Summary
Hier stellen wir ein neues Protokoll vor, um die gezielte Ablagerung von Wirkstoffträgern an Endothelzellen in fabrizierten, realen, dreidimensionalen menschlichen Arterienmodellen unter physiologischem Fluss zu untersuchen und abzubilden. Die vorgestellte Methode könnte als neue Plattform für die Gezielter von Wirkstoffträgern innerhalb des Gefäßsystems dienen.
Abstract
Die Verwendung von dreidimensionalen (3D) Modellen menschlicher Arterien, die mit den richtigen Abmessungen und Anatomie entworfen sind, ermöglicht die korrekte Modellierung verschiedener wichtiger Prozesse im Herz-Kreislauf-System. Obwohl in letzter Zeit mehrere biologische Studien mit solchen 3D-Modellen menschlicher Arterien durchgeführt wurden, wurden sie nicht zur Untersuchung des vaskulären Targetings angewendet. Dieser Artikel stellt eine neue Methode vor, um reale, rekonstruierte menschliche arterielle Modelle mit einer 3D-Drucktechnik herzustellen, sie mit menschlichen Endothelzellen (ECs) auszukleiden und partikelspezifische Ziele unter physiologischem Fluss zu untersuchen. Diese Modelle haben den Vorteil, dass sie die physiologische Größe und den Zustand der Blutgefäße im menschlichen Körper mit kostengünstigen Komponenten replizieren. Diese Technik könnte als neue Plattform für die Untersuchung und das Verständnis von Wirkstoff-Targeting im Herz-Kreislauf-System dienen und das Design neuer injizierbarer Nanomedikamente verbessern. Darüber hinaus kann der vorgestellte Ansatz wichtige Instrumente für die Untersuchung der gezielten Verabreichung verschiedener Wirkstoffe für Herz-Kreislauf-Erkrankungen unter patientenspezifischen Fluss- und physiologischen Bedingungen liefern.
Introduction
In jüngster Zeit wurden mehrere Ansätze unter Verwendung von 3D-Modellen der menschlichen Arterien1,2,3,4,5angewendet. Diese Modelle replizieren die physiologische Anatomie und Umgebung verschiedener Arterien im menschlichen Körper in vitro. Sie wurden jedoch hauptsächlich in zellbiologischen Studien verwendet. Aktuelle Studien zum vaskulären Targeting von Partikeln auf das Endothel umfassen in silico Computersimulationen6,7,8, in vitro mikrofluidische Modelle9,10,11und in vivo Tiermodelle12. Trotz der Erkenntnisse, die sie geliefert haben, haben diese experimentellen Modelle den Targeting-Prozess, der in menschlichen Arterien auftritt, nicht genau simuliert, wobei Blutfluss und Hämodynamik dominante Faktoren darstellen. Zum Beispiel kann die Untersuchung von Partikeln, die auf atherosklerotische Regionen in der Karotisarterienverzweigung abzielen, die für ihr komplexes Rezirkulationsflussmuster und ihren Wandscherspannungsgradienten bekannt sind, die Reise der Partikel beeinflussen, bevor sie das Endothel erreichen13,14,15,16. Daher müssen diese Studien unter Bedingungen durchgeführt werden, die die physiologische Umgebung replizieren, d. H.Größe, Dimension, Anatomie und Strömungsprofil.
Vor kurzem fertigte diese Forschungsgruppe 3D-rekonstruierte menschliche arterielle Modelle, um die Ablagerung und das Targeting von Partikeln auf das Gefäßsystem zu untersuchen17. Die Modelle basierten auf geometrischen 3D-Nachbildungen menschlicher Blutgefäße, die dann mit menschlichen ECs kultiviert wurden, die anschließend ihre Innenwände auskleideten. Darüber hinaus replizierten die Modelle, wenn sie einem Perfusionssystem unterzogen wurden, das einen physiologischen Fluss erzeugt, die physiologischen Bedingungen genau. Das Perfusionssystem wurde entwickelt, um Flüssigkeiten mit einer konstanten Durchflussrate zu perfusionieren, wobei eine Peristaltikpumpe sowohl in geschlossenen als auch in offenen Kreisläufen verwendet wird (Abbildung 1). Das System kann als geschlossener Kreislauf verwendet werden, um die Partikelablagerung und das Targeting auf die Zellen abzubilden, die innerhalb des Carotismodells ausgesät sind. Darüber hinaus kann es als offener Kreislauf verwendet werden, um nicht haftende Partikel am Ende der Experimente auszuwaschen und das System zu reinigen und zu warten. Dieser Artikel stellt Protokolle für die Herstellung von 3D-Modellen der menschlichen Carotisverzweigung, das Design des Perfusionssystems und die Abbildung der Ablagerung von Zielpartikeln innerhalb der Modelle vor.
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Protocol
HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung eines 3D-Modells der Halsschlagader und kann angewendet werden, um jede andere Arterie von Interesse zu erzeugen, indem einfach die geometrischen Parameter geändert werden.
1. Entwurf und Herstellung einer 3D-Verzweigung des Modells der menschlichen Halsschlagader
- Wählen Sie Bilder von Patienten oder zuvor untersuchte Geometrien der Verzweigung der menschlichen Halsschlagader und erstellen Sie ein computergestütztes Designmodell der Form, das gedruckt werden muss.
HINWEIS: Die Karotisverzweigung hat einen Einlass und zwei Auslässe. Es ist wichtig, einen 3D-Formrahmen um die Arterie und temporäre Druckstützen zwischen dem Rahmen und der Arterienform zu entwerfen (Abbildung 2A-C). - Drucken Sie die Geometrien mit einem 3D-Drucker. Schneiden Sie die temporären Druckstützen ab und verwenden Sie Schleifpapier, um die Formen zu polieren und zu glätten, insbesondere in den Bereichen, in denen die Stützen geschnitten wurden. Spülen Sie das geschliffene Modell mit Isopropylalkohol ab, um den Kunststoffstaub zu entfernen, und lassen Sie es in einer chemischen Haube für 2-3 h vollständig trocknen.
HINWEIS: Hier wurden die gedruckten Formen aus Klarem Harz v4 hergestellt (Abbildung 2D, E). - Um den Kunststoff leicht aufzulösen, sprühen Sie die Formen mit transparentem Lack in eine chemische Haube und lassen Sie sie 1 h an der Luft trocknen. Wiederholen Sie dies 3x.
HINWEIS: Hier wurde 2X Ultra Cover Clear Spray verwendet, aber jede andere Art sollte geeignet sein, solange es sich nicht um Holzlack handelt. Vergewissern Sie sich, dass kein freiliegender Kunststoff mehr vorhanden ist, da der Kunststoff möglicherweise mit dem Silikon reagiert und verhindert, dass es sich richtig verfestigt. Die Qualität der besprühten Oberfläche bestimmt die Qualität der Oberfläche des endgültigen Silikonmodells. - Schneiden Sie transparente rechteckige Dias / Streifen aus glattem Kunststoff mit den gleichen Abmessungen wie der Formrahmen und kleben Sie sie mit dem Lack auf allen Seiten und von einer Seite des Rahmens auf den Rahmen, so dass er unten versiegelt und oben geöffnet wird. Tragen Sie den Lack mit einem Pinsel in eine chemische Haube auf und lassen Sie die Dias mindestens 24 Stunden vollständig trocknen(Abbildung 2F).
- Um die Silikonkautschukmischung vorzubereiten, fügen Sie Flüssigsilikon mit seinem Härter (Massenverhältnis 1:10) in eine Kunststoffplatte ein und rühren Sie gründlich um, um eine vollständige Mischung zu gewährleisten. Für das Carotis-Modell fügen Sie 54 g des Silikons und 6 g seines Härters hinzu.
- Kühlen Sie das Gemisch für 15 min bei 4 °C ab und entgasen Sie es dann in einem Vakuum-Trockenmittel, bis alle Luftblasen beseitigt sind. Legen Sie die Form in den Trockenmittel (mit der offenen Seite nach oben), gießen Sie die Silikonmischung langsam in die Form und entfernen Sie die Luftblasen erneut, bis die Mischung klar ist.
- Lassen Sie die Form mit dem Silikon über Nacht bei Raumtemperatur stehen (wenn möglich, lassen Sie es ohne Vakuum im Ausstecher). Wenn die Mischung noch nicht vollständig getrocknet ist, inkubieren Sie sie bei 60 °C für weitere Stunden.
- Sobald die Mischung vollständig getrocknet ist, entfernen Sie die transparenten Dias und tauchen Sie das Modell 48 h lang in absolutes Aceton in eine chemische Haube, bis der Kunststoff vollständig gelöst ist. Entfernen Sie alle Plastikreste mit einem Holzstab. Um das im Modell eingeschlossene Aceton zu verdampfen, inkubieren Sie es bei 60 °C für mindestens 4 Tage, bevor Sie die Zelle aussäen.
2. Zellkultur und Seeding in Modellen
- Bereiten Sie drei Anschlüsse für das Carotismodell vor: einen für den Einlass und zwei für die Auslässe (siehe Materialtabelle). Sterilisieren Sie das Modell und die Anschlüsse durch ultraviolette Bestrahlung in einer biologischen Haube für 20 min.
- Beschichten Sie die Modelle mit 4 mL 100 μg/ml Fibronektin (in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung, (PBS)) für 2 h bei 37 °C oder über Nacht bei 4 °C. Injizieren Sie die Fibronektinlösung durch den Einlass mit einer 5- oder 10-ml-Kunststoffspritze in das Modell. Entfernen Sie das Fibronektin durch den Auslass und waschen Sie das Modell mit EC-Medium.
- Suspendieren Sie 2,5 × 106 Zellen/ml humane Nabelschnurvenendothelzellen (HUVECs, Passage < 6) und füllen Sie das Modell mit 4 ml der Zellsuspension mit einer 5 oder 10 ml Kunststoffspritze (Abbildung 3A). Legen Sie das Modell auf einen Rotator in einem Inkubator (37 °C) mit einer Geschwindigkeit von 1 U / min für 48 h, um eine homogene Aussaat zu gewährleisten. Stellen Sie sicher, dass das Modell gut am Rotator befestigt ist (Abbildung 3B). Wechseln Sie das Medium nach 24 h in einer biologischen Haube und kehren Sie für weitere 24 h zum Rotator im Inkubator zurück.
HINWEIS: Nach 24 h sind die Zellen ausgesät und können mit einem Mikroskop abgebildet werden. - Entfernen Sie das Modell aus dem Rotator und waschen Sie es mit 1x PBS mit einer 10-ml-Kunststoffspritze. Um die Zellen zu fixieren, inkubieren Sie die Zellen mit 4 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) für 15 minuten in einer chemischen Haube zum Modell und spülen Sie sie dann 3x mit PBS ab. Fügen Sie 4 ml PBS hinzu und lagern Sie es bei 4 °C bis zum Experiment (Abbildung 3C). Färben Sie die Zellen innerhalb des Modells mit Standard-Färbeprotokollen (z. B. Kernfärbung mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), Abbildung 3D).
3. Aufbau des Perfusionssystems
- Das Perfusionssystem verfügt über zwei Einlässe und zwei Auslassröhrchen. Verschmelzen Sie die beiden Einlässe zu einem einzigen 4 mm ID-Rohr und wieder zu zwei 6 mm ID-Rohren, die mit der Peristaltikpumpe verbunden sind. Verschmelzen Sie die beiden 6-mm-ID-Rohre, die aus der Peristaltikpumpe kommen, zu einem einzigen 4-mm-Rohr und verbinden Sie es mit einem Schwingungsdämpfer, um Schwingungen von der Pumpe zu eliminieren. Verwenden Sie eine 250 ml schmalmundige Flasche mit einem dreiblendeigen Deckel als Dämpfer.
- Schließen Sie eine Öffnung an den Einlass der Pumpe an, schließen Sie die zweite mit einem Korken, der in Notfällen zur Druckentlüftung verwendet wird, und verlängern Sie die dritte Öffnung (die der Auslass ist) bis zum Boden der Flasche.
- Verbinden Sie den Dämpfer mit dem Einlass des kultivierten Halsschlagadermodells über den Auslassschlauch. Verschmelzen Sie die beiden Auslässe des Modells zu einem Schlauch, der der Auslass des Systems ist (Alle Schläuche sind 4 mm ID).
- Teilen Sie den Auslassschlauch in zwei Auslassrohre auf (eines für den geschlossenen Kreislauf und das andere für den Abfallbehälter im offenen Kreislauf). Befestigen Sie an jedem Rohr eine Kunststoffklemme.
HINWEIS: Die Kombination aus offenen/geschlossenen Klemmen bestimmt, ob sich das System in einer geschlossenen oder offenen Konfiguration befindet. Wie in Abbildung 1dargestellt, ist das System ein geschlossener Stromkreis, wenn die Klemmen a und d geschlossen sind, während b und c geöffnet sind. Die Rückseite bringt das System zur Konfiguration des offenen Stromkreises. - Bereiten Sie drei Behälter vor: einen, der 300 ml Flüssigkeit aufnehmen kann (für geschlossenen Kreislauf) und zwei weitere von jeweils 1 L: einen zum Waschen und den anderen für Abfälle (für den offenen Kreislauf).
4. Geschlossene Konfiguration: Perfusionsexperiment und Bildgebung
- Fügen Sie dem Behälter mit geschlossenem Kreislauf 300 ml PBS hinzu, was ausreicht, um das gesamte System einschließlich des Schlauchs und des Modells zu füllen. Legen Sie ein Einlassrohr und ein Auslassrohr (offene Klemmen b und c) in den Behälter.
- Füllen Sie den 1 L Waschbehälter mit destilliertem Wasser (zum Waschen am Ende des Experiments) und lassen Sie den anderen 1 L Abfallbehälter leer. Legen Sie die anderen Ein- und Auslassschläuche (schließen Sie die Klemmen a und d) in die Wasch- bzw. Abfallbehälter.
- Nehmen Sie das fest zellkulierte Carotismodell aus dem 4 °C-Speicher und leeren Sie das PBS. Schließen Sie den Ein- und Auslass der Halsschlagader wie in den Schritten 3.3-3.4 beschrieben an. Lassen Sie das Modell nicht lange trocken. Sobald das Modell angeschlossen ist, aktivieren Sie die Pumpe, um Flüssigkeit zu perfundieren.
- Legen Sie das Carotismodell unter das Mikroskop. Öffnen Sie den Schlauch vor dem Einlass und nach dem Auslass des Halsschlagadermodells. Stellen Sie die Peristaltikpumpe auf 10 U / min ein und schalten Sie sie ein. Erhöhen Sie die Geschwindigkeit in Schritten von 5 U / min, alle 4-5 minuten. Stellen Sie sicher, dass es keine Leckagen gibt.
- Bei 100 U/min, was der maximalen Durchflussrate der physiologischen Wellenform der menschlichen Halsschlagader (~400 ml/min) entspricht, fügen Sie fluoreszierende carboxylierte Polystyrolpartikel (PS) (2 μm, in einer Konzentration von 1,6 μg/ml) zu den 300 ml PBS im geschlossenen Kreislaufbehälter hinzu. Stellen Sie die Region von Interesse alle 10 s für 1,5 h ab (standbildlich einzelne Bilder oder Videos nach Bedarf).
5. Open-Circuit-Konfiguration: der Waschschritt
- Öffnen Sie die Klemmen der Wasch- und Abfallrohre in den 1-L-Behältern (Klemmen a und d) und schließen Sie sofort die Klemmen der Einlass- und Auslassrohre im 300-ml-Behälter (Klemmen b und c), um das System von einer geschlossenen in eine offene Kreislaufkonfiguration zu wechseln.
- Lassen Sie den größten Teil des Wassers mit 100 U / min vom Waschbehälter zum Abfallbehälter fließen. Bevor es vollständig übertragen wird, drücken Sie Stopp auf der Peristaltikpumpe und schließen Sie die Rohrklemmen vor dem Einlass und nach dem Auslass des Halsschlagadermodells.
- Erfassen Sie mit den entsprechenden Filtern Bilder des Modells im interessierende Bereich, um die Ablagerung und Haftung von Partikeln an den Zellen zu zeigen. Trennen Sie das Carotismodell. Fügen Sie vorsichtig und langsam 4 ml PBS mit einer 10-ml-Spritze durch den Einlass des Modells hinzu.
- Verbinden Sie ein "Dummy-Modell" (das auch ein Silikonkautschuk-3D-Carotismodell ist, das nur zum Waschen ohne kultivierte Zellen verwendet wird) anstelle des Carotismodells und spülen Sie das System aus. Fügen Sie weitere 1 L Wasser hinzu und waschen Sie das System erneut, bis das gesamte Wasser aus dem Waschbehälter in den Abfall überführt ist. Schalten Sie die Peristaltikpumpe aus.
6. Datenerfassung und -analyse
- Erfassen Sie einen digitalen Film der Partikelablagerung im interessierende Bereich mit den während des Experiments aufgenommenen Bildern mit einem benutzerdefinierten Softwarecode (siehe Materialtabelle).
- Für die Abbildung der Ablagerung der Partikel entlang des Modells kacheln Sie mehrere Bilder, um den untersuchten Bereich von Interesse abzudecken (Abbildung 4A, B).
HINWEIS: Ein benutzerdefinierter Softwarecode kann geschrieben werden, um die Anzahl der anhaftenden Partikel an einem interessanten Ort zu quantifizieren (eine Beispieldatei wurde als ergänzende Informationbereitgestellt)17.
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Representative Results
Dieser Artikel stellt ein neues Protokoll vor, um die Ablagerung von Partikeln in realen 3D-Modellen menschlicher Arterien abzubilden, die eine neue Plattform für die Erforschung der Wirkstoffabgabe bieten könnten. Mit Hilfe einer 3D-Drucktechnik wurde ein Modell der menschlichen Karotisverzweigungsarterie hergestellt (Abbildung 2). Das Modell wurde aus Silikonkautschuk gefertigt und mit menschlichen ECs ausgesät (Abbildung 3). Wichtig ist, dass dieses Protokoll die Replikation physiologischer Bedingungen ermöglichte, insbesondere in Bezug auf die Fluiddynamik. Ein Perfusionssystem wurde entwickelt, um Partikel unter konstantem Fluss in der Größe der physiologischen Wellenform, die für die Halsschlagader charakteristisch ist, in die Karotisverzweigung einzugsen. Abbildung 1 zeigt das Perfusionssystem, das aus der Peristaltikpumpe, einem Schwingungsdämpfer, dem kultivierten Verzweigungsmodell, Schläuchen und Flüssigkeitsbehältern besteht.
Um die Ablagerung und Adhäsion der durchbluteten Partikel abzubilden, wurde das arterielle Modell sowohl am Ende des Experiments als auch nach dem Waschen unter einem Stereomikroskop abgebildet (Schritt 5.3). Die Bilder wurden mit 2x Objektiv aufgenommen und zu einem gesamten Bild des Modells zusammengefügt. Anschließend wurde die Anzahl der anhaftenden Partikel mit einem kundenspezifischen Softwarecode berechnet. Um die Bildung des Rezirkulationsmusters bei der Verzweigung zu untersuchen, wurden 10 μm fluoreszierende Glasperlen in das Modell infundiert. Abbildung 4A zeigt die Rezirkulation, was darauf hindeutet, dass die Bedingungen innerhalb des Modells physiologische Bedingungen nachahmen.
Um die Ablagerung von Partikeln innerhalb des Modells abzubilden, wurden 2 μm fluoreszierende carboxylierte PS-Partikel infundiert und ihre Haftung an den ECs abgebildet (Abbildung 4B, C). Diese Partikel hafteten unterschiedlich an verschiedenen Stellen entlang des Modells - mehr Adhäsion wurde außerhalb des Rezirkulationsbereichs beobachtet, wo die Wandscherspannung hoch ist. Diese Ergebnisse wurden bereits diskutiert, um zu zeigen, dass die Adhäsion von Partikeln eine Funktion der Geometrie des Modells, der Partikeloberflächeneigenschaften und der Scherspannung17ist. Diese Ablagerungskarten sind relativ einfach und können schnell für das Screening der Affinität von Arzneimittelträgern und das Targeting unter physiologischen Bedingungen in patientenspezifischen Modellen erhalten werden.
Abbildung 1: Das Perfusionssystem. Ein Perfusionssystem wurde entwickelt, um Flüssigkeiten unter konstantem Fluss zu perfusionieren. Es besteht aus (1) einer Peristaltikpumpe, (2) einem Schwingungsdämpfer, (3) dem kultivierten 3D-Arterienmodell und drei Glasbehältern: zwei mit einer Kapazität von 1 L (4 und 6) und einem dritten, der 300 ml Flüssigkeit aufnehmen kann (5). Das System kann in zwei Konfigurationen betrieben werden: (i) ein offener Stromkreis, in dem die Klemmen a+ d offen und b+c geschlossen sind, oder (ii) ein geschlossener Kreislauf, in dem die Klemmen a+d geschlossen und b+c offen sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Herstellungsprozess eines 3D-Carotis-Bifurkationsmodells. (A-C) Menschliche Karotisverzweigung, der Formrahmen um die Arterie und temporäre Druckstützen wurden entworfen. (D, E) Die Geometrien wurden mit einem 3D-Drucker gedruckt. (F) Die provisorischen Druckstützen wurden geschnitten, und das Modell wurde geschliffen und mit Lack besprüht. Anschließend wurden transparente rechteckige Dias von allen Seiten auf den Rahmen geklebt. Silikonkautschuk wurde gegossen, wenn der Kleber trocken war. Abkürzung: 3D = dreidimensional. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Aussaat von ECs in 3D-Modellen der Halsschlagader. (A) Reales 3D-Modell der menschlichen Karotisverzweigung aus Silikonkautschuk. Das Modell wurde mit menschlichen ECs kultiviert und mit Zellmedium gefüllt. (B) Das kultivierte Modell wurde für 48 h auf einen Rotator bei 37 °C gelegt. (C) Bilder der kultivierten ECs innerhalb des 3D-Modells im Hellfeld und (D) mit DAPI zur Kernfärbung in Blau. Maßstabsbalken = 10 μm. Abkürzungen: ECs = Endothelzellen; DAPI = 4′,6-Diamidino-2-phenylindol; 3D = dreidimensional. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Aufprischen und Abbildung der Haftung von Partikeln. (A) Streifenlinienbild von Stromlinien und Rezirkulation (gestricheltes Rechteck), das beim Durchbluten von 10 μm fluoreszierenden Glaspartikeln bei einem konstanten Fluss von 400 ml/min durch das Modell erzeugt wird. (B) Abscheidungskarte der 2 μm fluoreszierenden carboxylierten PS-Partikel (in rot) innerhalb des 3D-kultivierten Modells. Maßstabsbalken = 2 mm. (C) Haftung der Partikel (in rot) an den kultivierten ECs (in blau-DAPI) innerhalb des Modells bei einer 10-fachen Vergrößerung. Maßstabsleiste = 10 μm. Abkürzungen: PS = Polystyrol; 3D = dreidimensional; ECs = Endothelzellen; DAPI = 4′,6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Informationen: Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Aktuelle Ansätze zur Untersuchung des vaskulären Targetings von Partikeln versagen bei der Replikation der physiologischen Bedingungen im menschlichen Körper. Hier wird ein Protokoll zur Herstellung von 3D-rekonstruierten Modellen menschlicher Arterien vorgestellt, um das Partikel-Targeting auf die ECs zu untersuchen, die die Arterie unter physiologischem Fluss auskleiden, der mit einem maßgeschneiderten Perfusionssystem angewendet wird. Bei der Auswahl des Materials für den 3D-Druck ist es am besten, einen klaren Kunststoff zu verwenden, um einen Pigmenttransfer auf das Silikonmodell zu vermeiden, das so transparent wie möglich sein sollte. Darüber hinaus ist es wichtig, ein Material zu wählen, das sich nicht in Aceton auflöst, sondern weich und spröde wird und anschließend leicht aus dem Modell entfernt werden kann.
Die vorgestellten 3D-Modelle bestehen aus Silikonkautschuk, einem transparenten Silikon, gemischt mit seinem Härter. Es ist wichtig darauf zu achten, dass das Gemisch immer raumtemperatur oder darunter ist, da sonst die Vernetzung zwischen silikon und härter vor der Entgasung und dem Gießen auf die Formen beginnt. Obwohl Polydimethylsiloxan auch zur Herstellung solcher Modelle verwendet werden kann (Verhältnis 1:10 mit seinem Vernetzer), ist Silikonkautschuk haltbarer. Nachdem das Modell in Aceton getaucht wurde, um den Kunststoff aufzulösen, ist es wichtig, es bei 60 ° C für mindestens 4 Tage zu inkubieren, um eine vollständige Verdampfung aller Acetonrückstände zu gewährleisten. Wenn Aceton im Modell eingeschlossen bleibt, wachsen die Zellen nicht richtig. Der Wechsel des Mediums nach 24 h und die Fixierung der Zellen nach 48 h sind die beiden Schritte, die die manuelle Injektion von Flüssigkeit mit einer 10-ml-Spritze beinhalten. Es ist daher wichtig, langsam zu perfundieren, da sonst die Zellen ausgewaschen werden könnten.
Das Perfusionssystem verfügt über zwei Einlässe und zwei Auslassröhrchen. Jedes Rohr hat eine Kunststoffrohrklemme zur Durchflusskontrolle. Der größte Teil des Schlauchsystems besteht aus 4 mm Innendimeterrohren (ID), mit Ausnahme der in der Pumpe eingeklemmten Rohre, bei denen es sich um 6 mm ID-Rohre handelt. Die ID der in der Pumpe eingespannten Rohre bestimmt die maximale Durchflussrate, die im System erreicht werden kann. Dieses Perfusionssystem kann auch eine pulsierende Wellenform erzeugen, indem es Schwingungen auf dem konstanten mittleren Durchfluss17 überlagert, indem es den Auslass des Dämpfers mit einer Oszillatorbaugruppe verbindet, die den oszillierenden Teil einer gewünschten Wellenform auf die von der Peristaltikpumpe erzeugte konstante Durchflussrate überlagert. Diese Konfiguration ermöglicht den Betrieb unter oszillierendem Durchfluss oder unter konstanten Strömungsbedingungen, wenn der Oszillator ausgeschaltet ist.
In dieser Arbeit wurde das Perfusionssystem basierend auf Experimenten mit der 3D-Verzweigung der Halsschlagader humaner Halsschlagader angepasst. Wenn also andere arterielle Modelle oder andere Schläuche verwendet werden, können die Flüssigkeitsmengen und die Durchflussrate Anpassungen erfordern. In solchen Fällen müssen das System und die Durchflussrate kalibriert werden, wobei sichergestellt wird, dass sich die Zellen nicht von den Modellwänden lösen. Es ist sehr wichtig, die Durchflussrate in der Peristaltikpumpe schrittweise zu erhöhen, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht mit dem Strom weggespült werden. Darüber hinaus ist es wichtig sicherzustellen, dass das gesamte System, einschließlich des Schlauchs, des Modells sowie des Behälters, mit Flüssigkeiten gefüllt ist(z. B.wurde es in diesem Fall mit einem Gesamtvolumen von 300 ml Flüssigkeit gefüllt). Darüber hinaus sollte das System vor und nach jedem Experiment mit destilliertem Wasser in einer Offenkreiskonfiguration gewaschen werden.
Blut kann auch mit dem Perfusionssystem in die Modelle perfundiert werden17. In diesem Fall ist besondere Vorsicht geboten, um ein Auslaufen zu verhindern, insbesondere wenn menschliches Blut verwendet wird. Darüber hinaus ist der Waschschritt entscheidend, da am Ende des Experiments Bleichmittel durchblutet werden muss, um eine vollständige Auswaschung des Blutes zu gewährleisten. Nach dem Bleichen sollte Wasser wie im Protokoll erwähnt perfundiert werden. Es ist wichtig zu beachten, dass in diesem Papier carboxylierte PS-Partikel verwendet wurden, die eine gleichmäßige Zusammensetzung und eine enge Größenverteilung aufweisen. Darüber hinaus haften diese Partikel vor allem durch elektrostatische Wechselwirkungen an den Zellen. Es können jedoch andere Wirkstoff-Nanocarrier verwendet werden, und ein spezifisches Targeting sollte ebenso untersucht werden wie ligandenmarkierte Partikel, z. B.auf anti-interzelluläres Adhäsionsmolekül 1 und Anti-Thrombozyten-Endothelzelladhäsionsmolekül 1, was die Partikelakkumulation zu ECs an der interessierenden Stelle erhöht.
Darüber hinaus wurden in diesem Protokoll ECs festgelegt, bevor die Modelle an das Perfusionssystem und die Injektion der Partikel anknüpft wurden. Die Adhäsion von Partikeln an festen Zellen stellt die erste Stufe des Bindungsprozesses dar und daher müssen Experimente mit lebenden Zellen durchgeführt werden, bei denen die Internalisierung von Partikeln in späteren Phasen des Adhäsionsprozesses auftreten kann. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um 3D-arterielle Modelle für die Untersuchung von Arzneimittelträgern unter physiologischen Bedingungen herzustellen. Der skizzierte Ansatz kann bei der Untersuchung der Verabreichung von Wirkstoffen unter patientenspezifischen Bedingungen helfen.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Israel Science Foundation unterstützt (ISF-Stipendium # 902/18). Maria Khourys Stipendium wurde vom Baroness Ariane de Rothschild Women Doctoral Program unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | FormLabs | PKG-F2-REFURB | |
| Acetone, absolute (AR grade) | |||
| Connectors | Nordson Medical | FTLL013-1 | Female Luer |
| FTLL230-1 | Female Luer | ||
| FTLL360-1 | Female Luer | ||
| LP4-1 | Male Luer Integral Lock | ||
| Damper | Thermo-Fisher Scientific | DS2127-0250 | Nalgene Polycarbonate, Validation Bottle |
| Damper Cover | Thermo-Fisher Scientific | 2162-0531 | Nalgene Filling/Venting Closures |
| Elastosil Elastosil RT 601 A | Wacker | 60003805 | |
| Elastosil RT 601 B | Wacker | 60003817 | The crosslinker |
| Endothelial Cell Media | ScienCell | 1001 | |
| Fibrontectin | Sigma Aldrich | F0895-5mg | |
| HUVEC | Lonza | CC-2519 | |
| Isopropyl alcohol, AR grade 99.5% | Remove plastic dust from the sanded model | ||
| Lacquer | Rust-Oleum | 2X-Ultra cover Gloss Clear | |
| Matlab | Mathworks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Microscope | Nikon | SMZ25 | |
| Microscope Camera | Nikon | DS-Qi2 | |
| Peristaltic pump | Watson Marlow | 530U IP31 | With 2 pumpheads: 313D |
| Plastic tube clamp | Quickun | 1-2240-stopvalve-2pcs | |
| Polystyrene Particles | Thermo-Fisher Scientific | F8827 | Diameter = 2 µm |
| Printer resin | FormLabs | RS-F2-GPCL-04 | |
| Rotator | ELMI Ltd. | Intelli-Mixer RM-2 | |
| Solidworks | SolidWorks Corp., Dassault Systèmes | https://www.solidworks.com/ | |
| Tubing | Watson Marlow | 933.0064.016 | Tubing for the pump: 6.4 mm ID |
| All the other tubing: Silicon tubing: 4 mm ID | |||
References
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