Summary
هنا، نقدم بروتوكولا جديدا لدراسة وخريطة الترسب المستهدف لناقلي المخدرات للخلايا البطانية في نماذج الشرايين البشرية المصنعة والحقيقية الحجم وثلاثية الأبعاد تحت التدفق الفسيولوجي. وقد تكون الطريقة المعروضة بمثابة منصة جديدة لاستهداف حاملي المخدرات داخل نظام الأوعية الدموية.
Abstract
إن استخدام نماذج ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) للشرايين البشرية ، والتي تم تصميمها بالأبعاد الصحيحة والتشريح ، يمكن من النمذجة المناسبة لمختلف العمليات الهامة في نظام القلب والأوعية الدموية. في الآونة الأخيرة ، على الرغم من إجراء العديد من الدراسات البيولوجية باستخدام مثل هذه النماذج ثلاثية الأبعاد من الشرايين البشرية ، إلا أنها لم تطبق لدراسة استهداف الأوعية الدموية. تقدم هذه الورقة طريقة جديدة لتصنيع نماذج شريانية بشرية حقيقية الحجم أعيد بناؤها باستخدام تقنية طباعة ثلاثية الأبعاد ، وخطها مع الخلايا البطانية البشرية (ECs) ، ودراسة استهداف الجسيمات تحت التدفق الفسيولوجي. هذه النماذج لديها ميزة تكرار الحجم الفسيولوجي وظروف الأوعية الدموية في جسم الإنسان باستخدام مكونات منخفضة التكلفة. قد تكون هذه التقنية بمثابة منصة جديدة لدراسة وفهم استهداف الأدوية في نظام القلب والأوعية الدموية وقد تحسن تصميم الأدوية النانوية الجديدة القابلة للحقن. وعلاوة على ذلك، قد يوفر النهج المقدم أدوات هامة لدراسة الولادة المستهدفة لمختلف العوامل لأمراض القلب والأوعية الدموية في ظل التدفق الخاص بالمرضى والظروف الفسيولوجية.
Introduction
وقد تم مؤخرا تطبيق عدة نهج باستخدام نماذج 3D من الشرايين البشرية1،2،3،4،5. هذه النماذج تكرار التشريح الفسيولوجي والبيئة من الشرايين المختلفة في جسم الإنسان في المختبر. ومع ذلك ، فقد استخدمت أساسا في دراسات بيولوجيا الخلية. وتشمل الدراسات الحالية على استهداف الأوعية الدموية من الجسيمات إلى بطانة الرحم في المحاكاة الحسابية سيليكو 6،7،8، في المختبر نماذج microfluidic9،10،11، وفي نماذج حيوانية فيفو 12. وعلى الرغم من الرؤى التي قدمتها، فشلت هذه النماذج التجريبية في محاكاة عملية الاستهداف التي تحدث في الشرايين البشرية بدقة، حيث يشكل تدفق الدم والديناميكا الدموية عوامل مهيمنة. على سبيل المثال ، دراسة استهداف الجسيمات إلى المناطق تصلب الشرايين في تشعب الشريان السباتي ، والتي تشتهر بنمط تدفق إعادة الدوران المعقد وتدرج إجهاد القص الجداري ، قد تؤثر على الرحلة التي تقوم بها الجسيمات قبل وصولها إلى بطانة الرحم13و14و15و16. لذلك، يجب إجراء هذه الدراسات في ظل ظروف تكرر البيئة الفسيولوجية، أيالحجم والبعد والتشريح وملف التدفق.
في الآونة الأخيرة ، قام هذا الفريق البحثي بتصنيع نماذج شريانية بشرية ثلاثية الأبعاد لدراسة ترسب واستهداف الجسيمات إلى الأوعيةالدموية 17. واستندت النماذج على نسخ هندسية ثلاثية الأبعاد من الأوعية الدموية البشرية، والتي كانت بعد ذلك مثقفة مع ECs الإنسان التي اصطف في وقت لاحق جدرانها الداخلية. بالإضافة إلى ذلك ، عندما تتعرض لنظام التشوه الذي ينتج التدفق الفسيولوجي ، فإن النماذج تكرر بدقة الظروف الفسيولوجية. تم تصميم نظام التشويش لتشويش السوائل بمعدل تدفق ثابت ، وذلك باستخدام مضخة معمومة في كل من تكوينات الدائرة المغلقة والمفتوحة(الشكل 1). يمكن استخدام النظام كدائرة مغلقة لرسم خريطة لترسب الجسيمات واستهداف الخلايا المصنفة داخل النموذج السباتي. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدامه كدائرة مفتوحة لغسل الجسيمات غير الملتصقة في نهاية التجارب وتنظيف النظام وصيانته. تقدم هذه الورقة بروتوكولات لتصنيع نماذج ثلاثية الأبعاد للتشعب السباتي البشري ، وتصميم نظام التشويش ، ورسم خرائط لترسب الجسيمات المستهدفة داخل النماذج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يصف هذا البروتوكول تصنيع نموذج ثلاثي الأبعاد للشريان السباتي ويمكن تطبيقه لتوليد أي شريان آخر مهم بمجرد تعديل المعلمات الهندسية.
1. تصميم وتصنيع تشعب ثلاثي الأبعاد لنموذج الشريان السباتي البشري
- اختر صورا من المرضى أو هندسات مدروسة سابقا لتشعب الشريان السباتي البشري ، وإنشاء نموذج تصميم بمساعدة الكمبيوتر للقالب يحتاج إلى طباعة.
ملاحظة: يحتوي تشعب الشريان السباتي على مدخل واحد ومنفذين. من المهم تصميم إطار قالب ثلاثي الأبعاد حول الشريان ويدعم الطباعة المؤقتة بين الإطار وقالب الشريان (الشكل 2A- C). - طباعة الأشكال الهندسية باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد. قطع يدعم الطباعة المؤقتة، واستخدام الصنفرة لتلميع وسلس القوالب، وخاصة في المناطق التي قطعت يدعم. شطف نموذج الرملي مع الكحول isopropyl لإزالة الغبار البلاستيك، والسماح لتجف تماما في غطاء محرك السيارة الكيميائية لمدة 2-3 ساعة.
ملاحظة: هنا، قوالب المطبوعة مصنوعة من الراتنج v4 واضحة (الشكل 2D،ه). - لحل البلاستيك بسهولة، رش القوالب مع ورنيش شفاف داخل غطاء محرك السيارة الكيميائية، والسماح للهواء الجاف لمدة 1 ساعة. كرر هذا 3x.
ملاحظة: هنا، تم استخدام 2X الترا الغطاء رذاذ واضح، ولكن أي نوع آخر ينبغي أن تكون مناسبة طالما أنها ليست ورنيش الخشب. تأكد من عدم وجود البلاستيك المكشوفة اليسار لأن البلاستيك قد تتفاعل مع السيليكون ومنعها من ترسيخ بشكل صحيح. نوعية السطح رش ستحدد نوعية سطح نموذج السيليكون النهائي. - قطع الشرائح مستطيلة شفافة / شرائط من البلاستيك السلس من نفس أبعاد الإطار العفن، والغراء لهم باستخدام ورنيش إلى الإطار على جميع الجوانب ومن جانب واحد من الإطار، بحيث سيتم مختومة في الجزء السفلي وفتح في الجزء العلوي. تطبيق ورنيش باستخدام فرشاة الطلاء داخل غطاء محرك السيارة الكيميائية، والسماح للشرائح لتجف تماما لمدة 24 ساعة على الأقل(الشكل 2F).
- لإعداد خليط المطاط السيليكون، إضافة السيليكون السائل مع عامل المعالجة (نسبة الكتلة 1:10) في لوحة بلاستيكية، ويحرك جيدا لضمان الاختلاط الكامل. للنموذج السباتي، أضف 54 غرام من السيليكون و 6 غرام من وكيل المعالجة.
- يبرد الخليط لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية، ثم يزيل الغاز في مجفف فراغ حتى يتم القضاء على جميع فقاعات الهواء. ضع القالب في المجفف (مع الجانب المفتوح الذي يواجه الأعلى) ، صب ببطء خليط السيليكون في القالب ، ومرة أخرى إزالة فقاعات الهواء حتى يصبح الخليط واضحا.
- دع القالب يقف مع السيليكون بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة (إذا كان ذلك ممكنا، اتركه في المجفف دون فراغ). إذا لم يجف الخليط بالكامل، احتضنه عند 60 درجة مئوية لبضع ساعات أخرى.
- بمجرد أن يجف الخليط بالكامل ، قم بإزالة الشرائح الشفافة ، وغمر النموذج في الأسيتون المطلق لمدة 48 ساعة في غطاء محرك السيارة الكيميائي حتى يذوب البلاستيك بالكامل. إزالة أي بقايا بلاستيكية بعصا خشبية. لتتبخر الأسيتون المحاصرين داخل النموذج، واحتضانه في 60 درجة مئوية لمدة 4 أيام على الأقل قبل بذر الخلية.
2. خلية الثقافة وبذر في نماذج
- إعداد ثلاثة موصلات لنموذج السباتي: واحد للمدخل واثنين للمنافذ (انظر جدول المواد). تعقيم النموذج والموصلات عن طريق الأشعة فوق البنفسجية في غطاء محرك السيارة البيولوجي لمدة 20 دقيقة.
- معطف النماذج مع 4 مل من 100 ميكروغرام / مل فيبروكتين (في 1x الفوسفات العازلة المالحة، (PBS)) لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. حقن محلول فيبروكتين في النموذج من خلال مدخل باستخدام حقنة بلاستيكية 5 أو 10 مل. إزالة فيبروكتين من خلال منفذ, وغسل النموذج مع المتوسطة EC.
- تعليق 2.5 × 106 خلايا / مل الخلايا البطانية الوريد السري البشري (HUVECs، مرور < 6)، وملء النموذج مع 4 مل من تعليق الخلية باستخدام حقنة بلاستيكية 5 أو 10 مل(الشكل 3A). ضع النموذج على دوار داخل حاضنة (37 درجة مئوية) بسرعة دورة واحدة في الدقيقة لمدة 48 ساعة لضمان البذر المتجانس. تأكد من أن النموذج موصول بشكل جيد بالمدور(الشكل 3B). تغيير المتوسط بعد 24 ساعة داخل غطاء محرك السيارة البيولوجية، والعودة إلى الدوار داخل الحاضنة لمدة 24 ساعة أخرى.
ملاحظة: بعد 24 ساعة، يتم بذر الخلايا ويمكن تصويرها باستخدام المجهر. - إزالة النموذج من الدوار، ويغسل مع برنامج تلفزيوني 1x باستخدام حقنة بلاستيكية 10 مل. لإصلاح الخلايا، واحتضان الخلايا مع 4 مل من 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) إلى النموذج لمدة 15 دقيقة داخل غطاء محرك السيارة الكيميائية، ومن ثم شطف 3x مع برنامج تلفزيوني. إضافة 4 مل من برنامج تلفزيوني، وتخزينها في 4 درجة مئوية حتى التجربة (الشكل 3C). وصمة عار الخلايا داخل النموذج باستخدام بروتوكولات تلطيخ القياسية(على سبيل المثال، تلطيخ النووية مع 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), الشكل 3D).
3. تصميم نظام التشويش
- نظام التشوه له مدخلين وأنابيب منفذين. دمج مدخلين في أنبوب معرف واحد 4 ملم ومرة أخرى في اثنين من أنابيب معرف 6 ملم، والتي تتصل مضخة العجان. دمج اثنين من أنابيب معرف 6 ملم الخروج من مضخة التجبير في أنبوب واحد 4 ملم، وربطه إلى المثبط التذبذب للقضاء على أي تذبذبات من المضخة. استخدم زجاجة ضيقة الفم سعة 250 مل مع غطاء ثلاثي الفتحات كمخمد.
- ربط فتحة واحدة إلى مدخل من المضخة، وإغلاق الثانية مع الفلين الذي يستخدم للتنفيس عن الضغط في حالات الطوارئ، وتوسيع فتحة الثالث (وهو منفذ) إلى الجزء السفلي من الزجاجة.
- ربط المثبط إلى مدخل نموذج السباتي المثقف باستخدام أنابيب منفذ. دمج منفذين من النموذج إلى أنابيب واحدة، والتي ستكون منفذ للنظام (جميع الأنابيب هي معرف 4 ملم).
- تقسيم أنابيب منفذ لاثنين من أنابيب منفذ (واحد للدائرة مغلقة والآخر للحاوية النفايات في الدائرة المفتوحة). إرفاق المشبك البلاستيك إلى كل أنبوب.
ملاحظة: سوف يحدد تركيبة المشابك المفتوحة/المغلقة ما إذا كان النظام في تكوين دارة مغلق أو مفتوح. كما هو مبين في الشكل 1، إذا المشابك أ و د هي قريبة في حين ب وجيم مفتوحة ، والنظام هو دائرة مغلقة ؛ العكس يجلب النظام لفتح تكوين الدائرة. - إعداد ثلاث حاويات: واحدة يمكن أن تعقد 300 مل السائل (للدائرة المغلقة) واثنين آخرين من 1 لتر لكل منهما: واحدة لغسل والآخر للنفايات (للحلبة المفتوحة).
4. تكوين الدائرة المغلقة: تجربة التشويش والتصوير
- إضافة 300 مل من برنامج تلفزيوني إلى حاوية الدائرة المغلقة، وهو ما يكفي لملء النظام بأكمله، بما في ذلك الأنابيب والنموذج. ضع أنبوب مدخل واحد وأنبوب منفذ واحد (المشابك المفتوحة ب و ج) داخل الحاوية.
- املأ حاوية الغسيل 1 لتر بالماء المقطر (للغسيل في نهاية التجربة)، واترك حاوية النفايات الأخرى 1 لتر فارغة. ضع مدخل ومنفذ الأنابيب الأخرى (المشابك القريبة أ و د) في حاويات الغسيل والنفايات، على التوالي.
- خذ نموذج السباتية المثقفة للخلية الثابتة من 4 درجات مئوية، وافراغ برنامج تلفزيوني. قم بتوصيل مدخل ومنافذ السباتي كما هو موضح في الخطوات 3.3-3.4. لا تترك النموذج الجاف لفترة طويلة. بمجرد توصيل النموذج، قم بتنشيط المضخة لتشويش السائل.
- ضع النموذج السباتي تحت المجهر. فتح الأنابيب قبل مدخل وبعد منفذ النموذج السباتي. ضبط مضخة التجبير في 10 دورة في الدقيقة، وتحويله. زيادة السرعة بزيادات 5 دورة في الدقيقة، كل 4-5 دقائق. تأكد من عدم وجود تسرب.
- عند 100 دورة في الدقيقة، وهو ما يعادل معدل التدفق الأقصى للموجة الفسيولوجية للشريان السباتي البشري (~ 400 مل/دقيقة)، أضف جزيئات البوليسترين الفلورية (PS) (2 ميكرومتر، بتركيز 1.6 ميكروغرام/مل) إلى 300 مل من برنامج تلفزيوني في حاوية الدائرة المغلقة. صورة المنطقة ذات الاهتمام كل 10 ق لمدة 1.5 ساعة (لا تزال واحدة الصور أو الفيديو حسب الحاجة).
5. تكوين الدائرة المفتوحة: خطوة الغسيل
- افتح المشابك من أنابيب الغسيل والنفايات في حاويات 1 L (المشابك أ و د)، وإغلاق المشابك فورا من كل من مدخل ومنفذ أنابيب في حاوية 300 مل (المشابك ب ج) لتغيير النظام من مغلقة لفتح تكوين الدائرة.
- السماح لمعظم تدفق المياه من وعاء الغسيل إلى حاوية النفايات في 100 دورة في الدقيقة. قبل أن يتم نقلها تماما، اضغط على التوقف عن مضخة العجق، وإغلاق المشابك أنبوب قبل مدخل وبعد منفذ النموذج السباتي.
- باستخدام المرشحات المناسبة، التقط صورا للنموذج في المنطقة ذات الأهمية لإظهار ترسب الجسيمات والتصاقها بالخلايا. قطع الاتصال نموذج السباتي. بعناية وببطء إضافة 4 مل من برنامج تلفزيوني مع حقنة 10 مل من خلال مدخل النموذج.
- ربط "نموذج وهمية"، (وهو أيضا نموذج السباتي المطاط السيليكون 3D تستخدم فقط لغسل، دون خلايا مثقفة) بدلا من نموذج السباتي، وشطف النظام. إضافة 1 لتر آخر من الماء، وغسل النظام مرة أخرى حتى يتم نقل جميع المياه من وعاء الغسيل إلى النفايات. إيقاف تشغيل مضخة التجبير.
6. الحصول على البيانات وتحليلها
- الحصول على فيلم رقمي لترسب الجسيمات في المنطقة ذات الاهتمام مع الصور التي التقطت أثناء التجربة ، وذلك باستخدام رمز برنامج مخصص (انظر جدول المواد).
- لرسم خرائط لترسب الجسيمات على طول النموذج، بلاط صور متعددة لتغطية المنطقة التي تم فحصها من الفائدة (الشكل 4A،B).
ملاحظة: يمكن كتابة رمز برنامج مخصص لتحديد عدد الجسيمات التي تم الالتزام بها في موقع الاهتمام (تم توفير ملف عينة كمعلومات تكميلية)17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تقدم هذه الورقة بروتوكولا جديدا لرسم خريطة لترسب الجسيمات داخل نماذج الشرايين البشرية ثلاثية الأبعاد ذات الحجم الحقيقي ، والتي قد توفر منصة جديدة لأبحاث توصيل الأدوية. باستخدام تقنية الطباعة ثلاثية الأبعاد ، تم تصنيع نموذج من الشريان التشعب السباتي البشري(الشكل 2). وقدم النموذج من المطاط السيليكون وبذر مع ECs الإنسان (الشكل 3). والأهم من ذلك، أن هذا البروتوكول مكن من تكرار الظروف الفسيولوجية، وخاصة فيما يتعلق بديناميات السوائل. تم تصميم نظام التشوه لبث الجسيمات في التشعب السباتي تحت التدفق المستمر في حجم الشكل الموجي الفسيولوجي المميز للكاروتي. الشكل 1 يعرض نظام التشويش ، والذي يتكون من مضخة التثابر ، ومخمد التذبذب ، ونموذج التشعب المستزرع ، والأنابيب ، وحاويات السوائل.
لرسم خريطة لترسب الجسيمات المتغلغلة والتصاقها، تم تصوير النموذج الشرياني تحت منظار مجسم، سواء في نهاية التجربة أو بعد الغسيل (الخطوة 5.3). تم التقاط الصور باستخدام هدف 2x وتبليط معا لتشكيل صورة كاملة للنموذج. ثم تم حساب عدد الجسيمات التي تم الالتزام بها باستخدام رمز برنامج مخصص. لدراسة تشكيل نمط إعادة التدوير عند التشعب ، تم غرس حبات زجاجية فلورية 10 ميكرومتر في النموذج. ويبين الشكل 4 ألف إعادة التدوير، مما يشير إلى أن الظروف داخل النموذج تحاكي الظروف الفسيولوجية.
لرسم خريطة لترسب الجسيمات داخل النموذج، تم غرس جزيئات PS الفلورية 2 ميكرومتر، وتم تصوير التصاقها بمركبات ECs(الشكل 4B،C). وقد لوحظت هذه الجسيمات بشكل مختلف في مناطق مختلفة على طول التصاق النموذج أكثر من منطقة إعادة التدوير، حيث الضغط القص الجدار عالية. وقد نوقشت هذه النتائج سابقا لإظهار أن التصاق الجسيمات هو وظيفة من هندسة النموذج، وخصائص سطح الجسيمات، والإجهاد القص17. خرائط الترسب هذه بسيطة نسبيا ويمكن الحصول عليها بسرعة لفحص تقارب حاملي الأدوية واستهدافهم في ظل ظروف فسيولوجية في نماذج خاصة بالمرضى.
الشكل 1: نظام التغلغل. تم تصميم نظام التشويش لتشويش السوائل تحت التدفق المستمر. وهي تتألف من (1) مضخة تعلجية، (2) مخمد التذبذب، (3) نموذج الشريان ثلاثي الأبعاد المستزرع، وثلاث حاويات زجاجية: اثنتان بسعة 1 لتر (4 و6) وثالث يمكنه حمل سائل 300 مل (5). يمكن للنظام أن يعمل في تكوينين: (1) دائرة مفتوحة، حيث المشابك a+d مفتوحة وb+c مغلقة، أو (2) دائرة مغلقة، حيث المشابك a+d مغلقة وب +c مفتوحة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تم تصميمعملية تصنيع نموذج تشعب الشريان السباتي ثلاثي الأبعاد. (A-C) التشعب السباتي البشري ، وإطار العفن حول الشريان ، ودعم الطباعة المؤقتة. (D, E) تمت طباعة الأشكال الهندسية باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد. (F) تم قطع دعامات الطباعة المؤقتة، وتم وضع الرمال على النموذج ورشه بالورنيش. ثم تم لصقها الشرائح مستطيلة شفافة إلى الإطار من جميع الجوانب. وكان يلقي المطاط السيليكون عندما كان الغراء الجافة. اختصار: 3D = ثلاثي الأبعاد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: البذر من ECs داخل نماذج 3D من الشريان السباتي. (أ) نموذج 3D الحجم الحقيقي للتشعب السباتي البشري المصنوع من المطاط السيليكون. تم استزراع النموذج مع ECs الإنسان ومليئة المتوسطة الخلية. (ب)تم وضع النموذج المثقف على دوار عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة (C) صور لمركبات ECs المثقفة داخل النموذج ثلاثي الأبعاد في برايتفيلد و (D) مع DAPI للتلطيخ النووي باللون الأزرق. أشرطة المقياس = 10 ميكرومتر. الاختصارات: ECs = خلايا البطانية; DAPI = 4′,6-دياميدينو-2-فينيليندول; 3D = ثلاثي الأبعاد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: Perfusing ورسم خرائط التصاق الجسيمات. (أ) خط خط صورة من يبسط وإعادة تدوير (مستطيل متقطع) ولدت عند التخثر من جزيئات الزجاج الفلوري 10 ميكرومتر في تدفق مستمر من 400 مل / دقيقة من خلال النموذج. (ب) خريطة ترسب من 2 ميكرومتر الفلورسنت carboxylated PS الجسيمات (باللون الأحمر) داخل نموذج 3D-المستزرعة. شريط المقياس = 2 مم (C) التصاق الجسيمات (باللون الأحمر) إلى ECs المستزرعة (باللون الأزرق DAPI) داخل النموذج في تكبير 10x. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. الاختصارات: PS = البوليسترين; 3D = ثلاثي الأبعاد؛ ECs = خلايا البطانية; DAPI = 4′,6-دياميدينو-2-فينيليندول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
معلومات تكميلية: الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
النهج الحالية لدراسة استهداف الأوعية الدموية من الجسيمات تقصر في تكرار الظروف الفسيولوجية الموجودة في جسم الإنسان. يقدم هنا بروتوكول لتصنيع نماذج أعيد بناؤها ثلاثية الأبعاد من الشرايين البشرية لدراسة استهداف الجسيمات إلى المركبات المائية بطانة الشريان تحت التدفق الفسيولوجي تطبيقها باستخدام نظام التشوه مخصصة. عند اختيار المواد للطباعة ثلاثية الأبعاد ، من الأفضل استخدام البلاستيك الواضح لتجنب نقل الصباغ إلى نموذج السيليكون ، والذي يجب أن يكون شفافا قدر الإمكان. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم اختيار مادة لا تذوب في الأسيتون ، ولكن بدلا من ذلك تصبح ناعمة وهشة ويمكن إزالتها بسهولة من النموذج.
النماذج ثلاثية الأبعاد المقدمة مصنوعة من مطاط السيليكون، وهو سيليكون شفاف، ممزوج بعامل المعالجة الخاص به. من المهم التأكد من أن الخليط هو دائما في درجة حرارة الغرفة أو أقل، وإلا فإن الربط بين السيليكون وعامل المعالجة تبدأ قبل إزالة الغاز والصب على قوالب. على الرغم من أن البوليديميثيلسيلوكسيان يمكن أن تستخدم أيضا لتصنيع مثل هذه النماذج (نسبة 1:10 مع crosslinker لها)، والمطاط السيليكون هو أكثر دواما. بعد غمر النموذج في الأسيتون لإذابة البلاستيك ، من المهم احتضانه عند 60 درجة مئوية لمدة 4 أيام على الأقل لضمان التبخر الكامل لأي بقايا الأسيتون. إذا كان أي الأسيتون لا يزال محاصرا داخل النموذج، فإن الخلايا لا تنمو بشكل صحيح. تغيير المتوسطة بعد 24 ساعة، تثبيت الخلايا بعد 48 ساعة هي الخطوتين التي تنطوي على الحقن اليدوي للسائل باستخدام حقنة 10 مل. ولذلك فمن المهم أن تتغلغل ببطء، وإلا قد يتم غسل الخلايا.
نظام التشوه له مدخلين وأنابيب منفذين. كل أنبوب لديه أنبوب بلاستيكي المشبك للتحكم في التدفق. يتكون معظم نظام الأنابيب من أنابيب ثنائية الدايمتر الداخلية مقاس 4 مم ، باستثناء الأنابيب التي يتم تثبيتها في المضخة ، وهي أنابيب معرف 6 مم. معرف الأنابيب فرضت في المضخة ستحدد معدل التدفق الأقصى الذي يمكن تحقيقه في النظام. يمكن لنظام التشوه هذا أيضا توليد شكل موجي نابض عن طريق تذبذبات فائقة على التدفق المتوسط الثابت17 عن طريق ربط منفذ المثبط بتجميع مذبذب ، والذي يحل محل الجزء المتذبذب من شكل موجي مرغوب فيه على معدل التدفق الثابت الذي تنتجه المضخة العبيرية. يتيح هذا التكوين التشغيل تحت تدفق التذبذب أو في ظل ظروف التدفق المستمر عند إيقاف تشغيل المذبذب.
في هذه الورقة ، تم تخصيص نظام التشوه استنادا إلى تجارب مع تشعب الشريان السباتي البشري ثلاثي الأبعاد. لذلك، إذا تم استخدام نماذج شريانية أخرى أو أنابيب أخرى، قد تتطلب كميات السوائل ومعدل التدفق تعديلات. وفي مثل هذه الحالات، سيتعين معايرة النظام ومعدل التدفق، مع ضمان عدم انفصال الخلية عن جدران النموذج. من المهم جدا زيادة معدل التدفق تدريجيا في المضخة العجش لضمان عدم غسل الخلايا بالتدفق. وعلاوة على ذلك، من المهم ضمان أن النظام بأكمله، بما في ذلك الأنابيب، والنموذج، وكذلك الحاوية مليئة بالسوائل(على سبيل المثال،في هذه الحالة، تم ملء مع حجم إجمالي قدره 300 مل من السوائل). بالإضافة إلى ذلك، قبل وبعد كل تجربة، يجب غسل النظام بالماء المقطر في تكوين دائرة مفتوحة.
ويمكن أيضا أن يكون الدم في النماذج التي تستخدم نظام التغلغل17. في هذه الحالة، يجب توخي المزيد من الحذر لمنع أي تسرب، خاصة إذا تم استخدام الدم البشري. وعلاوة على ذلك، فإن خطوة الغسيل أمر بالغ الأهمية حيث يجب أن يتم تغلغل التبييض في نهاية التجربة لضمان الاغتسال الكامل من الدم. بعد التبييض ، يجب أن يكون الماء متغلغلا كما هو مذكور في البروتوكول. من المهم أن نلاحظ أنه في هذه الورقة ، تم استخدام جزيئات PS الكالبوكسيلات ، والتي لها تكوين موحد وتوزيع ضيق الحجم. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الجسيمات تلتزم الخلايا في المقام الأول من خلال التفاعلات الكهروستاتيكية. ومع ذلك ، يمكن استخدام النانوكاريرات الدوائية الأخرى ، وينبغي فحص الاستهداف المحدد أيضا مع الجسيمات ذات العلامات الليغندية ، على سبيل المثال، إلى جزيء الالتصاق المضاد للخلايا 1 وجزيئ الالتصاق البطاني المضاد للصفائح الدموية 1 ، مما سيزيد من تراكم الجسيمات إلى ECs في موقع الاهتمام.
وبالإضافة إلى ذلك، تم في هذا البروتوكول إصلاح المركبات قبل ربط النماذج بنظام التشوه وحقن الجسيمات. ويمثل التصاق الجسيمات بالخلايا الثابتة المرحلة الأولى في عملية الربط، وبالتالي، يجب إجراء تجارب على الخلايا الحية، حيث قد يحدث استيعاب للجسيمات خلال المراحل اللاحقة من عملية التصاق. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتصنيع نماذج الشرايين ثلاثية الأبعاد لدراسة ناقلات الأدوية في ظل الظروف الفسيولوجية. وقد يساعد النهج المبين في دراسة تسليم العوامل في ظروف خاصة بالمرضى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الإسرائيلية (منحة مؤسسة دعم الدولة رقم 902/18). تم دعم منحة ماريا خوري من قبل برنامج البارونة أريان دي روتشيلد للدكتوراه النسائية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | FormLabs | PKG-F2-REFURB | |
| Acetone, absolute (AR grade) | |||
| Connectors | Nordson Medical | FTLL013-1 | Female Luer |
| FTLL230-1 | Female Luer | ||
| FTLL360-1 | Female Luer | ||
| LP4-1 | Male Luer Integral Lock | ||
| Damper | Thermo-Fisher Scientific | DS2127-0250 | Nalgene Polycarbonate, Validation Bottle |
| Damper Cover | Thermo-Fisher Scientific | 2162-0531 | Nalgene Filling/Venting Closures |
| Elastosil Elastosil RT 601 A | Wacker | 60003805 | |
| Elastosil RT 601 B | Wacker | 60003817 | The crosslinker |
| Endothelial Cell Media | ScienCell | 1001 | |
| Fibrontectin | Sigma Aldrich | F0895-5mg | |
| HUVEC | Lonza | CC-2519 | |
| Isopropyl alcohol, AR grade 99.5% | Remove plastic dust from the sanded model | ||
| Lacquer | Rust-Oleum | 2X-Ultra cover Gloss Clear | |
| Matlab | Mathworks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Microscope | Nikon | SMZ25 | |
| Microscope Camera | Nikon | DS-Qi2 | |
| Peristaltic pump | Watson Marlow | 530U IP31 | With 2 pumpheads: 313D |
| Plastic tube clamp | Quickun | 1-2240-stopvalve-2pcs | |
| Polystyrene Particles | Thermo-Fisher Scientific | F8827 | Diameter = 2 µm |
| Printer resin | FormLabs | RS-F2-GPCL-04 | |
| Rotator | ELMI Ltd. | Intelli-Mixer RM-2 | |
| Solidworks | SolidWorks Corp., Dassault Systèmes | https://www.solidworks.com/ | |
| Tubing | Watson Marlow | 933.0064.016 | Tubing for the pump: 6.4 mm ID |
| All the other tubing: Silicon tubing: 4 mm ID | |||
References
- Chiu, J. J., et al. Analysis of the effect of disturbed flow on monocytic adhesion to endothelial cells. Journal of Biomechanics. 36 (12), 1883-1895 (2003).
- Martorell, J., et al. Extent of flow recirculation governs expression of atherosclerotic and thrombotic biomarkers in arterial bifurcations. Cardiovascular Research. 103 (1), 37-46 (2014).
- Karino, T., Goldsmith, H. L. Flow behaviour of blood cells and rigid spheres in an annular vortex. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 279 (967), 413-445 (1977).
- Goldsmith, H. L., Karino, T. Platelets in a region of disturbed flow. Transactions - American Society for Artificial Internal Organs. 23, 632-638 (1977).
- Farcas, M. A., Rouleau, L., Fraser, R., Leask, R. L. The development of 3-D, in vitro, endothelial culture models for the study of coronary artery disease. Biomedical Engineering Online. 8, 30 (2009).
- Peng, B., et al. Modeling nanoparticle targeting to a vascular surface in shear flow through diffusive particle dynamics. Nanoscale Research Letters. 10 (1), 942 (2015).
- Shah, S., Liu, Y., Hu, W., Gao, J. Modeling particle shape-dependent dynamics in nanomedicine. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 11 (2), 919-928 (2011).
- Hossain, S. S., Hughes, T. J., Decuzzi, P. Vascular deposition patterns for nanoparticles in an inflamed patient-specific arterial tree. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (3), 585-597 (2014).
- Charoenphol, P., Huang, R. B., Eniola-Adefeso, O. Potential role of size and hemodynamics in the efficacy of vascular-targeted spherical drug carriers. Biomaterials. 31 (6), 1392-1402 (2010).
- Ta, H. T., Truong, N. P., Whittaker, A. K., Davis, T. P., Peter, K. The effects of particle size, shape, density and flow characteristics on particle margination to vascular walls in cardiovascular diseases. Expert Opinion on Drug Delivery. 15 (1), 33-45 (2018).
- Cooley, M., et al. Influence of particle size and shape on their margination and wall-adhesion: implications in drug delivery vehicle design across nano-to-micro scale. Nanoscale. 10 (32), 15350-15364 (2018).
- Jiang, X. Y., et al. Quantum dot interactions and flow effects in angiogenic zebrafish (Danio rerio) vessels and human endothelial cells. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (3), 999-1010 (2017).
- Zarins, C. K., et al. Carotid bifurcation atherosclerosis. Quantitative correlation of plaque localization with flow velocity profiles and wall shear stress. Circulation Research. 53 (4), 502-514 (1983).
- Chien, S. Effects of disturbed flow on endothelial cells. Annals of Biomedical Engineering. 36 (4), 554-562 (2008).
- Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. JAMA. 282 (21), 2035-2042 (1999).
- Glagov, S., Zarins, C., Giddens, D. P., Ku, D. N. Hemodynamics and atherosclerosis. Insights and perspectives gained from studies of human arteries. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 112 (10), 1018-1031 (1988).
- Khoury, M., Epshtein, M., Zidan, H., Zukerman, H., Korin, N. Mapping deposition of particles in reconstructed models of human arteries. Journal of Controlled Release. 318, 78-85 (2020).
