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Biology

Valutazione delle interazioni proteiche nelle cellule vive con emissione sensibilizzata alla FRET

Published: April 22, 2021 doi: 10.3791/62241
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1, 2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen, 2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Summary

Il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) tra due molecole di fluorofori può essere utilizzato per studiare le interazioni proteiche nella cellula vivente. Qui, viene fornito un protocollo su come misurare la FRET nelle cellule vive rilevando l'emissione sensibilizzata dell'accettore e la tempra della molecola donatrice utilizzando la microscopia a scansione laser confocale.

Abstract

Il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) è il trasferimento di energia senza radiazioni da un donatore eccitato a una molecola accettore e dipende dalla distanza e dall'orientamento delle molecole, nonché dall'entità della sovrapposizione tra gli spettri di emissione del donatore e di assorbimento dell'accettore. FRET permette di studiare l'interazione delle proteine nella cellula vivente nel tempo e in diversi compartimenti subcellulari. In letteratura sono stati descritti diversi algoritmi basati sull'intensità per misurare la FRET utilizzando la microscopia. Qui vengono forniti un protocollo e un algoritmo per quantificare l'efficienza FRET sulla base della misurazione sia dell'emissione sensibilizzata dell'accettore che della tempra della molecola donatrice. La quantificazione della FRET raziometrica nella cellula vivente richiede non solo la determinazione della diafonia (spill-over spettrale, o bleed-through) delle proteine fluorescenti, ma anche l'efficienza di rilevazione della configurazione microscopica. Il protocollo fornito qui descrive come valutare questi parametri critici.

Introduction

L'analisi basata sulla microscopia del trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) consente di valutare le interazioni tra proteine in cellule vive. Fornisce informazioni spaziali e temporali, comprese informazioni su dove nella cellula e in quale compartimento subcellulare avviene l'interazione e se questa interazione cambia nel tempo.

Theodor Förster pose le basi teoriche della FRET nel 19481. La FRET è un trasferimento di energia senza radiazioni da un donatore eccitato a una molecola accettore e dipende dalla distanza delle molecole e dall'orientamento relativo dei loro dipoli di transizione, nonché dalla sovrapposizione tra gli spettri di emissione del donatore e di assorbimento dell'accettore. La velocità di trasferimento di energia è inversamente proporzionale alla sesta potenza della distanza donatore-accettore. Pertanto, FRET può essere utilizzato per misurare la prossimità molecolare nell'intervallo 1-10 nm.

La FRET compete con altri processi di deeccitazione della molecola donatrice e provoca il cosiddetto donor-quenching e l'emissione sensibilizzata dell'accettore. L'estinzione del donatore è una riduzione del numero di fotoni donatori emessi, mentre l'emissione sensibilizzata è un aumento dei fotoni accettori emessi. Molte analisi microscopiche FRET utilizzano misure di intensità di fluorescenza, tra cui il fotosbiancamento dell'accettore 2, il fotosbiancamento del donatore2 o il fotosbiancamento dell'accettore3 sensibilizzato al FRET.

Qui, un protocollo sperimentale passo-passo e un algoritmo matematico sono presentati per quantificare FRET utilizzando la tempra del donatore e l'emissione sensibilizzata all'accettore4,5, un metodo spesso indicato come FRET raziometrico. Sono stati pubblicati molti protocolli su come approssimare l'emissione sensibilizzata, pochi hanno quantificato l'efficienza assoluta FRET 6,7,8,9. La quantificazione delle efficienze FRET nella cellula vivente richiede la determinazione (i) della diafonia (spill-over spettrale o sanguinamento) delle proteine fluorescenti e, inoltre, (ii) dell'efficienza di rilevazione della configurazione microscopica. Mentre la diafonia può essere valutata mediante imaging delle cellule che esprimono solo uno dei fluorofori, la valutazione dell'efficienza di rilevazione relativa della fluorescenza del donatore e dell'accettore è più complicata. Richiede la conoscenza almeno del rapporto tra il numero di molecole donatrici e accettori che danno origine ai segnali misurati. Il numero di fluorofori espressi nelle cellule vive varia, tuttavia, da cellula a cellula ed è sconosciuto. Il cosiddetto fattore α caratterizza le potenze del segnale relative da una singola molecola eccitata del donatore e dell'accettore. La conoscenza del fattore è un prerequisito per le misure quantitative raziometriche FRET in campioni con rapporti molecola accettore-donatore variabili come riscontrato durante l'imaging di cellule vive con proteine fluorescenti. L'utilizzo di una proteina di fusione donatore-accettore 1 a 1 come sonda di calibrazione consente la determinazione del fattore α e serve anche come controllo positivo. Questa sonda geneticamente accoppiata è espressa dalle cellule in quantità totali sconosciute ma in una quantità relativa fissa e nota di uno-a-uno. Il seguente protocollo spiega come costruire la sonda 1-to-1 e come utilizzarla per quantificare l'efficienza del FRET. Un foglio di calcolo che include tutte le formule può essere trovato nel supplemento e può essere utilizzato dai lettori per inserire le proprie misure nelle rispettive colonne come descritto di seguito.

Mentre il protocollo utilizza la coppia donatore/accettore GFP-Cherry, l'approccio presentato può essere eseguito con qualsiasi altra coppia FRET. Il file supplementare 1 fornisce dettagli sulle coppie ciano-giallo.

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Protocol

1. Costruzione plasmidica

  1. Per generare la sonda di fusione eGFP-mCherry1, utilizzare un vettore di espressione cellulare di mammifero N1 (vedi Tabella dei materiali) con mCherry110 inserito utilizzando i siti di restrizione AgeI e BsrGI.
  2. Utilizzare i seguenti oligonucleotidi per amplificare eGFP11 senza codone di stop come frammento di SalI-BamHI : N-terminale primer 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G 3' e C-terminale primer 5'-AAT ATA TGG ATC CCG CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC 3'.
  3. Inserire questo frammento SalI-BamHI nel sito di clonazione multipla del vettore N1 per introdurre il linker RNPPV (cinque aminoacidi) linker tra la proteina fluorescente verde e rossa.
    NOTA: Questo linker produce un'efficienza media FRET per la coppia donatore-accettore GFP-Cherry di circa 0,25 -0,3 (Figura 1A). La scelta di linker rigidi12 ed elicoidali13 di lunghezza variabile per scalare le efficienze FRET misurate è stata discussa altrove, ma non è richiesta per il nostro scopo della proteina di fusione. Andando avanti per semplicità chiameremo le proteine fluorescenti 'GFP' e 'Cherry'.

2. Coltura cellulare e trasfezione

  1. Utilizzare qualsiasi linea cellulare, ad esempio cellule NRK, per esperimenti FRET in media, ad esempio, il mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM), senza rosso fenolo, per ridurre la fluorescenza di fondo. Per lo stesso motivo, si consiglia l'uso di tripsina libera rosso fenolo.
  2. Una volta che le cellule sono confluenti all'80%, staccare le cellule con 1 ml di tripsina-EDTA allo 0,05%, contare il numero di cellule in sospensione usando una camera Neubauer e seminare circa 10.000 cellule per pozzetto di un vetro di copertura a 8 pozzetti; in alternativa, da una coltura cellulare confluente coltivata in matraccio T25, utilizzare 1 goccia di sospensione cellulare da una pipetta da 2 mL o 3 gocce da una sospensione cellulare da 5 mL da una coltura confluente coltivata in un matraccio di coltura T da 12,5 cellule.
  3. Coltivare cellule in camere a 8 pozzetti (0,8 cm 2 / pozzetto) con vetro di copertura #1.0 per microscopia a cellule vive a fluorescenza in condizioni di coltura cellulare standard (37 ° C e 5% CO2).
  4. 24 ore dopo la placcatura trasfettare le cellule utilizzando un mezzo di trasfezione appropriato disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali), con GFP, Cherry, GFP/ Cherry mix (miscela 1:1, cioè 0,8 μg e 0,8 μg GFP e DNA plasmidico Cherry) e la chimera GFP-Cherry.
    1. Per la trasfezione, utilizzare 5 μL del reagente di trasfezione in 45 μL di DMEM e 1,6 μg di DNA plasmide. Mescolare facendo scorrere delicatamente il tubo della microcentrifuga.
    2. Dopo 15 minuti di incubazione della miscela a temperatura ambiente, aggiungere 1-2 μL della miscela di reagenti di trasfezione a ciascun pozzetto del vetrino della camera a 8 pozzetti. Restituire il vetro di copertura camerato all'incubatore.
  5. Lasciare trascorrere 20 ore dopo la trasfezione prima dell'imaging delle cellule vive, per consentire una corretta espressione, ripiegamento e maturazione delle proteine fluorescenti, in particolare del fluoroforo rosso.

3. Imaging FRET

  1. Immagine di celle trasfettate in una camera ambientale umidificata e riscaldata a 37 °C. Per tamponare i mezzi cellulari a pH fisiologico, utilizzare gas CO 2 impostato sul flusso del 5% o aggiungere 20 mM HEPES per rendere il supporto cellulare CO2-indipendente.
  2. Utilizzare un microscopio a scansione laser confocale. Impostare l'eccitazione e l'emissione come segue per ottimizzare il segnale e ridurre al minimo la diafonia.
    1. Utilizzare la linea a 488 nm del laser agli ioni di argon per eccitare la GFP e il laser a stato solido pompato a diodi da 561 nm (o laser Helium Neon da 543 nm, a seconda delle linee laser disponibili) per eccitare Cherry.
    2. Impostare quanto segue nel software di un microscopio confocale commerciale. Impostate lo specchio Dicroico su 488/561 facendo clic utilizzando il menu a discesa. Raccogliere la fluorescenza utilizzando la luce laser a 488 nm per l'eccitazione nel canale 1 attraverso una banda di emissione di 505 - 530 nm (o 505 - 550 nm) e nel canale 2 con un filtro passa-lungo >585 nm e utilizzare la luce laser a 561 nm per l'eccitazione nel canale 3 con un filtro passa-lungo > 585 nm (tipo in lunghezze d'onda). Possono essere utilizzati anche filtri passa-banda, ad esempio 590 - 650 nm o simili, che hanno il vantaggio di escludere lo scattering Raman.
  3. Eccitare con i due laser in sequenza e impostare la modalità di imaging su Switch dopo ogni riga in modo che l'eccitazione dell'immagine 512 x 512 pixel si alterni dopo ogni linea (e non dopo ogni fotogramma che abbrogherebbe la capacità di rilevare FRET a causa della diffusione delle proteine marcate durante la registrazione delle immagini con eccitazioni diverse; clic del pulsante).
  4. Imposta una mini-serie temporale di tre immagini con clic dei pulsanti per rilevare se si verifica un significativo photobleaching e potenzialmente ridurre la potenza del laser. Il fotosbiancamento inferiore all'1% è ottimale. Un'elevata intensità laser può anche portare alla saturazione dell'assorbimento riducendo l'apparente efficienza FRET14. La potenza del laser, fino a 10-20 μW misurata sulla lente dell'obiettivo, è sicura da usare.
  5. In primo luogo, le cellule dell'immagine che esprimono il costrutto di fusione GFP-Cherry. Impostare i parametri che definiscono l'intensità laser integrata nel tempo per pixel in un'immagine confocale, ovvero il tempo di permanenza del pixel in microsecondi, la trasmissione del filtro acusto-ottico sintonizzabile (AOTF) in percentuale e lo zoom.
    1. Celle immagine con un obiettivo olio 63x e Zoom impostato su 3x. Ciò fornisce un ingrandimento e una risoluzione sufficienti alle celle dell'immagine nella sua interezza. Punta a una dimensione dei pixel di 70-80 nm.
    2. Impostare il tempo di permanenza dei pixel a 2-4 μs e la trasmissione AOTF per il laser a 488 nm e 561 nm in modo tale che le immagini abbiano un buon rapporto segnale-rumore senza sbiancamento e nessun pixel che mostri la saturazione dell'intensità della fluorescenza. È vantaggioso regolare la potenza del laser di 488 e 561 in modo tale che i livelli di segnale nel canale 1 e nel canale 3 siano simili.
    3. Impostare il guadagno del fotomoltiplicatore (modalità media) su 600-800.
  6. Immagine con queste impostazioni 15-20 cellule che esprimono la proteina di fusione GFP-Cherry. 15-20 celle forniscono buone statistiche mantenendo il tempo totale di una sessione di misurazione FRET limitato a poche ore per garantire la stabilità del set-up microscopico.
  7. Immagine con le stesse celle di impostazioni che esprimono GFP, Cherry, GFP e Cherry e celle non trasfettate. Cerca le celle che esprimono rispettivamente nel canale verde o nel canale rosso.
  8. Quindi, immagina 15-20 cellule che co-esprimono proteine di interesse accoppiate rispettivamente a GFP e Cherry. Alla ricerca di cellule espresse, evitare una lunga esposizione delle cellule per non sbiancare le proteine fluorescenti. Cherry ha una fotostabilità inferiore rispetto alla GFP e sbiancando Cherry, l'accettore compromette l'analisi FRET.
    NOTA: Gli spettri di assorbimento ed emissione di GFP e Cherry sono mostrati nella figura supplementare 1. Dopo aver misurato per 5-6 ore, è consigliabile ripetere l'imaging di alcune cellule che esprimono la chimera GFP-Cherry alla fine della sessione di imaging per documentare che il set-up è rimasto stabile e le efficienze FRET rilevate della proteina di fusione GFP-Cherry non sono cambiate significativamente nel corso di una sessione di imaging.

4. Analisi delle immagini per rilevare le efficienze assolute di FRET mediante tempra del donatore ed emissione sensibilizzata

NOTA: Qui viene fornita una guida pratica passo-passo su come determinare l'efficienza FRET con l'uso del foglio di calcolo allegato (file supplementare 2). La teoria e la derivazione delle equazioni presentate possono essere trovate in dettaglio nelle pubblicazioni precedenti 4,15,16,17. Con le impostazioni descritte, vengono raccolte le seguenti intensità di fluorescenza.

  1. Misurare il segnale donatore I 1 nel canale 1, il canale donatore, con eccitazione a 488 nm e una banda di emissione di 505-530 nm.
    Equation 2
    dove ID è il segnale donatore non spento nel canale 1 che verrebbe misurato in assenza di un accettore, è l'efficienza media FRET e B 1 il segnale medio di fondo nel canale 1.
  2. Misurare il segnale accettore I 3 nel canale 3, il canale accettore, con eccitazione a 561 nm ed emissione a >585 nm.
    Equation 3
    dove IA è il segnale accettore e B 3 lo sfondo nel canale 3.
  3. Misurare il segnale FRET nel canale 2, il canale di trasferimento, con eccitazione a 488 nm ed emissione a >585 nm.
    Equation 4
    Dove, il segnale nel canale 2 è una somma di quattro diverse componenti: (i) I D(1 - E)S 1 è la fuoriuscita spettrale dal segnale del donatore spento nel canale di rivelazione >585 (con il fattore di diafonia S 1), (ii) IA S 2 è il segnale accettore dall'eccitazione diretta da parte della luce a 488 nm (con il fattore di diafonia S2), (iii) IDEα è l'emissione sensibilizzata dell'accettore da parte di FRET dalla molecola donatrice eccitata (α sarà ulteriormente dettagliato in 4.8. - 4.10.), e (iv) B2 è il segnale di fondo.
  4. Misurare le intensità medie di fondo nei canali 1, 2, 3 in celle non trasfettate o fintamente trasfettate; O va bene con una differenza trascurabile. Per tutte le misurazioni cellulari, utilizzare lo strumento a mano libera per delineare le regioni di interesse ed evitare vescicole perinucleari con maggiore autofluorescenza. È importante evitare una significativa autofluorescenza da queste vescicole perinucleari.
    1. Inserisci le misure nelle colonne X, Y e Z del foglio di calcolo fornito. Le intensità medie di sfondo nei 3 canali vengono immesse in A2, B2 e C2 del foglio di calcolo Excel (file supplementare 2).
  5. Misurare le intensità medie nei canali 1, 2, 3 delle cellule che esprimono GFP o Cherry da solo, e inserire le misurazioni nelle colonne C, D, E e N, O, P. Le rispettive intensità di fondo vengono sottratte (in F, G, H e Q, R, S).
  6. Per calcolare E, l'efficienza FRET, determinare i fattori di diafonia S 1 e S2. Il fattore spettrale di diafonia S1 è calcolato da cellule che esprimono solo GFP
    Equation 6
    nella colonna I. Immettere il valore medio per S1 nella cella D2 del foglio di calcolo di Excel.
  7. Calcolare il fattore spettrale di diafonia S2 da cellule che esprimono solo Cherry
    Equation 7
    nella colonna T. Immettere la media per S2 nella cella E2 del foglio di calcolo Excel.
  8. Assicurarsi che il fattore α metta in relazione il segnale di un dato numero di molecole GFP eccitate nel canale 1 con il segnale di un numero uguale di molecole di ciliegio eccitate nel canale 2 e sia definito da
    Equation 8   Equation 13
    dove Q A e QD sono le rese quantiche di fluorescenza di Cherry e GFP; ηA e ηD le efficienze di rilevazione della fluorescenza dell'accettore e del donatore nei canali 2 e 1, rispettivamente.
    NOTA: Il fattore α può essere determinato da due campioni che esprimono quantità assolute note di GFP e Cherry. Tuttavia, è impossibile conoscere l'esatta quantità di GFP e Cherry espressa in una cellula. Pertanto, abbiamo calcolato il fattore utilizzando cellule che esprimono la proteina di fusione GFP-Cherry. Qui, mentre la quantità assoluta è ancora sconosciuta, il rapporto tra molecole donatrici e accettori è noto per essere uno.
  9. Misurare le intensità medie nei canali 1, 2, 3 delle cellule che esprimono la proteina di fusione GFP-Cherry e inserire le misure nelle colonne AE, AF, AG. Le intensità di fondo vengono sottratte (in AH, AI, AJ).
  10. Calcolare il fattore α (colonna AJ) dalle intensità di fluorescenza nei canali 1, 2 e 3 della proteina di fusione GFP-Cherry come segue:
    Equation 10
  11. Le intensità corrette di fondo misurate rispettivamente nel canale 1 (I 1 - B 1), 2 (I 2 - B 2) e 3 (I 3 - B3), sono misurate utilizzando la chimera GFP-Cherry. Il fattore spettrale di diafonia incrociata S1 è stato determinato utilizzando cellule che esprimono solo GFP (vedere 4.7.). εD e ε A sono i coefficienti di estinzione della GFP, il donatore, e della ciliegia, l'accettore, a 488 nm, e possono essere determinati dalla letteratura (ε GFP = 53.000 M-1 cm-1)18 e dalla curva di assorbimento della ciliegia (εciliegio ≈ 5560 M-1cm 1). Il rapporto Equation 11 è stato inserito nella cella G2 del foglio di calcolo Excel. Immettete il valore medio per il fattore α in J2.
  12. Utilizzare il fattore di α determinato per il calcolo dell'efficienza del FRET, E, come segue (colonna AK):
    Equation 12
  13. In alternativa, determinare l'efficienza FRET, E, per i controlli negativi, cioè la co-espressione di GFP e Cherry e l'espressione della sola GFP aggiungendo le misurazioni dei canali 1, 2 e 3 nel foglio excel nella colonna AD, AE e AF sotto le misurazioni della proteina di fusione GFP-Cherry. Determinare le efficienze FRET tra le proteine di interesse GFP e Cherry allo stesso modo.
  14. Determinare l'intensità del donatore non spento, ID come (I 1 - B 1)/(1 - E) e l'intensità dell'accettore come I A = I 3 - B3; Questi valori sono proporzionali ai livelli di espressione delle proteine marcate.
  15. Determinare il corretto rapporto di intensità accettore-donatore (Q) della proteina di fusione GFP-Cherry come segue (colonna AL):
    Equation 13
  16. Per altre cellule co-trasfettate, calcolare il rapporto molecolare accettore-donatore N A/ND come segue:
    Equation 14
    NOTA: Il razionale per determinare il rapporto N A / N D e tracciare l'efficienza FRET cellulare media E rispetto a N A / N D, è che una molecola donatrice può trasferire energia a più accettori mentre una molecola accettore può ricevere energia solo da un donatore in un dato momento. Anche se solo un accettore può interagire con un donatore a causa della stechiometria dell'interazione, un aumento della concentrazione dell'accettore dovrebbe aumentare la frazione di donatori in complesso con l'accettore a causa della legge dell'azione di massa. Pertanto, per un intervallo fisso (o ristretto di) espressione del donatore, l'efficienza FRET dovrebbe aumentare con l'aumentare di N A / ND. Quando si traccia l'efficienza FRET E rispetto a N A/N D per la co-espressione di GFP e Cherry, cioè la sonda negativa, tuttavia, un aumento di N A/N D non dovrebbe comportare un aumento dell'efficienza FRET (almeno a concentrazioni accettori sufficientemente basse in cui non si verifica FRET casuale a causa della vicinanza di coloranti accettori a coloranti donatori).

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Representative Results

La Figura 1 mostra le immagini ottenute rispettivamente nel canale donatore, canale 1 (488, 505-530 nm), canale di trasferimento, canale 2 (488, >585 nm) e canale accettore, canale 3 (561, >585 nm). Immagini rappresentative di cellule che esprimono solo GFP, solo Cherry, che co-esprimono GFP e Cherry ed esprimono la proteina di fusione GFP-Cherry. Le efficienze medie di FRET cellulare calcolate nelle cellule NRK che esprimono la proteina di fusione GFP-Cherry (controllo positivo, Figura 2A) e quelle che co-esprimono GFP-Cherry (controllo negativo, Figura 2B) sono tracciate rispetto al rapporto di intensità del rapporto accettore-donatore (Q) o al rapporto molecolare N A / ND in ciascuna cellula. La figura 2C illustra un esempio su come delineare una regione di interesse ed evitare vescicole perinucleari con alta autofluorescenza.

L'algoritmo presentato può essere utilizzato per quantificare l'efficienza FRET in qualsiasi regione di interesse, compresa la quantificazione in ogni pixel dell'immagine nel canale di trasferimento. La Figura 2D mostra immagini FRET normalizzate pixel per pixel di cellule che esprimono la proteina di fusione GFP-Cherry, co-esprimendo GFP e Cherry come controllo negativo ed esprimendo subunità recettoriali del recettore di Ashwell-Morell. La variante ratta di questo recettore, la lectina epatica del ratto (RHL1 e RHL2), è un sistema recettore a due subunità noto per etero-oligomerizzare. Tutte le efficienze FRET sono state normalizzate a quella della proteina di fusione GFP-Cherry. Abbiamo etichettato RHL1 e 2 con GFP e Cherry sul lato citoplasmatico della membrana plasmatica. L'immagine mostra valori distinti di FRET sulla membrana plasmatica rispetto alle vescicole intracellulari. L'eliminazione del dominio di gambo di RHL1 (GFP-RHL1Δstalk) che si pensa medi la stretta interazione tra le due subunità diminuisce le efficienze FRET rilevate. Nella Figura 2E, le efficienze medie di FRET cellulare delle cellule che esprimono GFP-RHL1 e Cherry-RHL2, e GFP-RHL1Δstalk e Cherry-RHL2 sono tracciate rispetto al rapporto molecolare accettore-donatore (N A / ND). Per ulteriori analisi FRET di questo sistema recettoriale il lettore può fare riferimento ad una precedente pubblicazione5.

Figure 1
Figura 1: Immagini rappresentative di cellule che esprimono proteine fluorescenti. Cellule che esprimono solo GFP (A), solo ciliegia (B), GFP e co-espressione di ciliegie (C) e proteina di fusione GFP-ciliegia (D). Immagini rispettivamente nel canale 1 (488, 505-530 nm), nel canale 2 (488, >585 nm) e nel canale 3 (561, >585 nm). Le immagini sono state ottenute con l'obiettivo dell'olio 63x e lo zoom impostato su 3x. Barra scala: 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Quantificazione delle immagini FRET. Efficienze medie di FRET cellulare per le cellule che esprimono la proteina di fusione GFP-Cherry tracciata rispetto al rapporto di intensità accettore-donatore (Q) (A) e rispetto al rapporto molecolare accettore-donatore (N A / ND) per le cellule che co-esprimono GFP e Cherry (B). La linea spessa del cerchio aperto rappresenta una singola cellula che esprime la proteina di fusione GFP-Cherry. La linea sottile del cerchio aperto rappresenta una cellula che co-esprime GFP e Cherry. Si noti che a rapporti N A/N D più alti la frazione del segnale utile, l'emissione sensibilizzata (I DEα) nel canale di trasferimento diventa sempre più piccola rispetto all'eccitazione diretta dell'accettore (IAS2). Ciò si traduce in un errore maggiore nella determinazione di E. Immagini FRET pixel per pixel calcolate utilizzando l'algoritmo presentato (C). Questo pannello illustra una cellula che co-esprime GFP e Cherry, il controllo negativo, nel canale donatore, nel canale di trasferimento e nel canale accettore. Mostra anche un possibile profilo di una regione di interesse evitando vescicole perinucleari con alta autofluorescenza che possono influire negativamente sulla precisione del calcolo FRET. (D) Tutte le efficienze FRET sono state normalizzate a quella della proteina di fusione GFP-Cherry. Da sinistra a destra, proteina di fusione GFP-Cherry (controllo positivo), co-espressione GFP Cherry (controllo negativo), GFP-RHL1 e Cherry-RHL2, e GFP-RHL1Δstalk e Cherry-RHL2. Barra scala: 10 μm. Barra della scala codificata a colori: efficienza FRET media normalizzata (normalizzata al valore medio del controllo positivo, la proteina di fusione GFP-Cherry). (E) Questo pannello mostra le efficienze medie della FRET cellulare per le cellule che esprimono GFP-RHL1 e Cherry-RHL2, nonché GFP-RHL1Δstalk e Cherry-RHL2 tracciati rispetto al rapporto molecolare accettore-donatore (N A/ND). Il cerchio grigio chiuso rappresenta una singola cellula che esprime GFP-RHL1 e Cherry-RHL2. Il cerchio nero chiuso rappresenta una cellula che esprime GFP-RHL1Δstalk e Cherry-RHL2. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

File supplementare 1: Algoritmo per altre coppie donatore-accettore. Algoritmo per altre coppie donatore-accettore come diverse versioni di proteine fluorescenti ciano (ECFP, CyPet, mTFP1, Cerulean, mTurquoise2) e gialle (EYFP, Citrine, Venus, SYFP2, YPet). Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: Foglio di calcolo con l'algoritmo FRET presentato e uso della proteina di fusione GFP-Cherry per quantificare FRET mediante emissione sensibilizzata dell'accettore e tempra del donatore. Celle A2, B2, C2: segnali di fondo medi (B 1, B 2, B 3) nei canali 1, 2 e 3, rispettivamente. Celle D2 ed E2: valori medi per i fattori di diafonia S 1 e S2. Cella G2: Valore per il rapporto Equation 11del coefficiente di estinzione . Cella I1 e I2: coefficienti di estinzione di GFP e Cherry a luce laser a 488 nm. Cella J2: Valore medio per fattore. Colonna C (C5 e superiori): intensità di fluorescenza misurata di una cellula che esprime GFP nel canale 1. Colonna D (D5 e superiori): intensità di fluorescenza misurata di una cellula che esprime GFP nel canale 2. Colonna E (E5 e superiori): intensità di fluorescenza misurata di una cellula che esprime GFP nel canale 3. Colonne F, G e H (F5, G5, H5 e superiori, rispettivamente): intensità di fluorescenza misurate sottratte dalle intensità medie di fondo in tutti e 3 i canali. Colonna I (I5 e superiori): fattore di diafonia calcolato S1. Colonna M (M5 e superiori): intensità di fluorescenza misurata di una cellula che esprime Cherry nel canale 1. Colonna N (N5 e superiori): intensità di fluorescenza misurata di una cellula che esprime Cherry nel canale 2. Colonna O (O5 e oltre): intensità di fluorescenza misurata di una cellula che esprime Cherry nel canale 3. Colonne P, Q e R (rispettivamente P5, Q5, R5 e superiori): intensità di fluorescenza misurate sottratte dalle intensità medie di fondo in tutti e 3 i canali. Colonna S (S5 e superiori): fattore di diafonia calcolato S2. Colonna W (W5 e superiori): intensità di fluorescenza misurata di una cellula non trasfettata o simulata nel canale 1. Colonna X (X5 e superiori): intensità di fluorescenza misurata di una cellula non trasfettata o finta nel canale 2. Colonna Y (Y5 e superiori): intensità di fluorescenza misurata di una cellula non trasfettata o simulata nel canale 3.Colonna AD (AD5 e superiori): intensità di fluorescenza misurata di una cellula che esprime la proteina di fusione GFP-Cherry (o co-esprime GFP e Cherry, o qualsiasi coppia proteica di interesse) nel canale 1. Colonna AE (AE5 e superiori): intensità di fluorescenza misurata di una cellula che esprime la proteina di fusione GFP-Cherry (o co-esprime GFP e Cherry, o qualsiasi coppia proteica di interesse) nel canale 2. Colonna AF (AF5 e superiori): intensità di fluorescenza misurata di una cellula che esprime la proteina di fusione GFP-Cherry (o co-esprime GFP e Cherry, o qualsiasi coppia proteica di interesse) nel canale 3. Colonne AG, AH e AI (AG5, AH5, AI5 e superiori, rispettivamente): intensità di fluorescenza misurate sottratte dalle intensità medie di fondo in tutti e 3 i canali. Colonna AJ (AJ5 e versioni successive): fattore α calcolato. Colonna AK (AK 5 e superiori): efficienza media calcolata del FRET E. Colonna AL (AL5 e superiori): rapporto di intensità accettore/donatore corretto calcolato (Q). Esempi di parametri calcolati da un esperimento FRET espressi come deviazione media e standard: S1 = 0,2232 ± 0,0060. S2 = 0,2039 ± 0,0074. α = 1.9463 ± 0.1409. E = 0,2713 ± 0,0220. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 1: spettri di assorbimento ed emissione di GFP e ciliegie. Spettri normalizzati di assorbimento ed emissione di fluorescenza di eGFP e mCherry. Le linee laser di eccitazione (488 e 543 nm) e le trasmissioni di filtro utilizzate per il canale donatore (ch1: 505-530 nm) e i canali di trasferimento/accettore (ch2 e 3: >585 nm) nel microscopio confocale sono contrassegnate da ombreggiatura. Per l'eccitazione dell'accettore è possibile utilizzare anche linee laser a 561 o 590 nm. Source fluorescent protein data base (fpbase.org). Clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

Il protocollo presentato descrive in dettaglio l'uso della sonda di calibrazione della proteina fluorescente uno-a-uno geneticamente accoppiata per quantificare la FRET utilizzando la rilevazione dell'emissione sensibilizzata dell'accettore e la tempra della molecola donatrice mediante microscopia confocale. Questo metodo può essere applicato per valutare le interazioni proteiche nel contesto fisiologico della cellula vivente in diversi compartimenti subcellulari. La risoluzione spaziale può essere ulteriormente migliorata applicando l'algoritmo presentato per calcolare le efficienze FRET in ogni pixel di un'immagine (FRET pixel per pixel). La determinazione basata sull'intensità delle efficienze assolute di FRET richiede la determinazione del cross-talk, qui quantificato con i fattori S , e l'efficienza di rilevazione delle molecole donatrici e accettori mediante il set-up microscopico dato, quantificato dal fattore α. Qui viene fornito un protocollo che consente di quantificare sia la diafonia che l'efficienza di rilevamento. L'accoppiamento diretto dell'informazione genetica della proteina fluorescente garantisce l'espressione equimolare nelle cellule vive e rende quindi possibile la determinazione del fattore α. La conoscenza del fattore α a sua volta è un prerequisito per la quantificazione dell'efficienza FRET nelle cellule vive. I passaggi critici nel protocollo fornito sono la corretta clonazione della chimera della proteina fluorescente direttamente accoppiata, un tempo sufficiente dopo la trasfezione per consentire la maturazione delle proteine fluorescenti, l'uso di proteine fluorescenti in un microambiente cellulare simile, ad esempio proteine fluorescenti nel citoplasma e sul lato citoplasmatico della membrana plasmatica e una configurazione stabile del microscopio.

Il set-up sperimentale e l'algoritmo qui presentati sono progettati per la coppia GFP-Cherry FRET. Forniamo nel Supplementary File 1 l'algoritmo per diverse versioni di proteine ciano (ECFP, CyPet, mTFP1, Cerulean, mTurquoise2) e giallo fluorescente (EYFP, Citrine, Venus, SYFP2, YPet). Il vantaggio di queste coppie di proteine fluorescenti è una maggiore sovrapposizione spettrale tra lo spettro di emissione del ciano e lo spettro di assorbimento della proteina gialla (rispetto alla GFP-Cherry) con conseguenti valori di R0 leggermente più elevati e maggiori efficienze FRET. Tuttavia, per lo stesso motivo, anche il numero di fattori di diafonia non trascurabili e la loro entità sono maggiori (cfr. testo complementare).

I limiti della FRET raziometrica microscopica quantitativa nelle cellule vive devono essere considerati e discussi. Prerequisito dell'utilizzo di FRET per rilevare interazioni molecolari è l'applicazione di tag fluorescenti. Il nostro protocollo utilizza proteine fluorescenti codificate geneticamente. Poiché queste proteine fluorescenti possono essere paragonabili in dimensioni (27 kDa) alla proteina marcata di interesse, possono cambiare la localizzazione e la funzione della proteina di interesse. Pertanto, sia la localizzazione che la funzionalità di qualsiasi proteina marcata di interesse devono essere testate e confrontate con quelle della proteina endogena non marcata. Un altro punto critico da tenere a mente è il pool endogeno non etichettato della proteina di interesse. Le interazioni del marcato con proteine endogene non marcate diminuiranno il segnale FRET. Idealmente, tutte le proteine di interesse sono etichettate. Ciò può essere ottenuto utilizzando cellule che non hanno la proteina di interesse endogenamente (come nell'esempio dato in Figura 2C e 2E ), utilizzando cellule derivate da topi knock-in, utilizzando cellule modificate CRISPR, ecc. Anche con l'uso di FRET pixel per pixel, il segnale delle molecole donatrici e accettori sarà mediato su un punto limitato alla diffrazione, il limite di risoluzione di un microscopio confocale. Pertanto, è impossibile risolvere diverse popolazioni di donatori all'interno di un punto limitato alla diffrazione. Potrebbero esserci donatori senza accettore o donatori con accettori multipli che contribuiscono al segnale FRET medio. La dissezione di diverse sottopopolazioni molecolari mediante FRET richiede l'imaging a fluorescenza22. Un altro problema, specialmente ad alti livelli di espressione, è il cosiddetto FRET casuale tra fluorofori in stretta vicinanza senza interazione sottostante delle proteine di interesse23. Questa FRET casuale può essere significativa nella membrana plasmatica dato il confinamento 2-D delle proteine di membrana rispetto alle proteine citoplasmatiche liberamente diffusive. Pertanto, dovrebbero sempre essere fatti esperimenti di controllo come l'eliminazione di domini che mediano la presunta interazione tra molecole e test per la riduzione del segnale FRET rilevato.

L'incertezza delle stechiometrie esatte delle proteine interagenti nelle cellule vive limita l'uso della FRET come righello spettroscopico per valutare le distanze molecolari tra le proteine nelle cellule vive. Anche nel caso di una stretta interazione uno-a-uno, (i) la flessibilità del linker che lega la proteina fluorescente alla proteina di interesse e (ii) la mancanza di conoscenza dell'orientamento relativo dei momenti di dipolo dei coloranti (determinando il cosiddetto fattore κ2 ) può confondere le misure esatte della distanza. Studi su costrutti di fusione accettoria con linker rigidi di diverse lunghezze che separano i due fluorofori e mostrano diverse efficienze FRET sono stati riportati altrove12. Al contrario, la valutazione delle stechiometrie con misure FRET in cellule vive è complessa, tuttavia possibile utilizzando la quantificazione FRET raziometrica presentata. Il lettore incline può essere rimandato a lavori precedenti che descrivono in dettaglio un approccio fattibile5.

In sintesi, l'approccio quantitativo FRET qui presentato consente di rilevare (i) interazioni proteiche nel contesto fisiologico della cellula vivente, (ii) cambiamenti nelle interazioni proteiche nel tempo e (iii) differenze nelle interazioni in diversi compartimenti subcellulari fino al livello pixel per pixel di un'immagine confocale e (iv) la dipendenza del segnale FRET rilevato dal rapporto accettore-donatore molecolare espresso in una cellula viva.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Vorremmo ringraziare il Neuroscience Imaging Service della Stanford University School of Medicine per aver fornito attrezzature e spazio per questo progetto. Questa ricerca è stata supportata dal finanziamento intramurale dello Stanford Cancer Institute e della Gynecologic Oncology Division Stanford, nonché da GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107 dal National Research, Development and Innovation Office, Ungheria.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x) Thermo Fisher Scientific 15400054
Clontech mCherry N1 vector Addgene 3553
DMEM without phenol red Thermo Fisher Scientific 11054020
Fugene 6 Promega E2691
HEPES Thermo Fisher Scientific 15630080
LabTek 8-well chambers #1.0 Thermo Fisher Scientific 12565470
L-Glutamine (200 mM) Thermo Fisher Scientific 25030081

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Biologia Numero 170 imaging di cellule vive FRET microscopia quantitativa a fluorescenza fluoroforo interazione proteica emissione sensibilizzata

Erratum

Formal Correction: Erratum: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission
Posted by JoVE Editors on 03/14/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission. The Authors section was updated from:

György Vámosi1
Sarah Miller2
Molika Sinha2
Gabor Mocsár1
Malte Renz2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

to:

György Vámosi1
Sarah Miller2
Molika Sinha2
Maria Kristha Fernandez2
Gabor Mocsár1
Malte Renz2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

Valutazione delle interazioni proteiche nelle cellule vive con emissione sensibilizzata alla FRET
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Vámosi, G., Miller, S., Sinha,… More

Vámosi, G., Miller, S., Sinha, M., Fernandez, M. K., Mocsár, G., Renz, M. Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission. J. Vis. Exp. (170), e62241, doi:10.3791/62241 (2021).

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