Summary
Detta protokoll beskriver kvantifieringen av volymetrisk cerebral hemodynamic variationer i mushjärnan med hjälp av funktionella ultraljud (fUS). Procedurer för 3D funktionell aktiveringskarta efter sensorisk stimulering samt vilotillstånd funktionell anslutning tillhandahålls som illustrativa exempel, i sövda och vakna möss.
Abstract
Funktionell ultraljud (fUS) imaging är en ny hjärnan imaging modalitet som förlitar sig på hög känslighet måttet på cerebrala blod volym uppnås av ultrasnabb doppler angiografi. Eftersom hjärnan perfusion är starkt kopplad till lokala neuronal aktivitet, tillåter denna teknik hela hjärnan 3D mappning av uppgift-inducerad regional aktivering samt vilo-tillstånd funktionella anslutning, icke-invasivt, med oöverträffad spatio-temporal upplösning och operativ enkelhet. I jämförelse med fMRI (functional magnetic resonance imaging) består en stor fördel med fUS-avbildning i att möjliggöra en fullständig kompatibilitet med vakna och betedande djurförsök. Dessutom är fMRI-hjärnkartläggning hos möss, den mest använda prekliniska modellen i neurovetenskap, fortfarande tekniskt utmanande på grund av hjärnans lilla storlek och svårigheten att upprätthålla stabila fysiologiska förhållanden. Här presenterar vi ett enkelt, pålitligt och robust protokoll för helhjärna fUS imaging i sövda och vakna möss med hjälp av ett off-the-shelf kommersiell fUS-system med en motoriserad linjär givare, vilket ger betydande när aktivering efter sensorisk stimulering samt reproducerbara 3D funktionella anslutningsmönster för nätverksidentifiering.
Introduction
Under de senaste två decennierna har neuroimaging blivit ett viktigt verktyg för att studera hjärnans funktion och organisation, vilket gör det möjligt för forskare att göra viktiga upptäckter inom neurovetenskap. Idag har funktionell magnetisk resonanstomografi (fMRI) blivit den kliniska neuroimaging-tekniken för guldstandard för att bedöma uppgift eller läkemedelsförand hjärnaktivering och kartlägga funktionell anslutning i vila. Medan mänsklig fMRI har hög tillförlitlighet och känslighet, är mus fMRI fortfarande tekniskt utmanande av många skäl1. För det första har fMRI en dålig rumslig och tidsmässig upplösning. Den lilla storleken på mushjärnan kräver användning av starka magnetfält med dyra skannrar för att uppnå rimlig rumslig upplösning. För det andra är det mycket svårt att upprätthålla stabila fysiologiska parametrar inom det smala intervallet som möjliggör effektiv neuro-vaskulär koppling hos sövda möss. Slutligen har den blodsyrenivåberoende (BOLD) signal som fMRI-studier förlitar sig på relativt dålig känslighet, vilket leder till lågt signal-till-brus-förhållande när det appliceras på möss och kräver ofta upprepad stimulanspresentation över långt förvärv för att upptäcka små variationer. Musen är den mest använda djurmodellen i biomedicinsk preklinisk forskning, dessa begränsningar är delvis ansvariga för translationella gapet i neuropsykiatri, vilket hindrar nya lovande terapeutiska mål på bänken som ska införlivas i effektiva behandlingar på sängen.
Funktionell ultraljud (fUS) är en nyligen utvecklad neuroimaging teknik baserad på ultrasnabb doppler2. Genom att direkt provtagning cerebral blod volym, denna teknik tillåter sondering hjärnaktivitet i realtid genom neurovaskulära kopplingen. Jämfört med andra neuroimaging tekniker ger fUS en rumslig upplösning på 100 μm och en temporal upplösning i tiotals millisekunder. Denna teknik tillåter hel-hjärnan imaging av kompletta koronal delar av mushjärnan, helt icke-invasivt. Dessutom är den fullt kompatibel med medvetna och betedande djur3,4,5. En av de viktigaste nuvarande begränsningarna för fUS är dess 2D-funktion, vilket gör det möjligt att spela in ett enda koronalplan samtidigt. Medan volymetrisk 3D fUS med hjälp av 2D matrismatrisgivare redan har visats framgångsrikt hos råttor6 och bekräftats hos möss7, kräver dess nuvarande brist på känslighet en fullständig kraniotomi samt i genomsnitt ett viktigt antal prövningar för att upptäcka en liten förändring av aktiviteten. Alternativt kan linjära givare klivas över flera positioner och utföra funktionella bildplan med plan för att täcka hela hjärnan. Denna teknik kräver dock många experimentella paradigmrepetitioner och som sådan långa förvärvstider (3-4 timmar för mushjärnan)8,9.
I det nuvarande arbetet beskriver vi en robust experimentell plattform inklusive en kommersiellt tillgänglig funktionell ultraljudsskanner och en snabb planväxling linjär givare med förfaranden för att förvärva 3D fUS-data i sövda och vakna möss, vilket möjliggör volymetrisk och transkraniell funktionell kartläggning av mushjärnan, icke-invasivt, utan kontrastmedel och inom korta förvärvstider. Vi illustrerar denna funktion genom att mappa somatosensory cortex aktivering efter whisker stimulering samt vilotillstånd funktionella anslutning. Förutom djurberedning och datainsamling beskriver vi också förfarandet för visualisering, atlasregistrering och analys av fUS-signaler i realtid.
Protocol
Alla de förfaranden som presenteras här har utförts i samförstånd med Europeiska gemenskapens rådsdirektiv av den 22 september 2010 (010/63/UE) och vår lokala etikkommitté (Comité d'éthique en matière d'expérimentation animale number 59, "Paris Centre et Sud", projekt #2017-23). Vuxna möss (hane C57BL/6 Rj, ålder 2-3 månader, 20-30 g, från Janvier Labs, Frankrike) var inhyst 4 per bur med en 12h ljus / mörk cykel, konstant temperatur vid 22 °C och mat och vatten ad libitum. Före början av experimenten ges djuren en minsta acklimatiseringsperiod på en vecka till bostadsförhållandena.
1. Djurpreparat för sövd fUS-avbildning
- Anestesi
- Väg musen.
- Förbered en blandning av ketamin och xylazin vid 10 mg/ml respektive 2 mg/ml i steril saltlösning. Administrera 0, 2 ml av ketamin/xylazinlösningen intraperitoneally med en 26 gauge nål och 1 ml engångsspruta. Efter några minuter placerar du djuret på den stereotaxiska ramen och ser till att huvudet är platt.
- Administrera en andra volym bedövningsmedel för att uppnå en total dos på 100 mg/kg ketamin och 20 mg/kg xylazin (med hänsyn till den ursprungliga dosen).
OBS: Anestesi bör pågå i 1 h. För att bibehålla en stadig sedering under en längre tid, injicera 0,05 ml av ketamin/xylazinblandningen var 30:e minut intraperitoneally.
-
Djurpreparation för sövd avbildningssession
- Applicera lite ögonsalva (t.ex. Ocry-Gel) på musögonen för att undvika kataraktbildning under avbildningssessionen. Raka mushuvudet med en trimmer. Applicera lite depilatorisk kräm och skölj efter ett par minuter. Upprepa tills håret är helt borttaget.
- Sätt in subkutana stift i extremiteterna för registrering av elektrokardiogram (EKG). Placera centrifugerad ultraljudsgel (1500 rpm, 5 min) på huvudet.
- Övervaka anestesidjupet under experimentens hela varaktighet (anestesiinduktion ingår). Håll djurens temperatur vid 37 °C genom att använda en värmefilt kopplad till en rektalsond.
- Övervaka följande fysiologiska parametrar som är indirekta indikatorer på anestesidjupet: Hjärtfrekvens (220-250 slag per minut - övervakas genom elektrokardiogrammet tunna elektroder implanterade subkutant) och andningsfrekvens (130-140 andetag per minut - övervakas med hjälp av en spirometer ansluten till EKG-förvärvssystemet).
OBS: En beskrivning av den experimentella installationen visas i figur 1.
Bild 1: Experimentell installation för sövda fUS-experiment. Beskrivning av den experimentella installationen som visar all vetenskaplig utrustning som behövs under ett sövdat experiment. 1. Fysiologisk övervakning: livevisning av både andningsfrekvenser och hjärtfrekvenser. 2. Fyraxlig motormodul (tre översättningar och en rotation) övervakad av Iconeus One-system (9) och som gör det möjligt att utföra transkraniella 3D-tomografiska skanningar eller 4D-förvärv. 3a. Servomotor som kör whiskerstimulatorn (3b.) Servomotorn styrs av ett arduino uno-kort som är interfaceed med Iconeus One-systemet (9) för att synkronisera stimuleringsmönster med bildsekvenser. 4.a. Sprutpumpsregulator. 4.b. Spruthållare. 5.a. Temperaturplattans monitor som styr värmeplattan. 17.b. Värmeplatta och rektaltermometer i gränssnitt till temperaturplattans monitor (5.a.). 6. Ultraljudsgel placerad mellan djurets huvud och ultraljudssonden, vilket ger akustisk koppling mellan dem. 7. 15 MHz ultraljudssond. 8. Sondhållare som länkar sonden (7) till motormodulen (2). 9. Iconeus En utrustning och programvara som gör det möjligt att programmera olika bildsekvenser och styra motormodulen (2) som driver sonden (7). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
2. Djurberedning för vakna huvud-fasta möss experiment
- Huvudplatta kirurgi
- Placera det sövda djuret (steg 1.1-1.2) i den stereotaxiska ramen på en värmedyna (37 °C). Applicera skyddande gel för ögonen och administrera lidokain s.c. (0,2 ml, 2 %) under hårbotten huden med en 26-gauge nål och vänta några minuter.
OBS: Övervaka anestesinivån var 10-30 min genom svar (frånvaro) till en fast tånypa. - Utför ett snitt efter sagittal sutur från bakom occipital ben till början av nasala benet. Använd kirurgisk sax, ta bort huden över båda halvkloten.
- Rengör skallen med 1% jodlösning och ta bort eventuellt återstående periosteum. Använd huvudplattan som mall och borra två hål (1 mm diameter) i skallen för att placera förankringsskruvarna.
VARNING: Var försiktig så att du inte borrar helt genom skallen för att undvika hjärnskador eller durainflammation - Placera huvudplattan med skruvarna. Använd tandcement för att fästa skruvarna och huvudplattan framför och på baksidan av ramen för att upprätthålla ett bra grepp om implantatet.
VARNING: Var noga med att inte applicera cement inuti ramfönstret eftersom det kraftigt minskar signalkvaliteten. Täck skallen med ett tunt lager kirurgiskt lim för att skydda benet och försegla såren på sidan av bildfönstret. - Ta bort djuret från den stereotaxiska ramen efter att cementet är torrt och vänd anestesin genom en subkutan injektion av atipamezole vid 1 mg/kg. Profylaktisk administrering av meloxicam (5 mg/kg/dag, s.c.) administreras för postoperativ smärta.
- Placera djuret i en bärgare på en värmedyna (37 °C). Musen kan returnera sin hembur med littermates inom några timmar. Placera ett magnetiskt 3D-printat lock (polyaktsyramaterial med magnetinsatser) över huvudplattan för skydd(figur 2A). Låt musen återhämta sig i 4 till 6 dagar före början av tillvänjningen till husbilsburen (MHC).
OBS: Den totala vikten av locket och huvudplattan är 2,8 g.
- Placera det sövda djuret (steg 1.1-1.2) i den stereotaxiska ramen på en värmedyna (37 °C). Applicera skyddande gel för ögonen och administrera lidokain s.c. (0,2 ml, 2 %) under hårbotten huden med en 26-gauge nål och vänta några minuter.
- Hantering och tillvänjning
- På dag 1 efter återhämtning (PR), håll försiktigt musen i handen i 5-10 min flera gånger om dagen.
- På dag 2 PR, upprepa hanteringen som i dag 1 och lämna djuret i 5-10 min utforska fritt MHC.
OBS: Att spela lite bakgrundsmusik i rummet kan bidra till att minska djurets stress. - På dag 3 PR, låt djuret fritt utforska MHC i 5-10 min. Ta försiktigt tag i huvudplattan och placera den försiktigt i klämman och rör dig manuellt i kolburen för att följa med musen. Habituate djuret i huvudet-fast läge i 5-10 min. Rengör MHC mellan träningspassen med 70% etanollösning och skölj med kranvatten.
OBS: Se till att MHC får ett tillräckligt luftflöde enligt tillverkarens rekommendationer. Höjden på huvudklämman måste justeras manuellt för att ge en bekväm position. - På dag 4 och 5 PR spänner du upprepade gånger musen MHC och ökar gradvis den fasta tiden, från 5 min och upp till 30 min. Applicera lite saltlösning och ultraljudsgel på bildfönstret för att habituera.
- På dag 6 PR, upprepa protokollet från dag 4/5 PR och placera sonden ovanför djurets huvud enligt steg 3.1.
- På experimentdagen, fortsätt enligt beskrivningen ovan. Fukta sedan bildfönstret med saltlösning och applicera lite ultraljudsgel. Starta spårningen av djuret och fortsätt till sondens positionering (se nedan).
OBS: Fastspänning i MHC kan också göras genom att linda musen i en trasa. I så fall måste möss vara vana vid omslagsförfarandet före huvudfixering. En beskrivning av en fullständig experimentell installation för vaken avbildning finns i figur 2B.
Bild 2: Experimentell installation för vakna fUS-experiment. A. Schematisk illustration av huvudplattans magnetiska lock som skyddar bildfönstret (skapat med BioRender.com). Under avbildningssessioner (vänster) avlägsnas locket för att skanna hjärnan i den stora bländaren som erbjuds av huvudplattan. B. Fotografi av den experimentella inställningen för transkraniell vaken bildbehandling i huvudet-fasta fritt bete möss. 1. Iconeus Ett system och programvara som gör det möjligt att ställa in olika bildsekvenser och styra motormodulen. 2. Fyraxlig motormodul (tre översättningar och en rotation) övervakad av Iconeus One-system (1) och möjliggör 3D-tomografiska skanningar eller 4D-förvärv. 3. Luftdispenseringsbord. 4. Husbil (MHC). 5a,5b. Fotografier som visar närmare utsikt över djurets miljö inuti MHC. 6. Huvudfixeringssystem som spänner fast huvudplattan. 7. Sondhållare som länkar sonden till motormodulen (2). 8. 15 MHz ultraljud sond. 9. Ultraljudsgel placerad mellan mushuvudet och ultraljudssonden, vilket ger akustisk koppling mellan dem. 10. Servo-Motor som kör whiskerstimulatorn. Servo-Motor styrs av ett Arduino Uno-kort som är interfaceed med Iconeus One-systemet genom TTL-signal (1) för att synkronisera stimuleringsmönster med bildsekvenser. C. Illustration av de olika rumsliga provtagningsmöjligheterna (skapade med BioRender.com): i varje fall klivs sonden från den första positionen till den sista och en Doppler-bild registreras på varje position för att rekonstruera den staplade volymen. Denna process upprepas kontinuerligt under hela förvärvstiden. Tät skanning (vänster): Steget mellan segmenten måste vara tillräckligt litet (vanligtvis 400 μm, vilket motsvarar höjdupplösningen) för att möjliggöra volymetrisk avbildning. Sparse Scan (höger): om avlägsna funktionella regioner är riktade (på olika positioner) är det också möjligt att minska rumslig sampling för att avbilda olika segment som skär dessa regioner utan att kompromissa med tids samplingen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
3. Sondpositionering
- Starta programvaran (t.ex. IcoScan) och skapa en experimentsession. Gå till menyn Flytta sond för att justera placeringen av ultraljudssonden med hjälp av navigeringstangentbordet.
OBS: Sonden ska placeras cirka 1 mm ovanför djurets huvud. Det är viktigt att säkerställa att sonden är i kontakt med ultraljudsgel innan någon avbildningssekvens påbörjas. - Starta Live View-förvärvet och justera sondpositionen om det behövs via realtidsavbildning av djuret CBV (cerebral blodvolym). Justera hjärnan i mitten av bilden. Optimera bildparametrarna för att fånga upp det högsta signal-till-brus-förhållandet.
OBS: I vakna möss experiment, bländaren storlek måste minskas för att undvika artefakter induceras av laterala muskler sammandragning.
4. Angiographic skanning och atlasregistrering
- Öppna Angio 3D-alternativet i förvärvsprogramvaran. På den förinställda panelen justerar du skanningsparametrarna (första segmentet, sista segmentet och stegstorleken) för att skanna hela hjärnan (figur 3A, B) och starta förvärvet.
OBS: När du ställer in skanningsparametrarna, se till att skanningen täcker den bakre delen av hjärnan - Lämna anskaffningsprogramvaran öppen och starta programvaran för dataanalys och visualisering (t.ex. IcoStudio) och ladda angio 3D-skanningen. Navigera genom förvärvsvolymen med hjälp av panelen med 3 vyer och välj Coronal Scan Direction:antero-posterior eller postero-anterior.
- Gå till hjärnregistreringspanelen. Läs in musreferensmallen som behövs för registreringsprocessen. Registrera skanningen på Inen Mouse Common Coordinates Framework med hjälp av helautomatiska eller manuella registreringslägen(bild 3C).
- Kontrollera resultatet genom att titta på superpositionen av angio 3D-skanningen och referensmallen eller genom att titta på superpositionen av skanningen och Allen-referensatlasen med hjälp av Atlas Manager-panelen (figur 3D). Spara registreringen som en BPS-fil.
Registreringsfilen kan återanvändas för alla andra förvärv som utförs under samma experimentsession.
5. Hjärnans positioneringssystem (BPS)
- I IcoStudio-programvaran, se till att den angiografiska skanningen och dess .bps-fil (genererad i steg 4.4) läses in.
- Gå till hjärnnavigeringspanelen. Navigera genom musinterna hjärnatlasen med den överordnade/underordnade trädnavigatören på atlashanteraren. Hitta de anatomiska riktade regionerna och välj dem för att lägga dem på genomsökningen i 3-vyerna.
- Visualisera de riktade regionerna på 3-visningspanelen och välj ett bildplan som överlappar de riktade regionerna för experimentet. För att göra det, manuellt ställa in två markörer på koronalpositionen som inkluderar de regioner av intresse.
- Klicka på Brain Positioning System (BPS) för att extrahera de resulterande motorkoordinaterna. Dessa koordinater motsvarar sondens position som gör det möjligt att avbilda det riktade planet. Kontrollera förhandsgranskningen av bilden som beräknas från angio-skanningen.
- I IcoScan-programvaran går du in på avsökningspositionspanelen och klickar på Ange BPS-koordinater. Tillämpa de koordinater som anges i steg 5.4. Sonden rör sig och justerar på det riktade bildplanet.
- Utför ett live view-förvärv och kontrollera att det aktuella bildplanet motsvarar förutsägelsen i steg 5.4.
OBS: Det är också möjligt att välja parasagittala/icke-ortogonala plan.
Bild 3: Snabb transkraniell angiografisk skanning och hjärnregistrering för exakt sondpositionering. A. Schematisk representation av mushjärnan skannas transkranially av ultraljud sond från den första koronal skiva (grön) till den sista koronal skiva (blå) under en snabb angiographic skanning. Det aktuella bildsegmentet (representerat i rött) flyttas steg för steg från baksidan (grön) till hjärnans främre (blå). Skapad med BioRender.com B. Skärmdump av IcoScan-förvärvsprogram i Angio 3D-panelen. De förinställda parametrarna till höger konfigurerar den snabba genomsökningen. Positionerna i mm av den första segmentet, den sista skivan och stegstorleken måste väljas väl för att skanna linjärt hela hjärnan. C. Skärmdump av IcoStudio-bearbetningsprogramvaran. Den snabba Angio 3D-skanningen registreras automatiskt till en referensmall för mushjärnan. Tre-vyer (vänster) visar superpositionen av vaskulaturen och mushjärnan Allen atlas i koronal, sagittal och axiell vyer. D. Linjär utläggning (montage) av 16 skivor (av 31) från 3D angio-skanningen, med den registrerade Allen-referensatlasen ovanpå vaskulaturen. E. Skärmbild av hjärnnavigeringspanelen som visar det förutsagda bildplanet som motsvarar motorkoordinaterna beräknade av programvaran tack vare de två markörer som placeras i mitten av vänster och höger primär somatosensorisk cortex, fatfältsregion. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
6. Uppgiftsuppmanat experiment: whiskerstimulering
- Fördefiniera stimuleringssekvensen, inklusive stimuleringstid, interstimuleringstid och antal repetitioner.
- Kör en 3D fUS-sekvens genom att definiera den totala förvärvstiden, antalet positioner samt dödtiden mellan positionerna. Vid automatisk stimulering synkroniserad med förvärvssystemet via TTL-indata väljer du alternativet Trig-IN innan förvärvet påbörjas.
OBS: För de resultat som presenteras i detta arbete levererades stimulering med bomullspinne placerad så att de tillåter avböjning av de flesta whiskers i rygg/ventrala riktning. Det var fastsatt på en servomotor som drivs av ett Arduino UNO-kort, kopplat till Iconeus One-systemet för att säkerställa synkronisering. De rekommenderade parametrarna för stimulering är 30 s ON, 30 s OFF, amplitud på 20° och 4 Hz frekvens. Alternativt kan stimuleringen också levereras manuellt genom att avleda morrhåren vid de definierade tiderna under förvärvet. - Öppna förvärvet i programvaran IcoStudio och ange menyn Aktiveringskarta. Fyll aktiveringsmönstret med start- och sluttider och beräkna aktiveringskartan. Justera visningsparametrarna för visualisering. Exportera aktiveringskartan som en H5-fil för off-line-analys.
OBS: Aktivering beräknas med hjälp av en generaliserad linjär modell (GLM) metod med stimulansen som luras av ett standard mus hemodynamiskt svar (HRF). Alternativt kan aktivering visualiseras direkt genom att uppskatta Pearson-korrelationen mellan stimuleringsmönstret och den hemodynamiska signalen från varje voxel.
7. 4D-funktionell anslutning
- Kör en 3D fUS-sekvens genom att definiera den totala förvärvstiden, antalet bildplanspositioner samt dödtiden mellan positionerna.
OBS: För 4D-funktionell anslutning rekommenderar vi förvärvstid mellan varje volym < 2,5 s (samplingsfrekvens på minst 0,4 Hz) och en total förvärvstid på minst 10 min (antal tidpunkter > 180). - Spara förvärvet och ladda det i IcoStudio-programvaran. Om det behövs, ladda .bps-filen och in allen mus hjärnan koordinat ramverket. I Atlas-förvaltarenväljer du regioner i atlasen som intresseregioner (ROI).
- Gå in på menyn Funktionell anslutning och välj önskade regioner i ROI-hanteraren. Visualisera resultaten som anslutningsmatris (övervakad analys) eller fröbaserad korrelationskarta (oövervakad). Välj och justera bandbreddsfiltren efter önskemål och exportera korrelationsresultat för statistisk analys.
OBS: I 3D fUS-avbildningsläge ställs de relativa sondpositionerna in manuellt. Därför är två typer av skanningar möjliga och kan väljas beroende på den funktionella applikationen: täta skanningar kontra glesa skanningar (figur 2C).
Representative Results
Detta protokoll beskriver 3D kvantifiering av cerebrala hemodynamic variationer transcranially i mushjärnan, i vila eller som svar på sensorisk stimulering. Whisker stimulering, ett standardparadigm för att kartlägga hjärnans funktionella aktivering hos gnagare, har valts som ett exempel på sensorisk stimulering-framkallat svar. Figur 4 visar en representativ aktiveringskarta som svar på mekanisk morrhårsstimulering i en sövd mus som erhållits med hjälp av transkraniell fUS-avbildning. Den totala försökstiden var 760 s, med en 60-s baslinje (före och efter stimuleringen), en 80 s stimulering och en 60 s återhämtningstid, upprepad 5x. Signifikant aktivering fastställdes med upplösningen av en allmän linjär modell (GLM) med hjälp av en standard mus hemodynamisk svar funktion (HRF). De aktiverade regionerna (Z-poäng med p-värde >0.0000006 efter strikt Bonferroni-korrigering för flera jämförelser) visas som färgkodade värden som läggs över på den gemensamma koordinatrammallen Allen. Voxel-wise tidsförlopp av kontralateral primära somatosensory cortex, fat fält regionen (S1BF) visade en 15-20% ökning av CBV jämfört med baslinjen.
Figur 4: Transkraniell aktivering Kartor och rCBV tidskurs efter whiskers stimulering i ketamin/xylazin anestetiserad mus. A. Aktiveringskarta som visar signifikant aktiverade voxels efter mekanisk stimulering av rätt morrhår (80 s ON, 60 s OFF, 5x) under ketamin/xylazinestesi. Kartor erhölls genom beräkning av Z-poäng baserat på allmän linjär modellanalys (GLM) med Bonferroni korrigering för flera jämförelser. Z-poäng (färgkodade) läggs över på Allen brain 3D-mallen (efter registrering med hjärnans positioneringssystem) och visas i trevyer: koronal (vänster), sagittal (mitten) och axiell (höger). Anatomiska regioner från den gemensamma koordinatramen för allenmushjärna visas som referens. Aktiverade voxels är väl placerade inuti den vänstra S1BF cortex. Skalstång: 1 mm. Varje provvolym skannades över 2,8 mm (motsvarande 7 skivor i höjdriktningen) i 3,85 s, vilket gjorde det möjligt att registrera 20 volumiska prover under varje funktionellt svar. B. 3D rendering av whisker stimulering-framkallade relativa cerebrala blod volym (rCBV) ökning jämfört med baslinjen nivå. Den anatomiska avgränsningen av S1BF anges i blått. C. Tidskurs för CBV-variationer i vänster S1BF (blå) och motsvarande stimulans tillämpas (röd). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Samma paradigm har tillämpats i en huvud-fast beter sig musen i den mobila homecage med hjälp av den vakna förinställningen av IcoScan. Figur 5 visar aktiveringskartan efter ett multipla morrhårsstimuleringsexperiment med hjälp av den experimentella inställningen som beskrivs i figur 2. Några bakre och kaudala morrhår stimulerades med följande mönster: 30 s baslinje följt av fem på varandra följande försök med 30 s ON (4 Hz) och 30 s OFF (figur 5C). Stimulering levererades med hjälp av en servomotor som drivs av ett Arduino UNO-kort som utlöser bildförvärvssekvensen för synkronisering. Signifikant aktivering fastställdes med upplösningen av en allmän linjär modell (GLM) med hjälp av en standard mus hemodynamisk svar funktion (HRF). Multipla jämförelse korrigering utfördes med Bonferroni metoden. Konventionell alfanivå på 0,05 normaliserades av det totala antalet voxels i förvärvsvolymen, vilket resulterade i en slutlig strikt tröskel på 0,000003.
Bild 5: Aktiveringskartor och rCBV-tidskurs efter whiskers stimulering i vaken bete mus. A. Aktiveringskarta som visar signifikant aktiverade voxels efter mekanisk stimulering av rätt morrhår (30 s ON, 30 s OFF, 5x) i en vaken mus i den mobila hemtrevnad. Kartor erhölls genom beräkning av Z-poäng baserat på allmän linjär modellanalys (GLM) med Bonferroni-korrigering för flera jämförelser (normalisering med det totala antalet voxels). Z-poäng (färgkodade) läggs över på Allen brain 3D-mallen (efter registrering med Brain Positioning System) och visas i trevyer: koronal (vänster), sagittal (mitten) och axiell (höger). Anatomiska regioner från Allen Mouse Brain Common Coordinate Framework visas som referens. Aktiverade voxels är väl placerade inuti den vänstra S1BF cortex. Vågar stänger, 1 mm. Varje provvolym skannades över 1,6 mm (motsvarande 3 skivor i höjdriktningen) i 3,85 s, vilket gjorde det möjligt att registrera 17 volumiska prover under varje funktionellt svar. B. 3D-rendering av whisker stimulering-framkallad relativ cerebral blod volym (rCBV) ökning jämfört med baslinjen nivå. Den anatomiska avgränsningen av S1BF anges i blått. C. Illustration av musen i den mobila homecage under rätt whisker stimulering experiment, under vilken fem 30 s försök utfördes för en total förvärvstid på 330 s. D. Momentan relativ CBV-tidskurs extraherad inuti det aktiverade området (blått), med motsvarande stimulans ovanpå (röd). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 6 visar de tidsmässiga korrelationerna mellan normaliserade lågfrekventa (<0,2 Hz) spontana CBV fluktuationer mellan 3D hjärnregioner (identifieras från registrering till Allen gemensamma koordinatramen) i en ketamin-xylazin sövda mus. Total förvärvstid var 20 min (1200 s). Atlas-övervakad analys visade starka interhemispheric anslutning mönster, med resulterande korrelation koefficient värden upp till 0,8. Frö-baserade analys i dorsala hippocampus visade en betydande interhemispheric anslutning mellan höger och vänster hippocampus samt djupa retro-hippocampal regioner och piriform cortices. En frö region valt i S1BF resulterade också i en symmetrisk (cortico-cortical) korrelation mönster, som tidigare beskrivits.
Figur 6: Transkraniell volymetrisk vilotillstånd funktionell anslutning av mushjärnan under ketamin/xylazinestesi bedöms vid ett 20 min 3D fUS förvärv. A. Korrelationsmatris baserad på 3D-regioner i allen gemensamma koordinatramen som är registrerad på det transkraniella funktionella förvärvet. Matrisen erhålls genom att beräkna den normaliserade Pearsons korrelation av spontana lågfrekventa fluktuationer (<0,1 Hz) av de genomsnittliga tidssignalerna från alla voxels som ingår i varje identifierad ROI efter korrigering av segmenttid. Varje provvolym skannades över 1,6 mm i höjdriktningen (motsvarande 4 skivor) som förvärvats över 2,2 s. B. Fröbaserad analys projicerad på en 3D-mall. Fröet valdes inom rätt dorsal hippocampus vid β - 2,1 mm. Korrelationskartan erhålls genom beräkning av Pearson Korrelationskoefficienten mellan fröets temporalsignaler och varje voxel för hela förvärvet efter korrigering av segmenttidpunkten. C. 3D-korrelationskarta baserad på fröbaserad analys med fröregion som valts inom S1BF vid β - 2,1 mm. Skalningsstaplar: 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Hela hjärnan imaging metoder är avgörande verktyg för att bättre förstå hjärnans fysiologi och patologi. Metoden som beskrivs här möjliggör exakt kvantifiering av hemodynamiska signaler i den levande hjärnan direkt vid bänken. Oöverträffad känslighet och spatio-temporal upplösning av funktionella ultraljud är särskilt väl lämpad för musen fysiologi. Funktionella svar och vilotillståndsnätverk kan kartläggas inom korta förvärvstider, longitudinellt och utan att behöva göra genomsnittliga försök eller försökspersoner för att få en tillförlitlig åtgärd. Den relevanta kombinationen av hög känslighet ultraljud linjära sonder och snabba motoriserade inställningar gör det möjligt att utföra transkraniell volumetric fUS imaging i möss inom rimliga förvärvstider. Detta protokoll kan utföras antingen på sövda eller vakna möss med hjälp av en mobil hembur.
Whisker stimulering, den sensoriska stimulansen som används som ett illustrerande exempel i detta manuskript, är ett standard funktionellt aktiveringsparadigm hos gnagare och en pålitlig avläsning för att studera sensorisk bearbetning, neurovaskulära kopplingar och deras förändringar5,6,10,11. Medan grov manuell borstning av whiskers kan föredras för dess användarvänlighet, saknar denna metod rumslig och temporal precision. Användningen av en automatisk stimulator, såsom den som beskrivs här utlöstes med fUS-bildskannern, möjliggör en bättre kontroll av flera parametrar inklusive tidpunkten för insjuknandet, amplitudförskjutningen, frekvensen samt vinkeln på Q-spetsen / kammen, vilket resulterar i en bättre reproducerbarhet mellan djur. Dessutom möjliggör en mer exakt tidpunkt för stimulering modellering av hemodynamisk responsfunktion (HRF) genom att bestämma tiden till debut och tid tilltoppparametrarna 12,13. För att säkerställa bättre precision på antalet whiskers som avböjs under stimuleringen (och därmed området i den aktiverade regionen) kan mer sofistikerade stimulatorer anpassas till detta protokoll. Många andra stimuli som ljus8, ljud14 eller luktpresentation15 kan implementeras med samma protokoll.
Kompatibiliteten hos funktionell ultraljud med vakna och betedande djur är en viktig fördel jämfört med andra neuroimaging tekniker, vilket möjliggör funktionell aktivering mappning utan anestesi bias. Att använda en luftlyft mobil hemifrån är ett bra alternativ till andra befintliga huvud-fasta apparater som linjära eller sfäriska löpband. Samtidigt som den är fast huvud-fixerad, ger homecage rörelse musen illusionen att navigera i miljön, så att ett brett utbud av beteendetester kan kopplas till fUS imaging16. Tillvänjningsförfarandet för huvudfixering utgör dock ett viktigt steg för att minska stress, särskilt för experiment där det kan betraktas som en förvirrande faktor. Förfarandet som beskrivs här (6-dagars hantering och tillvänjning till huvudfixering) ger robusta resultat för sensorisk stimulering och vilotillstånd funktionell anslutning. Det kan dock vara nödvändigt att förlänga tillvänjningsperioden för mer raffinerade beteendetester17.
Disclosures
Jeremy Ferrier och Bruno-Félix Osmanski är anställda av Iconeus. Thomas Deffieux, Zsolt Lenkei, Bruno-Félix Osmanski och Mickael Tanter är medgrundare och aktieägare i Iconeus.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Europeiska forskningsrådet (ERC) Advanced Grant N° 339244-FUSIMAGINE, National Agency for Research funding 'Pinch' (ANR-18-CE37-005), Inserm Research Technology Accelerator in Biomedical Ultrasonic, ElfUS tekniska kärna av IPNP, Inserm U1266, det europeiska forskningsprogrammet FUSIMICE of the Human Brain Project och EMBO Short-Term Fellowship 8439.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Plastipak 1 mL syringes | Dutscher, France | 303172 | |
| BD Microlance 26 Gauge needles | Dutscher, France | 303800 | |
| Animal Temperature Controller (heating Plate coupled with a rectal probe) | Physitemp | TCAT-2DF | |
| Arduino | Arduino | Arduino Uno-Rev3 | |
| Atipamezole | Orion Pharma, France | Antisedan® | 5 mg/ml injectable solution |
| Dental Ciment | Sun Médical, Shiga, japan | Superbond C&B | |
| Depilatory cream | Klorane | N/A | |
| Eye Ointment | TVM, UK | Ocry-gel | |
| Hair trimmer | Wella Profesionnals | N/A | |
| Head plates | Neurotar, Finland | Model 14 | |
| Iconeus One standard package for fUS | Iconeus, France | Iconeus One | |
| IcoScan acquisition software (v1.0) | Iconeus, France | IcoScan | |
| IcoStudio analysis software (v1.0) | Iconeus, France | IcoStudio | |
| Isoflurane Anesthesia station | Minerve, Esternay, France | ||
| Ketamine | Virbac, France | Ketamine1000 | 100 mg/ml injectable solution |
| Lidocaine | Vetoquinol | Lurocaine® | 20 mg/ml injectable solution |
| Medetomidine | Orion Pharma, France | Domitor® | 1 mg/ml injectable solution |
| Meloxicam | Boehringer lingelheim | Metacam® | 0.5 mg/ml injectable solution |
| Mobile HomeCage Large with tracking capability | Neurotar, Finland | MHC-L-T-V4 | |
| Monitoring of ECG and breathing rate | AD Systems, (USA) and LabChart software | ||
| Servomotor | Feetech | FT90B | |
| Stereotaxic frame | David Kopf (Tujunga, USA) | 900-WA | Using Mouse Adaptor (Ref: 922) and Non-Rupture Ear Bars (ref: 922) |
| Surgical glue | 3M, USA | Vetbond | |
| Syringe Pump | KD Scientific, USA | Legato® 130, Cat# 788130 | |
| Ultrasound gel | DREXCO medical, France | Medi'Gel | |
| Xylazine 2% | Bayer, France | Rompun® | 20 mg/ml injectable solution |
References
- Hoyer, C., Gass, N., Weber-Fahr, W., Sartorius, A. Advantages and challenges of small animal magnetic resonance imaging as a translational tool. Neuropsychobiology. 69 (4), 187-201 (2014).
- Deffieux, T., Demene, C., Pernot, M., Tanter, M. Functional ultrasound neuroimaging: a review of the preclinical and clinical state of the art. Current Opinion in Neurobiology. 50, 128-135 (2018).
- Rabut, C., et al. Pharmaco-fUS: Quantification of pharmacologically-induced dynamic changes in brain perfusion and connectivity by functional ultrasound imaging in awake mice. NeuroImage. 222, 117231 (2020).
- Tiran, E., et al. Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).
- Ferrier, J., Tiran, E., Deffieux, T., Tanter, M., Lenkei, Z. Functional imaging evidence for task-induced deactivation and disconnection of a major default mode network hub in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (26), 15270-15280 (2020).
- Rabut, C., et al. 4D functional ultrasound imaging of whole-brain activity in rodents. Nature Methods. 16 (10), 994-997 (2019).
- Brunner, C., et al. A platform for brain-wide volumetric functional ultrasound imaging and of circuit dynamics in awake mice. Neuron. 108 (5), 861-875 (2020).
- Gesnik, M., et al. 3D functional ultrasound imaging of the cerebral visual system in rodents. NeuroImage. 149, 267-274 (2017).
- Macé, É, et al. Whole-brain functional ultrasound imaging reveals brain modules for visuomotor integration. Neuron. 100 (5), 1241-1251 (2018).
- Macé, E., Montaldo, G., Cohen, I., Baulac, M., Fink, M., Tanter, M.
- Tiran, E., et al. Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).
- Claron, J., et al. Large scale functional ultrasound imaging of the spinal cord reveals in depth spatiotemporal responses of spinal nociceptive circuits in both normal and inflammatory state. Pain. , (2020).
- Aydin, A. K., et al. Transfer functions linking neural calcium to single voxel functional ultrasound signal. Nature Communications. 11 (1), 2954 (2020).
- Bimbard, C., et al. Multi-scale mapping along the auditory hierarchy using high-resolution functional ultrasound in the awake ferret. eLife. 7, 35028 (2018).
- Boido, D., et al. Mesoscopic and microscopic imaging of sensory responses in the same animal. Nature Communications. 10 (1), 1110 (2019).
- Kislin, M., et al. Flat-floored air-lifted platform: A new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents. Journal of Visualized Experiments. (88), e51869 (2014).
- Juczewski, K., Koussa, J. A., Kesner, A. J., Lee, J. O., Lovinger, D. M. Stress and behavioral correlates in the head-fixed method: stress measurements, habituation dynamics, locomotion, and motor-skill learning in mice. Scientific Reports. 10 (1), 12245 (2020).
