Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Quantifizierung volumetrischer zerebraler hämodynamischer Variationen im Mausgehirn mittels funktionellem Ultraschall (fUS). Verfahren für eine funktionelle 3D-Aktivierungskarte nach sensorischer Stimulation sowie funktionelle Konnektivität im Ruhezustand werden als illustrative Beispiele bei anästhesierten und wachen Mäusen bereitgestellt.
Abstract
Die funktionelle Ultraschallbildgebung (fUS) ist eine neuartige Bildgebungsmodalität des Gehirns, die auf der hochempfindlichen Messung des zerebralen Blutvolumens beruht, die durch ultraschnelle Doppler-Angiographie erreicht wird. Da die Hirnperfusion stark mit der lokalen neuronalen Aktivität verbunden ist, ermöglicht diese Technik die 3D-Kartierung der aufgabeninduzierten regionalen Aktivierung sowie der funktionellen Konnektivität im Ruhezustand, nicht-invasiv, mit unübertroffener räumlich-zeitlicher Auflösung und operativer Einfachheit. Im Vergleich zur fMRT (funktionelle Magnetresonanztomographie) besteht ein Hauptvorteil der fUS-Bildgebung darin, eine vollständige Kompatibilität mit Wach- und Verhaltenstierversuchen zu ermöglichen. Darüber hinaus bleibt die fMRT-Gehirnkartierung bei Mäusen, dem am häufigsten verwendeten präklinischen Modell in den Neurowissenschaften, aufgrund der geringen Größe des Gehirns und der Schwierigkeit, stabile physiologische Bedingungen aufrechtzuerhalten, technisch schwierig. Hier präsentieren wir ein einfaches, zuverlässiges und robustes Protokoll für die Ganzhirn-fUS-Bildgebung bei anästhesierten und wachen Mäusen unter Verwendung eines handelsüblichen kommerziellen fUS-Systems mit einem motorisierten linearen Wandler, das eine signifikante kortikale Aktivierung nach sensorischer Stimulation sowie ein reproduzierbares 3D-Funktionskonnektivitätsmuster zur Netzwerkidentifikation liefert.
Introduction
In den letzten zwei Jahrzehnten hat sich das Neuroimaging zu einem wichtigen Werkzeug für die Untersuchung der Gehirnfunktion und -organisation entwickelt, das es Forschern ermöglicht, wichtige Entdeckungen auf dem Gebiet der Neurowissenschaften zu machen. Heute ist die funktionelle Magnetresonanztomographie (fMRT) zum Goldstandard der klinischen Neuroimaging-Technik geworden, um die Aktivierung des Gehirns zu beurteilen und die funktionelle Konnektivität in Ruhe abzubilden. Während die menschliche fMRT eine hohe Zuverlässigkeit und Sensibilität aufweist, bleibt die fMRT der Maus aus zahlreichen Gründen technisch anspruchsvoll1. Erstens hat fMRT eine schlechte räumliche und zeitliche Auflösung. Die geringe Größe des Mausgehirns erfordert die Verwendung starker Magnetfelder mit teuren Scannern, um eine vernünftige räumliche Auflösung zu erreichen. Zweitens ist es bei anästhesierten Mäusen sehr schwierig, stabile physiologische Parameter innerhalb des engen Bereichs aufrechtzuerhalten, die eine effiziente neurovaskuläre Kopplung ermöglichen. Schließlich hat das BOLD-Signal (Blood Oxygen Level Dependent), auf das sich fMRT-Studien stützen, eine relativ schlechte Empfindlichkeit, was zu einem niedrigen Signal-Rausch-Verhältnis führt, wenn es auf Mäuse angewendet wird, und erfordert oft eine wiederholte Reizpräsentation über lange Erfassungen, um kleine Variationen zu erkennen. Da die Maus das am weitesten verbreitete Tiermodell in der biomedizinischen präklinischen Forschung ist, sind diese Einschränkungen teilweise für die Translationslücke in der Neuropsychiatrie verantwortlich und behindern neue vielversprechende therapeutische Ziele auf der Bank, die in wirksame Behandlungen am Krankenbett umgesetzt werden können.
Funktioneller Ultraschall (fUS) ist eine kürzlich entwickelte Neuroimaging-Technik, die auf ultraschnellem Doppler2basiert. Durch die direkte Entnahme des zerebralen Blutvolumens ermöglicht diese Technik die Untersuchung der Gehirnaktivität in Echtzeit durch die neurovaskuläre Kopplung. Im Vergleich zu anderen Neuroimaging-Techniken liefert fUS eine räumliche Auflösung von 100 μm und eine zeitliche Auflösung im zweistelligen Millisekundenbereich. Diese Technik ermöglicht die Bildgebung des gesamten Gehirns von vollständigen koronalen Abschnitten des Mausgehirns, vollständig nicht-invasiv. Darüber hinaus ist es voll kompatibel mit bewussten und sich verhaltenden Tieren3,4,5. Eine der wichtigsten aktuellen Einschränkungen von fUS ist seine 2D-Funktion, die es ermöglicht, eine einzelne koronale Ebene gleichzeitig aufzunehmen. Während volumetrische 3D-fUS unter Verwendung von 2D-Matrix-Array-Aufnehmern bereits erfolgreich bei Ratten6 nachgewiesen und bei Mäusen7bestätigt wurden, erfordert ihr derzeitiger Mangel an Empfindlichkeit eine vollständige Kraniotomie sowie die durchschnittliche Anzahl von Studien, um eine leichte Änderung der Aktivität zu erkennen. Alternativ können lineare Wandler über mehrere Positionen gestuft werden und funktionelle Bildgebungsebene für Ebene durchführen, um das gesamte Gehirn abzudecken. Diese Technik erfordert jedoch zahlreiche experimentelle Paradigmenwiederholungen und damit lange Erfassungszeiten (3-4 Stunden für das Mausgehirn)8,9.
In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir eine robuste experimentelle Plattform mit einem kommerziell erhältlichen funktionellen Ultraschallgerät und einem schnellen linearen Wandler mit Methoden zur Erfassung von 3D-fUS-Daten in anästhesierten und wachen Mäusen, die eine volumetrische und transkranielle funktionelle Kartierung des Mausgehirns ermöglichen, nicht-invasiv, ohne Kontrastmittel und innerhalb kurzer Erfassungszeiten. Wir veranschaulichen diese Eigenschaft, indem wir die Aktivierung des somatosensorischen Kortex nach whisker Stimulation sowie die funktionelle Konnektivität im Ruhezustand kartieren. Neben der Tieraufbereitung und Datenerfassung beschreiben wir auch das Verfahren zur Visualisierung, Atlasregistrierung und Analyse von Echtzeit-fUS-Signalen.
Protocol
Alle hier vorgestellten Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der Richtlinie des Rates der Europäischen Gemeinschaft vom 22. September 2010 (010/63/EU) und unserer lokalen Ethikkommission (Comité d'éthique en matière d'expérimentation animale Nummer 59, "Paris Centre et Sud", Projekt Nr. 2017-23) durchgeführt. Erwachsene Mäuse (männlich C57BL/6 Rj, Alter 2-3 Monate, 20-30 g, von Janvier Labs, Frankreich) wurden 4 pro Käfig mit einem 12h Hell/Dunkel-Zyklus, konstanter Temperatur bei 22 °C und Nahrung und Wasser ad libitum untergebracht. Vor Beginn der Versuche erhalten die Tiere eine einwöchige Mindestgewöhnungszeit an die Haltungsbedingungen.
1. Tierische Vorbereitung für die anästhesierte fUS-Bildgebung
- Anästhesie
- Wiegen Sie die Maus.
- Eine Mischung aus Ketamin und Xylazin bei 10 mg/ml bzw. 2 mg/ml in steriler Kochsalzlösung zubereiten. 0,2 ml der Ketamin/Xylazin-Lösung intraperitoneal mit einer 26-Gauge-Nadel und einer 1-ml-Einwegspritze verabreichen. Positionieren Sie das Tier nach einigen Minuten auf dem stereotaktischen Rahmen und stellen Sie sicher, dass der Kopf flach ist.
- Verabreichen Sie ein zweites Volumen Anästhetika, um eine Gesamtdosis von 100 mg/kg Ketamin und 20 mg/kg Xylazin (unter Berücksichtigung der Anfangsdosis) zu erreichen.
HINWEIS: Die Anästhesie sollte 1 Stunde dauern. Um eine gleichmäßige Sedierung über einen längeren Zeitraum aufrechtzuerhalten, injizieren Sie alle 30 minuten intraperitoneal 0,05 ml des Ketamin/Xylazin-Gemisches.
-
Tierpräparation für die anästhesierte Bildgebungssitzung
- Tragen Sie etwas Augensalbe (z. B. Ocry-Gel) auf die Mausaugen auf, um eine Kataraktbildung während der Bildgebungssitzung zu vermeiden. Rasieren Sie den Mauskopf mit einem Trimmer. Tragen Sie etwas Enthaarungscreme auf und spülen Sie sie nach ein paar Minuten aus. Wiederholen Sie dies, bis die Haare vollständig entfernt sind.
- Setzen Sie subkutane Stifte in die Gliedmaßen für die Elektrokardiogramm-Aufzeichnung (EKG) ein. Zentrifugiertes Ultraschallgel (1500 U/min, 5 min) auf den Kopf auftragen.
- Überwachen Sie die Tiefe der Anästhesie während der gesamten Dauer der Experimente (einschließlich Anästhesieinduktion). Halten Sie die Temperatur der Tiere bei 37 °C, indem Sie eine Heizdecke verwenden, die an eine Rektalsonde gekoppelt ist.
- Überwachen Sie die folgenden physiologischen Parameter, die indirekte Indikatoren für die Tiefe der Anästhesie sind: Herzfrequenz (220-250 Schläge pro Minute - überwacht durch das Elektrokardiogramm dünne Elektroden, die subkutan implantiert werden) und Atemfrequenz (130-140 Atemzüge pro Minute - überwacht mit einem Spirometer, das an das EKG-Erfassungssystem angeschlossen ist).
HINWEIS: Eine Beschreibung des Versuchsaufbaus ist in Abbildung 1 dargestellt.
Abbildung 1: Versuchsaufbau für anästhesierte fUS-Experimente. Beschreibung des Versuchsaufbaus mit allen wissenschaftlichen Geräten, die während eines betäubten Experiments benötigt werden. 1. Physiologische Überwachung: Live-Anzeige sowohl der Atem- als auch der Herzfrequenzen. 2. Vierachsiges Motormodul (drei Übersetzungen und eine Rotation), das vom Iconeus One-System (9) überwacht wird und die Durchführung transkranieller 3D-tomographischer Scans oder 4D-Aufnahmen ermöglicht. 3a. Servo-Motor, der den Whisker-Stimulator antreibt (3b.) Der Servomotor wird von einer Arduino uno-Karte gesteuert, die mit dem Iconeus One-System (9) verbunden ist, um Stimulationsmuster mit Bildsequenzen zu synchronisieren. 4.a. Spritzenpumpenregler. 4.b. Spritzenhalter. 5.a. Temperaturplattenmonitor zur Steuerung der Heizplatte. 5.b. Heizplatte und Rektalthermometer in Verbindung mit dem Temperaturplattenmonitor (5.a.). 6. Ultraschallgel, das zwischen dem Kopf des Tieres und der Ultraschallsonde platziert wird und eine akustische Kopplung zwischen ihnen ermöglicht. 7. 15 MHz Ultraschallsonde. 8. Sondenhalter, der die Sonde (7) mit dem Motormodul (2) verbindet. 9. Iconeus One Ausrüstung und Software, die die Programmierung verschiedener Bildgebungssequenzen und die Steuerung des Motormoduls ( 2 ) ermöglicht, das dieSondeantreibt (7). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
2. Tierpräparat für Experimente mit wachen, kopffixierten Mäusen
- Kopfplattenchirurgie
- Legen Sie das betäubte Tier (Schritte 1.1-1.2) in den stereotaktischen Rahmen auf ein Heizkissen (37 °C). Tragen Sie ein Schutzgel für die Augen auf und verabreichen Sie Lidocain s.c. (0,2 ml, 2 %) mit einer 26-Gauge-Nadel unter die Kopfhaut und warten Sie einige Minuten.
HINWEIS: Überwachen Sie das Anästhesieniveau alle 10-30 Minuten durch Ansprechen (Fehlen von) auf eine feste Zehenklemme. - Führen Sie einen Schnitt nach der sagittalen Naht von hinter dem Hinterhauptbein bis zum Beginn des Nasenbeins durch. Schneiden Sie mit einer chirurgischen Schere die Haut über beide Hemisphären aus.
- Reinigen Sie den Schädel mit 1% iger Jodlösung und entfernen Sie das verbleibende Periost. Bohren Sie mit der Kopfplatte als Schablone zwei Löcher (1 mm Durchmesser) in den Schädel, um die Verankerungsschrauben zu positionieren.
VORSICHT: Achten Sie darauf, nicht vollständig durch den Schädel zu bohren, um Hirnschäden oder Dura-Entzündungen zu vermeiden - Positionieren Sie die Kopfplatte mit den Schrauben. Verwenden Sie Zahnzement, um die Schrauben und die Kopfplatte vorne und hinten am Rahmen zu befestigen, um einen guten Halt des Implantats zu erhalten.
VORSICHT: Achten Sie darauf, keinen Zement im Rahmenfenster aufzutragen, da dies die Signalqualität stark beeinträchtigt. Bedecken Sie den Schädel mit einer dünnen Schicht chirurgischen Klebstoffs, um den Knochen zu schützen und die Wunden an der Seite des Bildgebungsfensters zu versiegeln. - Entfernen Sie das Tier aus dem stereotaktischen Rahmen, nachdem der Zement getrocknet ist, und kehren Sie die Anästhesie durch eine subkutane Injektion von Atipamezol bei 1 mg / kg um. Eine prophylaktische Verabreichung von Meloxicam (5 mg/kg/Tag, s.c.) wird bei postoperativen Schmerzen verabreicht.
- Legen Sie das Tier in einen Aufwachkäfig auf ein Heizkissen (37 °C). Die Maus kann ihren Heimkäfig mit Wurfgeschwistern innerhalb weniger Stunden zurückgeben. Legen Sie zum Schutz eine magnetische 3D-gedruckte Kappe (Polyactsäurematerial mit Magneteinsätzen) über die Kopfplatte (Abbildung 2A). Lassen Sie die Maus 4 bis 6 Tage vor Beginn der Gewöhnung an den Wohnmobilkäfig (MHC) erholen.
HINWEIS: Das Gesamtgewicht der Kappe und der Kopfplatte beträgt 2,8 g.
- Legen Sie das betäubte Tier (Schritte 1.1-1.2) in den stereotaktischen Rahmen auf ein Heizkissen (37 °C). Tragen Sie ein Schutzgel für die Augen auf und verabreichen Sie Lidocain s.c. (0,2 ml, 2 %) mit einer 26-Gauge-Nadel unter die Kopfhaut und warten Sie einige Minuten.
- Handhabung und Gewöhnung
- Halten Sie die Maus am Tag 1 nach der Genesung (PR) mehrmals täglich 5-10 Minuten lang vorsichtig in der Hand.
- Wiederholen Sie an Tag 2 PR die Handhabung wie an Tag 1 und lassen Sie das Tier für 5-10 Minuten frei MHC erkunden.
HINWEIS: Das Abspielen von Hintergrundmusik im Raum kann helfen, den Stress des Tieres zu reduzieren. - Lassen Sie das Tier an Tag 3 PR 5-10 Minuten lang den MHC frei erkunden. Greifen Sie anschließend vorsichtig nach der Kopfplatte und legen Sie sie vorsichtig in die Klemme, wobei Sie den Kohlekäfig manuell bewegen, um die Maus zu begleiten. Gewöhnen Sie das Tier für 5-10 min in die kopffixierte Position. Reinigen Sie den MHC zwischen den Trainingseinheiten mit 70% Ethanollösung und spülen Sie ihn mit Leitungswasser ab.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der MHC einen ausreichenden Luftstrom erhält, wie vom Hersteller empfohlen. Die Höhe der Kopfklemme muss manuell eingestellt werden, um eine bequeme Position zu gewährleisten. - An Tag 4 und 5 PR die Maus MHC wiederholt einklemmen und die kopffixierte Zeit schrittweise erhöhen, beginnend mit 5 min und bis zu 30 min. Tragen Sie etwas Kochsalzlösung und Ultraschallgel auf das Bildgebungsfenster auf, um sich daran zu gewöhnen.
- Wiederholen Sie an Tag 6 PR das Protokoll von Tag 4/5 PR und positionieren Sie die Sonde nach Schritt 3.1 über dem Kopf des Tieres.
- Gehen Sie am Tag des Experiments wie oben beschrieben vor. Befeuchten Sie dann das Bildgebungsfenster mit Kochsalzlösung und tragen Sie etwas Ultraschallgel auf. Starten Sie die Verfolgung des Tieres und fahren Sie mit der Positionierung der Sonde fort (siehe unten).
HINWEIS: Das Einklemmen des MHC kann auch dadurch erfolgen, dass die Maus in einen Lappen gewickelt wird. In diesem Fall müssen Mäuse vor der Kopffixierung an das Wickelverfahren gewöhnt werden. Eine Beschreibung eines vollständigen Versuchsaufbaus für die Wachbildgebung finden Sie in Abbildung 2B.
Abbildung 2: Versuchsaufbau für wache fUS-Experimente. Ein. Schematische Darstellung der magnetischen Abdeckung der Kopfplatte, die das Bildfenster schützt (erstellt mit BioRender.com). Während der Bildgebungssitzungen (links) wird die Abdeckung entfernt, um das Gehirn in der großen Öffnung der Kopfplatte zu scannen. B. Fotografie des Versuchsaufbaus für die transkranielle Wachbildgebung bei kopffixierten, sich frei verhaltenden Mäusen. 1. Iconeus One System und Software, die es ermöglicht, verschiedene Bildgebungssequenzen einzurichten und das Motormodul zu steuern. 2. Vier-Achsen-Motormodul (drei Übersetzungen und eine Rotation), das vom Iconeus One-System (1) überwacht wird und 3D-tomographische Scans oder 4D-Aufnahmen ermöglicht. 3. Luftabgabetisch. 4. Mobilheimkäfig (MHC). 5a,5b. Fotos, die nähere Ansichten der Umgebung des Tieres im MHC zeigen. 6. Kopffixierungssystem klemmt die Kopfplatte. 7. Sondenhalter, der die Sonde mit dem Motormodul verbindet (2). 8. 15 MHz Ultraschallsonde. 9. Ultraschallgel zwischen dem Mauskopf und der Ultraschallsonde platziert und sorgt für eine akustische Kopplung zwischen ihnen. 10. Servo-Motor, der den Whisker-Stimulator antreibt. Der Servomotor wird von einer Arduino Uno-Karte gesteuert, die über das TTL-Signal (1) mit dem Iconeus One-System verbunden ist, um Stimulationsmuster mit Bildsequenzen zu synchronisieren. Hrsg. Veranschaulichung der verschiedenen räumlichen Sampling-Möglichkeiten (erstellt mit BioRender.com): Jeweils wird die Sonde von der ersten position zur letzten gesteppt und an jeder Position ein Dopplerbild aufgenommen, um das gestapelte Volumen zu rekonstruieren. Dieser Vorgang wird während der gesamten Erfassungszeit kontinuierlich wiederholt. Dichter Scan (links): Der Schritt zwischen den Scheiben muss klein genug sein (typischerweise 400 μm, was der Höhenauflösung entspricht), um eine volumetrische Bildgebung zu ermöglichen. Sparse Scan (rechts): Wenn entfernte Funktionsbereiche (an verschiedenen Positionen) anvisiert werden, ist es auch möglich, die räumliche Abtastung zu verringern, um verschiedene Scheiben abzubilden, die diese Bereiche schneiden, ohne die zeitliche Abtastung zu beeinträchtigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
3. Positionierung der Sonde
- Starten Sie die Software (z.B. IcoScan) und erstellen Sie eine Experimentiersitzung. Wechseln Sie zum Menü Sonde verschieben, um die Position der Ultraschallsonde über die Navigationstastatur anzupassen.
HINWEIS: Die Sonde sollte etwa 1 mm über dem Kopf des Tieres positioniert werden. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Sonde in Kontakt mit Ultraschallgel ist, bevor eine Bildgebungssequenz gestartet wird. - Starten Sie die Live-View-Erfassung und passen Sie die Sondenposition bei Bedarf über die Echtzeitbildgebung des CBV (zerebrales Blutvolumen) des Tieres an. Richten Sie das Gehirn in der Mitte des Bildes aus. Optimieren Sie die Bildgebungsparameter, um das höchste Signal-Rausch-Verhältnis zu erfassen.
HINWEIS: Bei Experimenten mit wachen Mäusen muss die Öffnungsgröße reduziert werden, um Artefakte zu vermeiden, die durch laterale Muskelkontraktion induziert werden.
4. Angiographischer Scan und Atlasregistrierung
- Öffnen Sie die Angio 3D-Option in der Erfassungssoftware. Passen Sie im Voreinstellungsbereich die Scanparameter (erstes Slice, letztes Slice und Schrittgröße) an, um das gesamte Gehirn zu scannen(Abbildung 3A, B), und starten Sie die Erfassung.
HINWEIS: Stellen Sie beim Einrichten der Scanparameter sicher, dass der Scan den hinteren Teil des Gehirns abdeckt - Lassen Sie die Erfassungssoftware offen und starten Sie die Software zur Datenanalyse und Visualisierung (z. B. IcoStudio) und laden Sie den angio 3D-Scan. Navigieren Sie über das 3-Ansichten-Bedienfeld durch das Erfassungsvolumen und wählen Sie die koronale Scanrichtung:antero-posterior oder postero-anterior.
- Gehen Sie zum Brain Registration Panel. Laden Sie die Mausreferenzvorlage, die für den Registrierungsprozess benötigt wird. Registrieren Sie den Scan auf dem Allen Mouse Common Coordinates Framework mit dem vollautomatischen oder manuellen Registrierungsmodus (Abbildung 3C).
- Überprüfen Sie das Ergebnis, indem Sie sich die Überlagerung des Angio-3D-Scans und der Referenzvorlage ansehen oder indem Sie die Überlagerung des Scans und des Inbus-Referenzatlas mit dem Atlas Manager-Bedienfeld betrachten ( Abbildung3D). Speichern Sie die Registrierung als BPS-Datei.
HINWEIS: Die Registrierungsdatei kann für jede andere Erfassung wiederverwendet werden, die während derselben Testsitzung durchgeführt wird.
5. Gehirn-Positionierungssystem (BPS)
- Stellen Sie in der IcoStudio-Software sicher, dass der angiographische Scan und seine .bps-Datei (generiert in Schritt 4.4)geladen sind.
- Gehen Sie zum Brain Navigation Panel. Navigieren Sie im Atlas Manager-Bedienfeld mit dem Übergeordneten/Untergeordneten Baumnavigator durch den Maus-In-Hirnatlas. Finden Sie die anatomischen Zielregionen und wählen Sie sie aus, um sie Ihrem Scan in den 3-Ansichten zu überlagern.
- Visualisieren Sie die Zielregionen im 3-Ansichten-Bereich und wählen Sie eine Abbildungsebene, die die Zielregionen für das Experiment überlappt. Setzen Sie dazu manuell zwei Markierungen auf der koronalen Position, die die interessierenden Regionen enthält.
- Klicken Sie auf Brain Positioning System (BPS), um die resultierenden motorischen Koordinaten zu extrahieren. Diese Koordinaten entsprechen der Sondenposition, die es ermöglicht, die Zielebene abzubilden. Überprüfen Sie die Vorschau des Bildes, das aus dem Angio-Scan berechnet wird.
- Rufen Sie in der IcoScan-Software das Positionierungsfeld Probe auf und klicken Sie auf BPS-Koordinaten eingeben. Wenden Sie die in Schritt 5.4angegebenen Koordinaten an. Die Sonde bewegt und richtet sich auf der zielgerichteten Abbildungsebene aus.
- Führen Sie eine Live-View-Erfassung durch und überprüfen Sie, ob die aktuelle Abbildungsebene der vorhersage in Schritt 5.4entspricht.
HINWEIS: Es ist auch möglich, parasagittale/nicht orthogonale Ebenen auszuwählen.
Abbildung 3: Schneller transkranieller angiographischer Scan und Gehirnregistrierung für eine präzise Sondenpositionierung. Ein. Schematische Darstellung des Mausgehirns, das von der Ultraschallsonde transkraniell von der ersten koronalen Scheibe (grün) bis zur letzten koronalen Scheibe (blau) während eines schnellen angiographischen Scans gescannt wird. Der aktuell abgebildete Schnitt (rot dargestellt) bewegt sich Schritt für Schritt von hinten (grün) nach vorne (blau) des Gehirns. Erstellt mit BioRender.com B. Screenshot der IcoScan-Erfassungssoftware im Angio 3D-Panel. Die voreingestellten Parameter auf der rechten Seite konfigurieren den schnellen Scan. Die Positionen in mm der ersten Scheibe, der letzten Scheibe und der Schrittweite müssen gut gewählt werden, um das gesamte Gehirn linear zu scannen. Hrsg. Screenshot der IcoStudio-Verarbeitungssoftware. Der schnelle Angio 3D-Scan wird automatisch auf eine Referenzvorlage des Mausgehirns registriert. Die drei Ansichten (links) zeigen die Überlagerung des Gefäßsystems und des Mausgehirn-Allen-Atlas in der koronalen, sagittalen und axialen Ansicht. Hrsg. Lineares Layout (Montage) von 16 Scheiben (von 31) aus dem 3D-Angio-Scan, wobei der registrierte Allen-Referenzatlas dem Gefäßsystem überlagert wird. E. Hrsg. Screenshot des Gehirnnavigationsfelds, der die vorhergesagte Bildgebungsebene zeigt, die den von der Software berechneten motorischen Koordinaten entspricht, dank der beiden Marker, die in der Mitte des linken und rechten primären somatosensorischen Kortex, der Region der Fassfelder, platziert sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
6. Task-evoziertes Experiment: Whisker-Stimulation
- Definieren Sie die Stimulationssequenz vor, einschließlich des Stimulationszeitpunkts, der Interstimulationszeit und der Anzahl der Wiederholungen.
- Führen Sie eine 3D-fUS-Sequenz aus, indem Sie die Gesamterfassungszeit, die Anzahl der Positionen sowie die Totzeit zwischen den Positionen definieren. Im Falle einer automatischen Stimulation, die über den TTL-Eingang mit dem Erfassungssystem synchronisiert ist, wählen Sie die Trig-IN-Option, bevor Sie mit der Erfassung beginnen.
ANMERKUNG: Für die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse wurde die Stimulation mit einem Wattestäbchen durchgeführt, das so positioniert war, dass die meisten Schnurrhaare in dorsaler/ventraler Richtung abgelenkt werden konnten. Es wurde auf einem Servomotor befestigt, der von einer Arduino UNO-Karte angetrieben wurde, die mit dem Iconeus One-System verbunden war, um die Synchronisation zu gewährleisten. Die empfohlenen Parameter für die Stimulation sind 30 s ON, 30 s OFF, Amplitude von 20° und 4 Hz Frequenz. Alternativ kann die Stimulation auch manuell durchgeführt werden, indem die Schnurrhaare zu den definierten Zeiten während der Erfassung abgelenkt werden. - Öffnen Sie die Erfassung in der IcoStudio-Software und rufen Sie das Aktivierungskartenmenü auf. Füllen Sie das Aktivierungsmusterfeld mit Start- und Endzeiten aus, und berechnen Sie die Aktivierungszuordnung. Passen Sie die Anzeigeparameter für die Visualisierung an. Exportieren Sie die Aktivierungszuordnung als H5-Datei für die Offline-Analyse.
HINWEIS: Die Aktivierung wird unter Verwendung eines generalisierten linearen Modellansatzes (GLM) geschätzt, wobei der Stimulus durch eine standardmäßige hämodynamische Reaktion der Maus (HRF) konvolviert wird. Alternativ kann die Aktivierung direkt visualisiert werden, indem die Pearson-Korrelation zwischen dem Stimulationsmuster und dem hämodynamischen Signal jedes Voxels geschätzt wird.
7. Funktionale 4D-Konnektivität
- Führen Sie eine 3D-fUS-Sequenz aus, indem Sie die Gesamterfassungszeit, die Anzahl der Positionen der Abbildungsebene sowie die Totzeit zwischen den Positionen definieren.
HINWEIS: Für die funktionale 4D-Konnektivität empfehlen wir die Erfassungszeit zwischen jedem Volume < 2,5 s (Abtastfrequenz von mindestens 0,4 Hz) und einer Gesamtaufnahmezeit von mindestens 10 min (Anzahl der Zeitpunkte > 180). - Speichern Sie die Erfassung und laden Sie sie in die IcoStudio-Software. Laden Sie bei Bedarf die BPS-Datei und das Gehirnkoordinatenframework der Allen-Maus. Wählen Sie im Atlas-ManagerRegionen des Atlas als Regions of Interest (ROI) aus.
- Rufen Sie das Menü Funktionale Konnektivität auf und wählen Sie die gewünschten Regionen im ROI-Manager aus. Visualisieren Sie die Ergebnisse als Konnektivitätsmatrix (überwachte Analyse) oder Seed-basierte Korrelationskarte (unbeaufsichtigt). Wählen und passen Sie die Bandbreitenfilter nach Belieben an und exportieren Sie Korrelationsergebnisse für die statistische Analyse.
HINWEIS: Im 3D-fUS-Bildgebungsmodus werden die relativen Sondenpositionen manuell eingestellt. Somit sind zwei Arten von Scans möglich und können je nach funktionaler Anwendung gewählt werden: dichte Scans versus Spärliche Scans (Abbildung 2C).
Representative Results
Dieses Protokoll beschreibt die 3D-Quantifizierung zerebraler hämodynamischer Variationen transkraniell im Gehirn der Maus, in Ruhe oder als Reaktion auf sensorische Stimulation. Die Whisker-Stimulation, ein Standardparadigma zur Abbildung der funktionellen Aktivierung des Gehirns bei Nagetieren, wurde als Beispiel für eine sensorische Stimulationsreaktion ausgewählt. Abbildung 4 zeigt eine repräsentative Aktivierungskarte als Reaktion auf die mechanische Whisker-Stimulation in einer anästhesierten Maus, die mit transkranieller fUS-Bildgebung erhalten wurde. Die Gesamtversuchszeit betrug 760 s, mit einer Ausgangslinie von 60 s (vor und nach der Stimulation), einer Stimulation von 80 s und einer Erholungszeit von 60 s, die 5x wiederholt wurde. Die signifikante Aktivierung wurde mit der Auflösung eines allgemeinen linearen Modells (GLM) unter Verwendung einer standardmäßigen hämodynamischen Reaktionsfunktion (HRF) der Maus bestimmt. Die aktivierten Bereiche (Z punktet mit p-Wert >0,0000006 nach strenger Bonferroni-Korrektur für mehrfachen Vergleich) werden als farbcodierte Werte angezeigt, die auf der Allen Common Coordinate Framework-Vorlage überlagert sind. Der voxelweise Zeitverlauf des kontralateralen primären somatosensorischen Kortex, Der Tonnenfeldregion (S1BF) zeigte einen Anstieg des CBV um 15-20% im Vergleich zum Ausgangswert.
Abbildung 4: Transkranielle Aktivierung Maps und rCBV-Zeitverlauf nach Whiskers-Stimulation in Ketamin/Xylazin anästhesierter Maus. Ein. Aktivierungskarte mit signifikant aktivierten Voxeln nach mechanischer Stimulation der rechten Schnurrhaare (80 s ON, 60 s OFF, 5x) unter Ketamin/Xylazin-Narkose. Die Karten wurden durch die Berechnung von Z-Scores auf der Grundlage der allgemeinen linearen Modellanalyse (GLM) mit Bonferroni-Korrektur für den Mehrfachvergleich erhalten. Z-Scores (farbcodiert) werden auf der Allen Brain 3D-Vorlage (nach Registrierung beim Gehirnpositionierungssystem) überlagert und in drei Ansichten angezeigt: koronal (links), sagittal (Mitte) und axial (rechts). Anatomische Regionen aus dem gemeinsamen Koordinatengerüst des Gehirns der Allen-Maus werden als Referenz angezeigt. Aktivierte Voxel befinden sich gut im linken S1BF-Kortex. Maßstabsleiste: 1 mm. Jedes Probenvolumen wurde über 2,8 mm (entsprechend 7 Scheiben in Elevationsrichtung) in 3,85 s gescannt, so dass bei jeder funktionellen Reaktion 20 volumische Proben aufgezeichnet werden konnten. B. 3D-Rendering des anstiegs des durch die Whisker-Stimulation hervorgerufenen relativen zerebralen Blutvolumens (rCBV) im Vergleich zum Ausgangswert. Die anatomische Abgrenzung des S1BF ist blau dargestellt. Hrsg. Zeitverlauf der CBV-Variationen im linken S1BF (blau) und des entsprechenden angewendeten Stimulus (rot). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Das gleiche Paradigma wurde in einer kopffixierten Maus im mobilen Homecage mit dem Wachvoreinstellung von IcoScan angewendet. Abbildung 5 zeigt die Aktivierungskarte nach einem Experiment zur Stimulation mehrerer Schnurrhaare unter Verwendung des in Abbildung 2beschriebenen Versuchsaufbaus. Einige posteriore und kaudale Schnurrhaare wurden mit folgendem Muster stimuliert: 30 s Baseline, gefolgt von fünf aufeinanderfolgenden Versuchen mit 30 s ON (4 Hz) und 30 s OFF (Abbildung 5C). Die Stimulation erfolgte über einen Servomotor, der von einer Arduino UNO-Karte angetrieben wurde und die Bildaufnahmesequenz für die Synchronisation auslöste. Die signifikante Aktivierung wurde mit der Auflösung eines allgemeinen linearen Modells (GLM) unter Verwendung einer standardmäßigen hämodynamischen Reaktionsfunktion (HRF) der Maus bestimmt. Die mehrfache Vergleichskorrektur wurde mit der Bonferroni-Methode durchgeführt. Der konventionelle Alpha-Wert von 0,05 wurde durch die Gesamtzahl der Voxel im Erfassungsvolumen normalisiert, was zu einem endgültigen strengen Schwellenwert von 0,000003 führte.
Abbildung 5: Aktivierungskarten und rCBV-Zeitverlauf nach Whisker-Stimulation bei sich wach verhaltenden Mausen. Ein. Aktivierungskarte, die signifikant aktivierte Voxel nach mechanischer Stimulation der rechten Schnurrhaare (30 s ON, 30 s OFF, 5x) in einer wachen Maus im mobilen Homecage zeigt. Karten wurden durch berechnung von Z-Scores basierend auf der allgemeinen linearen Modellanalyse (GLM) mit Bonferroni-Korrektur für den Mehrfachvergleich (Normalisierung durch die Gesamtzahl der Voxel) erhalten. Z-Scores (farbcodiert) werden auf der Allen Brain 3D-Vorlage (nach Registrierung beim Brain Positioning System) überlagert und in drei Ansichten angezeigt: koronal (links), sagittal (Mitte) und axial (rechts). Anatomische Regionen aus dem Allen Mouse Brain Common Coordinate Framework werden als Referenz angezeigt. Aktivierte Voxel befinden sich gut im linken S1BF-Kortex. Skalenstangen, 1 mm. Jedes Probenvolumen wurde über 1,6 mm (entsprechend 3 Scheiben in Elevationsrichtung) in 3,85 s gescannt, so dass bei jeder funktionellen Reaktion 17 volumische Proben aufgezeichnet werden konnten. B. 3D-Rendering des Anstiegs des durch Die Stimulation des Whiskers evozierten relativen zerebralen Blutvolumens (rCBV) im Vergleich zum Ausgangswert. Die anatomische Abgrenzung des S1BF ist blau dargestellt. Hrsg. Illustration der Maus im mobilen Homecage während des rechten Whisker-Stimulationsexperiments, bei dem fünf 30-s-Versuche für eine Gesamterfassungszeit von 330 s durchgeführt wurden. Momentaner relativer CBV-Zeitverlauf extrahiert innerhalb des aktivierten Bereichs (blau), wobei der entsprechende Reiz überlagert wird (rot). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6 zeigt die zeitlichen Korrelationen von normalisierten niederfrequenten (<0,2 Hz) spontanen CBV-Fluktuationen zwischen 3D-Hirnregionen (identifiziert durch Registrierung zum Gemeinsamen Allen-Koordinatengerüst) in einer Ketamin-Xylazin-anästhesierten Maus. Die Gesamterfassungszeit betrug 20 min (1200 s). Die von Atlas überwachte Analyse ergab starke interhemisphärische Konnektivitätsmuster mit resultierenden Korrelationskoeffizientenwerten von bis zu 0,8. Die samenbasierte Analyse im dorsalen Hippocampus ergab eine signifikante interhemisphärische Konnektivität zwischen rechtem und linkem Hippocampus sowie tiefen retro-hippokampalen Regionen und piriformen Kortexen. Eine im S1BF ausgewählte Saatgutregion ergab ebenfalls ein symmetrisches (kortiko-kortikales) Korrelationsmuster, wie zuvor beschrieben.
Abbildung 6: Transkranielle volumetrische funktionelle Konnektivität des Mausgehirns im Ruhezustand unter Ketamin/Xylazin-Anästhesie, beurteilt bei einer 20-minütigen 3D-fUS-Akquisition. Ein. Korrelationsmatrix basierend auf 3D-Regionen des gemeinsamen Allen-Koordinatengerüsts, die auf der transkraniellen Funktionserfassung registriert sind. Die Matrix wird durch Berechnung der normalisierten Pearson-Korrelation spontaner niederfrequenter Fluktuationen (<0,1 Hz) der durchschnittlichen Zeitsignale aller Voxel erhalten, die in jedem identifizierten ROI nach der Slice-Timing-Korrektur enthalten sind. Jedes abgetastete Volumen wurde über 1,6 mm in der Höhenrichtung (entsprechend 4 Scheiben) gescannt, die über 2,2 s. Berfasst wurde. Seed-basierte Analyse projiziert auf eine 3D-Vorlage. Der Samen wurde im rechten dorsalen Hippocampus an β - 2, 1 mm ausgewählt. Die Korrelationskarte wird durch Berechnung des Pearson-Korrelationskoeffizienten zwischen den zeitlichen Signalen des Samens und jedem Voxel der gesamten Erfassung nach der Slice-Timing-Korrektur erhalten. C. 3D-Korrelationskarte basierend auf einer samenbasierten Analyse mit ausgewählter Samenregion innerhalb der S1BF bei β - 2,1 mm. Maßstabsbalken: 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Discussion
Bildgebende Verfahren des gesamten Gehirns sind entscheidende Werkzeuge, um die Physiologie und Pathologie des Gehirns besser zu verstehen. Die hier beschriebene Methode erlaubt die präzise Quantifizierung hämodynamischer Signale im lebenden Gehirn direkt an der Bank. Die unübertroffene Sensitivität und räumlich-zeitliche Auflösung des funktionellen Ultraschalls eignet sich besonders gut für die Mausphysiologie. Funktionelle Reaktionen und Ruhezustandsnetzwerke können innerhalb kurzer Erfassungszeiten longitudinal und ohne durchschnittliche Studien oder Probanden abgebildet werden, um ein zuverlässiges Maß zu erhalten. Die relevante Kombination aus hochempfindlichen linearen Ultraschallsonden und schnellen motorisierten Setups ermöglicht es, transkranielle volumetrische fUS-Bildgebung bei Mäusen innerhalb angemessener Erfassungszeiten durchzuführen. Dieses Protokoll kann entweder an betäubten oder wachen Mäusen mit einem Wohnmobilkäfig durchgeführt werden.
Die Whisker-Stimulation, der sensorische Reiz, der in diesem Manuskript als veranschaulichendes Beispiel verwendet wird, ist ein Standard-Paradigma der funktionellen Aktivierung bei Nagetieren und ein zuverlässiges Auslesen, um die sensorische Verarbeitung, die neurovaskuläre Kopplung und ihre Veränderungen zu untersuchen5,6,10,11. Während das grobe manuelle Bürsten der Schnurrhaare wegen seiner Benutzerfreundlichkeit bevorzugt werden kann, fehlt es dieser Methode an räumlicher und zeitlicher Präzision. Die Verwendung eines automatischen Stimulators, wie er hier mit dem fUS-Bildgebungsscanner ausgelöst wird, ermöglicht eine bessere Kontrolle mehrerer Parameter, einschließlich des Zeitpunkts des Auftretens, der Amplitudenverschiebung, der Frequenz sowie des Winkels der Q-Spitze / des Kamms, was zu einer besseren Reproduzierbarkeit zwischen den Tieren führt. Darüber hinaus ermöglicht ein präziseres Timing der Stimulation die Modellierung der hämodynamischen Reaktionsfunktion (HRF) durch Bestimmung der Zeit bis zum Einsetzen und der Zeit bis zum Peak der Parameter12,13. Um eine bessere Präzision bei der Anzahl der während der Stimulation abgelenkten Schnurrhaare (und damit des Bereichs der aktivierten Region) zu gewährleisten, können ausgefeiltere Stimulatoren an dieses Protokoll angepasst werden. Viele andere Reize wie Licht8,Ton14 oder Geruchsdarstellung15 können mit dem gleichen Protokoll umgesetzt werden.
Die Kompatibilität von funktionellem Ultraschall mit wachen und sich verhaltenden Tieren ist ein wichtiger Vorteil im Vergleich zu anderen Neuroimaging-Techniken, der eine funktionelle Aktivierungskartierung ohne anästhesieverzerrung ermöglicht. Die Verwendung eines luftgestützten mobilen Heimkäfigs ist eine gute Alternative zu anderen bestehenden kopffesten Geräten wie linearen oder sphärischen Laufbändern. Während die Bewegung des Homecage fest am Kopf fixiert ist, gibt sie der Maus die Illusion, durch die Umgebung zu navigieren, so dass eine breite Palette von Verhaltenstests an die fUS-Bildgebung16gekoppelt werden kann. Das Gewöhnungsverfahren zur Kopffixierung stellt jedoch einen wichtigen Schritt zur Verringerung von Stress dar, insbesondere für Experimente, bei denen es als Störfaktor angesehen werden kann. Das hier beschriebene Verfahren (6 Tage Handhabung und Gewöhnung an die Kopffixierung) liefert robuste Ergebnisse für die sensorische Stimulation und die funktionelle Konnektivität im Ruhezustand. Es könnte jedoch notwendig sein, die Gewöhnungszeit für verfeinerte Verhaltenstests zu verlängern17.
Disclosures
Jeremy Ferrier und Bruno-Félix Osmanski sind Mitarbeiter von Iconeus. Thomas Deffieux, Zsolt Lenkei, Bruno-Félix Osmanski und Mickael Tanter sind Mitbegründer und Gesellschafter von Iconeus.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch den Advanced Grant N° 339244-FUSIMAGINE des Europäischen Forschungsrats (ERC), die Nationale Forschungsagentur zur Finanzierung von "Pinch" (ANR-18-CE37-005), den Inserm Research Technology Accelerator in Biomedical Ultrasound, den elfus technischen Kern des IPNP, Inserm U1266, das europäische Forschungsprogramm FUSIMICE des Human Brain Project und embo Short-Term Fellowship 8439 an Andrea Kliewer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Plastipak 1 mL syringes | Dutscher, France | 303172 | |
| BD Microlance 26 Gauge needles | Dutscher, France | 303800 | |
| Animal Temperature Controller (heating Plate coupled with a rectal probe) | Physitemp | TCAT-2DF | |
| Arduino | Arduino | Arduino Uno-Rev3 | |
| Atipamezole | Orion Pharma, France | Antisedan® | 5 mg/ml injectable solution |
| Dental Ciment | Sun Médical, Shiga, japan | Superbond C&B | |
| Depilatory cream | Klorane | N/A | |
| Eye Ointment | TVM, UK | Ocry-gel | |
| Hair trimmer | Wella Profesionnals | N/A | |
| Head plates | Neurotar, Finland | Model 14 | |
| Iconeus One standard package for fUS | Iconeus, France | Iconeus One | |
| IcoScan acquisition software (v1.0) | Iconeus, France | IcoScan | |
| IcoStudio analysis software (v1.0) | Iconeus, France | IcoStudio | |
| Isoflurane Anesthesia station | Minerve, Esternay, France | ||
| Ketamine | Virbac, France | Ketamine1000 | 100 mg/ml injectable solution |
| Lidocaine | Vetoquinol | Lurocaine® | 20 mg/ml injectable solution |
| Medetomidine | Orion Pharma, France | Domitor® | 1 mg/ml injectable solution |
| Meloxicam | Boehringer lingelheim | Metacam® | 0.5 mg/ml injectable solution |
| Mobile HomeCage Large with tracking capability | Neurotar, Finland | MHC-L-T-V4 | |
| Monitoring of ECG and breathing rate | AD Systems, (USA) and LabChart software | ||
| Servomotor | Feetech | FT90B | |
| Stereotaxic frame | David Kopf (Tujunga, USA) | 900-WA | Using Mouse Adaptor (Ref: 922) and Non-Rupture Ear Bars (ref: 922) |
| Surgical glue | 3M, USA | Vetbond | |
| Syringe Pump | KD Scientific, USA | Legato® 130, Cat# 788130 | |
| Ultrasound gel | DREXCO medical, France | Medi'Gel | |
| Xylazine 2% | Bayer, France | Rompun® | 20 mg/ml injectable solution |
References
- Hoyer, C., Gass, N., Weber-Fahr, W., Sartorius, A. Advantages and challenges of small animal magnetic resonance imaging as a translational tool. Neuropsychobiology. 69 (4), 187-201 (2014).
- Deffieux, T., Demene, C., Pernot, M., Tanter, M. Functional ultrasound neuroimaging: a review of the preclinical and clinical state of the art. Current Opinion in Neurobiology. 50, 128-135 (2018).
- Rabut, C., et al. Pharmaco-fUS: Quantification of pharmacologically-induced dynamic changes in brain perfusion and connectivity by functional ultrasound imaging in awake mice. NeuroImage. 222, 117231 (2020).
- Tiran, E., et al. Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).
- Ferrier, J., Tiran, E., Deffieux, T., Tanter, M., Lenkei, Z. Functional imaging evidence for task-induced deactivation and disconnection of a major default mode network hub in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (26), 15270-15280 (2020).
- Rabut, C., et al. 4D functional ultrasound imaging of whole-brain activity in rodents. Nature Methods. 16 (10), 994-997 (2019).
- Brunner, C., et al. A platform for brain-wide volumetric functional ultrasound imaging and of circuit dynamics in awake mice. Neuron. 108 (5), 861-875 (2020).
- Gesnik, M., et al. 3D functional ultrasound imaging of the cerebral visual system in rodents. NeuroImage. 149, 267-274 (2017).
- Macé, É, et al. Whole-brain functional ultrasound imaging reveals brain modules for visuomotor integration. Neuron. 100 (5), 1241-1251 (2018).
- Macé, E., Montaldo, G., Cohen, I., Baulac, M., Fink, M., Tanter, M.
- Tiran, E., et al. Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).
- Claron, J., et al. Large scale functional ultrasound imaging of the spinal cord reveals in depth spatiotemporal responses of spinal nociceptive circuits in both normal and inflammatory state. Pain. , (2020).
- Aydin, A. K., et al. Transfer functions linking neural calcium to single voxel functional ultrasound signal. Nature Communications. 11 (1), 2954 (2020).
- Bimbard, C., et al. Multi-scale mapping along the auditory hierarchy using high-resolution functional ultrasound in the awake ferret. eLife. 7, 35028 (2018).
- Boido, D., et al. Mesoscopic and microscopic imaging of sensory responses in the same animal. Nature Communications. 10 (1), 1110 (2019).
- Kislin, M., et al. Flat-floored air-lifted platform: A new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents. Journal of Visualized Experiments. (88), e51869 (2014).
- Juczewski, K., Koussa, J. A., Kesner, A. J., Lee, J. O., Lovinger, D. M. Stress and behavioral correlates in the head-fixed method: stress measurements, habituation dynamics, locomotion, and motor-skill learning in mice. Scientific Reports. 10 (1), 12245 (2020).
