Feltbaseret termisk fysiologianalyse: Kold stødgenvinding under omgivende forhold

Summary

Her beskrives en billig, tilgængelig protokol for at evaluere kold chokgenvinding af sommerfugle under omgivende miljøforhold.

Abstract

Økologisk fysiologi, især af ectotherms, bliver stadig vigtigere i denne foranderlige verden, da den bruger foranstaltninger af arter og miljømæssige træk til at udforske samspillet mellem organismer og deres omgivelser for bedre at forstå deres overlevelse og fitness. Traditionelle termiske assays er dyre med hensyn til tid, penge og udstyr og er derfor ofte begrænset til små stikprøvestørrelser og få arter. Præsenteret her er en ny protokol, der genererer detaljerede data om individuel adfærd og fysiologi af store, volant, terrestriske insekter ved hjælp af eksemplet med sommerfugle. Dette papir beskriver metoderne til en kold stødgenvindingsanalyse, der kan udføres i marken under omgivende miljøforhold og ikke kræver dyrt laboratorieudstyr. Denne metode er blevet brugt til at forstå reaktionen og genopretningsstrategien for koldt chok af tropiske sommerfugle, der genererer data på individuelt niveau på tværs af hele sommerfuglsamfund. Disse metoder kan anvendes i både fjerntliggende feltmiljøer og klasseværelser og kan bruges til at generere økologisk relevante fysiologiske data og som undervisningsværktøj.

Introduction

Integrationen af termisk fysiologi og økologi i slutningen af 1970'erne og begyndelsen af 1980'erne^1,2 lancerede området for økologisk fysiologi. Omfattende termiske undersøgelser foretaget på ectotherms fremhæve økologisk-fysiologiske synergier på tværs af forskellige øko-evolutionære sammenhænge^3,4,5. Forskning i termisk fysiologi af ectothermic organismer har genvundet opmærksomheden for nylig i lyset af klimaændringerne og ændrede termiske landskaber over hele verden^6,7. Ud over at informere undersøgelser inden for det akademiske område af økologisk fysiologi, termisk fysiologi assays kan være bredt tilgængelige for forskere og kan tjene som en hands-on undervisning tilgang til alle niveauer. Komponenter af termisk ydeevne, herunder termiske grænser og virkninger af temperaturchok, er grundlæggende for dyrenes økologi, adfærd og livshistorie^8,9.

Specifikt bruges økotothermer til at behandle spørgsmål om fysiologi, da endoterapi dikterer en uløselig forbindelse mellem omgivelses- og organismetemperatur. Temperaturområdet, som organismer kan modstå (deres kritiske termiske minimum til maksimalt termisk område) og de temperaturer, hvor deres adfærd og fitness maksimeres (termisk optima), er ofte rodfæstet i økologiske og evolutionære processer. Disse fysiologiske træk er af stigende betydning, da temperaturer, både midler og ekstremer, stiger¹⁰. For eksempel har de abiotiske ændringer, herunder temperaturstigninger, der ledsager ødelæggelse og fragmentering af levesteder, påvirket samfund af ectotherms, herunder anuraner, der begrænser fysiologisk skrøbelige arter (med smal termisk tolerance) til små rest habitat patches^11,12.

Vurdering af nøglekomponenter i termisk ydeevne kan være dyrt både med hensyn til tid og ressourcer og kræver traditionelt laboratorieudstyr og standardiserede forhold. Desuden afspejler konventionelle assays ofte ikke bredden af omgivelsesforhold, som et givet dyr oplever i naturen^13, da temperaturen i lignende fysiologiforsøg kontrolleres omhyggeligt og ofte ikke er relateret til omgivende forhold, som et dyr oplever. Denne temperaturkontrol kan mindske forståelsen af variation i individuelle reaktioner^2,14. Fysiologer har påberåbt sig laboratoriebaserede opvarmnings- og køleforsøg ved hjælp af programmerbare vandbade til støt at opvarme eller afkøle et dyrs miljø for at informere termiske ydelseskurver¹⁵.

Typisk placeres dyr i hætteglas med et termoelement, og deres omgivelsestemperatur ændres støt ved at kontrollere temperaturen i det omgivende vandbad. Forskere måler den tid, det tager at opnå en ændret fysiologisk tilstand (f.eks. chill coma, knockdown) og den temperatur, hvor statusændringen fandt sted^16,17. Fra mindst USD $ 500 er disse værktøjer store, tunge og kræver ekstra teknisk udstyr (f.eks. computer, termoelementer). Derfor er de grundlæggende værktøjer til at udføre klassiske metoder til vurdering af termisk ydeevne 1) ikke økonomisk tilgængelige for alle, 2) ikke egnede til at analysere dyr, der er for store til at være indeholdt i sædvanlige hætteglas, der anvendes til små dipteraner, og 3) ikke bærbare til brug i fjerntliggende feltindstillinger. Overholdelse af almindelig praksis har resulteret i begrænset repræsentation på tværs af taksonomi og forsøgsbetingelser^18,19,20.

Mens komplette termiske præstationskurver kan informere arternes fordeling, livshistorieegenskaber og adfærd, blandt andre træk, kan kvantificeringen af færre og enklere termiske målinger være mere effektiv og stadig ekstremt informativ. Fysiologiske assays, måling af chill coma debut og efterfølgende koldt chok opsving, koldhærdning, og ret til adfærd, er effektive og eksekverbare fuldmagter til den kritiske termiske minimum af en organisme⁸. Beskrevet her er en kold chokanalyse, der er nyttig til at fremkalde fysiologiske data fra store terrestriske ektotermiske insekter. Analysen er overkommelig, tilgængelig og let at udføre under feltforhold eller i klasseværelset. Data om genopretning af koldt chok genereret af denne protokol kan kombineres med data om arter eller træk på individuelt niveau for at forfølge spørgsmål vedrørende økologisk fysiologi og / eller bruges til at lære eleverne om fysiologiske principper.

Protocol

1. Identifikation af arter af interesse

1. Identificere arter af interesse for at bestemme koldt chok opsving tid. Husk, at hver gruppe vil variere i den tid, det tager at fremkalde en chill koma (dvs. det punkt, hvor insektet stadig er i live, men ikke bevæger sig og ikke reagerer). På samme måde skal man på grundlag af organismen og brugen af data vælge forskellige skæringssteder, hvor forsøget skal stoppes, hvis fokuspersonerne ikke flyver (se afsnit 4).
   BEMÆRK: Denne protokol er designet og udviklet til brug på Lepidoptera. Den gælder dog for store, volant, jordbaserede insekter, navnlig insekter, der kan opbevares fladt i glasinekonvolutter, der begrænser bevægelse og skader (f.eks. sommerfugle og guldsmede/damselflies).

2. Gennemførelse af en pretrial

1. Udfør en pretrial på en lille prøve af individer til at bestemme de vigtigste parametre. Følg afsnit 3 til 5 i protokollen nedenfor med 5-10 personer for en pretrial.
   1. Test den tid, der kræves på is for at fremkalde en kølekoma (ikke i bevægelse), men dræb ikke brændarterne ved at følge trin 5.1 ved hjælp af behandlinger på 30 min,60 min og 90 min.
      BEMÆRK: Den tid, der kræves for at fremkalde en chill koma vil afhænge af størrelse, placering, og naturlige historie / adfærd af enkeltpersoner.
   2. Baseret på resultater fra trin 4.1-4.4 og ved hjælp af viden om fokale insekters økologi skal du vælge et tidspunkt, hvor forsøget skal afsluttes, hvis en given person ikke foretager en fuld genopretning. Base denne gang cutoff på økologi af arten så godt, idet man tænker på, at efter mange minutter for at være ude af stand til flyvning, mange insekter er forud.
      BEMÆRK: Hvis de fleste indledende forsøg f.eks. slutter under flyvning efter 15 minutter, kan man beslutte at afslutte forsøg efter 25 minutter for at sikre, at selv outliers har en chance for at komme sig helt (dvs. flyve). Denne protokol er baseret på en 30 minutters skæringstid (trin 5.4).
2. Brug parametre fra pretrial data til at informere dataindsamling for eksperimenterne. Rediger den protokol, der er beskrevet nedenfor, baseret på fokalismernes behov, herunder tid i isslam, tidspunkt, hvor man kan kalde forsøg til ophør, og adfærd dokumenteret på databladet (f.eks. kan kuldegysning være en upassende adfærd for det valgte insekt).
   1. Definer specifikke forskningsspørgsmål, der skal besvares med disse data, mens parametrene finjusteres.
      BEMÆRK: Hvis forskeren for eksempel er interesseret i effekten af langvarig eksponering på restitution, er tiden i is en nøglevariabel at ændre. Hvis forskere er interesseret i forskelle i fysiologi mellem lyse og mørke farvede arter, kan de vælge enten to tydeligt farvede arter eller ændre insektets vingefarve for at måle vingefarvens virkning på restitutionstiden. Det er vigtigt, at denne metode i høj grad kan tilpasses de stillede behov og forskningsspørgsmål (se diskussionsafsnittet).

3. Indsamling af insekter

1. Opsamle insekter ved hjælp af egnede metoder såsom lokkemad fælder og entomologiske net,(supplerende figur 1). Ved afhentning skal du placere hver enkelt person i en separat glasinekonvolut med et unikt ID.
2. Opbevar dyr på et skyggefuldt, køligt sted efter at være blevet fanget og før de udsættes for det kolde chokforsøg. Altid udsætte dyret for den eksperimentelle behandling inden for 24 timer for at blive fanget, og standardisere denne gang så meget som muligt på tværs af forsøg.
   1. Selvom opbevaringsbetingelserne kan variere, skal du holde insekterne ude af direkte sol. Hvis det er muligt, skal du placere dem indendørs i et køligt, mørkt rum.
   2. I marken skal du sikre dig, at de vil blive skyggelagt, mens de opbevares og er beskyttet mod vind (blæser væk) og andre insekt rovdyr, der kan komme ind i konvolutterne.

4. Sæt det kolde chokeksperiment op

1. Fyld en køler med is og vand. Sørg for, at der er tilstrækkelig is til at holde i mindst en time, og tilsæt is med jævne mellemrum efter behov med det formål at opretholde miljøet i vandet ved 0 °C.
2. Vælg mellem 1 og 4 fokuspersoner for en runde eksperimenter, og sørg for, at den enkelte kan identificeres.
   1. Hvis du bruger flere arter, skal du kun bruge en af hver for at undgå at forvirre enkeltpersoner i dataarket. Hvis du kun eksperimenterer med en art, skal du kun bruge personer, der let kan skelnes, for eksempel ved en brudt vinge eller tydelig mærkning.
   2. Hvis eksperimentets mål ikke er relateret til vingefarve, skal du markere vingerne med unikke id'er (f.eks. tal) med en fin filtspidset markør for at skelne individer.
   3. Hvis forsøgene ikke opfylder nogen af ovennævnte kriterier, skal du udføre eksperimentet på en person ad gangen.
3. Udfyld rækkerne i databladet med de oplysninger, der er relevante for hvert enkelt insekt, der er analyseret, herunder deres entydige id og en nyttig identifikator i noterne, f.eks.
4. Placer alle fokale individer (stadig i deres individuelt markerede kuverter) i en forseglet plastikpose med en vægt(Tabel over materialer),og læg posen i isvand i 60 minutter (eller indtil chill koma er blevet induceret; se diskussion)(Supplerende figur 2).
   1. Sørg for, at vægten er tung (f.eks. store mønter, store skiver eller glatte sten) og stor nok til at holde posen med insekter nedsænket i isvandet og vinkelret på vandets overflade. Brug en vægt, der ikke forårsager lækager i den forseglede plastikpose.
      BEMÆRK: Mens insekter stadig er i stand til at komme sig, hvis de udsættes direkte for vandet, mens de er nedsænket, komplicerer våde konvolutter fjernelsen af hver enkelt person. Det er bedst at opretholde insekterne tørre i deres taske.
5. Registrer temperatur- og lysdata.
   1. Brug en datalogger (se materialetabellen) til at registrere omgivelsestemperatur- og lysdata ved hjælp af enten trin 5.1 eller 5.2.
      1. Programmer dataloggeren til at indsamle temperatur- og lysdata med 10 s intervaller, der starter på det tidspunkt, hvor insekterne frigives.
      2. Baser starttidspunktet for dataloggeren på, hvornår insekterne blev placeret i isvandet. Sørg for, at dataloggeroplysningerne (dato, klokkeslæt) synkroniseres, så data om omgivende forhold senere kan matches med hvert enkelt brændinsekt.
   2. Brug et simpelt termometer til at registrere temperatur- og lysdata med korte intervaller i hånden (af en anden forsker).
      1. Beslut dig for de eksperimentelle parametre, der skal knyttes til restitutionstid, der kan måles uden en datalogger. Brug forskellige behandlinger: skygge /sol; tusmørke/midt på dagen.
6. Placer et netbur til insekterne på et passende sted, så temperatur- og lysmiljøerne er så homogene som muligt i buret, og så bunden af buret er forhøjet og kan udnyttes af observatøren.
7. Placer dataloggeren lige uden for buret eller inde i buret, så den ikke bliver væltet eller på anden måde påvirket af små bevægelser inde i buret. Hvis du ikke bruger en datalogger, skal du placere et termometer korrekt og/eller opsætte burene i den relevante konfiguration.
   BEMÆRK: Dataloggeren skal placeres således, at de registrerede omgivende forhold er så tæt som muligt på dem, insektet oplever.

5. Start koldt chok eksperiment

1. Dyrene fjernes fra isvandsbadet efter 60 minutter (eller den fastsatte tid, se ovenfor). Fjern straks insekterne fra plastikposen, og fjern hver enkelt person fra sin kuvert så hurtigt som muligt, samtidig med at håndteringen minimeres (Supplerende figur 3).
2. Stopuret startes, så snart dyrene befinder sig i maskeburene (se eksempeldata, supplerende tabel 1).
3. Tryk på bunden af buret med en blyant for at ophidse de genoprettende insekter.
   BEMÆRK: At give stimuli under genopretning sikrer, at fokale insekter demonstrerer genopretningsstatus og adfærd, så snart de er fysiologisk i stand (Supplerende Video).
   1. Tryk ofte og stærkt nok til at sikre, at et dyr reagerer, hvis det er muligt, men ikke forårsager et svar.
      BEMÆRK: For eksempel, når man tapper buret, hvis et dyr katapulteres op i luften og lander oprejst, men ikke bevæger sig for at stå alene, betragtes det ikke som en "stand" adfærd, da organismen faktisk ikke stod alene.
4. Marker forsøget som fuldført, når en person har fløjet (dvs. vist en fuld gendannelse). Afslut forsøget og overvej insektet for at have opnået en fuld genopretning, hvis det ikke bevæger sig efter 30 minutter.
5. Fjern insekterne fra maskeburet, og læg individerne tilbage i deres mærkede glasinkuverter. Befri dyrene eller hold dem til yderligere dataindsamling (f.eks. individuelle træk af størrelse, vægt).
6. Hvis du bruger en datalogger, skal du stoppe dataindsamlingen af dataloggeren og gemme filen med temperatur- og lysdata under eksperimentet med relevante dato- og klokkeslætsoplysninger.

6. Databehandling

1. Indtast de data, der vises fra dataarket, i et regneark (f.eks.
2. Hvis du bruger en datalogger, skal du tilføje temperatur- og lysdata for hvert svar for hver enkelt analyseret.
   1. Beregn middel- og standardafvigelsen for temperatur og lys for hver enkelt persons adfærd.
      BEMÆRK: Da dataloggeren logger data hver 10. s, skal du bruge de første 5 poster fra dataloggeren til det pågældende forsøg, hvis standadfærden for et dyr tog 48 s.
   2. Knyt hver enkelt persons genoprettelsesfunktion med abiotiske data, der er registreret af dataloggeren, og afrunding op eller ned til 10 s intervaller efter behov.
3. Afbilde og analysere data. Figur 1visualiserer for eksempel effekten af temperatur og lys på kold stødgenvindingstid. Kompiler andre relevante data (artstræk, regionale habitatkarakteristika) for at undersøge de økologiske og evolutionære mønstre i de testede gruppers fysiologiske træk.
   BEMÆRK: Figur 1 blev afbildet ved hjælp af ggplot2-pakken i R. Detaljeringsgraden af data om omgivelsesforholdene vil variere baseret på de instrumenter, der anvendes til at måle omgivende forhold. Hvis der anvendes en datalogger, kan der genereres tal med detaljer, der kan sammenlignes med figur 2. Hvis der anvendes et termometer, vil forskeren ikke være i stand til at skabe et plot informeret af omgivende lys. På samme måde kan disse scatterplots ændres til kasseplotter eller en anden passende skabelon til at illustrere disse fænomener, hvis forskere bruger kategorier af lys eller temperatur.

Representative Results

De data, der indsamles i denne protokol, gør det muligt at undersøge og opdele variabler, der er vigtige for organismens fysiologi. For eksempel bidrager både temperatur- og lysforhold til genopretning af sommerfugle fra koldt chok (Figur 1). Plottet er beregnet til at udforske samspillet mellem omgivende forhold og koldt chok inddrive. Ved hjælp af vildfangede sommerfugle fra både fælder og net demonstrerede 181 sommerfuglearter en tydelig genopretning efter kølig koma forårsaget af koldt chok (figur 2). Data fremlagt i figur 2 blev indsamlet af tre observatører over ca. fem måneder (januar, februar, maj-juli 2020) i de colombianske Andesbjerge. Eksperimenter blev altid udført om morgenen efter sommerfugl indsamling. Ved maksimal effektivitet var det muligt for to observatører samtidig at observere fire sommerfugle hver, gentaget syv gange (minimum 7,37 timer), hvilket resulterede i test af 56 personer på en enkelt morgen. Dette gav mulighed for en stor dataindsamling på tværs af hele sommerfuglesamfund, mens man inkluderede og overvejede data om individuel variation. Da der kan forekomme assays under omgivende miljøforhold, er genopretningsbetingelserne repræsentative for deres levesteder og afspejler den naturlige variation, som organismer i naturen oplever. Figur 3 illustrerer overlapningen mellem temperatur- og lysforholdene i det kolde chokgenvindingseksperiment og forhold i en græsgang, hvorfra nogle testede sommerfugle blev indsamlet.

Figur 1: Spredning af restitutionstiden (i sekunder) for sommerfugle efter koldt stød. (A) Gennemsnitlig temperatur og (B) betyder LUX (lysintensitet) under deres genopretning. Arter er organiseret og farvet af familien. Samlet set, som lys og temperaturstigning, koldt chok opsving tid falder, viser variation på tværs af taxa. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Eksempel på resultater fra den kolde chok opsving analyse på 181 arter af sommerfugl fra den colombianske Andesbjergene. Dataene repræsenterer det antal sekunder, der er gået fra at fjerne sommerfuglen fra kulde, og hvornår den var i stand til at flyve. Arter er organiseret og farvet af familien. Dette tal viser den taksonomiske bredde, som dette eksperiment kan anvendes med succes på, og de mange forskellige reaktioner på genopretning af koldt chok på tværs af arter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Omgivelsestemperatur og LUX under forsøg med genopretning af koldt stød. Plot af omgivelsestemperatur (blå) og LUX (lysintensitet, rød) som registreret af dataloggere placeret i græsgange, hvor sommerfugl indsamling fandt sted (lyse farver, betingelser spænder hele dagen) og betingelser under koldt chok opsving forsøg (mørke farver, kun morgen timer). De omgivende feltforhold og de forsøgsbetingelser, der er afbildet, viser de mange og gennemsnitlige forhold, som sommerfugle oplever i løbet af en uges prøvetagning og eksperimentering i marken. Eksperimenter blev kun udført i de tidlige timer (07:00-13:00 h), mens dataloggere blev indsat i marken i en uge (dagslys timer, 06:00-18:00 h vist). Vist her er overlapningen mellem eksperimentelle forhold og omgivende forhold opleves af sommerfugle, der viser den økologiske relevans af at gennemføre fysiologi assays under omgivende forhold. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1: Procedure for indsamling af fokale insekter-i dettetilfælde sommerfugle-ved hjælpaf lokkemad Van-Someren fælder og aktivt net. Fælder blev lokket med både rådnende fisk og rådnende frugt lokkemad. Fælde (uden agn) i baggrunden, i forgrunden er en prøve i sin unikke kuvert mod en blå plast indsamling boks. Klik her for at hente denne fil.

Supplerende figur 2:Poser med op til fire individuelle sommerfugle nedsænket i isvand i en køler. Plastikposer blev markeret med den tid, de blev placeret i isvandet, så koldt chok eksperimenter kunne blive forskudt gennem morgenen. Plastikposer skal forsegles for at forhindre, at prøverne bliver våde; Men oversvømmelser af poser og kuvert i dette tilfælde havde ingen målbar effekt på inddrivelsen af sommerfugle. Klik her for at hente denne fil.

Supplerende figur 3:To observatører indsamler data i marken. Hvert netbur indeholder fire unikke sommerfugle, der kommer sig efter koldt chok. Polyvinylchlorid T-leddet i buret huser dataloggeren for at forhindre direkte sol- eller regneksponering. Hver observatør har et stopur, der blev startet umiddelbart efter sommerfugl frigivelse i buret. Burene er forhøjet af bænke, hvilket gør det muligt for observatører at ophidse bunden af buret for at sikre, at sommerfuglene reagerede adfærdsmæssigt så hurtigt som fysiologisk muligt. Klik her for at hente denne fil.

Supplerende tabel 1: Eksempel på datablad. Arket viser hver sommerfugls entydige id som tildelt i feltet og kendetegn (artsnavn, nøglefarver) i noter. Også registreret er den dominerende stilling sommerfuglen (dvs. hvilken side af vingen blev udsat for solen) i genopretningsperioden, noteret som D (dorsal) eller V (ventral). Klik her for at hente denne tabel.

Supplerende Video 1: Tappe buret for koldt chok opsving. Når sommerfugle kommer sig, tapper observatøren bunden af buret forsigtigt for at fremkalde adfærd, så snart sommerfuglene er i stand til det. Klik her for at downloade denne video.

Discussion

Studiet af termisk fysiologi inkorporerer målinger af arter og miljømæssige træk for bedre at forstå samspillet mellem organismer og deres omgivelser, der er nøglen til overlevelse og fitness. Mens altid integreret i forståelsen af naturhistorie og økologi af planter og dyr, termiske træk er af stigende betydning i lyset af landskabet og klimaændringerne^11,21. Flere grupper af ectothermic terrestriske insekter, især lepidoptera og odonatan, er relativt store og rigelige, udviser forskellige adfærd, og er modtagelige for manipulation. Skitseret her er en effektiv og billig analyse for effektivt at måle fysiologiske reaktioner hos sådanne insekter. Denne protokol kræver en kilde til sunde organismer til at analysere, hvis håndteringstid forud for forsøget er begrænset. Selv om antallet af organismer, der analyseres på én gang, er fleksibelt, vil antallet af forsøgspersoner pr. forsøg variere afhængigt af formålet med dataindsamlingen og/eller antallet af observatører.

For eksempel blev denne protokol udviklet til at indsamle detaljerede individuelle data om sommerfugle på tværs af hele samfund. Som sådan illustrerer de repræsentative resultater en indsats for at maksimere dataindsamlingen for personer af så mange arter som muligt og under en række forhold, der er relevante for det lokale miljø. Uanset antallet af fokale arter er det afgørende for observatøren at kunne identificere hver enkelt person i buret, der oplever genopretningen. Hvis målet er at indsamle data fra kun én art, bør kun en eller to personer (hvis de kan identificeres baseret på forskellig vingeslitage, eller hvis de er individuelt mærket) analyseres på én gang. Forsøgspersonerne skal udvælges i overensstemmelse med et specifikt forskningsspørgsmål eller en bestemt studieplan. Baseret på det stillede spørgsmål og formålet med dataindsamling (forskning eller klasseværelse, for eksempel), vil stikprøvestørrelsen og indsamlingen af andre træk variere.

For at illustrere de grundlæggende komponenter i fysiologi belyst af denne protokol (induktion af chill koma, trin for nyttiggørelse, rolle omgivende forhold), kan et klasseværelse instruktør vælge to forskellige arter eller morphs af en enkelt art. Hvis fokuspersonerne kun adskiller sig i et nøgletræk (f.eks. farve), vil en mindre stikprøvestørrelse være nødvendig, og studerende kan nøje studere forholdet mellem dette træk og organismefysiologi. Forskere interesseret i økologisk fysiologi kan bruge deres eksperimentelle data til at udforske komplekse økologiske og evolutionære spørgsmål. Forskerne skal sørge for omhyggeligt at vælge fokale insekter, der direkte behandler deres spørgsmål (f.eks. baseret på livsstadium, alder, køn, placering) og på grundlag af antallet af involverede variabler bestemme den passende stikprøvestørrelse. Stikprøvestørrelser for komplekse modeller vil være større end dem, der er beskrevet ovenfor.

Mens du indsamler adfærdsmæssige genopretningsdata, er det vigtigt, at buret hviler over jorden, fordi observatøren skal være i stand til at trykke på bunden af buret for at fremkalde genopretningsadfærd. Dette sikrer, at organismen reagerer (står, flyver), så snart den er fysiologisk i stand til at gøre det, og terminalgenvindingsadfærden (flyvning) er dokumenteret. Registrering af omgivende forhold under koldchokgenvinding er en integreret del af studiet af termisk fysiologi, da denne protokol er designet til at studere og adskille miljøets rolle i organismal fysiologi. Dataloggere (se materialetabellen) er nyttige til at registrere standardiserede målinger af relevante forhold (f.eks. temperatur, lys og endda fugtighed). Men hvis disse værktøjer ikke er tilgængelige, kan relevante forhold måles på andre måder, f.eks. med et digitalt termometer, eller ved at forenkle miljøforholdenes variabel og ved hjælp af forskellige miljøer som skygge og sol. Denne protokol giver forskeren mulighed for at måle forholdene under kold chokgendannelse baseret på undersøgelsens formål og omfang.

Selvom denne metode kan ændres, så den passer bedre til specifikke taksonomiske grupper, anbefales det, at der anvendes store, volant insekter. Flyvende insekter, der genvinder deres evne til at flyve uafhængigt, kan anses for at have opnået en fuld genopretning. Metoden, som beskrevet, blev med succes brugt på sommerfugle i troperne og subtroperne. Baseret på de termiske tendenser i et givet område (dvs. det temperaturområde, der opleves på et sted, der vil variere, hvilket påvirker forventningerne baseret på højde, breddegrad, baldakindække), kan en organisme kræve mere eller mindre end en time i et isvandbad for at komme ind i en kølekoma. Organismens størrelse kan også påvirke den tid, der er nødvendig for at komme i en kølekoma. Det er vigtigt at finde det tidspunkt for kold eksponering, der er nødvendigt for at fremkalde en kølig koma (ikke bevæger sig), men ikke dræbe fokusarter. Den tid, der kræves for at fremkalde en chill koma vil afhænge af størrelse, placering, og naturlige historie / adfærd af enkeltpersoner. Baseret på resultaterne fra det koldt chok eksperiment, der er beskrevet heri, og ved hjælp af viden om fokale insekters økologi, skal du vælge et tidspunkt, hvor forsøget skal afsluttes, hvis en given person ikke foretager en fuld genopretning.

Baseret på forskerens specifikke spørgsmål kan denne metode anvendes enten i marken eller laboratoriet for at give mulighed for både naturlig miljøvariation og kontrol for henholdsvis vigtige variabler. Denne analyse er enkel og billig og hjælper med at udfylde eksisterende huller inden for termisk fysiologi. Den lethed af denne protokol gør det tilgængeligt at ansætte for en bred vifte af taxa, åbne feltet for mere end lab-venlige organismer. Det nye ved at udføre en standardiseret, men omgivende termisk analyse udfylder kløften mellem laboratorie- og feltresultater²². Udnyttelse af de omgivende forhold for genopretning af organismer vil hjælpe forskerne med at opdele miljø - og artsfaktorernes rolle i fysiologi^14,22. Endelig, på grund af dens lave omkostninger og mangel på nødvendige materialer, kan denne protokol bruges i fjerntliggende steder i marken med lidt udstyr-ideel til mange feltbiologer-såvel som i klasseværelser for at give unge studerende en hands-on læringsoplevelse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 x 24 x 36" Popup Rearing & Observation Cage	Bioquip	1466PB	Ensure that the cage is slightly elevated from the ground to be able to tap the floor of the cage during experiments.
Cooler	Any	NA
Glassine envelopes	Bioquip	1130B
HOBO Pendant Temperature/Light 8K Data Logger	Onset	UA-002-08	If a datalogger is not accessible, researchers may choose to use a digital thermometer to record ambient temperatures at regular intervals. See protocol step 4.5 for additional information.
HOBO Optic USB Base Station	Onset	Base-U-1
Ice water	NA	NA
Insects (focal taxa)	NA	Any	Collect sufficient samples to test, ensuring replication of experimental groups (e.g. species, sampling location)
PVC T-joint	Any	Any
Sealable plastic bag	Any	NA
Stopwatch/timer	Any	NA
Weight	Any	NA	Large coins or small rocks to weigh down the plastic bags will ensure that specimens are submerged in ice water. A standardized weight is ideal.