Summary
Hier wordt een goedkoop, toegankelijk protocol beschreven om het herstel van koude schokken van vlinders onder omgevingsomstandigheden te evalueren.
Abstract
Ecologische fysiologie, met name van ectothermen, wordt steeds belangrijker in deze veranderende wereld, omdat het metingen van soorten en omgevingskenmerken gebruikt om de interacties tussen organismen en hun omgeving te verkennen om hun overleving en fitheid beter te begrijpen. Traditionele thermische assays zijn duur in termen van tijd, geld en apparatuur en zijn daarom vaak beperkt tot kleine steekproefgroottes en weinig soorten. Hier wordt een nieuw protocol gepresenteerd dat gedetailleerde gegevens genereert over individueel gedrag en fysiologie van grote, voluminante, terrestrische insecten, met behulp van het voorbeeld van vlinders. Dit artikel beschrijft de methoden van een koude schokhersteltest die in het veld kan worden uitgevoerd onder omgevingsomstandigheden en waarvoor geen dure laboratoriumapparatuur nodig is. Deze methode is gebruikt om de respons- en herstelstrategie op koude schokken van tropische vlinders te begrijpen en individuele gegevens te genereren over hele vlindergemeenschappen. Deze methoden kunnen zowel in afgelegen veldomgevingen als klaslokalen worden gebruikt en kunnen worden gebruikt om ecologisch relevante fysiologische gegevens te genereren en als leermiddel.
Introduction
De integratie van thermische fysiologie en ecologie in de late jaren 1970 en begin jaren 19801,2 lanceerde het gebied van ecologische fysiologie. Uitgebreide thermische studies uitgevoerd op ectothermen benadrukken ecologisch-fysiologische synergieën in verschillende eco-evolutionaire contexten3,4,5. Onderzoek naar thermische fysiologie van ectothermische organismen heeft onlangs de aandacht herwonnen in het licht van klimaatverandering en veranderde thermische landschappen over de hele wereld6,7. Naast het informeren van studies op academisch gebied van ecologische fysiologie, kunnen thermische fysiologietesten breed toegankelijk zijn voor onderzoekers en kunnen ze dienen als een praktische onderwijsaanpak voor alle niveaus. Componenten van thermische prestaties, waaronder thermische limieten en effecten van temperatuurschokken, zijn fundamenteel voor de ecologie, het gedrag en de levensgeschiedenis van dieren8,9.
In het bijzonder worden ecotothermen gebruikt om vragen over fysiologie aan te pakken, omdat endothermie een onlosmakelijk verband tussen omgevingstemperatuur en organismetemperatuur dicteert. Het temperatuurbereik dat organismen kunnen weerstaan (hun kritische thermische minimum tot maximaal thermisch bereik) en de temperaturen waarbij hun gedrag en geschiktheid worden gemaximaliseerd (thermische optima) zijn vaak geworteld in ecologische en evolutionaire processen. Deze fysiologische eigenschappen zijn van toenemend belang omdat temperaturen, zowel middelen als extremen, toenemen10. De abiotische veranderingen, waaronder temperatuurstijgingen, die gepaard gaan met habitatvernietiging en fragmentatie hebben bijvoorbeeld gemeenschappen van ectothermen, waaronder anuranen, beïnvloed, waardoor fysiologisch kwetsbare soorten (met smalle thermische tolerantie) worden beperkt tot kleine restgebieden van de habitat11,12.
Het beoordelen van belangrijke componenten van thermische prestaties kan duur zijn, zowel in termen van tijd als middelen en vereist traditioneel laboratoriumapparatuur en gestandaardiseerde omstandigheden. Bovendien weerspiegelen conventionele assays vaak niet de breedte van de omgevingsomstandigheden die een bepaald dier in de natuur13 eert, aangezien de temperatuur in vergelijkbare fysiologie-experimenten zorgvuldig wordt gecontroleerd en vaak geen verband houdt met omgevingsomstandigheden die een dier maakt. Deze temperatuurregeling kan het begrip van variatie in individuele reactiesverminderen 2,14. Fysiologen hebben vertrouwd op laboratoriumgebaseerde verwarmings- en koelingsexperimenten, met behulp van programmeerbare waterbaden om de omgeving van een dier gestaag te verwarmen of te koelen om thermische prestatiecurven te informeren15.
Meestal worden dieren in flacons met een thermokoppel geplaatst en wordt hun omgevingstemperatuur gestaag gewijzigd door de temperatuur van het omringende waterbad te regelen. Onderzoekers meten de tijd die nodig is om een veranderde fysiologische toestand te bereiken (bijv. chill coma, knockdown) en de temperatuur waarbij de statusverandering plaatsvond16,17. Vanaf een minimum van USD $ 500 zijn deze gereedschappen groot, zwaar en vereisen ze extra technische apparatuur (bijv. computer, thermokoppels). Bijgevolg zijn de basisinstrumenten voor het uitvoeren van klassieke methoden voor de beoordeling van thermische prestaties 1) economisch niet voor iedereen toegankelijk, 2) niet geschikt voor het testen van dieren die te groot zijn om te worden opgenomen in gebruikelijke flacons die worden gebruikt voor kleine dipterans, en 3) niet draagbaar voor gebruik in afgelegen veldinstellingen. De naleving van de gangbare praktijk heeft geresulteerd in een beperkte vertegenwoordiging in taxonomie en experimentele omstandigheden18,19,20.
Hoewel volledige thermische prestatiecurven de verspreiding van soorten, levensgeschiedeniskenmerken en gedrag kunnen informeren, kan de kwantificering van minder en eenvoudigere thermische statistieken efficiënter en nog steeds uiterst informatief zijn. Fysiologische assays, het meten van het begin van de koude coma en het daaropvolgende herstel van koude schokken, koudeharding en rechtzettend gedrag, zijn effectieve en uitvoerbare proxy's voor het kritische thermische minimum van een organisme8. Hier beschreven is een koude schoktest nuttig voor het opwekken van fysiologische gegevens van grote terrestrische ectothermische insecten. De test is betaalbaar, toegankelijk en gemakkelijk uit te voeren onder veldomstandigheden of in de klas. Gegevens over koude schokherstel die door dit protocol worden gegenereerd, kunnen worden gekoppeld aan soort- of individuele eigenschapsgegevens om vragen over ecologische fysiologie na te streven en / of worden gebruikt om studenten te leren over fysiologische principes.
Protocol
1. Identificatie van soorten van belang
- Identificeer soorten die van belang zijn om de hersteltijd van koude schokken te bepalen. Houd er rekening mee dat elke groep zal verschillen in de tijd die nodig is om een chill coma op te wekken (d.w.z. het punt waarop het insect nog leeft, maar niet beweegt en niet reageert). Kies ook op basis van het organisme en het gebruik van gegevens verschillende cutoff-punten waarop het experiment moet worden gestopt als de focale persoon(en) niet vliegen (zie rubriek 4).
OPMERKING: Dit protocol is ontworpen en ontwikkeld voor gebruik op Lepidoptera. Het is echter van toepassing op grote, voluminante, terrestrische insecten, in het bijzonder insecten die plat kunnen worden opgeslagen in glassine-enveloppen die beweging en schade beperken (bijv. vlinders en libellen / waterjuffers).
2. Het uitvoeren van een voorarrest
- Voer een vooronderzoek uit op een kleine steekproef van individuen om de belangrijkste parameters te bepalen. Volg de secties 3 tot en met 5 van het onderstaande protocol met 5-10 personen voor een voorarrest.
- Test de tijd die nodig is op ijs om een koude coma te induceren (niet bewegen), maar dood de focale soort niet door stap 5.1 te volgen met behandelingen van 30 min, 60 min en 90 min.
OPMERKING: De tijd die nodig is om een chill coma te induceren, hangt af van de grootte, locatie en natuurlijke geschiedenis / gedrag van de individuen. - Kies op basis van resultaten van stap 4.1-4.4 en met behulp van kennis van de ecologie van de focale insecten een tijdstip waarop de studie moet worden afgesloten als een bepaald individu niet volledig herstelt. Baseer deze keer ook op ecologie van de soort, rekening houdend met het feit dat na vele minuten van onbekwaam zijn om te vliegen, veel insecten vooraf gaan.
OPMERKING: Als de meeste voorbereidende proeven bijvoorbeeld na 15 minuten in de vlucht eindigen, kan men besluiten om de proeven na 25 minuten te beëindigen om ervoor te zorgen dat zelfs uitschieters de kans hebben om volledig te herstellen (d.w.z. vliegen). Dit protocol is gebaseerd op een afsluittijd van 30 minuten (stap 5.4).
- Test de tijd die nodig is op ijs om een koude coma te induceren (niet bewegen), maar dood de focale soort niet door stap 5.1 te volgen met behandelingen van 30 min, 60 min en 90 min.
- Gebruik parameters uit voorarrestgegevens om gegevensverzameling voor de experimenten te informeren. Wijzig het hieronder beschreven protocol op basis van de behoeften van de focale organismen, inclusief de tijd in de ijsmest, het tijdstip waarop proeven moeten worden beëindigd en gedrag dat op het gegevensblad is gedocumenteerd (rillingen kunnen bijvoorbeeld een ongepast gedrag zijn voor het insect van keuze).
- Definieer specifieke onderzoeksvragen die met deze gegevens moeten worden beantwoord terwijl u de parameters verfijnt.
OPMERKING: Als de onderzoeker bijvoorbeeld geïnteresseerd is in het effect van langdurige blootstelling op herstel, is de tijd in ijs een belangrijke variabele om te wijzigen. Als onderzoekers geïnteresseerd zijn in verschillen in fysiologie tussen licht- en donkergekleurde soorten, kunnen ze twee duidelijk gekleurde soorten kiezen of de vleugelkleur van het insect wijzigen om het effect van vleugelkleur op de hersteltijd te meten. Belangrijk is dat deze methode zeer aanpasbaar is aan de behoeften en onderzoeksvragen die worden gesteld (zie het discussiegedeelte).
- Definieer specifieke onderzoeksvragen die met deze gegevens moeten worden beantwoord terwijl u de parameters verfijnt.
3. Verzameling insecten
- Verzamel insecten met behulp van geschikte methoden zoals aasvallen en entomologische netten (Aanvullende figuur 1). Plaats bij het ophalen elk individu in een aparte glassine-envelop met een uniek identiteitsbewijs.
- Bewaar dieren op een schaduwrijke, koele plaats na gevangen te zijn en voor blootstelling aan het koude schokexperiment. Stel het dier altijd binnen 24 uur na het vangen bloot aan de experimentele behandeling en standaardiseer deze keer zoveel mogelijk in verschillende onderzoeken.
- Hoewel de opslagomstandigheden kunnen variëren, moet u de insecten uit de directe zon houden. Plaats ze indien mogelijk binnen in een koele, donkere kamer.
- Zorg er in het veld voor dat ze tijdens het opslaan in de schaduw staan en beschermd zijn tegen wind (wegblazen) en andere insectenroofdieren die in de enveloppen kunnen komen.
4. Stel het koude schokexperiment in
- Vul een koeler met ijs en water. Zorg ervoor dat er voldoende ijs is om ten minste één uur aan te houden en voeg indien nodig periodiek ijs toe met als doel het milieu in het water bij 0 °C te houden.
- Kies tussen 1 en 4 focale individuen voor een experimenteerronde en zorg ervoor dat elk individu identificeerbaar is.
- Als u meerdere soorten gebruikt, gebruikt u slechts één van elk om verwarring te voorkomen op personen in het gegevensblad. Als u met slechts één soort experimenteert, gebruikt u alleen individuen die gemakkelijk kunnen worden onderscheiden, bijvoorbeeld door een gebroken vleugel of een duidelijke markering.
- Als het doel van het experiment geen verband houdt met vleugelkleuring, markeert u de vleugels met unieke ID's (bijv. getallen) met een fijne viltstift om individuen te onderscheiden.
- Als de experimenten aan geen van de bovenstaande criteria voldoen, voert u het experiment op één persoon tegelijk uit.
- Vul de rijen van het gegevensblad in met de informatie die relevant is voor elk geïdentificeerd insect, met inbegrip van hun unieke ID en een nuttige identificatiecode in de notities, zoals de soortnaam of het onderscheidende teken (Aanvullende tabel 1).
- Plaats alle focale personen (nog steeds in hun individueel gemarkeerde enveloppen) in een verzegelde plastic zak met een gewicht (Tabel van materialen), en plaats de zak gedurende 60 minuten in ijswater (of totdat de koude coma is veroorzaakt; zie discussie) ( Aanvullende figuur2).
- Zorg ervoor dat het gewicht zwaar is (bijv. grote munten, grote ringen of gladde rotsen) en groot genoeg om de zak insecten ondergedompeld te houden in het ijswater en loodrecht op het wateroppervlak. Gebruik een gewicht dat geen lekken veroorzaakt in de verzegelde plastic zak.
OPMERKING: Hoewel insecten nog steeds kunnen herstellen als ze direct aan het water worden blootgesteld terwijl ze onder water staan, bemoeilijken natte enveloppen het verwijderen van elk individu. Het is het beste om de insecten droog in hun zak te houden.
- Zorg ervoor dat het gewicht zwaar is (bijv. grote munten, grote ringen of gladde rotsen) en groot genoeg om de zak insecten ondergedompeld te houden in het ijswater en loodrecht op het wateroppervlak. Gebruik een gewicht dat geen lekken veroorzaakt in de verzegelde plastic zak.
- Registreer temperatuur- en lichtgegevens.
- Gebruik een datalogger (zie de tabel met materialen)om omgevingstemperatuur- en lichtgegevens op te nemen met stap 5.1 of 5.2.
- Programmeer de datalogger om temperatuur- en lichtgegevens te verzamelen met tussenpozen van 10 s, te beginnen op het moment dat de insecten worden vrijgegeven.
- Baseer de starttijd van de datalogger op wanneer de insecten in het ijswater werden geplaatst. Zorg ervoor dat de informatie van de datalogger (datum, tijd) wordt gesynchroniseerd, zodat gegevens over omgevingsomstandigheden later kunnen worden afgestemd op elk afzonderlijk brandpuntsinsect.
- Gebruik een eenvoudige thermometer om temperatuur- en lichtgegevens met korte tussenpozen met de hand vast te leggen (door een tweede onderzoeker).
- Bepaal de experimentele parameters die moeten worden gekoppeld aan hersteltijd die kan worden gemeten zonder een datalogger. Gebruik verschillende behandelingen: schaduw/zon; schemering/middag.
- Gebruik een datalogger (zie de tabel met materialen)om omgevingstemperatuur- en lichtgegevens op te nemen met stap 5.1 of 5.2.
- Plaats een gaaskooi voor de insecten op een geschikte plaats, zodat de temperatuur- en lichtomgevingen zo homogeen mogelijk in de kooi zijn, zodat de basis van de kooi wordt verhoogd en door de waarnemer kan worden getapt.
- Plaats de datalogger net buiten de kooi of in de kooi, zodat deze niet wordt omgestoten of anderszins wordt beïnvloed door kleine bewegingen in de kooi. Als u geen datalogger gebruikt, plaatst u een thermometer op de juiste manier en/of zet u de kooien in de juiste configuratie.
OPMERKING: De datalogger moet zo worden geplaatst dat de geregistreerde omgevingsomstandigheden zo dicht mogelijk bij de omstandigheden van het insect liggen.
5. Start koude schok experiment
- Haal de dieren na 60 minuten uit het ijswaterbad (of de daarvoor geschikte tijd; zie hierboven). Verwijder onmiddellijk de insecten uit de plastic zak en verwijder elk individu zo snel mogelijk uit de envelop terwijl u de hantering minimaliseert (Aanvullend figuur 3).
- Start de stopwatch zodra de dieren zich in de gaaskooien bevinden (zie voorbeeldgegevens, aanvullende tabel 1).
- Tik met een potlood op de basis van de kooi om de herstellende insecten te roeren.
OPMERKING: Het geven van stimuli tijdens het herstel zorgt ervoor dat de focale insecten herstelstatus en gedrag vertonen zodra ze fysiologisch geschikt zijn (Aanvullende video).- Tik regelmatig en sterk genoeg om ervoor te zorgen dat een dier indien mogelijk reageert, maar geen reactie veroorzaakt.
OPMERKING: Bijvoorbeeld, bij het tikken op de kooi, als een dier in de lucht wordt gekatapulteerd en rechtop landt, maar niet beweegt om alleen te staan, wordt dat niet beschouwd als een "stand"-gedrag, omdat het organisme inderdaad niet op zichzelf stond.
- Tik regelmatig en sterk genoeg om ervoor te zorgen dat een dier indien mogelijk reageert, maar geen reactie veroorzaakt.
- Markeer de proef als voltooid zodra een persoon heeft gevlogen (d.w.z. een volledig herstel heeft getoond). Beëindig de proef en beschouw het insect als een volledig herstel als het na 30 minuten niet beweegt.
- Verwijder de insecten uit de gaaskooi en plaats de individuen terug in hun gelabelde glassine-enveloppen. Bevrijd de dieren of bewaar ze voor verdere gegevensverzameling (bijv. individuele eigenschappen van grootte, gewicht).
- Als u een datalogger gebruikt, stopt u het verzamelen van gegevensloggergegevens en slaat u het bestand met temperatuur- en lichtgegevens tijdens het experiment op met de juiste datum-/tijdinformatie.
6. Gegevensverwerking
- Voer de gegevens uit het gegevensblad in een werkblad in (bijvoorbeeld MS Excel).
- Als u een datalogger gebruikt, voegt u temperatuur- en lichtgegevens toe voor elke reactie van elke test.
- Bereken de gemiddelde en standaarddeviatie van de temperatuur en het licht voor elk gedrag van elk individu.
OPMERKING: Als de datalogger elke 10 s gegevens registreert, als het standgedrag voor één dier 48 s duurde, gebruik dan de eerste 5 vermeldingen van de datalogger voor die proef. - Koppel elk herstelgedrag van elk individu aan abiotische gegevens die door de datalogger zijn geregistreerd en rond indien nodig intervallen van 10 s naar boven of naar beneden af.
- Bereken de gemiddelde en standaarddeviatie van de temperatuur en het licht voor elk gedrag van elk individu.
- Gegevens plotten en analyseren. Figuur 1visualiseert bijvoorbeeld het effect van temperatuur en licht op de hersteltijd van koude schokken. Verzamel andere relevante gegevens (soorteigenschappen, regionale habitatkenmerken) om de ecologische en evolutionaire patronen in fysiologische eigenschappen van de geteste groepen te onderzoeken.
OPMERKING: Figuur 1 is uitgezet met behulp van het ggplot2-pakket in R. Het detailniveau van de gegevens over de omgevingsomstandigheden zal verschillen op basis van de instrumenten die worden gebruikt om de omgevingsomstandigheden te meten. Als een datalogger wordt gebruikt, kunnen cijfers worden gegenereerd met details die vergelijkbaar zijn met figuur 2. Als een thermometer wordt gebruikt, kan de onderzoeker geen plot maken die is geïnformeerd door omgevingslicht. Evenzo, als onderzoekers categorieën van licht of temperatuur gebruiken, kunnen deze scatterplots worden gewijzigd in boxplots of een ander geschikt sjabloon om deze verschijnselen te illustreren.
Representative Results
De gegevens die in dit protocol worden verzameld, maken onderzoek en verdeling van variabelen die belangrijk zijn voor de fysiologie van organismen mogelijk. Zowel temperatuur als lichtomstandigheden dragen bijvoorbeeld bij aan het herstel van vlinders door koude schokken (figuur 1). Het perceel is bedoeld om de interactie tussen omgevingsomstandigheden en koude schokherstel te verkennen. Met behulp van in het wild gevangen vlinders uit zowel vallen als netten vertoonden 181 soorten vlinders een duidelijk herstel van de koude coma veroorzaakt door koude shock (figuur 2). De in figuur 2 gepresenteerde gegevens werden verzameld door drie waarnemers over ongeveer vijf maanden (januari, februari, mei-juli 2020) in de Colombiaanse Andes. Experimenten werden altijd uitgevoerd op de ochtend na het verzamelen van vlinders. Bij maximale efficiëntie was het mogelijk voor twee waarnemers om tegelijkertijd vier vlinders te observeren, elk zeven keer herhaald (minimaal 7,37 uur), wat resulteerde in het testen van 56 individuen op één ochtend. Dit maakte een groot deel van de gegevensverzameling mogelijk in hele vlindergemeenschappen, terwijl gegevens over individuele variatie werden opgegaan en overwogen. Aangezien assays kunnen plaatsvinden onder omgevingsomstandigheden, zijn herstelomstandigheden representatief voor hun habitats en weerspiegelen ze de natuurlijke variatie die organismen in de natuur ervaren. Figuur 3 illustreert de overlap tussen temperatuur en lichtomstandigheden van het koude schokherstel-experiment en de omstandigheden in een weiland waaruit enkele geteste vlinders werden verzameld.
Figuur 1: Spreiding van de hersteltijd (in seconden) van vlinders na koude schok. (A) Gemiddelde temperatuur en (B) gemiddelde LUX (lichtintensiteit) tijdens hun herstel. Soorten worden georganiseerd en gekleurd door Familie. Over het algemeen neemt de hersteltijd van koude schokken af naarmate het licht en de temperatuur toenemen, wat variabiliteit in taxa laat zien. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Voorbeeld van resultaten van de koude schok hersteltest op 181 soorten vlinders uit de Colombiaanse Andes. De gegevens geven het aantal seconden weer dat is verstreken na het verwijderen van de vlinder uit de kou en wanneer hij kon vliegen. Soorten worden georganiseerd en gekleurd door Familie. Deze figuur toont de taxonomische breedte waarop dit experiment met succes kan worden toegepast, en de verscheidenheid aan reacties op het herstel van koude schokken tussen soorten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Omgevingstemperatuur en LUX tijdens koude schokterugwinningsproeven. Plot van omgevingstemperatuur (blauw) en LUX (lichtintensiteit, rood) zoals geregistreerd door dataloggers geplaatst in de weilanden waar vlinderverzameling plaatsvond (lichte kleuren, omstandigheden overspannen de hele dag) en omstandigheden tijdens koude schokherstelproeven (donkere kleuren, alleen ochtenduren). De omgevingsveldomstandigheden en experimentele omstandigheden die zijn uitgezet, tonen het bereik en de gemiddelde omstandigheden die vlinders ervaren gedurende een week veldbemonstering en experimenten. Experimenten werden alleen in de vroege uren uitgevoerd (07:00-13:00 uur), terwijl de dataloggers een week lang in het veld werden ingezet (daglichturen, 06:00-18:00 uur getoond). Hier wordt de overlap aangetoond tussen experimentele omstandigheden en omgevingsomstandigheden die vlinders ervaren, wat de ecologische relevantie aantoont van het uitvoeren van fysiologietesten onder omgevingsomstandigheden. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Aanvullend figuur 1: Procedure voor het verzamelen van focale insecten-in ditgeval vlinders-met behulpvan gelokte Van-Someren-vallen en actieve netten. Vallen werden gelokt met zowel rottende vissen als rottend fruitaas. Val (zonder aas) op de achtergrond, op de voorgrond is een exemplaar in zijn unieke envelop tegen een blauwe plastic verzameldoos. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend figuur 2: Zakken met maximaal vier individuele vlinders ondergedompeld in ijswater in een koeler. Plastic zakken werden gemarkeerd met de tijd dat ze in het ijswater werden geplaatst, zodat experimenten met koude schokken door de ochtend konden worden gespreid. Plastic zakken moeten worden verzegeld om te voorkomen dat monsters nat worden; overstromingen van de zakken en enveloppe hadden in dit geval echter geen meetbaar effect op het herstel van de vlinders. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend figuur 3: Twee waarnemers verzamelen gegevens in het veld. Elke gaaskooi bevat vier unieke vlinders die herstellen van een koude schok. De polyvinylchloride T-joint in de kooi herbergt de datalogger om directe blootstelling aan zon of regen te voorkomen. Elke waarnemer heeft een stopwatch die onmiddellijk bij het loslaten van de vlinder in de kooi werd gestart. De kooien worden verhoogd door banken, waardoor waarnemers de basis van de kooi kunnen roeren om ervoor te zorgen dat de vlinders zo snel mogelijk gedragsmatig reageerden. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 1: Voorbeeldgegevensblad. Het blad toont de unieke ID van elke vlinder zoals toegewezen in het veld en onderscheidende tekens (soortnaam, sleutelkleuren) in notities. Ook geregistreerd is de dominante positie van de vlinder (d.w.z. welke kant van de vleugel werd blootgesteld aan de zon) tijdens de herstelperiode, genoteerd als D (dorsaal) of V (ventrale). Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullende video 1: Tikken op de kooi voor herstel van koude schokken. Terwijl vlinders herstellen, tikt de waarnemer zachtjes op de basis van de kooi om gedrag te induceren zodra de vlinders in staat zijn. Klik hier om deze Video te downloaden.
Discussion
De studie van thermische fysiologie omvat metingen van soorten en omgevingskenmerken om de interacties tussen organismen en hun omgeving die essentieel zijn voor overleving en fitheid beter te begrijpen. Hoewel ze altijd een integraal onderdeel zijn van het begrijpen van de natuurlijke geschiedenis en ecologie van planten en dieren , zijn thermische eigenschappen van toenemend belang in het licht van landschap en klimaatverandering11,21. Verschillende groepen ectothermische terrestrische insecten, in het bijzonder lepidoptera en odonatan, zijn relatief groot en overvloedig, vertonen duidelijk gedrag en zijn vatbaar voor manipulatie. Hier wordt een efficiënte en goedkope test beschreven om fysiologische reacties van dergelijke insecten effectief te meten. Dit protocol vereist een bron van gezonde organismen om te assay, waarvan de verwerkingstijd voorafgaand aan het experiment beperkt is. Hoewel het aantal onderzochte organismen in één keer flexibel is, zal het aantal focale individuen per experiment variëren op basis van het doel van de gegevensverzameling en/of het aantal waarnemers.
Dit protocol is bijvoorbeeld ontwikkeld om gedetailleerde individuele gegevens over vlinders in hele gemeenschappen te verzamelen. Als zodanig illustreren de representatieve resultaten een inspanning om de gegevensverzameling voor individuen van zoveel mogelijk soorten en onder verschillende omstandigheden die relevant zijn voor de lokale omgeving te maximaliseren. Ongeacht het aantal focale soorten is het van cruciaal belang dat de waarnemer elk individu in de kooi kan identificeren dat het herstel ervaart. Als het doel is om gegevens van slechts één soort te verzamelen, moeten slechts één of twee personen (indien identificeerbaar op basis van verschillende vleugelslijtage of indien individueel gemarkeerd) in één keer worden geïdentificeerd. De proefpersonen moeten worden gekozen in overeenstemming met een specifieke onderzoeksvraag of studieplan. Op basis van de gestelde vraag en het doel van dataverzameling (bijvoorbeeld onderzoek of klaslokaal) zullen steekproefgrootte en verzameling van andere eigenschappen verschillen.
Om de fundamentele componenten van de fysiologie te illustreren die in dit protocol worden opgehelderd (inductie van chill coma, stappen van herstel, rol van omgevingsomstandigheden), kan een klasinstructeur twee verschillende soorten of morphs van één soort kiezen. Als de focale individuen slechts in één belangrijke eigenschap verschillen (bijv. kleur), zal een kleinere steekproefgrootte nodig zijn en kunnen studenten de relatie van die eigenschap en organismefysiologie nauwkeurig bestuderen. Onderzoekers die geïnteresseerd zijn in ecologische fysiologie kunnen hun experimentele gegevens gebruiken om complexe ecologische en evolutionaire vragen te verkennen. Onderzoekers moeten er zeker van zijn dat ze zorgvuldig focale insecten kiezen die hun vragen direct beantwoorden (bijvoorbeeld op basis van levensfase, leeftijd, geslacht, locatie) en, op basis van het aantal betrokken variabelen, de juiste steekproefgrootte bepalen. De steekproefgrootten voor complexe modellen zijn groter dan hierboven beschreven.
Tijdens het verzamelen van gedragsherstelgegevens is het belangrijk dat de kooi boven de grond rust, omdat de waarnemer op de bodem van de kooi moet kunnen tikken om herstelgedrag op te wekken. Dit zorgt ervoor dat het organisme reageert (staat, vliegt) zodra het fysiologisch in staat is om dit te doen, en het terminale herstelgedrag (vlucht) wordt gedocumenteerd. Het registreren van omgevingsomstandigheden tijdens het herstel van koude schokken is een integraal onderdeel van de studie van thermische fysiologie, omdat dit protocol is ontworpen om de rol van de omgeving in de organismefysiologie te bestuderen en te ontwarren. Dataloggers (zie de materialentabel)zijn nuttig om gestandaardiseerde metingen van relevante omstandigheden (bijv. temperatuur, licht en gelijkmatige vochtigheid) vast te leggen. Als deze tools echter niet beschikbaar zijn, kunnen relevante omstandigheden op andere manieren worden gemeten, zoals met een digitale thermometer of door de variabele omgevingsomstandigheden te vereenvoudigen en verschillende omgevingen zoals schaduw en zon te gebruiken. Dit protocol geeft de onderzoeker opties om de omstandigheden tijdens koude shock recovery te meten op basis van het doel en de omvang van het onderzoek.
Hoewel deze methode kan worden aangepast aan specifieke taxonomische groepen, wordt aanbevolen om grote, voluminante insecten te gebruiken. Vliegende insecten die hun vermogen om zelfstandig te vliegen herwinnen, kunnen worden beschouwd als een volledig herstel. De methode, zoals beschreven, werd met succes gebruikt op vlinders in de tropen en subtropen. Op basis van de thermische trends van een bepaald gebied (d.w.z. het temperatuurbereik op een locatie die zal variëren, waardoor de verwachtingen worden beïnvloed op basis van hoogte, breedtegraad, luifelbedekking), kan een organisme meer of minder dan een uur in een ijswaterbad nodig hebben om in een koude coma te komen. De grootte van het organisme kan ook van invloed zijn op de tijd die nodig is om in een koele coma te komen. Het is belangrijk om de tijd van koude blootstelling te vinden die nodig is om een koude coma te induceren (niet bewegen), maar niet om focale soorten te doden. De tijd die nodig is om een chill coma te induceren, hangt af van de grootte, locatie en natuurlijke geschiedenis / gedrag van de individuen. Op basis van de resultaten van het hierin beschreven koudeschokexperiment en met behulp van kennis van de ecologie van de focale insecten, kiest u een tijdstip waarop de proef moet worden afgesloten als een bepaald individu niet volledig herstelt.
Op basis van de specifieke vragen van de onderzoeker kan deze methode zowel in het veld als in het laboratorium worden gebruikt om zowel natuurlijke omgevingsvariatie als controle voor belangrijke variabelen mogelijk te maken. Deze test is eenvoudig en goedkoop en helpt bij het opvullen van bestaande hiaten op het gebied van thermische fysiologie. Het gemak van dit protocol maakt het toegankelijk om te gebruiken voor een breed scala aan taxa, waardoor het veld wordt geopend voor meer dan laboratoriumvriendelijke organismen. De nieuwigheid van het uitvoeren van een gestandaardiseerde maar omgevingsthermische test vult de kloof tussen laboratorium- en veldresultaten22. Door gebruik te maken van omgevingsomstandigheden voor het herstel van organismen zullen onderzoekers de rol van omgevings - en soortfactoren in de fysiologie kunnen verdelen14,22. Ten slotte kan dit protocol vanwege de lage kosten en het gebrek aan benodigde materialen worden gebruikt op afgelegen locaties in het veld met weinig apparatuur - ideaal voor veel veldbiologen - evenals in klaslokalen om jonge studenten een praktische leerervaring te bieden.
Disclosures
De auteur heeft geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten.
Acknowledgments
Met dank aan Jaret Daniels, Isabella Plummer, Brett Scheffers en Dan Hahn voor input over het protocol zoals het voor het eerst werd ontwikkeld. Extra dank aan Jaime Haggard, Sebastián Durán en Indiana Cristóbal Róis-Málaver voor het implementeren van verschillende iteraties van dit protocol en voor input op belangrijke componenten. Ook dank aan een anonieme recensent voor feedback op het manuscript als geheel. De steun werd verleend door het McGuire Center for Lepidoptera and Biodiversity's publication fund, het College of Agricultural and Life Sciences, School of Natural Resources and Environment en wildlife ecology and conservation department van UF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 x 24 x 36" Popup Rearing & Observation Cage | Bioquip | 1466PB | Ensure that the cage is slightly elevated from the ground to be able to tap the floor of the cage during experiments. |
| Cooler | Any | NA | |
| Glassine envelopes | Bioquip | 1130B | |
| HOBO Pendant Temperature/Light 8K Data Logger | Onset | UA-002-08 | If a datalogger is not accessible, researchers may choose to use a digital thermometer to record ambient temperatures at regular intervals. See protocol step 4.5 for additional information. |
| HOBO Optic USB Base Station | Onset | Base-U-1 | |
| Ice water | NA | NA | |
| Insects (focal taxa) | NA | Any | Collect sufficient samples to test, ensuring replication of experimental groups (e.g. species, sampling location) |
| PVC T-joint | Any | Any | |
| Sealable plastic bag | Any | NA | |
| Stopwatch/timer | Any | NA | |
| Weight | Any | NA | Large coins or small rocks to weigh down the plastic bags will ensure that specimens are submerged in ice water. A standardized weight is ideal. |
References
- Huey, B., Stevenson, R. D. Integrating thermal physiology and ecology of ectotherms a discussion of approaches. American Zoologist. 19 (1), 357-366 (1979).
- Huey, R. B., Slatkin, M. Cost and benefits of lizard thermoregulation. The Quarterly Review of Biology. 51 (3), 363-384 (1976).
- Kingsolver, J. G. Butterfly thermoregulario: Organismic mechanisms and population consequences. Journal of Research on the Lepidoptera. 24, 1-20 (1985).
- Kingsolver, J. G. Evolution and coadaptation of thermoregulatory behavior and wing pigmentation pattern in pierid butterflies. Evolution. 41 (3), 472-490 (1987).
- Kingsolver, J. G., Huey, R. B. Evolutionary analyses of morphological and physiological plasticity in thermally variable environments. American Zoologist. 38, 545-560 (1998).
- Malhi, Y., Wright, J. Spatial patterns and recent trends in the climate of tropical rainforest regions. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 359 (1443), 311-329 (2004).
- Sears, M. W., et al. Configuration of the thermal landscape determines thermoregulatory performance of ectotherms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (38), 10595-10600 (2016).
- Sinclair, B. J., Coello Alvarado, L. E., Ferguson, L. V. An invitation to measure insect cold tolerance: Methods, approaches, and workflow. Journal of Thermal Biology. 53, 180-197 (2015).
- Angilletta, M. Thermal adaptation: a theoretical and empirical synthesis. , Oxford University Press. (2009).
- Perkins-Kirkpatrick, S. E., Gibson, P. B. Changes in regional heatwave characteristics as a function of increasing global temperature. Scientific Reports. 7, 12256 (2017).
- Frishkoff, L. O., Hadly, E. A., Daily, G. C. Thermal niche predicts tolerance to habitat conversion in tropical amphibians and reptiles. Global Change Biology. 21 (11), 3901-3916 (2015).
- Nowakowski, A. J., Otero Jiménez, B., Allen, M., Diaz-Escobar, M., Donnelly, M. Landscape resistance to movement of the poison frog, Oophaga pumilio, in the lowlands of northeastern Costa Rica. Animal Conservation. 16 (2), 188-197 (2013).
- Kingsolver, J. G., Buckley, L. B. Quantifying thermal extremes and biological variation to predict evolutionary responses to changing climate. Philosophical Transactions of the Royal Society B. Biological Sciences. 372 (1723), 20160147 (2017).
- Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218, 1956-1967 (2015).
- Sinclair, B. J., Williams, C. M., Terblanche, J. S. Variation in thermal performance among insect populations. Physiological and Biochemical Zoology. 85 (6), 594-606 (2012).
- Gotcha, N., Terblanche, J. S., Nyamukondiwa, C. Plasticity and cross-tolerance to heterogeneous environments: divergent stress responses co-evolved in an African fruit fly. Journal of Evolutionary Biology. 31 (1), 98-110 (2018).
- Mutamiswa, R., Chidawanyika, F., Nyamukondiwa, C. Superior basal and plastic thermal responses to environmental heterogeneity in invasive exotic stemborer Chilo partellus Swinhoe over indigenous Busseola fusca (Fuller) and Sesamia calamistis Hampson. Physiological Entomology. 43 (2), 108-119 (2018).
- de Jong, M. A., Saastamoinen, M. Environmental and genetic control of cold tolerance in the Glanville fritillary butterfly. Journal of Evolutionary Biology. 31 (5), 636-645 (2018).
- DeVries, Z. C., Kells, S. A., Appel, A. G. Estimating the critical thermal maximum (CTmax) of bed bugs, Cimex lectularius: Comparing thermolimit respirometry with traditional visual methods. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Molecular & Integrative Physiology. 197, 52-57 (2016).
- De Keyser, R., Breuker, C. J., Hails, R. S., Dennis, R. L. H., Shreeve, T. G. Why small is beautiful: Wing colour is free from thermoregulatory constraint in the small lycaenid butterfly, Polyommatus icarus. PLoS One. 10 (4), 0122623 (2015).
- Nowakowski, A. J., et al. Tropical amphibians in shifting thermal landscapes under land-use and climate change. Conservation Biology. 31 (1), 96-105 (2017).
- Niehaus, A. C., Angilletta, M. J., Sears, M. W., Franklin, C. E., Wilson, R. S. Predicting the physiological performance of ectotherms in fluctuating thermal environments. Journal of Experimental Biology. 215, 694-701 (2012).
