1 ved hjelp av behandlinger på 30 min, 60 min og 90 min.
MERK: Tiden det tar å indusere en chill koma vil avhenge av størrelsen, plasseringen og naturhistorien / oppførselen til individene. - Basert på resultater fra trinn 4.1-4.4 og ved hjelp av kunnskap om økologien til fokalinsektene, velg en tid for å avslutte studien hvis en gitt person ikke gjør en full gjenoppretting. Base denne gangen cutoff på økologi av arten også, husk at etter mange minutter med å være ute av stand til å fly, er mange insekter predated.
MERK: For eksempel, hvis de fleste foreløpige forsøk slutter i flukt etter 15 min, kan man bestemme seg for å avslutte forsøk etter 25 minutter for å sikre at selv outliers har en sjanse til å komme seg helt (dvs. fly). Denne protokollen er basert på en 30 minutters avskjæringstid (trinn 5.4).
- Test tiden som kreves på is for å indusere en chill koma (ikke flytte), men ikke drepe fokal art ved å følge trinn 5.1 ved hjelp av behandlinger på 30 min, 60 min og 90 min.
- Bruk parametere fra pretriale data for å informere datainnsamling for eksperimentene. Endre protokollen beskrevet nedenfor basert på behovene til fokalorganismer, inkludert tid i isslammet, tid for å kalle forsøk til en slutt, og atferd dokumentert på databladet (f.eks. skjelving kan være en upassende oppførsel for det valgte insektet).
- Definer spesifikke forskningsspørsmål som skal besvares med disse dataene under raffinering av parametrene.
MERK: For eksempel, hvis forskeren er interessert i effekten av langvarig eksponering for utvinning, er tiden i is en nøkkelvariabel å endre. Hvis forskere er interessert i forskjeller i fysiologi mellom lyse og mørke fargede arter, kan de velge enten to tydelig fargede arter eller endre insektets vingefarge for å måle effekten av vingefarge på utvinningstid. Det er viktig at denne metoden kan tilpasses behovene og forskningsspørsmålene som stilles (se diskusjonsdelen).
- Definer spesifikke forskningsspørsmål som skal besvares med disse dataene under raffinering av parametrene.
3. Innsamling av insekter
- Samle insekter ved hjelp av passende metoder som baited feller og entomologiske garn, (Supplerende figur 1). Ved innsamling plasserer du hver enkelt person i en separat glasskonvolutt med en unik ID.
- Oppbevar dyr på et skyggefullt, kjølig sted etter å ha blitt fanget og før eksponering for det kalde sjokkeksperimentet. Utsett alltid dyret for eksperimentell behandling innen 24 timer etter å ha blitt fanget, og standardiser denne gangen så mye som mulig på tvers av forsøk.
- Selv om lagringsforholdene kan variere, hold insekter ute av direkte sol. Hvis det er mulig, plasser dem innendørs i et kjølig, mørkt rom.
- I feltet må du sørge for at de blir skyggelagt mens de er lagret og er beskyttet mot vind (blåser bort) og andre insekt rovdyr som kan komme inn i konvoluttene.
4. Sett opp kaldsjokkeksperimentet
- Fyll en kjøler med is og vann. Sørg for at det er nok is til å vedvare i minst en time, og tilsett is med jevne mellomrom etter behov med sikte på å opprettholde miljøet i vannet ved 0 °C.
- Velg mellom 1 og 4 fokale individer for en runde eksperimentering, og sørg for at hver enkelt er identifiserbar.
- Hvis du bruker flere arter, bruker du bare én av hver for å unngå å forvirre enkeltpersoner i dataarket. Hvis du eksperimenterer med bare en art, bruk bare personer som lett kan skille seg ut, for eksempel ved en ødelagt vinge eller tydelig merking.
- Hvis målet med eksperimentet ikke er relatert til vingefarge, markerer du vingene med unike ID-er (f.eks. tall) med en fin filtspisset markør for å skille individer.
- Hvis eksperimentene ikke oppfyller noen av kriteriene ovenfor, utfører du eksperimentet på ett individ om gangen.
- Fyll radene i databladet med informasjonen som er relevant for hvert insekt analysert, inkludert deres unike ID og en nyttig identifikator i notatene, for eksempel artsnavn eller skilletegn (Supplerende tabell 1).
- Legg alle fokalpersoner (fortsatt i deres individuelt merkede konvolutter) i en forseglet plastpose med vekt (Materialbord), og legg posen i isvann i 60 min (eller til kald koma er indusert; se diskusjon) (Supplerende figur 2).
- Sørg for at vekten er tung (f.eks. store mynter, store skiver eller glatte bergarter) og stor nok til å holde posen med insekter nedsenket i isvannet og vinkelrett på overflaten av vannet. Bruk en vekt som ikke forårsaker lekkasjer i den forseglede plastposen.
MERK: Mens insekter fortsatt er i stand til å gjenopprette hvis de blir utsatt direkte for vannet mens de er nedsenket, kompliserer våte konvolutter fjerning av hver enkelt person. Det er best å opprettholde insekter tørre i posen.
- Sørg for at vekten er tung (f.eks. store mynter, store skiver eller glatte bergarter) og stor nok til å holde posen med insekter nedsenket i isvannet og vinkelrett på overflaten av vannet. Bruk en vekt som ikke forårsaker lekkasjer i den forseglede plastposen.
- Registrer temperatur- og lysdata.
- Bruk en datalogger (se Materialfortegnelse) til å registrere omgivelsestemperatur og lysdata ved hjelp av trinn 5.1 eller 5.2.
- Programmer dataloggeren til å samle temperatur- og lysdata med 10 s intervaller, fra det tidspunktet insektene slippes ut.
- Baser starttiden for dataloggeren på når insektene ble plassert i isvannet. Forsikre deg om at dataloggerinformasjonen (dato, klokkeslett) synkroniseres slik at data om omgivelsesforhold senere kan samsvare med hvert enkelt fokalinsekt.
- Bruk et enkelt termometer for å registrere temperatur- og lysdata med korte intervaller for hånd (av en annen forsker).
- Bestem deg for de eksperimentelle parametrene for å knytte til gjenopprettingstid som kan måles uten datalogger. Bruk distinkte behandlinger: skygge / sol; skumring/midt på dagen.
- Bruk en datalogger (se Materialfortegnelse) til å registrere omgivelsestemperatur og lysdata ved hjelp av trinn 5.1 eller 5.2.
- Plasser et maskebur for insekter på et passende sted slik at temperatur- og lysmiljøene er så homogene som mulig i buret, og slik at bunnen av buret er forhøyet og kan tappes av observatøren.
- Plasser dataloggeren rett utenfor buret, eller inne i buret slik at det ikke blir slått over eller på annen måte påvirket av små bevegelser inne i buret. Hvis du ikke bruker en datalogger, plasserer du et termometer riktig og/eller setter opp merdene i riktig konfigurasjon.
MERK: Dataloggeren må plasseres slik at omgivelsesforholdene som registreres er så nær som mulig for de som insektet opplever.
5. Start kaldt sjokkeksperiment
- Fjern dyrene fra isvannbadet etter 60 min (eller tid bestemt passende; se ovenfor). Fjern straks insekter fra plastposen, og fjern hver enkelt person fra konvolutten så raskt som mulig mens du minimerer håndteringen (Supplerende figur 3).
- Start stoppeklokken så snart dyrene er i maskemerdene (se eksempeldata, Supplerende tabell 1).
- Trykk på bunnen av buret med en blyant for å agitere de gjenopprettende insekter.
MERK: Å gi stimuli under gjenoppretting sikrer at fokalinsekter viser gjenopprettingsstatus og atferd så snart de er fysiologisk i stand (Supplemental Video).- Trykk ofte og sterkt nok til å sikre at et dyr vil reagere om mulig, men ikke forårsake respons.
MERK: For eksempel, når du banker på buret, hvis et dyr blir katapultert i luften og lander oppreist, men ikke beveger seg for å stå alene, anses det ikke som en "stå" oppførsel, da organismen ikke faktisk står alene.
- Trykk ofte og sterkt nok til å sikre at et dyr vil reagere om mulig, men ikke forårsake respons.
- Merk studien som fullført når en person har fløyet (dvs. vist en full gjenoppretting). Avslutt studien og vurder insektet å ha oppnådd en full gjenoppretting hvis den ikke beveger seg etter 30 min.
- Fjern insekter fra maskeburet, og legg individene tilbake i sine merkede glasskonvolutter. Frigjør dyrene eller behold dem for videre datainnsamling (f.eks. individuelle egenskaper av størrelse, vekt).
- Hvis du bruker en datalogger, stopper du datainnsamlingen for dataloggeren og lagrer filen med temperatur- og lysdata under eksperimentet med riktig dato/klokkeslett-informasjon.
6. Databehandling
- Skriv inn dataene som presenteres fra dataarket, i et regneark (f.eks.
- Hvis du bruker en datalogger, legger du til temperatur- og lysdata for hvert svar fra hver enkelt person som er analysert.
- Beregn gjennomsnitts- og standardavviket for temperatur og lys for hver enkelt persons oppførsel.
MERK: Når dataloggeren logger data hver 10. - Knytt hver gjenopprettingsatferd til hver enkelt person med abiotiske data registrert av dataloggeren, og rund opp eller ned til 10 s intervaller etter behov.
- Beregn gjennomsnitts- og standardavviket for temperatur og lys for hver enkelt persons oppførsel.
- Tegne inn og analysere data. Figur 1visualiserer for eksempel effekten av temperatur og lys på gjenopprettingstiden for kaldt sjokk. Kompilere andre relevante data (artstrekk, regionale habitategenskaper) for å undersøke de økologiske og evolusjonære mønstrene i fysiologiske egenskaper til gruppene som testes.
MERK: Figur 1 ble plottet inn ved hjelp av ggplot2-pakken i R. Detaljnivået av data om omgivelsesforhold vil variere basert på instrumentene som brukes til å måle omgivelsesforhold. Hvis en datalogger brukes, kan tall med detaljer som kan sammenlignes med figur 2 genereres. Hvis et termometer brukes, vil forskeren ikke kunne lage et plott informert av omgivelseslys. På samme måte, hvis forskere bruker kategorier av lys eller temperatur, kan disse scatterplotene endres til boxplots eller en annen passende mal for å illustrere disse fenomenene.
Representative Results
Dataene som samles inn i denne protokollen tillater undersøkelse og partisjonering av variabler som er viktige for organismefysiologi. For eksempel bidrar både temperatur- og lysforhold til utvinning av sommerfugler fra kaldt sjokk (Figur 1). Plottet er ment å utforske samspillet mellom omgivelsesforhold og kaldt sjokk. Ved hjelp av villfangede sommerfugler fra både feller og netting viste 181 sommerfuglarter tydelig utvinning fra chill koma indusert av kaldt sjokk (Figur 2). Data presentert i figur 2 ble samlet inn av tre observatører i løpet av omtrent fem måneder (januar, februar, mai-juli 2020) i colombianske Andesfjellene. Eksperimenter ble alltid utført om morgenen etter sommerfuglkolleksjon. Ved maksimal effektivitet var det mulig for to observatører samtidig å observere fire sommerfugler hver, gjentatt syv ganger (minimum 7,37 timer), noe som resulterte i testing av 56 personer på en enkelt morgen. Dette tillot mye datainnsamling på tvers av hele sommerfuglsamfunn, samtidig som vi inkluderte og vurderte data om individuell variasjon. Ettersom analyser kan forekomme under omgivelsesmiljøforhold, er utvinningsforholdene representative for deres habitater og gjenspeiler den naturlige variasjonen som organismer opplever i naturen. Figur 3 illustrerer overlappingen mellom temperatur og lysforhold ved forsøk på kaldsjokkgjenvinning og forhold i et beite hvorfra noen testede sommerfugler ble samlet inn.
Figur 1: Spredning av restitusjonstid (i sekunder) av sommerfugler etter kaldt støt. (A) Gjennomsnittstemperatur og (B) betyr LUX (lysintensitet) under gjenopprettingen. Arter er organisert og farget av familien. Totalt sett, etter hvert som lys og temperatur øker, reduseres utvinningstiden for kaldt sjokk, noe som viser variasjon på tvers av taxa. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Eksempel på resultater fra kaldsjokkgjenvinningsanalysen på 181 sommerfuglarter fra colombianske Andesfjellene. Dataene representerer antall sekunder som gikk fra å fjerne sommerfuglen fra kulde og når den var i stand til å fly. Arter er organisert og farget av familien. Denne figuren demonstrerer den taksonomiske bredden som dette eksperimentet kan brukes på, og mangfoldet av kaldsjokkgjenopprettingsresponser på tvers av arter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Omgivelsestemperatur og LUX under forsøk på å gjenvinne kuldesjokk. Plott av omgivelsestemperatur (blå) og LUX (lysintensitet, rød) som registrert av dataloggere plassert i beitemarkene der sommerfuglsamling fant sted (lyse farger, forhold spenner over hele dagen) og forhold under forsøk med gjenoppretting av kaldt sjokk (mørke farger, bare morgentimer). Omgivelsesfeltforholdene og eksperimentelle forhold plottet viser rekkevidden av og gjennomsnittlige forhold som oppleves av sommerfugler over en uke med feltprøvetaking og eksperimentering. Eksperimenter ble bare utført i tidlige timer (07:00-13:00 h), mens dataloggerne ble utplassert i feltet i en uke (dagslys timer, 06:00-18:00 h vist). Vist her er overlappingen mellom eksperimentelle forhold og omgivelsesforhold opplevd av sommerfugler, som demonstrerer den økologiske relevansen av å gjennomføre fysiologianalyser under omgivelsesforhold. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: Prosedyre for innsamling av fokale insekter-i dette tilfelletsommerfugler-ved hjelp avbaited Van-Someren feller og aktiv netting. Feller ble baited med både rotting fisk og rotting frukt agn. Felle (uten agn) i bakgrunnen, i forgrunnen er et eksemplar i sin unike konvolutt mot en blå plastoppsamlingsboks. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 2: Poser med opptil fire individuelle sommerfugler nedsenket i isvann i en kjøler. Plastposer ble merket med tiden de ble plassert i isvannet, slik at kaldsjokkforsøk kunne forskyves gjennom morgenen. Plastposer bør forsegles for å forhindre at prøver blir våte; Oversvømmelse av posene og konvolutten i dette tilfellet hadde imidlertid ingen målbar effekt på utvinningen av sommerfuglene. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 3: To observatører samler inn data i felten. Hvert nettingbur inneholder fire unike sommerfugler som gjenoppretter fra kaldt sjokk. Polyvinylklorid T-leddet i buret huser dataloggeren for å forhindre direkte sol- eller regneksponering. Hver observatør har en stoppeklokke som ble startet umiddelbart etter at sommerfuglen ble sluppet ut i buret. Burene er forhøyet av benker, slik at observatører kan agitere bunnen av buret for å sikre at sommerfuglene reagerte atferdsmessig så raskt som fysiologisk mulig. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende tabell 1: Eksempeldatablad. Arket viser hver sommerfugls unike ID som tilordnet i feltet, og skilletegn (artenavn, nøkkelfarger) i notater. Også registrert er sommerfuglens dominerende posisjon (dvs. hvilken side av vingen som ble utsatt for solen) i gjenopprettingsperioden, kjent som D (dorsal) eller V (ventral). Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Ekstra video 1: Tapping av buret for kald sjokkgjenoppretting. Når sommerfugler gjenoppretter, trykker observatøren forsiktig på bunnen av buret for å indusere atferd så snart sommerfuglene er i stand. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Discussion
Studien av termisk fysiologi inneholder mål på arter og miljøegenskaper for bedre å forstå samspillet mellom organismer og deres omgivelser som er nøkkelen til overlevelse og kondisjon. Selv om det alltid er integrert i å forstå naturhistorien og økologien til planter og dyr, er termiske egenskaper av økende betydning i møte med landskap og klimaendringer11,21. Flere grupper av ectothermic terrestriske insekter, spesielt lepidoptera og odonatan, er relativt store og rikelige, viser tydelig oppførsel og er mottagelige for manipulering. Her skisseres en effektiv og rimelig analyse for effektivt å måle fysiologiske responser av slike insekter. Denne protokollen krever en kilde til sunne organismer for å analyse, hvis håndteringstid før eksperimentet er begrenset. Selv om det er fleksibelt i antall organismer som er analysert på en gang, vil antall fokale individer per eksperiment variere basert på formålet med datainnsamling og / eller antall observatører.
For eksempel ble denne protokollen utviklet for å samle detaljerte individuelle data om sommerfugler på tvers av hele samfunn. Som sådan illustrerer de representative resultatene et forsøk på å maksimere datainnsamlingen for personer av så mange arter som mulig og under en rekke forhold som er relevante for lokalmiljøet. Uavhengig av antall fokalarter er det avgjørende for observatøren å kunne identifisere hvert individ i buret som opplever utvinningen. Hvis målet er å samle inn data fra bare én art, bør bare en eller to personer (hvis identifiserbare basert på forskjellig vingeslitasje eller hvis individuelt merket) analyses på en gang. Studiefagene må velges i henhold til et spesifikt forskningsspørsmål eller studieplan. Basert på spørsmålet som stilles og formålet med datainnsamling (for eksempel forskning eller klasserom), vil utvalgsstørrelse og innsamling av andre egenskaper variere.
For å illustrere de grunnleggende komponentene i fysiologi som er belyst av denne protokollen (induksjon av chill koma, trinn for utvinning, rolle av omgivelsesforhold), kan en klasseromsinstruktør velge to forskjellige arter eller morphs av en enkelt art. Hvis fokalpersonene bare varierer i ett nøkkeltrekk (f.eks. farge), vil en mindre utvalgsstørrelse være nødvendig, og studentene kan nøye studere forholdet mellom det trekket og organismefysiologien. Forskere som er interessert i økologisk fysiologi kan bruke sine eksperimentelle data til å utforske komplekse økologiske og evolusjonære spørsmål. Forskeren må sørge for å nøye velge fokale insekter som direkte adresserer spørsmålene deres (f.eks. basert på livsstadium, alder, kjønn, plassering), og basert på antall variabler som er involvert, bestemmer riktig utvalgsstørrelse. Prøvestørrelsene for komplekse modeller vil være større enn de som er beskrevet ovenfor.
Mens du samler inn atferdsdata, er det viktig at buret hviler over bakken fordi observatøren må kunne trykke på bunnen av buret for å fremkalle gjenopprettingsatferd. Dette sikrer at organismen reagerer (står, flyr) så snart den er fysiologisk i stand til å gjøre det, og terminal utvinningsadferd (fly) er dokumentert. Registrering av omgivelsesforhold under kaldsjokkgjenoppretting er integrert i studiet av termisk fysiologi, da denne protokollen er designet for å studere og disentangle miljøets rolle i organismefysiologi. Dataloggere (se materialtabellen) er nyttige for å registrere standardiserte mål på relevante forhold (f.eks. temperatur, lys og til og med fuktighet). Men hvis disse verktøyene ikke er tilgjengelige, kan relevante forhold måles på andre måter som med et digitalt termometer eller ved å forenkle variabelen av miljøforhold og bruke forskjellige miljøer som skygge og sol. Denne protokollen gir forskeren mulighet til å måle forholdene under kaldsjokkutvinning basert på studiens formål og omfang.
Selv om denne metoden kan endres for bedre å passe til spesifikke taksonomiske grupper, anbefales det at store, volante insekter brukes. Flygende insekter som gjenvinner sin evne til å fly uavhengig, kan betraktes å ha oppnådd en full gjenoppretting. Metoden, som beskrevet, ble vellykket brukt på sommerfugler i tropene og subtropene. Basert på de termiske trendene i et gitt område (dvs. temperaturområdet som oppleves på et sted som vil variere, og dermed påvirke forventningene basert på høyde, breddegrad, baldakindeksel), kan en organisme kreve mer eller mindre enn en time i et isvannbad for å komme inn i en chill koma. Størrelsen på organismen kan også påvirke tiden som er nødvendig for å komme inn i en chill koma. Det er viktig å finne tiden for kald eksponering som er nødvendig for å indusere en chill koma (ikke flytte), men ikke drepe fokale arter. Tiden det tar å indusere en chill koma vil avhenge av individets størrelse, plassering og naturhistorie / oppførsel. Basert på resultater fra det kalde sjokkeksperimentet beskrevet heri og ved hjelp av kunnskap om økologien til fokalinsektene, velg en tid for å avslutte studien hvis en gitt person ikke gjør en full gjenoppretting.
Basert på forskerens spesifikke spørsmål kan denne metoden brukes enten i feltet eller laboratoriet for å muliggjøre både naturlig miljøvariasjon og kontroll for viktige variabler. Denne analysen er enkel og billig og bidrar til å fylle eksisterende hull innen termisk fysiologi. Enkelheten i denne protokollen gjør den tilgjengelig for bruk for et mangfoldig utvalg av taxa, og åpner feltet for mer enn laboratorievennlige organismer. Nyheten om å utføre en standardisert, men omgivende termisk analyse fyller gapet mellom laboratorie- og feltresultater22. Utnytte omgivelsesforhold for organisme utvinning vil hjelpe forskere partisjonere rollen som miljø- og artfaktorer i fysiologi14,22. Til slutt, på grunn av lave kostnader og mangel på nødvendige materialer, kan denne protokollen brukes på avsidesliggende steder i feltet med lite utstyr som er ideelt for mange feltbiologer - så vel som i klasserom for å tillate unge studenter en praktisk læringsopplevelse.
Disclosures
Forfatteren har ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter.
Acknowledgments
Takk til Jaret Daniels, Isabella Plummer, Brett Scheffers og Dan Hahn for innspill til protokollen slik den først ble utviklet. Ytterligere takknemlighet til Jaime Haggard, Sebastián Durán og Indiana Cristóbal Róis-Málaver for implementering av flere gjentakelser av denne protokollen og for innspill til nøkkelkomponenter. Takk også til en anonym anmelder for tilbakemelding på manuskriptet som helhet. Støtten ble gitt av McGuire Center for Lepidoptera og Biodiversitys publiseringsfond, College of Agricultural and Life Sciences, School of Natural Resources and Environment og Wildlife Ecology and Conservation-avdelingen i UF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 x 24 x 36" Popup Rearing & Observation Cage | Bioquip | 1466PB | Ensure that the cage is slightly elevated from the ground to be able to tap the floor of the cage during experiments. |
| Cooler | Any | NA | |
| Glassine envelopes | Bioquip | 1130B | |
| HOBO Pendant Temperature/Light 8K Data Logger | Onset | UA-002-08 | If a datalogger is not accessible, researchers may choose to use a digital thermometer to record ambient temperatures at regular intervals. See protocol step 4.5 for additional information. |
| HOBO Optic USB Base Station | Onset | Base-U-1 | |
| Ice water | NA | NA | |
| Insects (focal taxa) | NA | Any | Collect sufficient samples to test, ensuring replication of experimental groups (e.g. species, sampling location) |
| PVC T-joint | Any | Any | |
| Sealable plastic bag | Any | NA | |
| Stopwatch/timer | Any | NA | |
| Weight | Any | NA | Large coins or small rocks to weigh down the plastic bags will ensure that specimens are submerged in ice water. A standardized weight is ideal. |
References
- Huey, B., Stevenson, R. D. Integrating thermal physiology and ecology of ectotherms a discussion of approaches. American Zoologist. 19 (1), 357-366 (1979).
- Huey, R. B., Slatkin, M. Cost and benefits of lizard thermoregulation. The Quarterly Review of Biology. 51 (3), 363-384 (1976).
- Kingsolver, J. G. Butterfly thermoregulario: Organismic mechanisms and population consequences. Journal of Research on the Lepidoptera. 24, 1-20 (1985).
- Kingsolver, J. G. Evolution and coadaptation of thermoregulatory behavior and wing pigmentation pattern in pierid butterflies. Evolution. 41 (3), 472-490 (1987).
- Kingsolver, J. G., Huey, R. B. Evolutionary analyses of morphological and physiological plasticity in thermally variable environments. American Zoologist. 38, 545-560 (1998).
- Malhi, Y., Wright, J. Spatial patterns and recent trends in the climate of tropical rainforest regions. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 359 (1443), 311-329 (2004).
- Sears, M. W., et al. Configuration of the thermal landscape determines thermoregulatory performance of ectotherms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (38), 10595-10600 (2016).
- Sinclair, B. J., Coello Alvarado, L. E., Ferguson, L. V. An invitation to measure insect cold tolerance: Methods, approaches, and workflow. Journal of Thermal Biology. 53, 180-197 (2015).
- Angilletta, M. Thermal adaptation: a theoretical and empirical synthesis. , Oxford University Press. (2009).
- Perkins-Kirkpatrick, S. E., Gibson, P. B. Changes in regional heatwave characteristics as a function of increasing global temperature. Scientific Reports. 7, 12256 (2017).
- Frishkoff, L. O., Hadly, E. A., Daily, G. C. Thermal niche predicts tolerance to habitat conversion in tropical amphibians and reptiles. Global Change Biology. 21 (11), 3901-3916 (2015).
- Nowakowski, A. J., Otero Jiménez, B., Allen, M., Diaz-Escobar, M., Donnelly, M. Landscape resistance to movement of the poison frog, Oophaga pumilio, in the lowlands of northeastern Costa Rica. Animal Conservation. 16 (2), 188-197 (2013).
- Kingsolver, J. G., Buckley, L. B. Quantifying thermal extremes and biological variation to predict evolutionary responses to changing climate. Philosophical Transactions of the Royal Society B. Biological Sciences. 372 (1723), 20160147 (2017).
- Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218, 1956-1967 (2015).
- Sinclair, B. J., Williams, C. M., Terblanche, J. S. Variation in thermal performance among insect populations. Physiological and Biochemical Zoology. 85 (6), 594-606 (2012).
- Gotcha, N., Terblanche, J. S., Nyamukondiwa, C. Plasticity and cross-tolerance to heterogeneous environments: divergent stress responses co-evolved in an African fruit fly. Journal of Evolutionary Biology. 31 (1), 98-110 (2018).
- Mutamiswa, R., Chidawanyika, F., Nyamukondiwa, C. Superior basal and plastic thermal responses to environmental heterogeneity in invasive exotic stemborer Chilo partellus Swinhoe over indigenous Busseola fusca (Fuller) and Sesamia calamistis Hampson. Physiological Entomology. 43 (2), 108-119 (2018).
- de Jong, M. A., Saastamoinen, M. Environmental and genetic control of cold tolerance in the Glanville fritillary butterfly. Journal of Evolutionary Biology. 31 (5), 636-645 (2018).
- DeVries, Z. C., Kells, S. A., Appel, A. G. Estimating the critical thermal maximum (CTmax) of bed bugs, Cimex lectularius: Comparing thermolimit respirometry with traditional visual methods. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Molecular & Integrative Physiology. 197, 52-57 (2016).
- De Keyser, R., Breuker, C. J., Hails, R. S., Dennis, R. L. H., Shreeve, T. G. Why small is beautiful: Wing colour is free from thermoregulatory constraint in the small lycaenid butterfly, Polyommatus icarus. PLoS One. 10 (4), 0122623 (2015).
- Nowakowski, A. J., et al. Tropical amphibians in shifting thermal landscapes under land-use and climate change. Conservation Biology. 31 (1), 96-105 (2017).
- Niehaus, A. C., Angilletta, M. J., Sears, M. W., Franklin, C. E., Wilson, R. S. Predicting the physiological performance of ectotherms in fluctuating thermal environments. Journal of Experimental Biology. 215, 694-701 (2012).
