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Biology

Bewertung von Proteininteraktionen in lebenden Zellen mit FRET-sensibilisierter Emission

Published: April 22, 2021 doi: 10.3791/62241
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1, 2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen, 2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Summary

Der Förster-Resonanz-Energietransfer (FRET) zwischen zwei Fluorophor-Molekülen kann zur Untersuchung von Proteininteraktionen in der lebenden Zelle verwendet werden. Hier wird ein Protokoll zur Verfügung gestellt, wie FRET in lebenden Zellen gemessen werden kann, indem die sensibilisierte Emission des Akzeptors und das Abschrecken des Donormoleküls mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie detektiert werden.

Abstract

Der Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) ist die strahlungslose Übertragung von Energie von einem angeregten Donor auf ein Akzeptormolekül und hängt vom Abstand und der Ausrichtung der Moleküle sowie dem Ausmaß der Überlappung zwischen den Donoremissions- und Akzeptorabsorptionsspektren ab. FRET ermöglicht es, die Interaktion von Proteinen in der lebenden Zelle im Laufe der Zeit und in verschiedenen subzellulären Kompartimenten zu untersuchen. In der Literatur wurden verschiedene intensitätsbasierte Algorithmen zur Messung von FRET mittels Mikroskopie beschrieben. Hier werden ein Protokoll und ein Algorithmus zur Quantifizierung der FRET-Effizienz bereitgestellt, die sowohl auf der Messung der sensibilisierten Emission des Akzeptors als auch der Abschreckung des Donormoleküls basieren. Die Quantifizierung der ratiometrischen FRET in der lebenden Zelle erfordert nicht nur die Bestimmung des Übersprechens (spektraler Spillover oder Bleed-Through) der fluoreszierenden Proteine, sondern auch die Detektionseffizienz des mikroskopischen Aufbaus. Das hier bereitgestellte Protokoll beschreibt, wie diese kritischen Parameter zu bewerten sind.

Introduction

Die mikroskopische Analyse des Förster-Resonanz-Energietransfers (FRET) ermöglicht die Beurteilung der Wechselwirkungen zwischen Proteinen in lebenden Zellen. Es liefert räumliche und zeitliche Informationen, einschließlich Informationen darüber, wo in der Zelle und in welchem subzellulären Kompartiment die Interaktion stattfindet und ob sich diese Interaktion im Laufe der Zeit ändert.

Theodor Förster legte 1948 die theoretischen Grundlagen der FRET1. FRET ist eine strahlungslose Energieübertragung von einem angeregten Donor zu einem Akzeptormolekül und hängt vom Abstand der Moleküle und der relativen Orientierung ihrer Übergangsdipole sowie von der Überlappung zwischen den Donoremissions- und Akzeptorabsorptionsspektren ab. Die Energieübertragungsrate ist umgekehrt proportional zur sechsten Potenz des Donor-Akzeptor-Abstands. Somit kann FRET verwendet werden, um die molekulare Nähe im Bereich von 1-10 nm zu messen.

FRET konkurriert mit anderen De-Anregungsprozessen des Donormoleküls und führt zur sogenannten Donor-Quenching und sensibilisierten Emission des Akzeptors. Donor-Quenching ist eine Verringerung der Anzahl der emittierten Donorphotonen, während sensibilisierte Emission eine Erhöhung der emittierten Akzeptorphotonen ist. Viele mikroskopische FRET-Analysen verwenden Fluoreszenzintensitätsmessungen, einschließlich Akzeptor-Photobleiche 2, Donor-Photobleiche2 oder FRET-sensibilisiertes Photobleichen des Akzeptors3.

Hier werden ein Schritt-für-Schritt-Versuchsprotokoll und ein mathematischer Algorithmus zur Quantifizierung von FRET unter Verwendung von Donor Quenching und akzeptorsensibilisierter Emission4,5 vorgestellt, einer Methode, die oft als ratiometrische FRET bezeichnet wird. Es wurden viele Protokolle zur Annäherung an die sensibilisierte Emission veröffentlicht, nur wenige haben den absoluten FRET-Wirkungsgrad 6,7,8,9 quantifiziert. Die Quantifizierung der FRET-Effizienz in der lebenden Zelle erfordert die Bestimmung (i) des Übersprechens (spektraler Spillover oder Bleed-Through) der fluoreszierenden Proteine und (ii) der Detektionseffizienz des mikroskopischen Aufbaus. Während das Übersprechen durch die Bildgebung von Zellen beurteilt werden kann, die nur eines der Fluorophore exprimieren, ist die Beurteilung der relativen Detektionseffizienz der Donor- und Akzeptorfluoreszenz komplizierter. Es erfordert die Kenntnis mindestens des Verhältnisses der Anzahl der Donor- und Akzeptormoleküle, die zu den gemessenen Signalen führen. Die Anzahl der in lebenden Zellen exprimierten Fluorophore variiert jedoch von Zelle zu Zelle und ist unbekannt. Der sogenannte α-Faktor charakterisiert die relativen Signalstärken eines einzelnen angeregten Donor- und Akzeptormoleküls. Die Kenntnis des Faktors ist eine Voraussetzung für quantitative ratiometrische FRET-Messungen in Proben mit variablen Akzeptor-zu-Donor-Molekül-Verhältnissen, wie sie bei der Bildgebung lebender Zellen mit fluoreszierenden Proteinen auftreten. Die Verwendung eines 1-zu-1-Donor-Akzeptor-Fusionsproteins als Kalibriersonde ermöglicht die Bestimmung des α Faktors und dient gleichzeitig als Positivkontrolle. Diese genetisch gekoppelte Sonde wird von Zellen in unbekannten Gesamtmengen, aber in einer festen und bekannten relativen Menge von eins zu eins exprimiert. Das folgende Protokoll beschreibt, wie die 1-zu-1-Sonde aufgebaut und zur Quantifizierung der FRET-Effizienz verwendet wird. Eine Tabelle, die alle Formeln enthält, finden Sie in der Beilage und kann von den Lesern verwendet werden, um ihre eigenen Maße in die jeweiligen Spalten einzugeben, wie unten beschrieben.

Während das Protokoll das GFP-Cherry-Donor/Akzeptor-Paar verwendet, kann der vorgestellte Ansatz mit jedem anderen FRET-Paar durchgeführt werden. Die Zusatzdatei 1 enthält Details zu cyan-gelben Paaren.

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Protocol

1. Plasmid-Konstruktion

  1. Verwenden Sie zur Erzeugung der eGFP-mCherry1-Fusionssonde einen N1-Säugetierzellexpressionsvektor (siehe Materialtabelle) mit mCherry110, der unter Verwendung der Restriktionsstellen AgeI und BsrGI eingefügt wird.
  2. Verwenden Sie die folgenden Oligonukleotide, um eGFP11 ohne Stoppcodon als SalI-BamHI-Fragment zu amplifizieren: N-terminaler Primer 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G 3' und C-terminaler Primer 5'-AAT ATA TGG ATC CCG CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC 3'.
  3. Setzen Sie dieses SalI-BamHI-Fragment in die multiple Klonierungsstelle des N1-Vektors ein, um einen RNPPV-Linker (fünf Aminosäuren) zwischen dem grün und rot fluoreszierenden Protein einzuführen.
    HINWEIS: Dieser Linker ergibt eine mittlere FRET-Effizienz für das GFP-Cherry-Donor-Akzeptor-Paar von etwa 0,25 -0,3 (Abbildung 1A). Die Wahl von steifen12 - undhelikalen 13-Linkern unterschiedlicher Länge zur maßstabsgetreuen gemessenen FRET-Effizienz wurde an anderer Stelle diskutiert, ist aber für unseren Zweck des Fusionsproteins nicht erforderlich. Der Einfachheit halber nennen wir die fluoreszierenden Proteine "GFP" und "Cherry".

2. Zellkultur und Transfektion

  1. Verwenden Sie eine beliebige Zelllinie, z. B. NRK-Zellen, für FRET-Experimente in Medien, z. B. Dulbeccos modifizierte Eagle-Medien (DMEM), ohne Phenolrot, um die Hintergrundfluoreszenz zu reduzieren. Aus dem gleichen Grund wird die Verwendung von phenolrotfreiem Trypsin empfohlen.
  2. Sobald die Zellen zu 80 % konfluent sind, trennen Sie die Zellen mit 1 ml 0,05 % Trypsin-EDTA, zählen Sie die Anzahl der in Suspension befindlichen Zellen mit einer Neubauer-Kammer und säen Sie etwa 10.000 Zellen pro Vertiefung eines Deckglases mit 8 Well-Kammern. Verwenden Sie alternativ aus einer konfluenten Zellkultur, die in einem T25-Kolben gezüchtet wurde, 1 Tropfen Zellsuspension aus einer 2-ml-Pipette oder 3 Tropfen aus einer 5-ml-Zellsuspension aus einer konfluenten Kultur, die in einem T-12,5-Zell-Kulturkolben gezüchtet wurde.
  3. Züchten Sie Zellen in 8-Well-Kammern (0,8 cm 2 / Well) mit #1,0 Deckglas für die Fluoreszenz-Lebendzellmikroskopie unter Standard-Zellkulturbedingungen (37°C und 5% CO2).
  4. 24 h nach der Beschichtung werden die Zellen mit einem geeigneten handelsüblichen Transfektionsmedium (siehe Materialtabelle) mit GFP, Kirsche, GFP/Kirsch-Mischung (1:1-Mischung, d. h. 0,8 μg und 0,8 μg GFP- und Kirschplasmid-DNA) und der GFP-Kirsch-Chimäre transfizieren.
    1. Verwenden Sie für die Transfektion 5 μl des Transfektionsreagenzes in 45 μl DMEM und 1,6 μg Plasmid-DNA. Rühren Sie um, indem Sie das Mikrozentrifugenröhrchen vorsichtig betätigen.
    2. Nach 15-minütiger Inkubation der Mischung bei Raumtemperatur 1-2 μl der Transfektionsreagenzmischung in jede Vertiefung des 8-Well-Objektträgers geben. Legen Sie das gekammerte Deckglas wieder in den Inkubator.
  5. Lassen Sie 20 Stunden nach der Transfektion verstreichen, bevor Lebendzell-Bildgebung durchgeführt wird, um eine ordnungsgemäße fluoreszierende Proteinexpression, Faltung und Reifung, insbesondere des roten Fluorophors, zu ermöglichen.

3. FRET-Bildgebung

  1. Abbildung transfizierter Zellen in einer befeuchteten und beheizten Klimakammer bei 37 °C. Um das Zellmedium bei einem physiologischen pH-Wert zu puffern, verwenden Sie CO 2 -Gas, das auf 5 % Durchfluss eingestellt ist, oder fügen Sie 20 mM HEPES hinzu, um das Zellmedium CO2 -unabhängig zu machen.
  2. Verwenden Sie ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop. Stellen Sie die Anregung und Emission wie folgt ein, um das Signal zu optimieren und das Übersprechen zu minimieren.
    1. Verwenden Sie die 488-nm-Linie des Argon-Ionenlasers, um GFP anzuregen, und den diodengepumpten 561-nm-Festkörperlaser (oder den 543-nm-Helium-Neon-Laser, abhängig von den verfügbaren Laserlinien), um Cherry anzuregen.
    2. Stellen Sie Folgendes in der Software eines kommerziellen konfokalen Mikroskops ein. Stellen Sie den dichroitischen Spiegel auf 488/561 ein, indem Sie über das Pulldown-Menü klicken. Sammeln Sie Fluoreszenz mit 488-nm-Laserlicht zur Anregung in Kanal 1 durch ein Emissionsband von 505 - 530 nm (oder 505 - 550 nm) und in Kanal 2 mit einem Langpassfilter >585 nm und verwenden Sie das 561-nm-Laserlicht zur Anregung in Kanal 3 mit einem Langpassfilter > 585 nm (Typ-in-Wellenlängen). Es können auch Bandpassfilter wie z.B. 590 - 650 nm oder ähnliches verwendet werden, die den Vorteil haben, Raman-Streuung auszuschließen.
  3. Stimulieren Sie mit den beiden Lasern nacheinander und stellen Sie den Bildgebungsmodus nach jeder Zeile auf Switch ein, so dass sich die Anregung des 512 x 512-Pixel-Bildes nach jeder Zeile abwechselt (und nicht nach jedem Bild, was die Fähigkeit zur Erkennung von FRET aufgrund der Diffusion der markierten Proteine aufheben würde, während die Bilder mit unterschiedlichen Anregungen aufgezeichnet werden; Klicken Sie auf die Schaltfläche).
  4. Richten Sie eine Mini-Zeitserie von drei Bildern per Tastenklick ein, um zu erkennen, ob ein signifikantes Photobleaching auftritt, und reduzieren Sie möglicherweise die Laserleistung. Optimal ist ein Photobleaching von weniger als 1%. Eine hohe Laserintensität kann auch zu einer Absorptionssättigung führen, die den scheinbaren FRET-Wirkungsgradverringert 14. Laserleistungen von bis zu 10-20 μW, gemessen an der Objektivlinse, sind sicher in der Anwendung.
  5. Erstens, Bildzellen, die das GFP-Cherry-Fusionskonstrukt exprimieren. Stellen Sie die Parameter ein, die die zeitintegrierte Laserintensität pro Pixel in einem konfokalen Bild definieren, d. h. die Pixelverweilzeit in Mikrosekunden, die akusto-optische Durchstimmungsfilter-Transmission (AOTF) in Prozent und den Zoom.
    1. Bildzellen mit einem 63-fachen Ölobjektiv und einem auf 3-fach eingestellten Zoom. Dies bietet eine ausreichende Vergrößerung und Auflösung, um Zellen in ihrer Gesamtheit abzubilden. Streben Sie eine Pixelgröße von 70-80 nm an.
    2. Stellen Sie die Pixelverweilzeit für den 488-nm- und 561-nm-Laser auf 2-4 μs und AOTF-Übertragung ein, so dass die Bilder ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis ohne Ausbleichen und keine Pixel aufweisen, die eine Fluoreszenzintensitätssättigung aufweisen. Es ist vorteilhaft, die Laserleistung von 488 und 561 so einzustellen, dass die Signalpegel in Kanal 1 und Kanal 3 ähnlich sind.
    3. Stellen Sie die Verstärkung des Photomultipliers (Mittelungsmodus) auf 600-800 ein.
  6. Stellen Sie sich mit diesen Einstellungen 15-20 Zellen vor, die das GFP-Cherry-Fusionsprotein exprimieren. 15-20 Zellen liefern gute Statistiken, während die Gesamtzeit einer FRET-Messsitzung auf wenige Stunden begrenzt bleibt, um die Stabilität des mikroskopischen Aufbaus zu gewährleisten.
  7. Bild mit den gleichen Einstellungen: Zellen, die GFP, Cherry, GFP und Cherry exprimieren, und nicht transfizierte Zellen. Suchen Sie nach exprimierenden Zellen im grünen bzw. roten Kanal.
  8. Stellen Sie dann 15-20 Zellen dar, die Proteine von Interesse koexprimieren, die an GFP bzw. Cherry gekoppelt sind. Vermeiden Sie bei der Suche nach exprimierenden Zellen eine lange Exposition der Zellen, um die fluoreszierenden Proteine nicht zu bleichen. Cherry hat eine geringere Photostabilität als GFP, und das Bleichen von Cherry, dem Akzeptor, beeinträchtigt die FRET-Analyse.
    ANMERKUNG: Die Absorptions- und Emissionsspektren von GFP und Cherry sind in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt. Nach einer Messung von 5-6 h ist es ratsam, die Bildgebung einiger Zellen, die die GFP-Cherry-Chimäre exprimieren, am Ende der Bildgebungssitzung zu wiederholen, um zu dokumentieren, dass der Aufbau stabil blieb und sich die nachgewiesenen FRET-Wirkungsgrade des GFP-Cherry-Fusionsproteins im Verlauf einer Bildgebungssitzung nicht signifikant veränderten.

4. Bildanalyse zur Erkennung absoluter FRET-Wirkungsgrade mittels Donor-Quenching und sensibilisierter Emission

HINWEIS: Hier finden Sie eine praktische Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Bestimmung der FRET-Effizienz mithilfe der beigefügten Tabelle (Ergänzende Datei 2). Theorie und Herleitung der vorgestellten Gleichungen finden Sie ausführlich in den vorangegangenen Veröffentlichungen 4,15,16,17. Mit den beschriebenen Einstellungen werden die folgenden Fluoreszenzintensitäten erfasst.

  1. Messen Sie das Donorsignal I 1 in Kanal 1, dem Donorkanal, mit 488 nm Anregung und einer Emissionsbande von 505-530 nm.
    Equation 2
    wobei ID das ungelöschte Donorsignal in Kanal 1 ist, das in Abwesenheit eines Akzeptors gemessen würde, die mittlere FRET-Effizienz und B 1 das durchschnittliche Hintergrundsignal in Kanal 1 ist.
  2. Messen Sie das Akzeptorsignal I 3 in Kanal 3, dem Akzeptorkanal, mit 561 nm Anregung und Emission bei >585 nm.
    Equation 3
    wobei IA das Akzeptorsignal und B 3 der Hintergrund in Kanal 3 ist.
  3. Messen Sie das FRET-Signal in Kanal 2, dem Übertragungskanal, mit 488 nm Anregung und Emission bei >585 nm.
    Equation 4
    Dabei ist das Signal in Kanal 2 eine Summe aus vier verschiedenen Komponenten: (i) I D(1 - E)S1 ist der spektrale Überlauf vom gelöschten Donorsignal in den >585-Detektionskanal (mit dem Übersprechfaktor S1), (ii) IAS2 ist das Akzeptorsignal aus der direkten Anregung durch 488-nm-Licht (mit dem Übersprechfaktor S2), (iii) IDEα ist die sensibilisierte Emission des Akzeptors durch FRET aus dem angeregten Donormolekül (α wird in 4.8. - 4.10. näher beschrieben), und (iv) B2 ist das Hintergrundsignal.
  4. Messen Sie die durchschnittlichen Hintergrundintensitäten in den Kanälen 1, 2, 3 in nicht transfizierten oder simulierten Zellen; Beides ist mit vernachlässigbarem Unterschied in Ordnung. Verwenden Sie für alle Zellmessungen das Freihandwerkzeug, um Interessenregionen abzugrenzen und perinukleäre Vesikel mit erhöhter Autofluoreszenz zu vermeiden. Es ist wichtig, eine signifikante Autofluoreszenz dieser perinukleären Vesikel zu vermeiden.
    1. Geben Sie die Messungen in die Spalten X, Y und Z der bereitgestellten Tabelle ein. Die durchschnittlichen Hintergrundintensitäten in den 3 Kanälen werden in A2, B2 und C2 der Excel-Tabelle (Ergänzungsdatei 2) eingegeben.
  5. Messen Sie die durchschnittlichen Intensitäten in den Kanälen 1, 2, 3 von Zellen, die nur GFP oder Cherry exprimieren, und geben Sie die Messungen in die Spalten C, D, E und N, O, P ein.
  6. Um E, den FRET-Wirkungsgrad, zu berechnen, bestimmen Sie die Übersprechfaktoren S 1 und S2. Der spektrale Übersprechfaktor S1 wird aus Zellen berechnet, die nur GFP exprimieren
    Equation 6
    in Spalte I. Geben Sie den Mittelwert für S1 in die Zelle D2 der Excel-Tabelle ein.
  7. Berechnen Sie den spektralen Übersprechfaktor S2 aus Zellen, die nur Cherry exprimieren
    Equation 7
    in Spalte T. Geben Sie den Mittelwert für S2 in die Zelle E2 der Excel-Tabelle ein.
  8. Stellen Sie sicher, dass der α-Faktor das Signal einer beliebigen Anzahl von angeregten GFP-Molekülen in Kanal 1 mit dem Signal einer gleichen Anzahl von angeregten Cherry-Molekülen in Kanal 2 in Beziehung setzt und definiert ist durch
    Equation 8   Equation 13
    wobei Q A und QD die Fluoreszenzquantenausbeuten von Cherry und GFP sind; ηA und ηD die Detektionseffizienz der Akzeptor- und Donorfluoreszenz in den Kanälen 2 bzw. 1.
    ANMERKUNG: Der α Faktor konnte aus zwei Proben bestimmt werden, die bekannte absolute Mengen an GFP und Cherry ausdrücken. Es ist jedoch unmöglich, die genaue Menge an GFP und Cherry zu kennen, die in einer Zelle exprimiert wird. Daher haben wir den Faktor berechnet, indem wir Zellen verwendet haben, die das GFP-Cherry-Fusionsprotein exprimieren. Während hier die absolute Menge noch unbekannt ist, ist bekannt, dass das Verhältnis von Donor- und Akzeptormolekülen eins ist.
  9. Messen Sie die durchschnittlichen Intensitäten in den Kanälen 1, 2, 3 von Zellen, die das GFP-Cherry-Fusionsprotein exprimieren, und geben Sie die Messungen in die Spalten AE, AF, AG ein. Hintergrundintensitäten werden subtrahiert (in AH, AI, AJ).
  10. Berechnen Sie den α-Faktor (AJ-Säule) aus den Fluoreszenzintensitäten in Kanal 1, 2 und 3 des GFP-Cherry-Fusionsproteins wie folgt:
    Equation 10
  11. Hintergrundkorrigierte Intensitäten, die in Kanal 1 (I 1 - B 1), 2 (I 2 - B 2) bzw. 3 (I 3 - B3) gemessen werden, werden mit der GFP-Cherry-Chimäre gemessen. Der spektrale Übersprechfaktor S1 wurde unter Verwendung von Zellen bestimmt, die nur GFP exprimieren (siehe 4.7.). εD und ε A sind die Extinktionskoeffizienten von GFP, dem Donor, und Cherry, dem Akzeptor, bei 488 nm und können aus der Literatur (ε GFP = 53.000 M-1 cm-1)18 und der Absorptionskurve von Kirsche (εKirsche ≈ 5560 M-1cm 1) bestimmt werden. Das Verhältnis Equation 11 wurde in Zelle G2 der Excel-Tabelle eingegeben. Geben Sie den Mittelwert für den α Faktor in J2 ein.
  12. Verwenden Sie den ermittelten α Faktor für die Berechnung des FRET-Wirkungsgrads E wie folgt (Spalte AK):
    Equation 12
  13. Alternativ können Sie die FRET-Effizienz E für die Negativkontrollen bestimmen, d. h. die Koexpression von GFP und Cherry und die Expression von GFP allein, indem Sie die Messungen der Kanäle 1, 2 und 3 in der Excel-Tabelle in Spalte AD, AE und AF unter den GFP-Cherry-Fusionsproteinmessungen addieren. Bestimmen Sie die FRET-Effizienz zwischen den GFP- und Cherry-markierten Proteinen auf die gleiche Weise.
  14. Bestimmen Sie die Intensität des ungelöschten Donors, I D als (I 1 - B 1)/(1 - E), und die Akzeptorintensität als I A = I 3 - B3; Diese Werte sind proportional zu den Expressionsniveaus der markierten Proteine.
  15. Bestimmen Sie das korrigierte Akzeptor-zu-Donor-Intensitätsverhältnis (Q) des GFP-Cherry-Fusionsproteins wie folgt (Spalte AL):
    Equation 13
  16. Berechnen Sie für andere co-transfizierte Zellen das Akzeptor-zu-Donor-Molekülverhältnis N A/ND wie folgt:
    Equation 14
    HINWEIS: Der Grund für die Bestimmung des N A / N-D-Verhältnisses und die Darstellung der mittleren zellulären FRET-Effizienz E im Vergleich zu NA /N D ist, dass ein Donormolekül Energie auf mehrere Akzeptoren übertragen kann, während ein Akzeptormolekül nur Energie von einem Donor zu einem bestimmten Zeitpunkt erhalten kann. Selbst wenn aufgrund der Stöchiometrie der Wechselwirkung nur ein Akzeptor mit einem Spender interagieren kann, wird erwartet, dass eine Erhöhung der Akzeptorkonzentration aufgrund des Gesetzes der Massenwirkung den Anteil der Spender im Komplex mit dem Akzeptor erhöht. Daher sollte bei einer festen (oder engen Reichweite) der Spenderexpression die FRET-Effizienz mit zunehmendem N A/ND steigen. Bei der Darstellung der FRET-Effizienz E versus N A/N D für die Co-Expression von GFP und Cherry, d.h. der negativen Sonde, sollte eine Erhöhung der N A/N D jedoch nicht zu einer Erhöhung der FRET-Effizienz führen (zumindest bei ausreichend niedrigen Akzeptorkonzentrationen, bei denen aufgrund der Nähe von Akzeptorfarbstoffen zu Donorfarbstoffen keine zufällige FRET auftritt).

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Representative Results

Abbildung 1 zeigt die Bilder, die im Donorkanal, Kanal 1 (488, 505-530 nm), im Übertragungskanal Kanal 2 (488, >585 nm) bzw. im Akzeptorkanal, Kanal 3 (561, >585 nm), erhalten wurden. Repräsentative Bilder von Zellen, die nur GFP exprimieren, nur Kirsche exprimieren, GFP und Kirsche co-exprimieren und das GFP-Kirsch-Fusionsprotein exprimieren. Die mittleren zellulären FRET-Wirkungsgrade, die in NRK-Zellen berechnet wurden, die GFP-Cherry-Fusionsprotein exprimieren (Positivkontrolle, Abbildung 2A) und solche, die GFP-Cherry koexprimieren (Negativkontrolle, Abbildung 2B), werden im Vergleich zum Akzeptor-Donor-Verhältnis-Intensitätsverhältnis (Q) oder dem Molekülverhältnis N A/ND in jeder Zelle aufgetragen. Abbildung 2C zeigt ein Beispiel dafür, wie eine Region von Interesse umrissen und perinukleäre Vesikel mit hoher Autofluoreszenz vermieden werden können.

Der vorgestellte Algorithmus kann verwendet werden, um die FRET-Effizienz in jeder Region von Interesse zu quantifizieren, einschließlich der Quantifizierung in jedem Pixel des Bildes im Übertragungskanal. Abbildung 2D zeigt normalisierte Pixel-für-Pixel-FRET-Bilder von Zellen, die das GFP-Cherry-Fusionsprotein exprimieren, GFP und Cherry als Negativkontrolle co-exprimieren und Rezeptoruntereinheiten des Ashwell-Morell-Rezeptors exprimieren. Die Rattenvariante dieses Rezeptors, das Leberlektin der Ratte (RHL1 und RHL2), ist ein Rezeptorsystem mit zwei Untereinheiten, von dem bekannt ist, dass es hetero-oligomerisiert. Alle FRET-Wirkungsgrade wurden auf die des GFP-Cherry-Fusionsproteins normalisiert. Wir markierten RHL1 und 2 mit GFP und Cherry auf der zytoplasmatischen Seite der Plasmamembran. Das Bild zeigt deutliche FRET-Werte an der Plasmamembran im Vergleich zu intrazellulären Vesikeln. Das Löschen der Stieldomäne von RHL1 (GFP-RHL1Δstalk), von der angenommen wird, dass sie die enge Wechselwirkung zwischen den beiden Untereinheiten vermittelt, verringert die nachgewiesenen FRET-Wirkungsgrade. In Abbildung 2E sind die mittleren zellulären FRET-Wirkungsgrade von Zellen, die GFP-RHL1 und Cherry-RHL2 exprimieren, sowie GFP-RHL1Δstalk und Cherry-RHL2 im Vergleich zum Akzeptor-zu-Donor-Molekülverhältnis (N A/ND) aufgetragen. Für weitere FRET-Analysen dieses Rezeptorsystems kann der Leser auf eine frühere Publikationverweisen 5.

Figure 1
Abbildung 1: Repräsentative Bilder von Zellen, die fluoreszierende Proteine exprimieren. Zellen, die nur GFP exprimieren (A), nur Cherry (B), GFP- und Cherry-Koexpression (C) und GFP-Cherry-Fusionsprotein (D). Bilder in Kanal 1 (488, 505-530 nm), Kanal 2 (488, >585 nm) bzw. Kanal 3 (561, >585 nm). Die Bilder wurden mit einem 63-fachen Ölobjektiv und einem auf 3-fach eingestellten Zoom aufgenommen. Maßstabsleiste: 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Quantifizierung von FRET-Bildern. Mittlere zelluläre FRET-Effizienz für Zellen, die das GFP-Cherry-Fusionsprotein exprimieren, aufgetragen gegen das Akzeptor-zu-Donor-Intensitätsverhältnis (Q) (A) und gegen das Akzeptor-zu-Donor-Molekularverhältnis (N A/ND) für Zellen, die GFP und Cherry (B) koexprimieren. Die dicke Linie des offenen Kreises stellt eine einzelne Zelle dar, die GFP-Cherry-Fusionsprotein exprimiert. Die dünne Linie des offenen Kreises stellt eine Zelle dar, die GFP und Cherry co-exprimiert. Beachten Sie, dass bei höheren N A/ND-Verhältnissen der Anteil des Nutzsignals, der sensibilisierten Emission (I DEα) im Übertragungskanal relativ zur direkten Anregung des Akzeptors (IAS2) immer kleiner wird. Dies führt zu einem größeren Fehler bei der Bestimmung von E. Pixel-für-Pixel-FRET-Bilder, die mit dem vorgestellten Algorithmus (C) berechnet wurden. Dieses Panel zeigt eine Zelle, die GFP und Cherry, die Negativkontrolle, im Spenderkanal, im Transferkanal und im Akzeptorkanal coexprimiert. Es zeigt auch einen möglichen Umriss einer Region von Interesse, wobei perinukleäre Vesikel mit hoher Autofluoreszenz vermieden werden, was sich negativ auf die Genauigkeit der FRET-Berechnung auswirken kann. (D) Alle FRET-Wirkungsgrade wurden auf die des GFP-Cherry-Fusionsproteins normalisiert. Von links nach rechts: GFP-Cherry-Fusionsprotein (Positivkontrolle), GFP-Cherry-Koexpression (Negativkontrolle), GFP-RHL1 und Cherry-RHL2 sowie GFP-RHL1Δstalk und Cherry-RHL2. Maßstabsleiste: 10 μm. Farbkodierter Maßstabsbalken: normalisierte mittlere FRET-Effizienz (normiert auf den Mittelwert der Positivkontrolle, des GFP-Cherry-Fusionsproteins). (E) Dieses Panel zeigt die mittleren zellulären FRET-Wirkungsgrade für Zellen, die GFP-RHL1 und Cherry-RHL2 sowie GFP-RHL1Δstalk und Cherry-RHL2 exprimieren, aufgetragen im Vergleich zum Akzeptor-zu-Donor-Molekülverhältnis (N A/ND). Der geschlossene graue Kreis stellt eine einzelne Zelle dar, die GFP-RHL1 und Cherry-RHL2 exprimiert. Der geschlossene schwarze Kreis stellt eine Zelle dar, die GFP-RHL1Δstalk und Cherry-RHL2 exprimiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzungsdatei 1: Algorithmus für andere Donor-Akzeptor-Paare. Algorithmus für andere Donor-Akzeptor-Paare wie verschiedene Versionen von cyan (ECFP, CyPet, mTFP1, Cerulean, mTurquoise2) und gelben (EYFP, Citrin, Venus, SYFP2, YPet) fluoreszierenden Proteinen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2: Tabellenkalkulation mit dem vorgestellten FRET-Algorithmus und Verwendung des GFP-Cherry-Fusionsproteins zur Quantifizierung von FRET durch sensibilisierte Emission des Akzeptors und Donor-Quenching. Zellen A2, B2, C2: Mittlere Hintergrundsignale (B 1, B 2, B 3) in den Kanälen 1, 2 bzw. 3. Zellen D2 und E2: Mittelwerte für die Übersprechfaktoren S 1 und S 2. Zelle G2: Wert für das Extinktionskoeffizientenverhältnis Equation 11. Zelle I1 und I2: Extinktionskoeffizienten von GFP und Cherry bei 488-nm-Laserlicht. Zelle J2: Mittelwert für den Faktor. Spalte C (C5 und höher): gemessene Fluoreszenzintensität einer Zelle, die GFP in Kanal 1 exprimiert. Spalte D (D5 und höher): gemessene Fluoreszenzintensität einer Zelle, die GFP in Kanal 2 exprimiert. Spalte E (E5 und höher): gemessene Fluoreszenzintensität einer Zelle, die GFP in Kanal 3 exprimiert. Spalten F, G und H (F5, G5, H5 bzw. höher): gemessene Fluoreszenzintensitäten subtrahiert von mittleren Hintergrundintensitäten in allen 3 Kanälen. Spalte I (I5 und höher): Berechneter Übersprechfaktor S1. Spalte M (M5 und höher): gemessene Fluoreszenzintensität einer Zelle, die Cherry in Kanal 1 exprimiert. Spalte N (N5 und höher): gemessene Fluoreszenzintensität einer Zelle, die Cherry in Kanal 2 exprimiert. Spalte O (O5 und höher): gemessene Fluoreszenzintensität einer Zelle, die Cherry in Kanal 3 exprimiert. Spalten P, Q und R (P5, Q5, R5 bzw. höher): gemessene Fluoreszenzintensitäten subtrahiert von mittleren Hintergrundintensitäten in allen 3 Kanälen. Spalte S (ab S5): Berechneter Übersprechfaktor S2. Spalte W (W5 und höher): gemessene Fluoreszenzintensität einer nicht- oder mock-transfizierten Zelle in Kanal 1. Spalte X (X5 und höher): gemessene Fluoreszenzintensität einer nicht- oder mock-transfizierten Zelle in Kanal 2. Spalte Y (Y5 und höher): gemessene Fluoreszenzintensität einer nicht- oder mock-transfizierten Zelle in Kanal 3.Spalte AD (AD5 und höher): gemessene Fluoreszenzintensität einer Zelle, die das GFP-Cherry-Fusionsprotein (oder die Co-Expression von GFP und Cherry oder ein beliebiges Proteinpaar) in Kanal 1 exprimiert. Spalte AE (AE5 und höher): gemessene Fluoreszenzintensität einer Zelle, die das GFP-Cherry-Fusionsprotein (oder die Co-Expression von GFP und Cherry oder ein beliebiges Proteinpaar) in Kanal 2 exprimiert. Säulen-AF (AF5 und höher): gemessene Fluoreszenzintensität einer Zelle, die das GFP-Cherry-Fusionsprotein (oder die Co-Expression von GFP und Cherry oder ein beliebiges Proteinpaar) in Kanal 3 exprimiert. Spalten AG, AH und AI (AG5, AH5, AI5 bzw. höher): gemessene Fluoreszenzintensitäten subtrahiert von mittleren Hintergrundintensitäten in allen 3 Kanälen. Spalte AJ (AJ5 und höher): Berechnet α Faktor. Spalte AK (AK 5 und höher): Berechneter mittlerer FRET-Wirkungsgrad E. Spalte AL (AL5 und höher): berechnetes korrigiertes Akzeptor-zu-Donor-Intensitätsverhältnis (Q). Beispiele für berechnete Parameter aus einem FRET-Experiment, ausgedrückt als Mittelwert und Standardabweichung: S1 = 0,2232 ± 0,0060. S2 = 0,2039 ± 0,0074. α = 1.9463 ± 0.1409. E = 0,2713 ± 0,0220. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 1: GFP- und Cherry-Absorptions- und Emissionsspektren. Normalisierte Absorptions- und Fluoreszenzemissionsspektren von eGFP und mCherry. Die im konfokalen Mikroskop verwendeten Anregungslaserlinien (488 und 543 nm) und Filtertransmissionen für den Donorkanal (ch1: 505-530 nm) und die Transfer-/Akzeptorkanäle (ch2 & 3: >585 nm) sind durch Schattierung gekennzeichnet. Zur Anregung des Akzeptors können auch 561- oder 590-nm-Laserlinien verwendet werden. Quelle: Datenbank für fluoreszierende Proteine (fpbase.org). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Das vorgestellte Protokoll beschreibt die Verwendung der genetisch gekoppelten Eins-zu-Eins-Fluoreszenzprotein-Kalibrierungssonde zur Quantifizierung von FRET unter Verwendung des Nachweises der sensibilisierten Emission des Akzeptors und des Quenchings des Donormoleküls durch konfokale Mikroskopie. Diese Methode kann angewendet werden, um Proteininteraktionen im physiologischen Kontext der lebenden Zelle in verschiedenen subzellulären Kompartimenten zu bewerten. Die räumliche Auflösung kann weiter verbessert werden, indem der vorgestellte Algorithmus angewendet wird, um FRET-Effizienzen in jedem Pixel eines Bildes zu berechnen (Pixel-für-Pixel-FRET). Die intensitätsbasierte Bestimmung der absoluten FRET-Wirkungsgrade erfordert die Bestimmung des Übersprechens, das hier mit den S-Faktoren quantifiziert wird, und der Detektionseffizienz von Donor- und Akzeptormolekülen durch den gegebenen mikroskopischen Aufbau, quantifiziert durch den α-Faktor. Hier wird ein Protokoll bereitgestellt, das die Quantifizierung sowohl des Übersprechens als auch der Detektionseffizienz ermöglicht. Die direkte Kopplung der genetischen Information des fluoreszierenden Proteins garantiert eine äquimolare Expression in lebenden Zellen und ermöglicht so die Bestimmung des α Faktors. Die Kenntnis des α Faktors ist wiederum Voraussetzung für die Quantifizierung der FRET-Effizienz in lebenden Zellen. Kritische Schritte im bereitgestellten Protokoll sind die ordnungsgemäße Klonierung der direkt gekoppelten fluoreszierenden Proteinchimäre, eine ausreichende Zeit nach der Transfektion, um eine fluoreszierende Proteinreifung zu ermöglichen, die Verwendung von fluoreszierenden Proteinen in einer ähnlichen zellulären Mikroumgebung, z. B. fluoreszierende Proteine im Zytoplasma und auf der zytoplasmatischen Seite der Plasmamembran, und ein stabiler Mikroskopaufbau.

Der hier vorgestellte Versuchsaufbau und Algorithmus sind für das GFP-Cherry-FRET-Paar ausgelegt. Wir stellen in der Ergänzungsdatei 1 den Algorithmus für verschiedene Versionen von Cyan (ECFP, CyPet, mTFP1, Cerulean, mTurquoise2) und gelb fluoreszierenden Proteinen (EYFP, Citrin, Venus, SYFP2, YPet) zur Verfügung. Der Vorteil dieser fluoreszierenden Proteinpaare ist eine größere spektrale Überlappung zwischen dem Emissionsspektrum des Cyans und dem Absorptionsspektrum des gelben Proteins (im Vergleich zu GFP-Cherry), was zu etwas höherenR0-Werten und größeren FRET-Wirkungsgraden führt. Aus dem gleichen Grund sind jedoch auch die Anzahl der nicht zu vernachlässigenden Übersprechfaktoren und ihre Größenordnungen größer (siehe Ergänzender Text).

Einschränkungen der quantitativen mikroskopischen ratiometrischen FRET in lebenden Zellen müssen berücksichtigt und diskutiert werden. Voraussetzung für den Einsatz von FRET zur Detektion molekularer Wechselwirkungen ist das Aufbringen von Fluoreszenz-Tags. Unser Protokoll verwendet genetisch kodierte fluoreszierende Proteine. Da diese fluoreszierenden Proteine in ihrer Größe (27 kDa) mit dem markierten Protein von Interesse vergleichbar sein können, können sie die Lokalisation und Funktion des interessierenden Proteins verändern. Daher sollten sowohl die Lokalisation als auch die Funktionalität eines markierten Proteins von Interesse getestet und mit denen des endogenen unmarkierten Proteins verglichen werden. Ein weiterer kritischer Punkt, den es zu beachten gilt, ist der endogene, unmarkierte Pool des interessierenden Proteins. Die Wechselwirkungen der markierten mit unmarkierten endogenen Proteinen verringern das FRET-Signal. Im Idealfall werden alle interessierenden Proteine markiert. Dies kann erreicht werden, indem Zellen verwendet werden, die das interessierende Protein nicht endogen haben (wie im Beispiel in Abbildung 2C und 2E ), Zellen verwendet werden, die von Knock-in-Mäusen stammen, CRISPR-modifizierte Zellen verwendet werden usw. Selbst bei Verwendung von Pixel-für-Pixel-FRET wird das Signal von Donor- und Akzeptormolekülen über einen beugungsbegrenzten Punkt, die Auflösungsgrenze eines konfokalen Mikroskops, gemittelt. Daher ist es unmöglich, verschiedene Spenderpopulationen innerhalb eines beugungsbegrenzten Spots aufzulösen. Es kann Spender ohne Akzeptor oder Spender mit mehreren Akzeptoren geben, die zum durchschnittlichen FRET-Signal beitragen. Die Analyse verschiedener molekularer Subpopulationen mittels FRET erfordert eine Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebung22. Ein weiteres Problem, insbesondere bei hohen Expressionsniveaus, ist das sogenannte zufällige FRET zwischen Fluorophoren in unmittelbarer Nähe ohne zugrunde liegende Wechselwirkung der interessierenden Proteine23. Diese zufällige FRET kann in der Plasmamembran signifikant sein, da die Membranproteine im Vergleich zu frei diffundierenden zytoplasmatischen Proteinen 2-D-eingeschlossen sind. Daher sollten immer Kontrollexperimente durchgeführt werden, wie z.B. das Löschen von Domänen, die die vermutete Wechselwirkung zwischen Molekülen vermitteln, und der Test auf Reduktion des detektierten FRET-Signals.

Die Unsicherheit der exakten Stöchiometrie interagierender Proteine in lebenden Zellen schränkt die Verwendung von FRET als spektroskopisches Lineal zur Beurteilung molekularer Abstände zwischen Proteinen in lebenden Zellen ein. Selbst im Falle einer strikten Eins-zu-Eins-Wechselwirkung können (i) die Flexibilität des Linkers, der das fluoreszierende Protein an das interessierende Protein bindet, sowie (ii) die mangelnde Kenntnis der relativen Orientierung der Dipolmomente der Farbstoffe (Bestimmung des sogenannten κ2-Faktors ) exakte Entfernungsmessungen verfälschen. An anderer Stelle wurden Studien zu Akzeptorfusionskonstrukten mit steifen Linkern unterschiedlicher Länge berichtet, die die beiden Fluorophore trennen und unterschiedliche FRET-Wirkungsgrade aufweisen12. Umgekehrt ist die Beurteilung von Stöchiometrien mit FRET-Messungen in lebenden Zellen komplex, jedoch mit der vorgestellten ratiometrischen FRET-Quantifizierung möglich. Der geneigte Leser kann auf frühere Arbeiten verwiesen werden, in denen ein praktikabler Ansatzbeschrieben wird 5.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der hier vorgestellte quantitative FRET-Ansatz die Detektion von (i) Proteininteraktionen im physiologischen Kontext der lebenden Zelle, (ii) Veränderungen der Proteininteraktionen im Laufe der Zeit und (iii) Unterschieden in den Interaktionen in verschiedenen subzellulären Kompartimenten bis hinunter zur Pixel-für-Pixel-Ebene eines konfokalen Bildes und (iv) der Abhängigkeit des detektierten FRET-Signals vom molekularen Akzeptor-zu-Donor-Verhältnis, das in einer lebenden Zelle exprimiert wird, ermöglicht.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Wir danken dem Neuroscience Imaging Service der Stanford University School of Medicine für die Bereitstellung von Ausrüstung und Raum für dieses Projekt. Diese Forschung wurde durch intramurale Mittel des Stanford Cancer Institute und der Abteilung für gynäkologische Onkologie Stanford sowie durch GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107 des Nationalen Büros für Forschung, Entwicklung und Innovation, Ungarn, unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x) Thermo Fisher Scientific 15400054
Clontech mCherry N1 vector Addgene 3553
DMEM without phenol red Thermo Fisher Scientific 11054020
Fugene 6 Promega E2691
HEPES Thermo Fisher Scientific 15630080
LabTek 8-well chambers #1.0 Thermo Fisher Scientific 12565470
L-Glutamine (200 mM) Thermo Fisher Scientific 25030081

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References

  1. Förster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Annal der Physik. 437, 55-75 (1948).
  2. Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Luminescence digital imaging microscopy. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).
  3. Mekler, V. M. A photochemical technique to enhance sensitivity of detection of fluorescence resonance energy transfer. Photochemistry and Photobiology. 59, 615-620 (1994).
  4. Vamosi, G., et al. Conformation of the c-Fos/c-Jun complex in vivo: A combined FRET, FCCS, and MD-modeling study. Biophysical Journal. 94 (7), 2859-2868 (2008).
  5. Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (44), 2989-2997 (2012).
  6. van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission. Biophysical Journal. 86 (4), 2517-2529 (2004).
  7. Muller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. Quantification of Forster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells. Frontiers in Plant Sciences. 4, 413 (2013).
  8. Gates, E. M., LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. Improving quality, reproducibility, and usability of FRET-based tension sensors. Cytometry Part A. 95 (2), 201-213 (2019).
  9. Menaesse, A., et al. Simplified instrument calibration for wide-field fluorescence resonance energy transfer (FRET) measured by the sensitized emission method. Cytometry Part A. , 24194 (2020).
  10. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  11. Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). Gene. 173, 1 Spec No 33-38 (1996).
  12. Nagy, P., et al. Novel calibration method for flow cytometric fluorescence resonance energy transfer measurements between visible fluorescent proteins. Cytometry Part A. 67 (2), 86-96 (2005).
  13. Arai, R., Ueda, H., Kitayama, A., Kamiya, N., Nagamune, T. Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein. Protein Engineering. 14 (8), 529-532 (2001).
  14. Szendi-Szatmari, T., Szabo, A., Szollosi, J., Nagy, P. Reducing the detrimental effects of saturation phenomena in FRET microscopy. Analytical Chemistry. 91 (9), 6378-6382 (2019).
  15. Tron, L., et al. Flow cytometric measurement of fluorescence resonance energy transfer on cell surfaces. Quantitative evaluation of the transfer efficiency on a cell-by-cell basis. Biophysical Journal. 45 (5), 939-946 (1984).
  16. Sebestyen, Z., et al. Long wavelength fluorophores and cell-by-cell correction for autofluorescence significantly improves the accuracy of flow cytometric energy transfer measurements on a dual-laser benchtop flow cytometer. Cytometry. 48 (3), 124-135 (2002).
  17. Szaloki, N., et al. High throughput FRET analysis of protein-protein interactions by slide-based imaging laser scanning cytometry. Cytometry Part A. 83 (9), 818-829 (2013).
  18. McRae, S. R., Brown, C. L., Bushell, G. R. Rapid purification of EGFP, EYFP, and ECFP with high yield and purity. Protein Expression and Purification. 41 (1), 121-127 (2005).
  19. Kremers, G. J., Goedhart, J., van Munster, E. B., Gadella, T. W. Cyan and yellow super fluorescent proteins with improved brightness, protein folding, and FRET Forster radius. Biochemistry. 45 (21), 6570-6580 (2006).
  20. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors (Basel). 16 (9), (2016).
  21. Scott, B. L., Hoppe, A. D. Optimizing fluorescent protein trios for 3-Way FRET imaging of protein interactions in living cells. Science Reports. 5, 10270 (2015).
  22. Chen, Y. C., Spring, B. Q., Clegg, R. M. Fluorescence lifetime imaging comes of age how to do it and how to interpret it. Methods Molecular Biology. 875, 1-22 (2012).
  23. King, C., Sarabipour, S., Byrne, P., Leahy, D. J., Hristova, K. The FRET signatures of noninteracting proteins in membranes: Simulations and experiments. Biophysical Journal. 106 (6), 1309-1317 (2014).

Tags

Biology Lebendzell-Bildgebung FRET quantitative Fluoreszenzmikroskopie Fluorophor Proteininteraktion sensibilisierte Emission

Erratum

Formal Correction: Erratum: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission
Posted by JoVE Editors on 03/14/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission. The Authors section was updated from:

György Vámosi1
Sarah Miller2
Molika Sinha2
Gabor Mocsár1
Malte Renz2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

to:

György Vámosi1
Sarah Miller2
Molika Sinha2
Maria Kristha Fernandez2
Gabor Mocsár1
Malte Renz2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

Bewertung von Proteininteraktionen in lebenden Zellen mit FRET-sensibilisierter Emission
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Vámosi, G., Miller, S., Sinha,… More

Vámosi, G., Miller, S., Sinha, M., Fernandez, M. K., Mocsár, G., Renz, M. Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission. J. Vis. Exp. (170), e62241, doi:10.3791/62241 (2021).

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