Summary
Här beskrivs ett lågkostnadsprotokoll för att utvärdera kallchocksåterhämtning av fjärilar under omgivande miljöförhållanden.
Abstract
Ekologisk fysiologi, särskilt av ektotermer, blir allt viktigare i denna föränderliga värld eftersom den använder mått på arter och miljöegenskaper för att utforska interaktionerna mellan organismer och deras omgivning för att bättre förstå deras överlevnad och kondition. Traditionella termiska analyser är kostsamma när det gäller tid, pengar och utrustning och är därför ofta begränsade till små provstorlekar och få arter. Presenteras här är ett nytt protokoll som genererar detaljerade data om individuellt beteende och fysiologi hos stora, volanta, markbundna insekter, med hjälp av exemplet med fjärilar. Detta dokument beskriver metoderna för en kall chock återvinningsanalys som kan utföras på fältet under omgivande miljöförhållanden och kräver inte dyr laboratorieutrustning. Denna metod har använts för att förstå svars- och återhämtningsstrategin på kall chock av tropiska fjärilar, vilket genererar data på individnivå över hela fjärilssamhällen. Dessa metoder kan användas både i avlägsna fältmiljöer och klassrum och kan användas för att generera ekologiskt relevanta fysiologiska data och som undervisningsverktyg.
Introduction
Integrationen av termisk fysiologi och ekologi i slutet av 1970-talet och början av 1980-talet1,2 lanserade fältet ekologisk fysiologi. Omfattande termiska studier utförda på ectotherms belyser ekologiska-fysiologiska synergier i olika eko-evolutionärasammanhang 3,4,5. Forskning om termisk fysiologi hos ektotermiska organismer har återfått uppmärksamhet nyligen inför klimatförändringar och förändrade termiska landskap över hela världen6,7. Förutom att informera studier inom det akademiska området ekologisk fysiologi kan termisk fysiologianalys vara allmänt tillgänglig för forskare och kan fungera som en praktisk undervisningsmetod för alla nivåer. Komponenter av termisk prestanda, inklusive termiska gränser och effekter av temperaturchocker, är grundläggande för ekologi, beteende och livshistoria hos djur8,9.
Specifikt används ecototherms för att ta itu med frågor om fysiologi, eftersom endothermy dikterar en oupplöslig koppling mellan omgivnings- och organismtemperatur. Temperaturområdet som organismer kan motstå (deras kritiska termiska minimum till maximalt termiskt intervall) och de temperaturer vid vilka deras beteenden och kondition maximeras (termisk optima) är ofta rotade i ekologiska och evolutionära processer. Dessa fysiologiska egenskaper är av ökande betydelse eftersom temperaturer, både medel och ytterligheter, ökar10. Till exempel har de abiotiska förändringarna, inklusive temperaturökningar, som åtföljer livsmiljöförstörelse och fragmentering påverkat samhällen av ektotermer, inklusive anuraner, som begränsar fysiologiskt bräckliga arter (med smal termisk tolerans) till små restlivsmiljöfläckar 11,12.
Att bedöma viktiga komponenter i termisk prestanda kan vara dyrt både när det gäller tid och resurser och kräver traditionellt laboratorieutrustning och standardiserade förhållanden. Konventionella analyser återspeglar dessutom ofta inte bredden av omgivningsförhållanden som upplevs i naturen av ett visst djur13 eftersom temperaturen i liknande fysiologiska experiment kontrolleras noggrant och ofta inte har något samband med omgivningsförhållanden som ett djur upplever. Denna temperaturkontroll kan minska förståelsen för variation i enskilda svar2,14. Fysiologer har förlitat sig på laboratoriebaserade värme- och kylexperiment, med hjälp av programmerbara vattenbad för att ständigt värma eller kyla ett djurs miljö för att informera termiska prestandakurvor15.
Vanligtvis placeras djur i injektionsflaska med termoelement, och deras omgivningstemperatur ändras stadigt genom att kontrollera temperaturen på det omgivande vattenbadet. Forskare mäter den tid det tar att uppnå ett förändrat fysiologiskt tillstånd (t.ex. chill coma, knockdown) och temperaturen vid vilken statusändringen inträffade16,17. Från minst USD $ 500 är dessa verktyg stora, tunga och kräver ytterligare teknisk utrustning (t.ex. dator, termoelement). Följaktligen är de grundläggande verktygen för att utföra klassiska metoder för att bedöma termisk prestanda 1) inte ekonomiskt tillgängliga för alla, 2) som inte är lämpliga för att analysera djur som är för stora för att ingå i sedvanliga injektionsflaskar som används för små diftare och 3) inte bärbara för användning i fjärrfältsinställningar. Efterlevnad av allmän praxis har resulterat i begränsad representation över taxonomi och experimentella villkor18,19,20.
Medan kompletta termiska prestandakurvor kan informera artfördelning, livshistoria egenskaper och beteende, bland andra egenskaper, kvantifiering av färre och enklare termiska mätvärden kan vara effektivare och fortfarande extremt informativ. Fysiologiska analyser, mätning av chill coma-inledning och efterföljande återhämtning av kalla stötar, kallhärdande och härdningsbeteende är effektiva och körbara proxyservrar för det kritiska termiska minimumet av en organism8. Beskrivs här är en kall chock analys användbar för att framkalla fysiologiska data från stora terrestra ektotermiska insekter. Analysen är prisvärd, tillgänglig och lätt att utföra under fältförhållanden eller i klassrummet. Data om återhämtning av köldstötar som genereras av detta protokoll kan kopplas till egenskapsdata på art- eller individnivå för att driva frågor om ekologisk fysiologi och/eller användas för att lära eleverna om fysiologiska principer.
Protocol
1. Identifiering av arter av intresse
- Identifiera arter av intresse för att bestämma återhämtningstiden för kalla stötar. Tänk på att varje grupp kommer att skilja sig åt under den tid det tar att inducera en chill coma (dvs. den punkt där insekten fortfarande lever, men inte rör sig och inte svarar). På samma sätt väljer du olika brytpunkter för att stoppa försöket om de centrala individerna inte flyger (se avsnitt 4) baserat på organismen och användningen av data.
OBS: Detta protokoll utformades och utvecklades för användning på Lepidoptera. Det är dock tillämpligt på stora, volanta, marklevande insekter, särskilt de som kan lagras platt i glashöljen som begränsar rörelse och skador (t.ex. fjärilar och sländor/damselflies).
2. Genomföra en förundersökning
- Utför en förinställning på ett litet urval av individer för att bestämma nyckelparametrarna. Följ avsnitten 3 till 5 i protokollet nedan med 5-10 personer för en förundersökning.
- Testa den tid som krävs på is för att inducera en chill coma (inte röra sig), men inte döda brännarten genom att följa steg 5.1 med behandlingar på 30 min, 60 min och 90 min.
Obs: Den tid som krävs för att inducera en chill koma beror på individernas storlek, plats och naturhistoria / beteende. - Baserat på resultat från steg 4.1-4.4 och med hjälp av kunskap om fokala insekters ekologi, välj en tidpunkt då du ska avsluta studien om en viss individ inte gör en fullständig återhämtning. Basera denna tidsavskärning på artens ekologi också, med tanke på att många insekter är fördaterade efter många minuters oförmögen flygning.
OBS: Om till exempel de flesta preliminära försök slutar i flygning efter 15 minuter, kan man besluta att avsluta försök efter 25 minuter för att säkerställa att även avvikande värden har en chans att återhämta sig helt (dvs. flyga). Detta protokoll är baserat på en 30 minuters bryttid (steg 5.4).
- Testa den tid som krävs på is för att inducera en chill coma (inte röra sig), men inte döda brännarten genom att följa steg 5.1 med behandlingar på 30 min, 60 min och 90 min.
- Använd parametrar från förmaksdata för att informera datainsamlingen för experimenten. Ändra protokollet som beskrivs nedan baserat på behoven hos de fokala organismerna, inklusive tid i isslammet, tid då försök ska avslutas och beteenden som dokumenteras på databladet (t.ex. rysningar kan vara ett olämpligt beteende för den insekt som de väljer).
- Definiera specifika forskningsfrågor som ska besvaras med dessa data samtidigt som parametrarna förfinas.
OBS: Om forskaren till exempel är intresserad av effekten av långvarig exponering på återhämtningen är tiden i is en nyckelvariabel att ändra. Om forskare är intresserade av skillnader i fysiologi mellan ljusa och mörkfärgade arter kan de välja antingen två tydligt färgade arter eller modifiera insektens vingfärg för att mäta vingfärgens effekt på återhämtningstiden. Viktigt är att denna metod är mycket anpassningsbar till de behov och forskningsfrågor som ställs (se diskussionsavsnittet).
- Definiera specifika forskningsfrågor som ska besvaras med dessa data samtidigt som parametrarna förfinas.
3. Insamling av insekter
- Samla insekter med lämpliga metoder som betefällor och entomologiska nät (kompletterande figur 1). Vid insamling, placera varje individ i ett separat glashölje med ett unikt ID.
- Förvara djur på en skuggad, sval plats efter att ha fångats och innan du exponerar för kallchocksexperimentet. Utsätt alltid djuret för den experimentella behandlingen inom 24 timmar efter att ha fångats och standardisera den här gången så mycket som möjligt över försök.
- Även om lagringsförhållandena kan variera, håll insekterna borta från direkt sol. Om möjligt, placera dem inomhus i ett svalt, mörkt rum.
- På fältet, se till att de kommer att skuggas medan de lagras och skyddas från vind (blåser bort) och andra insekts rovdjur som kan komma in i kuverten.
4. Ställ in kallchocksexperimentet
- Fyll en kylare med is och vatten. Se till att det finns tillräckligt med is för att hålla i minst en timme och tillsätt is regelbundet efter behov med målet att hålla miljön i vattnet vid 0 °C.
- Välj mellan 1 och 4 fokala individer för en experimentrunda och se till att varje individ är identifierbar.
- Om du använder flera arter använder du bara en av varje för att undvika att förvirra individer i databladet. Om du experimenterar med endast en art, använd bara individer som lätt kan särskiljas, till exempel genom en trasig vinge eller distinkt märkning.
- Om målet med experimentet inte har något samband med vingfärgning, markera vingarna med unika ID:t (t.ex. siffror) med en fin filtspetsad markör för att särskilja individer.
- Om experimenten inte uppfyller något av ovanstående kriterier, utför experimentet på en individ i taget.
- Fyll i raderna i databladet med den information som är relevant för varje insekt som analyseras, inklusive deras unika ID och en användbar identifierare i noterna, t.ex. artnamn eller särskiljande karaktär (kompletterande tabell 1).
- Placera alla brännbara personer (fortfarande i sina individuellt märkta kuvert) i en förseglad plastpåse med vikt(materialförteckning)och placera påsen i isvatten i 60 minuter (eller tills chill coma har framkallats, se diskussion) (kompletterande figur 2).
- Se till att vikten är tung (t.ex. stora mynt, stora brickor eller släta stenar) och tillräckligt stor för att hålla insektspåsen nedsänkt i isvattnet och vinkelrät mot vattenytan. Använd en vikt som inte orsakar läckage i den förseglade plastpåsen.
OBS: Medan insekter fortfarande kan återhämta sig om de utsätts direkt för vattnet medan de är nedsänkta, komplicerar våta kuvert avlägsnandet av varje individ. Det är bäst att hålla insekterna torra i sin väska.
- Se till att vikten är tung (t.ex. stora mynt, stora brickor eller släta stenar) och tillräckligt stor för att hålla insektspåsen nedsänkt i isvattnet och vinkelrät mot vattenytan. Använd en vikt som inte orsakar läckage i den förseglade plastpåsen.
- Registrera temperatur- och ljusdata.
- Använd en datalogger (se materialförteckningen) föratt registrera omgivningstemperatur och ljusdata med antingen steg 5.1 eller 5.2.
- Programmera dataloggaren för att samla in temperatur- och ljusdata med 10 s intervall, med början vid den tidpunkt då insekterna kommer att släppas ut.
- Basera starttiden för dataloggaren på när insekterna placerades i isvattnet. Se till att datalogginformationen (datum, tid) synkroniseras så att data om omgivningsförhållanden senare kan matchas med varje enskild fokal insekt.
- Använd en enkel termometer för att registrera temperatur- och ljusdata med korta intervaller för hand (av en andra forskare).
- Bestäm vilka experimentella parametrar som ska associeras med återställningstid som kan mätas utan en datalogger. Använd distinkta behandlingar: skugga/sol; skymning/mitt på dagen.
- Använd en datalogger (se materialförteckningen) föratt registrera omgivningstemperatur och ljusdata med antingen steg 5.1 eller 5.2.
- Placera en nätbur för insekterna på en lämplig plats så att temperaturen och ljusmiljöerna är så homogena som möjligt i buret och så att burbasen är förhöjd och kan knackas av observatören.
- Placera dataloggaren precis utanför buret, eller inuti buret så att den inte kommer att slås omkull eller på annat sätt påverkas av små rörelser inuti buret. Om du inte använder en datalogger, placera en termometer på lämpligt sätt och/eller ställ in burarna i lämplig konfiguration.
OBS: Dataloggen måste placeras så att de registrerade omgivningsförhållandena ligger så nära de som insekten upplever som möjligt.
5. Starta kallchocksexperiment
- Avlägsna djuren från isvattenbadet efter 60 min (eller lämplig tid; se ovan). Avlägsna omedelbart insekterna från plastpåsen och ta bort varje individ från kuvertet så snabbt som möjligt samtidigt som hanteringen minimeras (kompletterande figur 3).
- Starta stoppuret så snart djuren är i nätburarna (se exempeldata, kompletterande tabell 1).
- Knacka på burens botten med en penna för att agitera de återhämtande insekterna.
OBS: Att tillhandahålla stimuli under återhämtning säkerställer att de fokala insekterna visar återhämtningsstatus och beteenden så snart de är fysiologiskt kapabla (Kompletterande video).- Knacka ofta och tillräckligt starkt för att säkerställa att ett djur kommer att svara om möjligt, men inte orsaka ett svar.
OBS: Till exempel, när man knackar buret, om ett djur katapulteras i luften och landar upprätt, men inte rör sig för att stå på egen hand, anses det inte vara ett "stativ" beteende, eftersom organismen inte verkligen stod på egen hand.
- Knacka ofta och tillräckligt starkt för att säkerställa att ett djur kommer att svara om möjligt, men inte orsaka ett svar.
- Markera rättegången som fullständig när en individ har flugit (dvs. visat en fullständig återhämtning). Avsluta försöket och betrakta insekten som att ha uppnått en fullständig återhämtning om den inte rör sig efter 30 min.
- Ta bort insekterna från nätburen och placera individerna tillbaka i sina märkta glashöljen. Befria djuren eller behåll dem för ytterligare datainsamling (t.ex. individuella egenskaper av storlek, vikt).
- Om du använder en datalogger stoppar du dataloggdatainsamlingen och sparar filen med temperatur- och ljusdata under experimentet med lämplig datum-/tidsinformation.
6. Databehandling
- Ange data som presenteras från databladet i ett kalkylblad (t.ex. MS Excel).
- Om du använder en datalogger lägger du till temperatur- och ljusdata för varje svar av varje enskilt analyserat.
- Beräkna medelvärdet och standardavvikelsen för temperatur och ljus för varje enskild individs beteende.
OBS: När dataloggaren loggar data var 10: e s, om stativbeteendet för ett djur tog 48 s att inträffa, använd de första 5 posterna från dataloggaren för den studien. - Associera varje återställnings beteende för varje individ med abiotiska data som registreras av dataloggern, avrundning upp eller ner till 10 s intervall vid behov.
- Beräkna medelvärdet och standardavvikelsen för temperatur och ljus för varje enskild individs beteende.
- Rita och analysera data. Figur 1visualiserar till exempel effekten av temperatur och ljus på återhämtningstiden för kalla stötar. Sammanställa andra relevanta data (artegenskaper, regionala livsmiljöegenskaper) för att undersöka de ekologiska och evolutionära mönstren i fysiologiska egenskaper hos de testade grupperna.
OBS: Figur 1 ritades med ggplot2-paketet i R. Detaljnivån för uppgifter om omgivningsförhållanden kommer att skilja sig åt beroende på vilka instrument som används för att mäta omgivningsförhållanden. Om en datalogger används kan siffror med detaljer som är jämförbara med figur 2 genereras. Om en termometer används kommer forskaren inte att kunna skapa ett område som informeras av omgivande ljus. På samma sätt, om forskare använder kategorier av ljus eller temperatur, kan dessa scatterplots ändras till boxplots eller en annan lämplig mall för att illustrera dessa fenomen.
Representative Results
De uppgifter som samlas in i detta protokoll möjliggör undersökning och uppdelning av variabler som är viktiga för organismisk fysiologi. Till exempel bidrar både temperatur- och ljusförhållanden till återhämtning av fjärilar från kall chock (Figur 1). Tomten är avsedd att utforska samspelet mellan omgivningsförhållanden och kall chock återhämtning. Med vildspåriga fjärilar från både fällor och nät visade 181 fjärilsarter distinkt återhämtning från chill coma inducerad av kall chock (Figur 2). Uppgifter som presenterades i figur 2 samlades in av tre observatörer under cirka fem månader (januari, februari, maj-juli 2020) i de colombianska Anderna. Experiment utfördes alltid på morgonen efter fjärilssamlingen. Vid maximal effektivitet var det möjligt för två observatörer att samtidigt observera fyra fjärilar vardera, upprepade sju gånger (minst 7,37 timmar), vilket resulterade i testning av 56 individer på en enda morgon. Detta möjlige en hel del datainsamling i hela fjärilssamhällen samtidigt som man inkluderar och överväger data om individuell variation. Som analyser kan förekomma under omgivande miljöförhållanden är återhämtningsförhållandena representativa för deras livsmiljöer och återspeglar den naturliga variation som upplevs av organismer i naturen. Figur 3 illustrerar överlappningen mellan temperatur och ljusförhållanden i experimentet med återhämtning av kalla stötar och förhållandena i en betesmark från vilken vissa testade fjärilar samlades in.
Figur 1:Spridning av återhämtningstid (i sekunder) av fjärilar efter kall chock. (A) Medeltemperatur och (B) betyder LUX (ljusintensitet) under återhämtningen. Arter är organiserade och färgade efter familj. Sammantaget, när ljus och temperatur ökar, minskar återhämtningstiden för kalla stötar, vilket visar variabilitet över taxa. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Exempel på resultat från kallchocksåtervinningstestet på 181 fjärilsarter från de colombianska Anderna. Data representerar antalet sekunder som förfluter från att ta bort fjärilen från kyla och när den kunde flyga. Arter är organiserade och färgade efter familj. Denna siffra visar den taxonomiska bredd över vilken detta experiment framgångsrikt kan tillämpas och mångfalden av kalla chockåterhämtningssvar mellan arter. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3:Omgivningstemperatur och LUX under försök med återhämtning av köldstötar. Plot av omgivningstemperatur (blå) och LUX (ljusintensitet, röd) som registrerats av dataloggers placerade i betesmarkerna där fjärilssamling ägde rum (ljusa färger, förhållanden sträcker sig över hela dagen) och förhållanden under försök med återhämtning av kalla stötar (mörka färger, bara morgontimmar). De omgivande fältförhållandena och de experimentella förhållandena visar de olika och genomsnittliga förhållanden som fjärilar upplevt under en veckas fältprovtagning och experiment. Experiment utfördes endast tidigt på morgonen (07:00-13:00 h), medan dataloggersna distribuerades i fältet i en vecka (dagsljus, 06:00-18:00 h visas). Här visas överlappningen mellan experimentella förhållanden och omgivningsförhållanden som fjärilar upplevs, vilket visar den ekologiska relevansen av att genomföra fysiologiska analyser under omgivande förhållanden. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kompletterande figur 1: Förfarande för insamling av fokala insekter-i dettafall fjärilar-med hjälp av beteVan-Someren fällor och aktivt nät. Fällor betades med både ruttnande fisk och ruttnande fruktbeten. Fälla (utan bete) i bakgrunden, i förgrunden är ett prov i sitt unika kuvert mot en blå plastsamlingslåda. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: Påsar med upp till fyra enskilda fjärilar nedsänkta i isvatten i en kylare. Plastpåsarna var märkta med den tid de placerades i isvattnet, så att kalla chockförsök kunde stappla under morgonen. Plastpåsar bör förseglas för att förhindra att exemplar blir våta; Översvämning av påsar och kuvert i detta fall hade dock ingen mätbar effekt på fjärilarnas återhämtning. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 3: Två observatörer samlar in uppgifter på fältet. Varje nätbur innehåller fyra unika fjärilar som återhämtar sig från kall chock. Polyvinylklorid T-fogen i buret rymmer dataloggen för att förhindra direkt sol- eller regnexponering. Varje observatör har ett stoppur som startades omedelbart efter fjärilsfrisättning i buret. Burarna är upphöjda av bänkar, vilket gör det möjligt för observatörer att agitera burets botten för att säkerställa att fjärilarna svarade beteendemässigt så snabbt som fysiologiskt möjligt. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande tabell 1: Exempel på datablad. Bladet visar varje fjärils unika ID som tilldelats i fältet och särskiljande tecken (artnamn, nyckelfärger) i anteckningar. Också registrerat är fjärilens dominerande ställning (dvs. vilken sida av vingen som utsattes för solen) under återhämtningsperioden, känd som D (dorsal) eller V (ventral). Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Kompletterande video 1: Knacka på buret för återhämtning av kalla stötar. När fjärilar återhämtar sig knackar observatören försiktigt på burens botten för att inducera beteenden så snart fjärilarna är kapabla. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Discussion
Studien av termisk fysiologi innehåller mått på arter och miljöegenskaper för att bättre förstå interaktionerna mellan organismer och deras omgivning som är nyckeln till överlevnad och kondition. Även om det alltid är viktigt att förstå växters och djurs naturhistoria och ekologi, är termiska egenskaper av ökande betydelse inför landskap ochklimatförändringar 11,21. Flera grupper av ektermiska terrestra insekter, i synnerhet lepidoptera och odonatan, är relativt stora och rikliga, uppvisar distinkta beteenden och är mottagliga för manipulation. Här beskrivs en effektiv och billig analys för att effektivt mäta fysiologiska svar av sådana insekter. Detta protokoll kräver en källa till friska organismer för att analysera, vars hanteringstid före experimentet är begränsad. Även om antalet skadegörare som analyseras samtidigt är flexibelt, kommer antalet fokala individer per experiment att variera beroende på syftet med datainsamlingen och/eller antalet observatörer.
Till exempel utvecklades detta protokoll för att samla in detaljerade individuella data om fjärilar i hela samhällen. De representativa resultaten illustrerar därför ett försök att maximera datainsamlingen för individer av så många arter som möjligt och under en rad olika förhållanden som är relevanta för den lokala miljön. Oavsett antalet fokala arter är det viktigt för observatören att kunna identifiera varje individ i buren som upplever återhämtningen. Om målet är att samla in data från endast en art, bör endast en eller två individer (om de kan identifieras baserat på olika vingslitage eller om de är individuellt märkta) analyseras omedelbart. Försökspersonerna ska väljas i enlighet med en specifik forskningsfråga eller studieplan. Baserat på den fråga som ställs och syftet med datainsamling (till exempel forskning eller klassrum) kommer urvalsstorleken och insamlingen av andra egenskaper att skilja sig åt.
För att illustrera de grundläggande komponenterna i fysiologi som belyses av detta protokoll (induktion av chill coma, återhämtningssteg, omgivningsförhållandenas roll) kan en klassrumsinstruktör välja två distinkta arter eller morfer av en enda art. Om de fokala individerna endast skiljer sig åt i ett nyckeldrag (t.ex. färg), kommer en mindre provstorlek att vara nödvändig, och eleverna kan noggrant studera förhållandet mellan det drag och organismfysiologi. Forskare som är intresserade av ekologisk fysiologi kan använda sina experimentella data för att utforska komplexa ekologiska och evolutionära frågor. Forskare måste vara noga med att noggrant välja fokala insekter som direkt tar itu med sina frågor (t.ex. baserat på livsstadium, ålder, kön, plats) och, baserat på antalet variabler som är inblandade, bestämma lämplig provstorlek. Provstorlekarna för komplexa modeller kommer att vara större än de som beskrivs ovan.
När du samlar in beteendemässiga återhämtningsdata är det viktigt att buret vilar ovanför marken eftersom observatören måste kunna trycka på botten av buret för att framkalla återhämtningsbeteenden. Detta säkerställer att organismen svarar (står, flyger) så snart den är fysiologiskt kapabel att göra det, och det terminala återhämtningsbeteendet (flygningen) dokumenteras. Registrering av omgivningsförhållanden under återhämtningen av kalla stötar är integrerad i studien av termisk fysiologi, eftersom detta protokoll är utformat för att studera och skilja miljöns roll i organismisk fysiologi. Dataloggers (se materialförteckningen) äranvändbara för att registrera standardiserade mått på relevanta förhållanden (t.ex. temperatur, ljus och jämn fuktighet). Men om dessa verktyg inte är tillgängliga kan relevanta förhållanden mätas på andra sätt, till exempel med en digital termometer eller genom att förenkla variabeln av miljöförhållanden och använda distinkta miljöer som skugga och sol. Detta protokoll ger forskaren alternativ att mäta förhållandena under kall chock återhämtning baserat på studiens syfte och omfattning.
Även om denna metod kan modifieras för att bättre passa specifika taxonomiska grupper, rekommenderas att stora, volant insekter används. Flygande insekter som återfår sin förmåga att flyga självständigt kan anses ha uppnått en fullständig återhämtning. Metoden, som beskrivits, användes framgångsrikt på fjärilar i tropikerna och subtroperna. Baserat på termiska trender i ett visst område (dvs. temperaturintervallet på en plats som kommer att variera, vilket påverkar förväntningarna baserat på höjd, latitud, baldakinskydd), kan en organism kräva mer eller mindre än en timme i ett isvattenbad för att komma in i en kylkoma. Organismens storlek kan också påverka den tid som krävs för att komma in i en chill koma. Det är viktigt att hitta den tid för kall exponering som krävs för att inducera en chill koma (inte flytta), men inte döda fokala arter. Den tid som krävs för att inducera en chill coma beror på individernas storlek, plats och naturhistoria / beteende. Baserat på resultat från det kalla chockexperimentet som beskrivs häri och med hjälp av kunskap om fokala insekters ekologi, välj en tidpunkt då du ska avsluta studien om en viss individ inte gör en fullständig återhämtning.
Baserat på forskarens specifika frågor kan denna metod användas antingen inom området eller laboratoriet för att möjliggöra både naturlig miljövariation respektive kontroll för viktiga variabler. Denna analys är enkel och billig och hjälper till att fylla befintliga luckor inom termisk fysiologi. Enkelheten i detta protokoll gör det tillgängligt att anställa för ett varierat utbud av taxa, vilket öppnar fältet för mer än labbvänliga organismer. Nyheten att utföra en standardiserad men omgivande termisk analys fyller klyftan mellan laboratorie- och fältresultat22. Att utnyttja omgivningsförhållandena för organismåtervinning kommer att hjälpa forskare att dela upp miljö- och artfaktorernas roll ifysiologi 14,22. Slutligen, på grund av dess låga kostnad och brist på material som krävs, kan detta protokoll användas på avlägsna platser i fältet med lite utrustning som är idealisk för många fältbiologer - såväl som i klassrum för att ge unga studenter en praktisk inlärningsupplevelse.
Disclosures
Upphovsmannen har inga konkurrerande ekonomiska intressen eller andra intressekonflikter.
Acknowledgments
Tack till Jaret Daniels, Isabella Plummer, Brett Scheffers och Dan Hahn för input på protokollet när det först utvecklades. Ytterligare tacksamhet till Jaime Haggard, Sebastián Durán och Indiana Cristóbal Róis-Málaver för att ha genomfört flera iterationer av detta protokoll och för input om nyckelkomponenter. Tack också till en anonym recensent för feedback på manuskriptet som helhet. Stöd tillhandahölls av McGuire Center for Lepidoptera and Biodiversity's publikationsfond, College of Agricultural and Life Sciences, School of Natural Resources and Environment och Wildlife Ecology and Conservation department vid UF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 x 24 x 36" Popup Rearing & Observation Cage | Bioquip | 1466PB | Ensure that the cage is slightly elevated from the ground to be able to tap the floor of the cage during experiments. |
| Cooler | Any | NA | |
| Glassine envelopes | Bioquip | 1130B | |
| HOBO Pendant Temperature/Light 8K Data Logger | Onset | UA-002-08 | If a datalogger is not accessible, researchers may choose to use a digital thermometer to record ambient temperatures at regular intervals. See protocol step 4.5 for additional information. |
| HOBO Optic USB Base Station | Onset | Base-U-1 | |
| Ice water | NA | NA | |
| Insects (focal taxa) | NA | Any | Collect sufficient samples to test, ensuring replication of experimental groups (e.g. species, sampling location) |
| PVC T-joint | Any | Any | |
| Sealable plastic bag | Any | NA | |
| Stopwatch/timer | Any | NA | |
| Weight | Any | NA | Large coins or small rocks to weigh down the plastic bags will ensure that specimens are submerged in ice water. A standardized weight is ideal. |
References
- Huey, B., Stevenson, R. D. Integrating thermal physiology and ecology of ectotherms a discussion of approaches. American Zoologist. 19 (1), 357-366 (1979).
- Huey, R. B., Slatkin, M. Cost and benefits of lizard thermoregulation. The Quarterly Review of Biology. 51 (3), 363-384 (1976).
- Kingsolver, J. G. Butterfly thermoregulario: Organismic mechanisms and population consequences. Journal of Research on the Lepidoptera. 24, 1-20 (1985).
- Kingsolver, J. G. Evolution and coadaptation of thermoregulatory behavior and wing pigmentation pattern in pierid butterflies. Evolution. 41 (3), 472-490 (1987).
- Kingsolver, J. G., Huey, R. B. Evolutionary analyses of morphological and physiological plasticity in thermally variable environments. American Zoologist. 38, 545-560 (1998).
- Malhi, Y., Wright, J. Spatial patterns and recent trends in the climate of tropical rainforest regions. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 359 (1443), 311-329 (2004).
- Sears, M. W., et al. Configuration of the thermal landscape determines thermoregulatory performance of ectotherms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (38), 10595-10600 (2016).
- Sinclair, B. J., Coello Alvarado, L. E., Ferguson, L. V. An invitation to measure insect cold tolerance: Methods, approaches, and workflow. Journal of Thermal Biology. 53, 180-197 (2015).
- Angilletta, M. Thermal adaptation: a theoretical and empirical synthesis. , Oxford University Press. (2009).
- Perkins-Kirkpatrick, S. E., Gibson, P. B. Changes in regional heatwave characteristics as a function of increasing global temperature. Scientific Reports. 7, 12256 (2017).
- Frishkoff, L. O., Hadly, E. A., Daily, G. C. Thermal niche predicts tolerance to habitat conversion in tropical amphibians and reptiles. Global Change Biology. 21 (11), 3901-3916 (2015).
- Nowakowski, A. J., Otero Jiménez, B., Allen, M., Diaz-Escobar, M., Donnelly, M. Landscape resistance to movement of the poison frog, Oophaga pumilio, in the lowlands of northeastern Costa Rica. Animal Conservation. 16 (2), 188-197 (2013).
- Kingsolver, J. G., Buckley, L. B. Quantifying thermal extremes and biological variation to predict evolutionary responses to changing climate. Philosophical Transactions of the Royal Society B. Biological Sciences. 372 (1723), 20160147 (2017).
- Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218, 1956-1967 (2015).
- Sinclair, B. J., Williams, C. M., Terblanche, J. S. Variation in thermal performance among insect populations. Physiological and Biochemical Zoology. 85 (6), 594-606 (2012).
- Gotcha, N., Terblanche, J. S., Nyamukondiwa, C. Plasticity and cross-tolerance to heterogeneous environments: divergent stress responses co-evolved in an African fruit fly. Journal of Evolutionary Biology. 31 (1), 98-110 (2018).
- Mutamiswa, R., Chidawanyika, F., Nyamukondiwa, C. Superior basal and plastic thermal responses to environmental heterogeneity in invasive exotic stemborer Chilo partellus Swinhoe over indigenous Busseola fusca (Fuller) and Sesamia calamistis Hampson. Physiological Entomology. 43 (2), 108-119 (2018).
- de Jong, M. A., Saastamoinen, M. Environmental and genetic control of cold tolerance in the Glanville fritillary butterfly. Journal of Evolutionary Biology. 31 (5), 636-645 (2018).
- DeVries, Z. C., Kells, S. A., Appel, A. G. Estimating the critical thermal maximum (CTmax) of bed bugs, Cimex lectularius: Comparing thermolimit respirometry with traditional visual methods. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Molecular & Integrative Physiology. 197, 52-57 (2016).
- De Keyser, R., Breuker, C. J., Hails, R. S., Dennis, R. L. H., Shreeve, T. G. Why small is beautiful: Wing colour is free from thermoregulatory constraint in the small lycaenid butterfly, Polyommatus icarus. PLoS One. 10 (4), 0122623 (2015).
- Nowakowski, A. J., et al. Tropical amphibians in shifting thermal landscapes under land-use and climate change. Conservation Biology. 31 (1), 96-105 (2017).
- Niehaus, A. C., Angilletta, M. J., Sears, M. W., Franklin, C. E., Wilson, R. S. Predicting the physiological performance of ectotherms in fluctuating thermal environments. Journal of Experimental Biology. 215, 694-701 (2012).
