Summary
Burada, fizyolojik akış altında imal edilmiş, gerçek boyutlu, üç boyutlu insan arter modellerinde ilaç taşıyıcılarının hedeflenen birikimini incelemek ve endotel hücreleriyle haritalamak için yeni bir protokol sunuyoruz. Sunulan yöntem, damar sistemi içindeki ilaç taşıyıcılarını hedeflemek için yeni bir platform görevi görebilebilir.
Abstract
Doğru boyut ve anatomi ile tasarlanan insan arterlerinin üç boyutlu (3D) modellerinin kullanılması, kardiyovasküler sistemdeki çeşitli önemli süreçlerin uygun şekilde modellenerek kullanılmasını sağlar. Son zamanlarda, insan arterlerinin bu tür 3D modelleri kullanılarak çeşitli biyolojik çalışmalar yapılmasına rağmen, vasküler hedeflemeyi incelemek için uygulanmamıştır. Bu makale, 3D baskı tekniği kullanarak gerçek boyutlu, yeniden yapılandırılmış insan arteriyel modelleri imal etmek, bunları insan endotel hücreleri (VC) ile hizalamak ve fizyolojik akış altında parçacık hedeflemeyi incelemek için yeni bir yöntem sürmektedir. Bu modeller, insan vücudundaki kan damarlarının fizyolojik boyutunu ve koşullarını düşük maliyetli bileşenler kullanarak çoğaltma avantajına sahiptir. Bu teknik, kardiyovasküler sistemde ilaç hedeflemesini incelemek ve anlamak için yeni bir platform görevi görebilir ve yeni enjekte edilebilir nanotıpların tasarımını geliştirebilir. Ayrıca, sunulan yaklaşım, hastaya özgü akış ve fizyolojik koşullar altında kardiyovasküler hastalıklar için farklı ajanların hedefli teslimatının incelenmesi için önemli araçlar sağlayabilir.
Introduction
Son zamanlarda insan arterlerinin 1 ,2, 3 ,4,53Dmodelleri kullanılarak çeşitli yaklaşımlar uygulanmıştır. Bu modeller, insan vücudundaki farklı arterlerin fizyolojik anatomisini ve ortamını in vitro olarak çoğaltır. Bununla birlikte, daha çok hücre biyolojisi çalışmalarında kullanılmıştır. Parçacıkların endotellere vasküler hedeflemesi üzerine yapılan güncel çalışmalar siliko hesaplama simülasyonları 6,7,8, in vitro mikroakışkan modeller 9,10,11ve in vivo hayvan modelleri12içerir. Sağladıkları içgörülere rağmen, bu deneysel modeller, kan akışı ve hemodinamiklerin baskın faktörleri oluşturduğu insan arterlerinde meydana gelen hedefleme sürecini doğru bir şekilde simüle edememiştir. Örneğin, karmaşık devridaim akış deseni ve duvar kesme gerilme gradyanı ile bilinen karotis arter çatallanmadaki aterosklerotik bölgelere yönelik parçacık hedefleme çalışması, parçacıkların endotel 13 , 14,15,16'yaulaşmadan önce yaptıkları yolculuğu etkileyebilir. Bu nedenle, bu çalışmalar fizyolojik ortamı, yaniboyutu, boyutu, anatomisini ve akış profilini çoğaltan koşullar altında yapılmalıdır.
Son zamanlarda, bu araştırma grubu, parçacıkların vaskülür17'yebirikmesini ve hedeflenerek incelenmesini incelemek için 3D yeniden yapılandırılmış insan arteriyel modeller üretmektedir. Modeller, daha sonra iç duvarlarını kaplayan insan WC'leri ile kültürlenen insan kan damarlarının geometrik 3D kopyalarına dayanıyordu. Ek olarak, fizyolojik akış üreten bir perfüzyon sistemine maruz kaldığında, modeller fizyolojik durumları doğru bir şekilde çoğaltmıştır. Perfüzyon sistemi, hem kapalı hem de açık devre konfigürasyonlarında peristaltik bir pompa kullanarak sıvıları sabit bir akış hızında perfüzyonlamak için tasarlanmıştır (Şekil 1). Sistem, parçacık biriktirme ve hedeflemeyi karotid modelinin içinde tohumlanan hücrelere eşlemek için kapalı devre olarak kullanılabilir. Ek olarak, deneylerin sonunda yapışmayan parçacıkları yıkamak ve sistemi temizlemek ve korumak için açık devre olarak kullanılabilir. Bu makale, insan şahda ikiye ayırmanın 3D modellerinin imalatı, perfüzyon sisteminin tasarımı ve modellerin içindeki hedeflenen parçacıkların birikmesinin haritalandırılması için protokoller sunun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu protokol, şahdamarının 3D modelinin imalatını açıklar ve geometrik parametreleri değiştirerek başka bir ilgi atardamarı oluşturmak için uygulanabilir.
1. İnsan şahdamar modelinin 3D çatallanmasının tasarımı ve imalatı
- Hastalardan veya daha önce çalışılan insan şahdamar çatallanmasının geometrilerinden görüntüler seçin ve basılması gereken kalıbın bilgisayar destekli bir tasarım modelini oluşturun.
NOT: Şahdamar bifurkasyonu bir giriş ve iki çıkışa sahiptir. Arter etrafında bir 3D kalıp çerçevesi tasarlamak önemlidir ve çerçeve ile arter kalıbı arasında geçici baskı destekleri(Şekil 2A-C). - Geometrileri 3D yazıcı kullanarak yazdırın. Geçici baskı desteklerini kesin ve özellikle desteklerin kesildiği alanlarda kalıpları parlatmak ve pürüzsüzleştirmek için zımpara kağıdı kullanın. Plastik tozu çıkarmak için zımparalanmış modeli izopropil alkolle durulayın ve kimyasal bir başlıkta 2-3 saat boyunca tamamen kurumaya bırakın.
NOT: Burada, baskılı kalıplar berrak reçine v4(Şekil 2D,E)yapılmıştır. - Plastiği kolayca çözmek için kalıpları kimyasal bir kaputun içine şeffaf lake ile püskürtün ve 1 saat boyunca havayla kurumaya bırakın. Bunu 3x tekrarlayın.
NOT: Burada, 2X Ultra Kapak Şeffaf Sprey kullanıldı, ancak ahşap lake olmadığı sürece başka her türlü uygun olmalıdır. Açıkta plastik kalmadığını onaylayın, çünkü plastik silikonla reaksiyona sokabilir ve düzgün bir şekilde katılaşmasını önleyebilir. Püskürtülen yüzeyin kalitesi, nihai silikon modelinin yüzeyinin kalitesini belirleyecektir. - Kalıp çerçevesiyle aynı boyutlarda şeffaf dikdörtgen slaytlar / şeritler kesin ve cilayı kullanarak çerçevenin her tarafındaki çerçeveye ve çerçevenin bir tarafından yapıştırın, böylece altta kapatılır ve üstte açılır. Cilayı kimyasal bir kaputun içinde bir boya fırçası kullanarak uygulayın ve slaytların en az 24 saat boyunca tamamen kurumasını bekleyin(Şekil 2F).
- Silikon kauçuk karışımını hazırlamak için, kürleme maddesi (kütle oranı 1:10) ile sıvı silikonu plastik bir plakaya ekleyin ve tam karıştırmayı sağlamak için iyice karıştırın. Şahdatır modeli için 54 g silikon ve 6 g kürleyici maddesi ekleyin.
- Karışımı 4 °C'de 15 dakika soğutun, ardından tüm hava kabarcıkları ortadan kaldırılınceye kadar vakumlu bir kurutucuda gazdan arındırın. Kalıbı kurutucuya yerleştirin (açık tarafı yukarı bakacak şekilde), silikon karışımını yavaşça kalıba dökün ve karışım net olana kadar hava kabarcıklarını tekrar çıkarın.
- Kalıbın oda sıcaklığında bir gecede silikonla durmasına izin verin (mümkünse vakumsuz olarak kurutucuda bırakın). Karışım tam olarak kurumamışsa, birkaç saat daha 60 ° C'de kuluçkaya yatırın.
- Karışım tamamen kurudıktan sonra şeffaf slaytları çıkarın ve plastik tamamen çözünene kadar modeli kimyasal bir kaputta 48 saat boyunca mutlak aseton içine daldırin. Plastik artıkları tahta bir çubukla çıkarın. Modelin içine sıkışmış asetonları buharlaşmak için, hücre tohumlamadan önce en az 4 gün boyunca 60 ° C'de kuluçkaya yatırın.
2. Modellerde hücre kültürü ve tohumlama
- Karotid modeli için üç konektör hazırlayın: biri giriş için, ikisi çıkışlar için (bkz. Malzeme Tablosu). Modeli ve konektörleri biyolojik bir başlıkta ultraviyole ışınlama ile 20 dakika sterilize edin.
- Modelleri 4 mL 100 μg/mL fibronektin (1x fosfat tamponlu salin, (PBS)) ile 37 °C'de 2 saat veya 4 °C'de bir gecede kapla. Fibronektin çözeltisini 5 veya 10 mL plastik şırınna kullanarak giriş yoluyla modele enjekte edin. Fibronektin çıkıştan çıkarın ve modeli EC ortamı ile yıkayın.
- 2,5 ×10 6 hücre/mL insan göbek damarı endotel hücrelerini (HUVEC'ler, geçiş < 6) askıya alın ve modeli 5 veya 10 mL plastik şırıng kullanarak hücre süspansiyonunun 4 mL'si ile doldurun (Şekil 3A). Homojen tohumlama sağlamak için modeli 48 saat boyunca 1 rpm hızında bir inkübatörün (37 °C) içindeki bir rotatora yerleştirin. Modelin rotatora iyi takıldığından emin olun (Şekil 3B). Biyolojik bir kaputun içinde 24 saat sonra ortamı değiştirin ve 24 saat daha inkübatör içindeki rotatora geri dönün.
NOT: 24 saat sonra hücreler tohumlanır ve mikroskop kullanılarak görüntülenebilir. - Modeli rotatordan çıkarın ve 10 mL plastik şırınna kullanarak 1x PBS ile yıkayın. Hücreleri sabitlemek için, hücreleri kimyasal bir kaputun içinde 15 dakika boyunca modele% 4 paraformaldehit (PFA) 4 mL ile kuluçkaya yatırın ve ardından PBS ile 3x durulayın. 4 mL PBS ekleyin ve deneye kadar 4 °C'de saklayın (Şekil 3C). Standart boyama protokollerini kullanarak modelin içindeki hücreleri lekele(örneğin, 4′, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI), Şekil 3Dile nükleer boyama).
3. Perfüzyon sisteminin tasarımı
- Perfüzyon sistemi iki giriş ve iki çıkış tüpüne sahiptir. İki girişi tek bir 4 mm kimlik tüpünde ve peristaltik pompaya bağlanan iki adet 6 mm kimlik tüpünde birleştirin. Peristaltik pompadan çıkan iki adet 6 mm'lik ID tüpü tek bir 4 mm'lik tüpte birleştirin ve pompadan salınımları ortadan kaldırmak için bir salınım damperine bağlayın. Damper olarak üç delikli kapaklı 250 mL dar ağızlı bir şişe kullanın.
- Pompadan girişe bir delik bağlayın, ikincisini acil durumlarda basınç havalandırma için kullanılan bir mantarla kapatın ve üçüncü deliği (çıkış olan) şişenin altına uzatın.
- Damperi, çıkış borularını kullanarak kültürlü karotis modelinin girişine bağlayın. Modelin iki çıkışını, sistemin çıkışı olacak bir boruyla birleştirin (Tüm borular 4 mm'dir).
- Çıkış borularını iki çıkış tüpüne bölün (biri kapalı devre için, diğeri açık devredeki atık konteyneri için). Her tüpe plastik bir kelepçe takın.
NOT: Açık/kapalı kelepçelerin kombinasyonu, sistemin kapalı veya açık devre konfigürasyonunda olup olmadığını belirleyecektir. Şekil 1'degösterildiği gibi, b ve c açıkken a ve d kelepçeleri yakınsa, sistem kapalı bir devredir; ters devre konfigürasyona sistemi getirir. - Üç kap hazırlayın: biri 300 mL sıvı (kapalı devre için) ve her biri 1 L'lik diğer iki sıvıyı tutabilen: biri yıkama için, diğeri atık için (açık devre için).
4. Kapalı devre konfigürasyonu: perfüzyon deneyi ve görüntüleme
- Kapalı devre konteynere 300 mL PBS ekleyin, bu da boru ve model de dahil olmak üzere tüm sistemi doldurmak için yeterlidir. Kabın içine bir giriş tüpü ve bir çıkış tüpü (açık kelepçeler b ve c) yerleştirin.
- 1 L yıkama kabını damıtılmış suyla doldurun (deneyin sonunda yıkamak için) ve diğer 1 L atık kabını boş bırakın. Diğer giriş ve çıkış borularını (a ve d kelepçelerini kapatın) sırasıyla yıkama ve atık kaplarına yerleştirin.
- Sabit hücreli kültürlü karotid modelini 4 °C depolama alanından alın ve PBS'yi boşaltın. Karotid giriş ve çıkışlarını 3.3-3.4 adımlarında açıklandığı gibi bağlayın. Modeli uzun süre kuru bırakmayın. Model bağlandıktan sonra, sıvıyı boğmak için pompayı etkinleştirin.
- Şahdatoid modelini mikroskop altına yerleştirin. Karotid modelinin girişinden önce ve çıkışından sonra boruyu açın. Peristaltik pompayı 10 rpm'ye ayarlayın ve açın. Hızı her 4-5 dakikada bir 5 rpm'lik artışlarla artırın. Sızıntı olmadığından emin olun.
- İnsan şahdamarının fizyolojik dalga biçiminin maksimum akış hızına (~400 mL/dk) eşit olan 100 rpm'de, kapalı devre konteynerdeki 300 mL PBS'ye floresan karboksilatlı polistiren (PS) parçacıklar (2 μm, 1,6 μg/mL konsantrasyonda) ekleyin. 1,5 saat boyunca her 10 s'de bir ilgi çekici bölgeyi görüntüleyin (gerektiğinde hala tek resim veya video).
5. Açık devre konfigürasyonu: yıkama adımı
- Yıkama ve atık tüplerinin kelepçelerini 1 L kapta (kelepçeler a ve d) açın ve sistemi kapalıdan açık devre konfigürasyonundan değiştirmek için 300 mL konteynerdeki (kelepçeler b ve c) hem giriş hem de çıkış tüplerinin kelepçelerini hemen kapatın.
- Suyun büyük kısmının yıkama kabından saat 100 rpm'de atık konteynerine akmasına izin verin. Tamamen aktarılmadan önce, peristaltik pompaya basın ve karotis modelinin girişinden önce ve çıkışından sonra tüp kelepçelerini kapatın.
- Uygun filtreleri kullanarak, parçacıkların hücrelere birikmesini ve yapışmasını göstermek için modelin ilgi çekici bölgedeki görüntülerini yakalayın. Şahdayıt modelinin bağlantısını kesin. Modelin girişine dikkatlice ve yavaşça 10 mL şırınna ile 4 mL PBS ekleyin.
- Karotis modeli yerine bir "kukla model" (aynı zamanda sadece yıkama için kullanılan silikon kauçuk 3D karotid modelidir) karotis modeli yerine bağlayın ve sistemi durulayın. 1 L daha su ekleyin ve tüm su yıkama kabından atıklara aktarılana kadar sistemi tekrar yıkayın. Peristaltik pompayı kapatın.
6. Veri toplama ve analiz
- Özelleştirilmiş bir yazılım kodu kullanarak deney sırasında çekilen görüntülerle ilgi çekici bölgede parçacık biriktirmenin dijital bir filmini haline alın (Bkz. Malzeme Tablosu).
- Model boyunca parçacıkların birikmesinin haritalandırılması için, incelenen ilgi bölgesini kapsayacak şekilde birden fazla görüntü döşeyin (Şekil 4A,B).
NOT: İlgi çekici bir yerdeki yapışan parçacıkların sayısını ölçmek için özelleştirilmiş bir yazılım kodu yazılabilir (ek bilgiolarak örnek bir dosya sağlanmıştır)17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu makale, ilaç dağıtım araştırmaları için yeni bir platform sağlayabilecek gerçek boyutlu 3D insan arter modellerindeki parçacıkların birikmesini haritalamak için yeni bir protokol sunun. 3D baskı tekniği kullanılarak, insan şahdamarının bir modeli imal edildi (Şekil 2). Model silikon kauçuktan yapılmış ve insan VC'leri ile tohumlanmıştır (Şekil 3). Daha da önemlisi, bu protokol fizyolojik koşulların özellikle akışkan dinamiği açısından replikasyonunun etkinleştirilmesini sağladı. Karotid bifurkasyonuna karotid karakteristiği büyüklüğünde sürekli akış altında parçacıklar aşılamak için bir perfüzyon sistemi tasarlanmıştır. Şekil 1 peristaltik pompa, salınım damperi, kültürlü bifurkasyon modeli, boru ve sıvı kaplarından oluşan perfüzyon sistemini sunar.
Perfüzyona uğramış parçacıkların birikimini ve yapışmasını haritalamak için, arteriyel model hem deneyin sonunda hem de yıkandıktan sonra stereomikroskop altında görüntülendi (adım 5.3). Görüntüler 2x amaç kullanılarak çekildi ve modelin tüm görüntüsünü oluşturmak için birlikte döşendi. Daha sonra, yapışan parçacıkların sayısı özelleştirilmiş bir yazılım kodu kullanılarak hesaplandı. Çatallanmada devridaim deseninin oluşumunu incelemek için modele 10 μm floresan cam boncuk aşılandı. Şekil 4A, modelin içindeki koşulların fizyolojik koşulları taklit ettiğini gösteren devridaimi göstermektedir.
Modelin içindeki parçacıkların birikmesini haritalamak için, 2 μm floresan karboksilatlı PS parçacıkları aşılandı ve VC'lere yapışmaları görüntülendi (Şekil 4B,C). Bu parçacıklar model-daha fazla yapışma boyunca çeşitli bölgelerde farklı yapışmış, duvar kesme stresinin yüksek olduğu devridaim alanından gözlenmiştir. Bu sonuçlar daha önce parçacıkların yapışmasının modelin geometrisinin, parçacık yüzey özelliklerinin ve kesme stresinin bir işlevi olduğunu göstermek için tartışılmıştır17. Bu biriktirme haritaları nispeten basittir ve hastaya özgü modellerde ilaç taşıyıcılarının benzeşimini ve fizyolojik koşullar altında hedeflemelerini taramak için hızlı bir şekilde elde edilebilir.
Şekil 1: Perfüzyon sistemi. Perfüzyon sistemi, sıvıları sürekli akış altında perfüzyonlamak için tasarlanmıştır. (1) peristaltik pompa, (2) salınım damperi, (3) kültürlü 3D arteriyel model ve üç cam kaptan oluşur: ikisi 1 L kapasiteli (4 ve 6) ve üçüncüsü 300 mL sıvı (5) tutabilir. Sistem iki konfigürasyonda çalışabilir: (i) a+d kelepçelerinin açık ve b+c'nin kapalı olduğu açık devre veya (ii) a+d kelepçelerinin kapalı ve b+c'nin açık olduğu kapalı bir devre. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: 3D karotis arter bifurkasyon modelinin imalat işlemi. (A-C) İnsan karotis çatallanma, arter çevresindeki kalıp çerçevesi ve geçici baskı destekleri tasarlanmıştır. (D, E) Geometriler 3D yazıcı kullanılarak basıldı. (F) Geçici baskı destekleri kesildi ve model zımparalandı ve lake ile püskürtüldü. Daha sonra çerçeveye her taraftan şeffaf dikdörtgen slaytlar yapıştırıldı. Tutkal kuruyken silikon kauçuk döküldü. Kısaltma: 3D = üç boyutlu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Karotis arterin 3D modellerinin içindeki VC'lerin tohumlanması. (A) Silikon kauçuktan yapılmış insan karotis çatallanmasının gerçek boyutlu 3D modeli. Model insan VC'leri ile kültürlendi ve hücre ortamı ile dolduruldu. (B) Kültürlü model 48 saat boyunca 37 °C'debir rotator üzerine yerleştirildi. Ölçek çubukları = 10 μm. Kısaltmalar: ECs = endotel hücreleri; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole; 3D = üç boyutlu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Parçacıkların yapışmasını perfüzyon ve haritalama. (A) Model aracılığıyla 400 mL / dk sabit bir akışta 10 μm floresan cam parçacıklarının perfüzyonu üzerine oluşturulan düzen ve devridaim (kesikli dikdörtgen) çizgi çizgili görüntü. (B) 3D kültürlü modelin içindeki 2 μm floresan karboksilatlı PS parçacıklarının (kırmızı) biriktirme haritası. Ölçek çubuğu = 2 mm. (C) Parçacıkların (kırmızı) modelin içindeki kültürlü VC'lere (mavi-DAPI) 10x büyütme ile yapışması. Ölçek çubuğu = 10 μm. Kısaltmalar: PS = polistiren; 3D = üç boyutlu; ECs = endotel hücreleri; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Parçacıkların vasküler hedeflemesini incelemek için mevcut yaklaşımlar, insan vücudunda bulunan fizyolojik koşulları çoğaltmada yetersiz kalmaktadır. Burada sunulan, özelleştirilmiş bir perfüzyon sistemi kullanılarak uygulanan fizyolojik akış altında arteri kaplayan VC'lere partikül hedeflemesini incelemek için insan arterlerinin 3D yeniden yapılandırılmış modellerini imal etmek için bir protokol sunulmaktadır. 3D baskı için malzemeyi seçerken, silikon modeline pigment transferini önlemek için mümkün olduğunca şeffaf olması gereken şeffaf bir plastik kullanmak en iyisidir. Ek olarak, asetonda çözünmeyen, bunun yerine yumuşak ve kırılgan hale gelen ve daha sonra modelden kolayca çıkarılabilen bir malzeme seçmek önemlidir.
Sunulan 3D modeller, kürleme maddesi ile karıştırılmış şeffaf bir silikon kauçuktan yapılmıştır. Karışımın her zaman oda sıcaklığında veya altında olduğundan emin olmak önemlidir, aksi takdirde silikon ve kürleme maddesi arasındaki çapraz bağlantı, gaz giderme ve kalıplara dökümden önce başlayacaktır. Polidimetilsiloksan bu tür modelleri (çapraz bağlantısıyla 1:10 oranı) imal etmek için de kullanılabilse de silikon kauçuk daha dayanıklıdır. Plastiği eritmek için modeli aseton içine batırdıktan sonra, aseton kalıntılarının tam buharlaşmasını sağlamak için en az 4 gün boyunca 60 ° C'de kuluçkaya yatmak çok önemlidir. Herhangi bir aseton modelin içinde sıkışmış kalırsa, hücreler düzgün büyümez. Ortamı 24 saat sonra değiştirmek ve 48 saat sonra hücrelerin sabitlenmesi, 10 mL şırıng kullanarak sıvının manuel olarak enjeksiyonunu içeren iki adımdır. Bu nedenle yavaşça perfüzyoz etmek önemlidir, aksi takdirde hücreler yıkanabilir.
Perfüzyon sistemi iki giriş ve iki çıkış tüpüne sahiptir. Her tüp, akış kontrolü için plastik bir boru kelepçeye sahiptir. Boru sisteminin çoğu, pompaya kenetlenmiş tüpler hariç, 6 mm kimlik tüpleri olan 4 mm iç dimeter (ID) tüplerden oluşur. Pompaya kenetlenen tüplerin kimliği, sistemde elde edilebilecek maksimum debiyi belirleyecektir. Bu perfüzyon sistemi ayrıca, damperin çıkışını peristaltik pompa tarafından üretilen sabit akış hızı üzerinde istenen bir dalga biçiminin salınımlı kısmını süper pozlayan bir osilatör tertibata bağlayarak sabit ortalama akış17'ye salınımlar yükleyerek pulsatil bir dalga formu oluşturabilir. Bu yapılandırma, osilatör kapatıldığında salınımlı akış altında veya sabit akış koşullarında çalışma sağlar.
Bu yazıda perfüzyon sistemi, 3D insan şahdamar bifurkasyonu ile yapılan deneylere dayanarak özelleştirilmiştir. Bu nedenle, diğer arteriyel modeller veya başka borular kullanılırsa, sıvı miktarları ve akış hızı ayarlamalar gerektirebilir. Bu gibi durumlarda, sistem ve akış hızının kalibre edilmesi gerekirken, model duvarlarından hücre kopmasını sağlamaz. Hücrelerin akışla yıkanmamasını garanti etmek için peristaltik pompadaki akış hızını kademeli olarak artırmak çok önemlidir. Ayrıca, boru, model ve kap dahil olmak üzere tüm sistemin sıvılarla doldurulmasını sağlamak çok önemlidir(örneğin,bu durumda, toplam 300 mL sıvı hacmi ile doldurulmuştu). Ek olarak, her deneyden önce ve sonra, sistem açık devre konfigürasyonunda damıtılmış su ile yıkanmalıdır.
Kan ayrıca perfüzyon sistemi kullanılarak modellere perfüzyon17. Bu durumda, özellikle insan kanı kullanılıyorsa, herhangi bir sızıntıyı önlemek için ekstra dikkatli olunmalıdır. Ayrıca, yıkama adımı çok önemlidir, çünkü kandan tam olarak yıkanmasını sağlamak için deneyin sonunda çamaşır suyu perfüzyona uğramalıdır. Çamaşır suyundan sonra protokolde belirtildiği gibi su perfüzyona maruz olmalıdır. Bu makalede, düzgün bir bileşime ve dar bir boyut dağılımına sahip karboksilatlı PS parçacıklarının kullanıldığını belirtmek önemlidir. Ayrıca, bu parçacıklar öncelikle elektrostatik etkileşimlerle hücrelere yapışır. Bununla birlikte, diğer ilaç nanokarrierleri kullanılabilir ve ligand etiketli parçacıklarla birlikte spesifik hedefleme incelenmelidir, örneğinhücreler arası yapışma molekülü 1 ve anti-trombosit endotel hücre yapışma molekülü 1, ilgi çekici yerde ECS'lere parçacık birikimini artıracaktır.
Ek olarak, bu protokolde, VC'ler modelleri perfüzyon sistemine bağlamadan ve parçacıkların enjeksiyonundan önce sabitlenmiştir. Parçacıkların sabit hücrelere yapışması, bağlama işleminin ilk aşamasını temsil eder ve bu nedenle, yapışma işleminin sonraki aşamalarında parçacıkların içselleştirilmesinin gerçekleşebileceği canlı hücrelerle deneyler yapılması gerekir. Bu protokol, fizyolojik koşullar altında ilaç taşıyıcılarının çalışması için 3D arteriyel modeller imal etmek için kullanılabilir. Özetlenen yaklaşım, hastaya özgü koşullar altında ajanların doğumunun incelenmesine yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.
Acknowledgments
Bu çalışma İsrail Bilim Vakfı tarafından desteklendi (ISF hibesi # 902/18). Maria Khoury'nin bursu Baroness Ariane de Rothschild Kadın Doktora Programı tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | FormLabs | PKG-F2-REFURB | |
| Acetone, absolute (AR grade) | |||
| Connectors | Nordson Medical | FTLL013-1 | Female Luer |
| FTLL230-1 | Female Luer | ||
| FTLL360-1 | Female Luer | ||
| LP4-1 | Male Luer Integral Lock | ||
| Damper | Thermo-Fisher Scientific | DS2127-0250 | Nalgene Polycarbonate, Validation Bottle |
| Damper Cover | Thermo-Fisher Scientific | 2162-0531 | Nalgene Filling/Venting Closures |
| Elastosil Elastosil RT 601 A | Wacker | 60003805 | |
| Elastosil RT 601 B | Wacker | 60003817 | The crosslinker |
| Endothelial Cell Media | ScienCell | 1001 | |
| Fibrontectin | Sigma Aldrich | F0895-5mg | |
| HUVEC | Lonza | CC-2519 | |
| Isopropyl alcohol, AR grade 99.5% | Remove plastic dust from the sanded model | ||
| Lacquer | Rust-Oleum | 2X-Ultra cover Gloss Clear | |
| Matlab | Mathworks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Microscope | Nikon | SMZ25 | |
| Microscope Camera | Nikon | DS-Qi2 | |
| Peristaltic pump | Watson Marlow | 530U IP31 | With 2 pumpheads: 313D |
| Plastic tube clamp | Quickun | 1-2240-stopvalve-2pcs | |
| Polystyrene Particles | Thermo-Fisher Scientific | F8827 | Diameter = 2 µm |
| Printer resin | FormLabs | RS-F2-GPCL-04 | |
| Rotator | ELMI Ltd. | Intelli-Mixer RM-2 | |
| Solidworks | SolidWorks Corp., Dassault Systèmes | https://www.solidworks.com/ | |
| Tubing | Watson Marlow | 933.0064.016 | Tubing for the pump: 6.4 mm ID |
| All the other tubing: Silicon tubing: 4 mm ID | |||
References
- Chiu, J. J., et al. Analysis of the effect of disturbed flow on monocytic adhesion to endothelial cells. Journal of Biomechanics. 36 (12), 1883-1895 (2003).
- Martorell, J., et al. Extent of flow recirculation governs expression of atherosclerotic and thrombotic biomarkers in arterial bifurcations. Cardiovascular Research. 103 (1), 37-46 (2014).
- Karino, T., Goldsmith, H. L. Flow behaviour of blood cells and rigid spheres in an annular vortex. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 279 (967), 413-445 (1977).
- Goldsmith, H. L., Karino, T. Platelets in a region of disturbed flow. Transactions - American Society for Artificial Internal Organs. 23, 632-638 (1977).
- Farcas, M. A., Rouleau, L., Fraser, R., Leask, R. L. The development of 3-D, in vitro, endothelial culture models for the study of coronary artery disease. Biomedical Engineering Online. 8, 30 (2009).
- Peng, B., et al. Modeling nanoparticle targeting to a vascular surface in shear flow through diffusive particle dynamics. Nanoscale Research Letters. 10 (1), 942 (2015).
- Shah, S., Liu, Y., Hu, W., Gao, J. Modeling particle shape-dependent dynamics in nanomedicine. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 11 (2), 919-928 (2011).
- Hossain, S. S., Hughes, T. J., Decuzzi, P. Vascular deposition patterns for nanoparticles in an inflamed patient-specific arterial tree. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (3), 585-597 (2014).
- Charoenphol, P., Huang, R. B., Eniola-Adefeso, O. Potential role of size and hemodynamics in the efficacy of vascular-targeted spherical drug carriers. Biomaterials. 31 (6), 1392-1402 (2010).
- Ta, H. T., Truong, N. P., Whittaker, A. K., Davis, T. P., Peter, K. The effects of particle size, shape, density and flow characteristics on particle margination to vascular walls in cardiovascular diseases. Expert Opinion on Drug Delivery. 15 (1), 33-45 (2018).
- Cooley, M., et al. Influence of particle size and shape on their margination and wall-adhesion: implications in drug delivery vehicle design across nano-to-micro scale. Nanoscale. 10 (32), 15350-15364 (2018).
- Jiang, X. Y., et al. Quantum dot interactions and flow effects in angiogenic zebrafish (Danio rerio) vessels and human endothelial cells. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (3), 999-1010 (2017).
- Zarins, C. K., et al. Carotid bifurcation atherosclerosis. Quantitative correlation of plaque localization with flow velocity profiles and wall shear stress. Circulation Research. 53 (4), 502-514 (1983).
- Chien, S. Effects of disturbed flow on endothelial cells. Annals of Biomedical Engineering. 36 (4), 554-562 (2008).
- Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. JAMA. 282 (21), 2035-2042 (1999).
- Glagov, S., Zarins, C., Giddens, D. P., Ku, D. N. Hemodynamics and atherosclerosis. Insights and perspectives gained from studies of human arteries. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 112 (10), 1018-1031 (1988).
- Khoury, M., Epshtein, M., Zidan, H., Zukerman, H., Korin, N. Mapping deposition of particles in reconstructed models of human arteries. Journal of Controlled Release. 318, 78-85 (2020).
