Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Vurdering af proteininteraktioner i levende celler med FRET-sensibiliseret emission

Published: April 22, 2021 doi: 10.3791/62241
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1, 2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen, 2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Summary

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) mellem to fluoroformolekyler kan bruges til at studere proteininteraktioner i den levende celle. Her tilvejebringes en protokol for, hvordan man måler FRET i levende celler ved at detektere sensibiliseret emission af acceptoren og slukning af donormolekylet ved hjælp af konfokal laserscanningsmikroskopi.

Abstract

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) er den strålingsfri overførsel af energi fra en exciteret donor til et acceptormolekyle og afhænger af molekylernes afstand og orientering samt omfanget af overlapning mellem donoremissions- og acceptorabsorptionsspektrene. FRET tillader at studere interaktionen mellem proteiner i den levende celle over tid og i forskellige subcellulære rum. Forskellige intensitetsbaserede algoritmer til måling af FRET ved hjælp af mikroskopi er beskrevet i litteraturen. Her tilvejebringes en protokol og en algoritme til kvantificering af FRET-effektivitet baseret på måling af både den sensibiliserede emission af acceptoren og slukning af donormolekylet. Kvantificeringen af ratiometrisk FRET i den levende celle kræver ikke kun bestemmelse af krydstale (spektral spill-over eller gennemblødning) af de fluorescerende proteiner, men også detektionseffektiviteten af den mikroskopiske opsætning. Protokollen her beskriver, hvordan man vurderer disse kritiske parametre.

Introduction

Mikroskopibaseret analyse af Förster Resonance Energy Transfer (FRET) muliggør vurdering af interaktioner mellem proteiner i levende celler. Det giver rumlig og tidsmæssig information, herunder information om hvor i cellen og i hvilket subcellulært rum interaktionen finder sted, og hvis denne interaktion ændrer sig over tid.

Theodor Förster lagde det teoretiske grundlag for FRET i 19481. FRET er en strålingsfri overførsel af energi fra en exciteret donor til et acceptormolekyle og afhænger af molekylernes afstand og den relative orientering af deres overgangsdipoler samt overlapningen mellem donoremissions- og acceptorabsorptionsspektrene. Energioverførselshastigheden er omvendt proportional med den sjette effekt af donoracceptorafstanden. FRET kan således anvendes til at måle molekylær nærhed i området 1-10 nm.

FRET konkurrerer med andre de-excitationsprocesser af donormolekylet og resulterer i den såkaldte donor-quenching og sensibiliserede emission af acceptoren. Donor-slukning er en reduktion af antallet af udsendte donorfotoner, mens sensibiliseret emission er en stigning i udsendte acceptorfotoner. Mange mikroskopiske FRET-analyser bruger fluorescensintensitetsmålinger, herunder acceptorfotoblegning 2, donorfotoblegning2 eller FRET-sensibiliseret fotoblegning af acceptoren3.

Her præsenteres en trin-for-trin eksperimentel protokol og matematisk algoritme til kvantificering af FRET ved hjælp af donorslukning og acceptorsensibiliseret emission4,5, en metode, der ofte omtales som ratiometrisk FRET. Mange protokoller om, hvordan man tilnærmer sensibiliseret emission er blevet offentliggjort, få har kvantificeret den absolutte FRET-effektivitet 6,7,8,9. Kvantificeringen af FRET-effektiviteten i den levende celle kræver bestemmelse af (i) krydstale (spektral spill-over eller gennemblødning) af de fluorescerende proteiner og også (ii) detektionseffektiviteten af den mikroskopiske opsætning. Mens krydstale kan vurderes ved at billeddannende celler, der kun udtrykker en af fluoroforerne, er vurderingen af donorens og acceptorfluorescensens relative detektionseffektivitet mere kompliceret. Det kræver kendskab til mindst forholdet mellem antallet af donor- og acceptormolekyler, der giver anledning til de målte signaler. Antallet af fluoroforer udtrykt i levende celler varierer imidlertid fra celle til celle og er ukendt. Den såkaldte α faktor karakteriserer de relative signalstyrker fra et enkelt exciteret donor- og acceptormolekyle. Kendskab til faktoren er en forudsætning for kvantitative ratiometriske FRET-målinger i prøver med variable acceptor-til-donor-molekyleforhold, som det ses under levende cellebilleddannelse med fluorescerende proteiner. Brug af et 1-til-1 donoracceptorfusionsprotein som kalibreringssonde muliggør bestemmelse af α faktor og fungerer også som en positiv kontrol. Denne genetisk koblede sonde udtrykkes af celler i ukendte samlede mængder, men i en fast og kendt relativ mængde en-til-en. Følgende protokol beskriver, hvordan 1-til-1-sonden konstrueres, og hvordan den bruges til kvantificering af FRET-effektivitet. Et regneark, der indeholder alle formler, findes i tillægget og kan bruges af læserne til at indtaste deres egne mål i de respektive kolonner som beskrevet nedenfor.

Mens protokollen bruger GFP-Cherry donor / acceptorparret, kan den præsenterede tilgang udføres med ethvert andet FRET-par. Den supplerende fil 1 indeholder nærmere oplysninger om cyangule par.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Plasmid konstruktion

  1. Til generering af fusionssonden eGFP-mCherry1 skal du bruge en N1-pattedyrcelleekspressionsvektor (se materialetabellen) med mCherry110 indsat ved hjælp af restriktionsstederne AgeI og BsrGI.
  2. Brug følgende oligonukleotider til at forstærke eGFP11 uden stopkodon som SalI-BamHI-fragment : N-terminal primer 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G 3' og C-terminal primer 5'-AAT ATA TGG ATC CCG CTT GTA CAG CTC GTC GTC CAT GC 3'.
  3. Indsæt dette SalI-BamHI-fragment i multipelkloningsstedet for N1-vektoren for at indføre RNPPV-linker (fem aminosyre) linker mellem det grønne og røde fluorescerende protein.
    BEMÆRK: Denne linker giver en gennemsnitlig FRET-effektivitet for GFP-Cherry donoracceptorparret på ca. 0,25 -0,3 (figur 1A). Valget af stive12 og spiralformede13 linkere af varierende længde til at skalere målte FRET-virkningsgrader er blevet diskuteret andetsteds, men er ikke påkrævet til vores formål med fusionsproteinet. Fremadrettet vil vi for nemheds skyld kalde de fluorescerende proteiner 'GFP' og 'Cherry'.

2. Cellekultur og transfektion

  1. Brug enhver cellelinje, f.eks. NRK-celler, til FRET-eksperimenter i medier, f.eks. Dulbeccos modificerede Eagle's media (DMEM) uden phenolrød, for at reducere baggrundsfluorescens. Af samme grund anbefales brugen af phenolrød fri trypsin.
  2. Når cellerne er 80% sammenflydende, løsnes celler med 1 ml 0,05% trypsin-EDTA, tæller antallet af celler i suspension ved hjælp af et Neubauer-kammer og frø ca. 10.000 celler pr. Brønd i et 8-brønds kammerdækglas; alternativt anvendes fra en sammenflydende cellekultur dyrket i T25-kolbe 1 dråbe cellesuspension fra en 2 ml pipette eller 3 dråber fra en 5 ml cellesuspension fra en sammenflydende kultur dyrket i en T12,5-celle kulturkolbe.
  3. Dyrk celler i 8-brønds kamre (0,8 cm 2 / brønd) med # 1,0 dækglas til fluorescens levende cellemikroskopi ved standard cellekulturbetingelser (37 ° C og 5% CO2).
  4. 24 timer efter plettering transfekteres cellerne ved hjælp af et passende kommercielt tilgængeligt transfektionsmedium (se materialetabellen) med GFP, kirsebær, GFP / kirsebærblanding (1: 1 blanding, dvs. 0,8 μg og 0,8 μg GFP og kirsebærplasmid-DNA) og GFP-kirsebærkimæren.
    1. Til transfektion anvendes 5 μL transfektionsreagens i 45 μL DMEM og 1,6 μg plasmid-DNA. Rør rundt ved forsigtigt at svirpe med mikrocentrifugeglasset.
    2. Efter 15 minutters inkubation af blandingen ved stuetemperatur tilsættes 1-2 μL transfektionsreagensblandingen til hvert hul i 8-brøndens kammerglas. Sæt det kammerede dækglas tilbage til inkubatoren.
  5. Lad 20 timer efter transfektion gå før levende cellebilleddannelse for at muliggøre korrekt fluorescerende proteinekspression, foldning og modning, især af den røde fluorofor.

3. FRET-billeddannelse

  1. Billede af transfekterede celler i et befugtet og opvarmet miljøkammer ved 37 °C. For at buffere cellemediet ved fysiologisk pH skal du bruge CO 2 -gas indstillet til 5% flow eller tilføje 20 mM HEPES for at gøre cellemediet CO2 -uafhængigt.
  2. Brug et konfokal laserscanningsmikroskop. Indstil excitation og emission som følger for at optimere signalet og minimere krydstale.
    1. Brug argonionlaserens 488 nm-linje til at excitere GFP og 561 nm diodepumpet solid state-laser (eller 543 nm Helium Neon-laser, afhængigt af tilgængelige laserlinjer) til at begejstre kirsebær.
    2. Indstil følgende i softwaren til et kommercielt konfokalmikroskop. Indstil Dichroic-spejlet til 488/561 ved at klikke på knappen ved hjælp af rullemenuen. Opsaml fluorescens ved hjælp af 488 nm laserlys til excitation i kanal 1 gennem et emissionsbånd på 505 - 530 nm (eller 505 - 550 nm) og i kanal 2 med et langpasfilter >585 nm og brug 561 nm laserlys til excitation i kanal 3 med et langpasfilter > 585 nm (indtast bølgelængder). Der kan også anvendes båndpasfiltre f.eks. 590 - 650 nm eller lignende, som har den fordel, at Raman-spredning udelukkes.
  3. Excite med de to lasere sekventielt og indstil billeddannelsestilstanden til Skift efter hver linje, så excitationen af 512 x 512 pixels billedet skifter efter hver linje (og ikke efter hver ramme, hvilket ville ophæve evnen til at detektere FRET på grund af diffusion af de mærkede proteiner, mens du optager billederne med forskellige excitationer; klik på knappen).
  4. Opret en mini-tidsserie på tre billeder med klik på en knap for at registrere, om der forekommer betydelig fotoblegning, og potentielt reducere lasereffekten. Fotoblegning på mindre end 1% er optimal. Høj laserintensitet kan også føre til absorptionsmætning, hvilket reducerer den tilsyneladende FRET-effektivitet14. Lasereffekt, op til 10-20 μW målt ved objektivobjektivet er sikkert at bruge.
  5. For det første billedceller, der udtrykker GFP-Cherry-fusionskonstruktionen. Indstil de parametre, der definerer den tidsintegrerede laserintensitet pr. pixel i et konfokalbillede, dvs. pixelopholdstiden i mikrosekunder, AOTF-transmissionen (acousto-optical tunable filter) i procent og zoom.
    1. Billedceller ved hjælp af et 63x oliemål og Zoom indstillet til 3x. Dette giver tilstrækkelig forstørrelse og opløsning til billedceller i sin helhed. Sigt efter en pixelstørrelse på 70-80 nm.
    2. Indstil Pixel dwell time til 2-4 μs og AOTF transmission for 488-nm og 561-nm laser, således at billeder har et godt signal-støj-forhold uden blegning og ingen pixels, der viser fluorescensintensitetsmætning. Det er fordelagtigt at justere lasereffekten på 488 og 561, så signalniveauerne i kanal 1 og kanal 3 er ens.
    3. Indstil Photomultiplier-forstærkningen (gennemsnitstilstand) til 600-800.
  6. Billede med disse indstillinger 15-20 celler, der udtrykker GFP-Cherry fusionsproteinet. 15-20 celler giver god statistik, samtidig med at den samlede tid for en FRET-målesession begrænses til et par timer for at sikre stabiliteten af den mikroskopiske opsætning.
  7. Billede med de samme indstillinger celler, der udtrykker GFP, kirsebær, GFP og kirsebær og ikke-transfekterede celler. Søg efter at udtrykke celler i henholdsvis den grønne kanal eller den røde kanal.
  8. Derefter billede 15-20 celler, der co-udtrykker proteiner af interesse koblet til henholdsvis GFP og kirsebær. Søgning efter ekspressive celler, undgå lang eksponering af cellerne for ikke at blege de fluorescerende proteiner. Kirsebær har en lavere fotostabilitet end GFP, og blegning af kirsebær, acceptoren, kompromitterer FRET-analyse.
    BEMÆRK: Absorptions- og emissionsspektre for GFP og kirsebær er vist i supplerende figur 1. Efter måling i 5-6 timer anbefales det at gentage billeddannelsen af nogle få celler, der udtrykker GFP-Cherry-kimæren i slutningen af billeddannelsessessionen for at dokumentere, at opsætningen forblev stabil, og at detekterede FRET-effektivitetsgevinster af GFP-Cherry-fusionsproteinet ikke ændrede sig signifikant i løbet af en billeddannelsessession.

4. Billedanalyse til påvisning af absolut FRET-effektivitet ved hjælp af donorslukning og sensibiliseret emission

BEMÆRK: Her gives en praktisk trin-for-trin vejledning i, hvordan man bestemmer FRET-effektivitet ved brug af det vedhæftede regneark (supplerende fil 2). Teori og afledning af de præsenterede ligninger kan findes detaljeret i tidligere publikationer 4,15,16,17. Med de beskrevne indstillinger indsamles følgende fluorescensintensiteter.

  1. Mål donorsignalet I 1 i kanal 1, donorkanalen, med 488 nm excitation og et emissionsbånd på 505-530 nm.
    Equation 2
    hvor ID er det uudslukkede donorsignal i kanal 1, der ville blive målt uden en acceptor, er den gennemsnitlige FRET-effektivitet, og B 1 det gennemsnitlige baggrundssignal i kanal 1.
  2. Mål acceptorsignalet I 3 i kanal 3, acceptorkanalen, med 561 nm excitation og emission ved >585 nm.
    Equation 3
    hvor IA er acceptorsignalet og B 3 baggrunden i kanal 3.
  3. Mål FRET-signalet i kanal 2, overførselskanalen, med 488 nm excitation og emission ved >585 nm.
    Equation 4
    Hvor signalet i kanal 2 er summen af fire forskellige komponenter: (i) I D(1 - E)S 1 er spektralafsmitningen fra det slukkede donorsignal til detektionskanalen >585 (med krydstalefaktoren S 1), (ii) IA S 2 er acceptorsignalet fra den direkte excitation med 488 nm lys (med krydstalefaktoren S2), iii) IDEα er FRET's sensibiliserede emission af acceptoren fra det exciterede donormolekyle (α beskrives nærmere i 4.8.-4.10.), og iv) B2 er baggrundssignalet.
  4. Mål gennemsnitlige baggrundsintensiteter i kanal 1, 2, 3 i ikke-transfekterede eller mock-transfekterede celler; Begge er fint med ubetydelig forskel. For alle cellemålinger skal du bruge frihåndsværktøjet til at afgrænse interesseområder og undgå perinukleære vesikler med øget autofluorescens. Det er vigtigt at undgå signifikant autofluorescens fra disse perinukleære vesikler.
    1. Indtast målene i kolonnerne X, Y og Z i det medfølgende regneark. Gennemsnitlige baggrundsintensiteter i de 3 kanaler indtastes i A2, B2 og C2 i Excel-regnearket (Supplerende fil 2).
  5. Mål gennemsnitsintensiteter i kanal 1, 2, 3 af celler, der udtrykker GFP eller kirsebær alene, og indtast målingerne i kolonne C, D, E og N, O, P. De respektive baggrundsintensiteter trækkes fra (i F, G, H og Q, R, S).
  6. For at beregne E, FRET-effektiviteten, bestemmes krydstalefaktorerne S 1 og S2. Den spektrale krydstalefaktor S1 beregnes ud fra celler, der kun udtrykker GFP
    Equation 6
    i kolonne I. Indtast middelværdien for S1 i celle D2 i Excel-regnearket.
  7. Beregn spektral krydstalefaktor S2 fra celler, der kun udtrykker kirsebær
    Equation 7
    i kolonne T. Indtast middelværdien for S2 i celle E2 i Excel-regnearket.
  8. Sørg for, at α faktoren relaterer signalet fra et givet antal exciterede GFP-molekyler i kanal 1 til signalet fra et lige antal exciterede kirsebærmolekyler i kanal 2 og defineres ved
    Equation 8   Equation 13
    hvor QA og QD er fluorescenskvanteudbytterne for kirsebær og GFP ηA og ηD detektionseffektiviteten af acceptor- og donorfluorescens i henholdsvis kanal 2 og 1.
    BEMÆRK: Den α faktor kunne bestemmes ud fra to stikprøver, der udtrykte kendte absolutte mængder GFP og kirsebær. Det er imidlertid umuligt at kende den nøjagtige mængde GFP og kirsebær udtrykt i en celle. Derfor beregnede vi faktoren ved hjælp af celler, der udtrykker GFP-Cherry fusionsproteinet. Her, mens den absolutte mængde stadig er ukendt, er forholdet mellem donor- og acceptormolekyler kendt for at være en.
  9. Mål gennemsnitsintensiteter i kanal 1, 2, 3 af celler, der udtrykker GFP-Cherry fusionsproteinet, og indtast målingerne i kolonnerne AE, AF, AG. Baggrundsintensiteter trækkes fra (i AH, AI, AJ).
  10. Den α faktor (AJ-kolonne) beregnes ud fra fluorescensintensiteterne i kanal 1, 2 og 3 af GFP-Cherry-fusionsproteinet som følger:
    Equation 10
  11. Baggrundskorrigerede intensiteter målt i henholdsvis kanal 1 (I 1 - B 1), 2 (I 2 - B 2) og 3 (I 3 - B3) måles ved hjælp af GFP-Cherry kimæren. Den spektrale krydstalefaktor S1 blev bestemt udelukkende ved hjælp af celler, der udtrykte GFP (se 4.7.). εD og ε A er udryddelseskoefficienterne for GFP, donoren og Cherry, acceptoren, ved 488 nm og kan bestemmes ud fra litteraturen (ε GFP = 53.000 M-1 cm-1)18 og absorptionskurven for kirsebær (εCherry ≈ 5560 M-1cm 1). Forholdet Equation 11 er indtastet i celle G2 i Excel-regnearket. Indtast middelværdien for α faktoren i J2.
  12. Den fastsatte α faktor anvendes til beregning af FRET-effektiviteten, E, som følger (kolonne AK):
    Equation 12
  13. Alternativt kan du bestemme FRET-effektivitet, E, for de negative kontroller, dvs. co-ekspressionen af GFP og Cherry og ekspressionen af GFP alene ved at tilføje målingerne af kanal 1, 2 og 3 i excel-arket i kolonne AD, AE og AF under GFP-Cherry fusionsproteinmålingerne. Bestem FRET-effektivitet mellem GFP og kirsebærmærkede proteiner af interesse på samme måde.
  14. Bestem den uudslukkede donorintensitet, I D som (I 1 - B 1) / (1 - E) og acceptorintensiteten som I A = I 3 - B3; Disse værdier er proportionale med ekspressionsniveauerne for de mærkede proteiner.
  15. Det korrigerede acceptor-til-donor-intensitetsforhold (Q) for GFP-Cherry-fusionsproteinet bestemmes som følger (kolonne AL):
    Equation 13
  16. For andre co-transfekterede celler beregnes acceptor-til-donor-molekylforholdet N A/ND på følgende måde:
    Equation 14
    BEMÆRK: Begrundelsen for at bestemme N A / N D-forholdet og plotte den gennemsnitlige cellulære FRET-effektivitet E versus N A / ND er, at et donormolekyle kan overføre energi til flere acceptorer, mens et acceptormolekyle kun kan modtage energi fra en donor ad et givet tidspunkt. Selvom kun en acceptor kan interagere med en donor på grund af interaktionens støkiometri, forventes en stigning i acceptorkoncentrationen at øge fraktionen af donorer i kompleks med acceptoren på grund af loven om massehandling. For et fast (eller snævert udvalg af) donorudtryk bør FRET-effektiviteten således stige med stigende N A/ND. Ved afbildning af FRET-effektiviteten E versus N A/N D for samekspression af GFP og kirsebær, dvs. den negative sonde, bør en stigning i N A/N D imidlertid ikke resultere i en stigning i FRET-effektiviteten (i det mindste ved tilstrækkeligt lave acceptorkoncentrationer, hvor tilfældig FRET på grund af acceptorfarvestoffers nærhed til donorfarvestoffer ikke forekommer).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 viser billederne opnået i henholdsvis donorkanalen, kanal 1 (488, 505-530 nm), overførselskanalen, kanal 2 (488, >585 nm) og acceptorkanalen, kanal 3 (561, >585 nm). Repræsentative billeder af celler, der kun udtrykker GFP, kun kirsebær, der udtrykker GFP og kirsebær og udtrykker GFP-Cherry-fusionsproteinet. De gennemsnitlige cellulære FRET-effektivitetsgevinster beregnet i NRK-celler, der udtrykker GFP-Cherry-fusionsprotein (positiv kontrol, figur 2A), og dem, der samtidig udtrykker GFP-Cherry (negativ kontrol, figur 2B), afbildes i forhold til acceptor-til-donor-forholdets intensitetsforhold (Q) eller molekylforholdet N A/ND i hver celle. Figur 2C illustrerer et eksempel på, hvordan man skitserer en region af interesse og undgår perinukleære vesikler med høj autofluorescens.

Den præsenterede algoritme kan bruges til at kvantificere FRET-effektivitet i enhver region af interesse, herunder kvantificering i hver pixel af billedet i overførselskanalen. Figur 2D viser normaliserede pixel-for-pixel FRET-billeder af celler, der udtrykker GFP-Cherry-fusionsproteinet, co-udtrykker GFP og Cherry som negativ kontrol og udtrykker receptorunderenheder af Ashwell-Morell-receptoren. Rottevarianten af denne receptor, rotteleverlektin (RHL1 og RHL2), er et to-underenhedsreceptorsystem, der vides at hetero-oligomerisere. Alle FRET-effektivitetsgevinster blev normaliseret til GFP-Cherry-fusionsproteinet. Vi mærkede RHL1 og 2 med GFP og Cherry på den cytoplasmatiske side af plasmamembranen. Billedet viser forskellige FRET-værdier ved plasmamembranen sammenlignet med intracellulære vesikler. Sletning af stilkdomænet RHL1 (GFP-RHL1Δstalk), som menes at formidle den tætte interaktion mellem de to underenheder, reducerer den detekterede FRET-effektivitet. I figur 2E afbildes den gennemsnitlige cellulære FRET-effektivitet af celler, der udtrykker GFP-RHL1 og Cherry-RHL2, og GFP-RHL1Δstalk og Cherry-RHL2 i forhold til acceptor-til-donor-molekylforholdet (N A/ND). For yderligere FRET-analyser af dette receptorsystem henvises til en tidligere publikation5.

Figure 1
Figur 1: Repræsentative billeder af celler, der udtrykker fluorescerende proteiner. Celler, der kun udtrykker GFP (A), kun kirsebær (B), GFP og kirsebær co-ekspression (C) og GFP-Cherry fusionsprotein (D). Billeder i henholdsvis kanal 1 (488, 505-530 nm), kanal 2 (488, >585 nm) og kanal 3 (561, >585 nm). Billeder blev opnået med 63x oliemål og zoom indstillet til 3x. Skalabjælke: 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Kvantificering af FRET-billeder. Gennemsnitlig cellulær FRET-effektivitet for celler, der udtrykker GFP-Cherry-fusionsproteinet plottet versus acceptor-til-donor-intensitetsforholdet (Q) (A) og versus acceptor-til-donor-molekylforholdet (N, A/N,D) for celler, der samtidig udtrykker GFP og kirsebær (B). Åben cirkel tyk linje repræsenterer enkeltcelle, der udtrykker GFP-kirsebærfusionsprotein. Åben cirkel tynd linje repræsenterer en celle, der co-udtrykker GFP og kirsebær. Bemærk, at ved højere N A / N D-forhold brøkdelen af det nyttige signal bliver den sensibiliserede emission (I DEα) i overførselskanalen mindre og mindre i forhold til acceptorens direkte excitation (IA S2). Dette resulterer i en større fejl i bestemmelsen af E. Pixel-for-pixel FRET-billeder beregnet ved hjælp af den præsenterede algoritme (C). Dette panel illustrerer en celle, der co-udtrykker GFP og Cherry, den negative kontrol, i donorkanalen, overførselskanalen og acceptorkanalen. Det viser også en mulig oversigt over en region af interesse, der undgår perinukleære vesikler med høj autofluorescens, hvilket kan påvirke FRET-beregningens præcision negativt. (D) Alle FRET-effektivitetsgevinster blev normaliseret til GFP-Cherry-fusionsproteinet. Fra venstre mod højre, GFP-Cherry fusionsprotein (positiv kontrol), GFP Cherry co-ekspression (negativ kontrol), GFP-RHL1 og Cherry-RHL2 og GFP-RHL1Δstalk og Cherry-RHL2. Skalabjælke: 10 μm. Farvekodet skalabjælke: normaliseret gennemsnitlig FRET-effektivitet (normaliseret til middelværdien af den positive kontrol, GFP-Cherry-fusionsproteinet). (E) Dette panel viser den gennemsnitlige cellulære FRET-effektivitet for celler, der udtrykker GFP-RHL1 og Cherry-RHL2 samt GFP-RHL1Δstalk og Cherry-RHL2 plottet versus acceptor-til-donor-molekylforholdet (N A/ND). Lukket grå cirkel repræsenterer en enkelt celle, der udtrykker GFP-RHL1 og Cherry-RHL2. Lukket sort cirkel repræsenterer en celle, der udtrykker GFP-RHL1Δstilk og kirsebær-RHL2. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende fil 1: Algoritme for andre donoracceptorpar. Algoritme til andre donoracceptorpar såsom forskellige versioner af cyan (ECFP, CyPet, mTFP1, Cerulean, mTurquoise2) og gule (EYFP, Citrin, Venus, SYFP2, YPet) fluorescerende proteiner. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2: Regneark med den præsenterede FRET-algoritme og anvendelse af GFP-Cherry-fusionsproteinet til kvantificering af FRET ved sensibiliseret emission af acceptoren og donorslukning. Cellerne A2, B2, C2: Gennemsnitlige baggrundssignaler (B 1, B 2, B 3) i henholdsvis kanal 1, 2 og 3. Cellerne D2 og E2: Middelværdier for krydstalefaktorerne S 1 og S 2. Celle G2: Værdi for udryddelseskoefficientforhold Equation 11. Celle I1 og I2: Udryddelseskoefficienter for GFP og kirsebær ved 488 nm laserlys. Celle J2: Middelværdi for faktor. Kolonne C (C5 og op): målt fluorescensintensitet af en celle, der udtrykker GFP i kanal 1. Kolonne D (D5 og op): målt fluorescensintensitet af en celle, der udtrykker GFP i kanal 2. Kolonne E (E5 og opefter): målt fluorescensintensitet af en celle, der udtrykker GFP i kanal 3. Kolonne F, G og H (henholdsvis F5, G5, H5 og op): målte fluorescensintensiteter fratrukket gennemsnitlige baggrundsintensiteter i alle 3 kanaler. Kolonne I (I5 og opefter): Beregnet krydstalefaktor S1. Kolonne M (M5 og op): målt fluorescensintensitet af en celle, der udtrykker kirsebær i kanal 1. Kolonne N (N5 og op): målt fluorescensintensitet af en celle, der udtrykker kirsebær i kanal 2. Kolonne O (O5 og op): målt fluorescensintensitet af en celle, der udtrykker kirsebær i kanal 3. Kolonne P, Q og R (henholdsvis P5, Q5, R5 og op): målte fluorescensintensiteter fratrukket gennemsnitlige baggrundsintensiteter i alle 3 kanaler. Kolonne S (S5 og op): Beregnet krydstalefaktor S2. Kolonne W (W5 og op): målt fluorescensintensitet af en ikke- eller mock-transfekteret celle i kanal 1. Kolonne X (X5 og op): målt fluorescensintensitet af en ikke- eller mock-transfekteret celle i kanal 2. Kolonne Y (Y5 og op): målt fluorescensintensitet af en ikke- eller mock-transfekteret celle i kanal 3.Kolonne AD (AD5 og op): målt fluorescensintensitet af en celle, der udtrykker GFP-Cherry-fusionsproteinet (eller co-udtrykker GFP og kirsebær eller ethvert proteinpar af interesse) i kanal 1. Kolonne AE (AE5 og opefter): målt fluorescensintensitet af en celle, der udtrykker GFP-Cherry-fusionsproteinet (eller co-ekspression af GFP og kirsebær eller ethvert proteinpar af interesse) i kanal 2. Kolonne AF (AF5 og op): målt fluorescensintensitet af en celle, der udtrykker GFP-Cherry-fusionsproteinet (eller co-udtrykker GFP og kirsebær eller ethvert proteinpar af interesse) i kanal 3. Kolonne AG, AH og AI (henholdsvis AG5, AH5, AI5 og op): målte fluorescensintensiteter fratrukket gennemsnitlige baggrundsintensiteter i alle 3 kanaler. Kolonne AJ (AJ5 og op): Beregnet α faktor. Kolonne AK (AK 5 og opefter): Beregnet gennemsnitlig FRET-effektivitet E. Kolonne AL (AL5 og opefter): beregnet korrigeret acceptor-til-donor-intensitetsforhold (Q). Eksempler på beregnede parametre fra et FRET-eksperiment udtrykt som middel- og standardafvigelse: S1 = 0,2232 ± 0,0060. S2 = 0,2039 ± 0,0074. α = 1.9463 ± 0.1409. E = 0,2713 ± 0,0220. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 1: GFP og absorptions- og emissionsspektre for kirsebær. Normaliseret absorption og fluorescensemissionsspektre af eGFP og mCherry. Excitationslaserlinjerne (488 og 543 nm) og filtertransmissionerne, der anvendes til donorkanalen (ch1: 505-530 nm) og overførsels- / acceptorkanalerne (ch2 & 3: >585 nm) i det konfokale mikroskop, er markeret med skygge. Til excitation af acceptoren kan 561 eller 590 nm laserlinjer også anvendes. Kildedatabase for fluorescerende protein (fpbase.org). Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den præsenterede protokol beskriver brugen af den genetisk koblede en-til-en fluorescerende proteinkalibreringssonde til kvantificering af FRET ved påvisning af sensibiliseret emission af acceptoren og slukning af donormolekylet ved konfokal mikroskopi. Denne metode kan anvendes til at vurdere proteininteraktioner i den fysiologiske kontekst af den levende celle i forskellige subcellulære rum. Den rumlige opløsning kan forbedres yderligere ved at anvende den præsenterede algoritme til at beregne FRET-effektivitet i hver pixel i et billede (pixel-for-pixel FRET). Intensitetsbaseret bestemmelse af absolutte FRET-effektivitetsgevinster kræver bestemmelse af krydstalen, her kvantificeret med S-faktorerne , og detektionseffektiviteten af donor- og acceptormolekyler ved den givne mikroskopiske opsætning, kvantificeret ved α-faktoren. Her leveres en protokol, der tillader kvantificering af både krydstale og detektionseffektivitet. Direkte kobling af fluorescerende proteins genetiske information garanterer equimolær ekspression i levende celler og muliggør derved bestemmelse af den α faktor. Kendskab til α faktor er igen en forudsætning for kvantificering af FRET-effektiviteten i levende celler. Kritiske trin i den medfølgende protokol er korrekt kloning af den direkte koblede fluorescerende proteinkimær, tilstrækkelig tid efter transfektion til at muliggøre fluorescerende proteinmodning, anvendelse af fluorescerende proteiner i et lignende cellulært mikromiljø, f.eks. fluorescerende proteiner i cytoplasma og på cytoplasmatisk side af plasmamembranen, og en stabil mikroskopopsætning.

Eksperimentel opsætning og algoritme, der præsenteres her, er designet til GFP-Cherry FRET-parret. Vi leverer i den supplerende fil 1 algoritmen til forskellige versioner af cyan (ECFP, CyPet, mTFP1, Cerulean, mTurquoise2) og gule fluorescerende proteiner (EYFP, Citrin, Venus, SYFP2, YPet). Fordelen ved disse fluorescerende proteinpar er en større spektral overlapning mellem cyanens emissionsspektrum og absorptionsspektret for det gule protein (sammenlignet med GFP-kirsebær), hvilket resulterer i noget højereR0-værdier og større FRET-effektiviteter. Af samme grund er antallet af ikke ubetydelige krydstalefaktorer og deres størrelse imidlertid også større (se supplerende tekst).

Begrænsninger af kvantitativ mikroskopisk ratiometrisk FRET i levende celler skal overvejes og diskuteres. Forudsætningen for at bruge FRET til påvisning af molekylære interaktioner er anvendelsen af fluorescerende tags. Vores protokol bruger genetisk kodede fluorescerende proteiner. Da disse fluorescerende proteiner kan være sammenlignelige i størrelse (27 kDa) med det mærkede protein af interesse, kan de ændre lokalisering og funktion af proteinet af interesse. Derfor bør både lokalisering og funktionalitet af ethvert mærket protein af interesse testes og sammenlignes med det endogene umærkede protein. Et andet kritisk punkt at huske på er den endogene umærkede pulje af proteinet af interesse. Interaktionerne mellem de mærkede med umærkede endogene proteiner vil reducere FRET-signalet. Ideelt set er alle proteiner af interesse mærket. Dette kan opnås ved at bruge celler, der ikke har proteinet af interesse endogent (som i eksemplet i figur 2C og 2E ), ved hjælp af celler afledt af knock-in-mus, ved hjælp af CRISPR-modificerede celler osv. Selv ved brug af pixel-for-pixel FRET vil signalet fra donor- og acceptormolekyler blive gennemsnittet over et diffraktionsbegrænset sted, opløsningsgrænsen for et konfokalmikroskop. Derfor er det umuligt at løse forskellige donorpopulationer inden for et diffraktionsbegrænset sted. Der kan være donorer uden acceptor eller donorer med flere acceptorer, der bidrager til det gennemsnitlige FRET-signal. Dissekering af forskellige molekylære subpopulationer ved hjælp af FRET kræver fluorescenslivstidsbilleddannelse22. Et andet problem, især ved høje ekspressionsniveauer, er den såkaldte tilfældige FRET mellem fluoroforer i umiddelbar nærhed uden underliggende interaktion mellem proteinerne af interesse23. Denne tilfældige FRET kan være signifikant i plasmamembranen givet 2D-indeslutning af membranproteinerne sammenlignet med frit diffusive cytoplasmatiske proteiner. Derfor bør kontroleksperimenter altid udføres, såsom at slette domæner, der medierer den formodede interaktion mellem molekyler og teste for reduktion i det detekterede FRET-signal.

Usikkerheden om nøjagtige støkiometri af interagerende proteiner i levende celler begrænser brugen af FRET som spektroskopisk lineal til vurdering af molekylære afstande mellem proteiner i levende celler. Selv i tilfælde af en streng en-til-en-interaktion kan (i) fleksibiliteten af linkeren, der fastgør det fluorescerende protein til proteinet af interesse, samt (ii) manglen på viden om den relative orientering af farvestoffernes dipolmomenter (bestemmelse af den såkaldte κ2-faktor ) forvirre nøjagtige afstandsmålinger. Undersøgelser af acceptorfusionskonstruktioner med stive bindere af forskellig længde, der adskiller de to fluoroforer og udviser forskellige FRET-effektiviteter, er blevet rapporteret andetsteds12. Omvendt er vurdering af støkiometri med FRET-målinger i levende celler kompleks, men det er muligt ved hjælp af den præsenterede ratiometriske FRET-kvantificering. Den tilbøjelige læser kan henvises til tidligere arbejde, der beskriver en gennemførlig tilgang5.

Sammenfattende tillader den kvantitative FRET-tilgang, der præsenteres her, påvisning af (i) proteininteraktioner i den levende celles fysiologiske kontekst, (ii) ændringer i proteininteraktioner over tid og (iii) forskelle i interaktioner i forskellige subcellulære rum ned til pixel-for-pixel-niveauet af et konfokal billede og (iv) afhængigheden af det detekterede FRET-signal af det molekylære acceptor-til-donor-forhold udtrykt i en levende celle.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Neuroscience Imaging Service ved Stanford University School of Medicine for at levere udstyr og plads til dette projekt. Denne forskning blev støttet af intramural finansiering af Stanford Cancer Institute og Gynecologic Oncology Division Stanford samt GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107 fra National Research, Development and Innovation Office, Ungarn.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x) Thermo Fisher Scientific 15400054
Clontech mCherry N1 vector Addgene 3553
DMEM without phenol red Thermo Fisher Scientific 11054020
Fugene 6 Promega E2691
HEPES Thermo Fisher Scientific 15630080
LabTek 8-well chambers #1.0 Thermo Fisher Scientific 12565470
L-Glutamine (200 mM) Thermo Fisher Scientific 25030081

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Förster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Annal der Physik. 437, 55-75 (1948).
  2. Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Luminescence digital imaging microscopy. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).
  3. Mekler, V. M. A photochemical technique to enhance sensitivity of detection of fluorescence resonance energy transfer. Photochemistry and Photobiology. 59, 615-620 (1994).
  4. Vamosi, G., et al. Conformation of the c-Fos/c-Jun complex in vivo: A combined FRET, FCCS, and MD-modeling study. Biophysical Journal. 94 (7), 2859-2868 (2008).
  5. Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (44), 2989-2997 (2012).
  6. van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission. Biophysical Journal. 86 (4), 2517-2529 (2004).
  7. Muller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. Quantification of Forster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells. Frontiers in Plant Sciences. 4, 413 (2013).
  8. Gates, E. M., LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. Improving quality, reproducibility, and usability of FRET-based tension sensors. Cytometry Part A. 95 (2), 201-213 (2019).
  9. Menaesse, A., et al. Simplified instrument calibration for wide-field fluorescence resonance energy transfer (FRET) measured by the sensitized emission method. Cytometry Part A. , 24194 (2020).
  10. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  11. Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). Gene. 173, 1 Spec No 33-38 (1996).
  12. Nagy, P., et al. Novel calibration method for flow cytometric fluorescence resonance energy transfer measurements between visible fluorescent proteins. Cytometry Part A. 67 (2), 86-96 (2005).
  13. Arai, R., Ueda, H., Kitayama, A., Kamiya, N., Nagamune, T. Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein. Protein Engineering. 14 (8), 529-532 (2001).
  14. Szendi-Szatmari, T., Szabo, A., Szollosi, J., Nagy, P. Reducing the detrimental effects of saturation phenomena in FRET microscopy. Analytical Chemistry. 91 (9), 6378-6382 (2019).
  15. Tron, L., et al. Flow cytometric measurement of fluorescence resonance energy transfer on cell surfaces. Quantitative evaluation of the transfer efficiency on a cell-by-cell basis. Biophysical Journal. 45 (5), 939-946 (1984).
  16. Sebestyen, Z., et al. Long wavelength fluorophores and cell-by-cell correction for autofluorescence significantly improves the accuracy of flow cytometric energy transfer measurements on a dual-laser benchtop flow cytometer. Cytometry. 48 (3), 124-135 (2002).
  17. Szaloki, N., et al. High throughput FRET analysis of protein-protein interactions by slide-based imaging laser scanning cytometry. Cytometry Part A. 83 (9), 818-829 (2013).
  18. McRae, S. R., Brown, C. L., Bushell, G. R. Rapid purification of EGFP, EYFP, and ECFP with high yield and purity. Protein Expression and Purification. 41 (1), 121-127 (2005).
  19. Kremers, G. J., Goedhart, J., van Munster, E. B., Gadella, T. W. Cyan and yellow super fluorescent proteins with improved brightness, protein folding, and FRET Forster radius. Biochemistry. 45 (21), 6570-6580 (2006).
  20. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors (Basel). 16 (9), (2016).
  21. Scott, B. L., Hoppe, A. D. Optimizing fluorescent protein trios for 3-Way FRET imaging of protein interactions in living cells. Science Reports. 5, 10270 (2015).
  22. Chen, Y. C., Spring, B. Q., Clegg, R. M. Fluorescence lifetime imaging comes of age how to do it and how to interpret it. Methods Molecular Biology. 875, 1-22 (2012).
  23. King, C., Sarabipour, S., Byrne, P., Leahy, D. J., Hristova, K. The FRET signatures of noninteracting proteins in membranes: Simulations and experiments. Biophysical Journal. 106 (6), 1309-1317 (2014).

Tags

Biologi udgave 170 levende cellebilleddannelse FRET kvantitativ fluorescensmikroskopi fluorofor proteininteraktion sensibiliseret emission

Erratum

Formal Correction: Erratum: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission
Posted by JoVE Editors on 03/14/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission. The Authors section was updated from:

György Vámosi1
Sarah Miller2
Molika Sinha2
Gabor Mocsár1
Malte Renz2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

to:

György Vámosi1
Sarah Miller2
Molika Sinha2
Maria Kristha Fernandez2
Gabor Mocsár1
Malte Renz2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

Vurdering af proteininteraktioner i levende celler med FRET-sensibiliseret emission
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vámosi, G., Miller, S., Sinha,… More

Vámosi, G., Miller, S., Sinha, M., Fernandez, M. K., Mocsár, G., Renz, M. Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission. J. Vis. Exp. (170), e62241, doi:10.3791/62241 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter