Summary
Dette papir beskriver en detaljeret protokol til brug af DNA-baserede spændingsprober til at afbilde receptorkræfterne anvendt af immunceller. Denne tilgang kan kortlægge receptorkræfter >4,7 pN i realtid og kan integrere kræfter over tid.
Abstract
Mekaniske kræfter, der overføres ved krydset mellem to naboceller og ved krydset mellem celler og den ekstracellulære matrix, er kritiske for regulering af mange processer lige fra udvikling til immunologi. Derfor er det afgørende at udvikle værktøjerne til at studere disse kræfter på molekylær skala. Vores gruppe udviklede en række molekylære spændingssensorer til at kvantificere og visualisere de kræfter, der genereres af celler og overføres til specifikke ligander. Den mest følsomme klasse af molekylære spændingssensorer består af nukleinsyrestamme-loop hårnåle. Disse sensorer bruger fluorofor-quencherpar til at rapportere om den mekaniske forlængelse og udfoldning af DNA-hårnåle under kraft. En udfordring med DNA-hårnålespændingssensorer er, at de er reversible med hurtig hårnål, der foldes sammen igen efter afslutning af spændingen, og derfor er forbigående kræfter vanskelige at registrere. I denne artikel beskriver vi protokollerne til forberedelse af DNA-spændingssensorer, der kan "låses" og forhindres i at folde sammen igen for at muliggøre "lagring" af mekanisk information. Dette muliggør registrering af stærkt forbigående piconewtonkræfter, som efterfølgende kan "slettes" ved tilsætning af komplementære nukleinsyrer, der fjerner låsen. Denne evne til at skifte mellem spændingskortlægning i realtid og mekanisk informationslagring afslører svage, kortvarige og mindre rigelige kræfter, der almindeligvis anvendes af T-celler som en del af deres immunfunktioner.
Introduction
Immunceller forsvarer sig mod patogener og kræftceller ved kontinuerligt at kravle og scanne overfladerne af målceller for antigener og studse deres overflade 1,2. Antigengenkendelse initieres ved binding mellem T-cellereceptoren (TCR) og peptid-major histokompatibilitetskomplekset MHC (pMHC) kompleks udtrykt på overfladen af målceller. Fordi TCR-pMHC-genkendelse sker ved krydset mellem to mobile celler, har det længe været mistænkt for at opleve mekaniske kræfter. Desuden førte dette til mekanosensormodellen for TCR-aktivering, hvilket tyder på, at TCR-kræfter bidrager til dens funktion 3,4. For at forstå, hvornår, hvor og hvordan mekaniske kræfter bidrager til T-cellefunktionen, er det bydende nødvendigt at udvikle værktøjer til at visualisere de molekylære kræfter, der transmitteres af T-celler. Traditionelt bruges metoder som traction force mikroskopi (TFM) og micropillar arrays til at undersøge cellulære kræfter 5,6. Imidlertid er kraftfølsomheden af TFM og mikrosøjle arrays på nanonewton (nN) skalaen og er derfor ofte utilstrækkelig til at studere de molekylære piconewton (pN) kræfter, der transmitteres af cellereceptorer7. For at forbedre kraften og den rumlige opløsning til detektion var vores laboratorium banebrydende for udviklingen af molekylære spændingsprober, som oprindeligt blev syntetiseret ved hjælp af polyethylenglycol (PEG) polymerer7. Molekylspændingssonder består af en udvidelig molekylær "fjeder" (PEG, protein, DNA) flankeret af en fluorofor og slukker og er forankret på en overflade. Kræfter, der påføres sondens endestation, fører til dens forlængelse, adskiller fluoroforen og slukkeren og genererer således et stærkt fluorescenssignal (figur 1A)8,9,10.
I løbet af det sidste årti har vi udviklet et bibliotek af forskellige klasser af molekylære spændingsprober med fjederelementer fremstillet af nukleinsyrer11, proteiner10 og polymerer8. Blandt disse giver de DNA-baserede spændingssonder det højeste signal / støjforhold og den største kraftfølsomhed, som let indstilles fra nogle få pN op til ~ 20 pN11. Vi har brugt disse DNA-spændingssonder i realtid til at studere de molekylære kræfter, der genereres af mange forskellige celletyper, herunder fibroblaster, kræftceller, blodplader og immunceller11,12,13. Dette manuskript vil beskrive protokoller til syntetisering og samling af DNA-spændingssonder på en overflade for at kortlægge molekylære receptorkræfter med pN-kraftopløsning ved hjælp af et konventionelt fluorescensmikroskop. Mens den nuværende procedure inkluderer kemiske modifikationer af nukleinsyren for at introducere den fluorescerende reporter (figur 1B), er det vigtigt at bemærke, at mange af modifikations- og oprensningstrinnene kan outsources til brugerdefinerede DNA-syntesevirksomheder. Derfor er DNA-spændingssondeteknologi let og tilgængelig for de bredere cellebiologi- og mekanobiologiske samfund.
Kort sagt, for at samle DNA-spændingssensorer, hybridiseres en DNA-hårnål til en fluorescerende ligandstreng på den ene arm og en slukningsankerstreng på den anden arm og immobiliseres derefter på et glassubstrat (figur 1C, realtidsspænding). I mangel af mekanisk kraft lukkes hårnålen, og fluorescensen slukkes således. Men når den påførte mekaniske kraft er større end F1/2 (kraften ved ligevægt, der fører til en 50% sandsynlighed for udfoldelse), smelter hårnålen mekanisk, og der genereres et fluorescerende signal.
Med udgangspunkt i DNA-spændingssensoren i realtid beskriver vi også protokoller til kortlægning af akkumulerede kræfter, hvilket er særligt nyttigt til at studere interaktioner mellem receptorer på immunceller og deres naturlige ligand. Dette skyldes, at immunreceptorer ofte viser kortvarige bindinger 3,14. Akkumulerede kræfter afbildes ved hjælp af en "låsende" streng, der fortrinsvis binder til åbne DNA-hårnåle og muliggør lagring af fluorescenssignaler forbundet med mekaniske trækhændelser (figur 1C, låst spænding). Låsestrengen er designet til at binde et kryptisk bindingssted, der eksponeres ved mekanisk induceret smeltning af hårnålen og låse hårnålen i åben tilstand ved at blokere hårnålens foldning igen, således at spændingssignalet lagres og genererer et akkumuleret spændingskort. Desuden er låsestrengen designet med et otte-nukleotid-tåhold, som muliggør en tåholdsmedieret strengforskydningsreaktion med sit fulde komplement, "oplåsningsstrengen". Med tilføjelsen af oplåsningsstrengen fjernes den bundne låsestreng fra hårnålekonstruktionen, hvilket sletter det lagrede spændingssignal og nulstiller hårnålen tilbage til realtidstilstanden.
Figur 1: Skema for de nyeste molekylære spændingssonder. (A) Generelt design af molekylær spændingssonde i realtid, (B) strenge til den DNA-baserede spændingssondekonstruktion og (C) konstruerede DNA-baserede spændingssonder og deres skift mellem realtidstilstand og låst tilstand. Klik her for at se en større version af denne figur.
Hovedprotokollen består af fire hovedafsnit - oligonukleotidpræparation, overfladebehandling, billeddannelse og dataanalyse. Denne protokol er med succes blevet demonstreret af vores laboratorium og andre i naive og aktiverede OT-1 CD8 + T-celler, OT-II CD4 + celler samt hybridomer og kan anvendes til at forhøre forskellige immuncellereceptorer, herunder T-cellereceptor, programmeret celledødsreceptor (PD1) og lymfocytfunktionsassocieret antigen 1 (LFA-1) kræfter. OT-1 CD8+ naive T-celler bruges som eksempel på cellelinje i dette papir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OT-1 transgene mus er anbragt på Division of Animal Resources Facility ved Emory University. Alle forsøgene blev godkendt og udført under Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) protokol.
1. Fremstilling af oligonukleotid
- Opløs ligandstreng-DNA'et i vand (18,2 MΩ resistivitet, anvendt gennem hele protokollen). Vortex og drej opløsningen ned med en bordpladecentrifuge. Indstil vandmængden, så den endelige koncentration er 1 mM. Koncentrationen valideres ved hjælp af et nanodrop-spektrofotometer til måling af absorbansen ved 260 nm og bestemmelse af den endelige koncentration baseret på oligonukleotidets ekstinktionskoefficient.
BEMÆRK: Ligandstrengen har en modifikation ved hver endestation, 5' amin og 3' biotin, for at konjugere med fluoroforen og præsentere den biotinylerede ligand. Amingruppen i ligandstrengen skal konjugeres med en fluorofor. Cy3B farvestof bruges til denne konjugering på grund af dets høje lysstyrke og fotostabilitet, men det tilbydes generelt ikke kommercielt og kræver intern konjugering. I overensstemmelse hermed beskriver det følgende afsnit konjugeringen mellem aminer og NHS-esterfarvestoffer. For slutbrugere, der ikke har adgang til faciliteter eller ressourcer til nukleinsyremodifikation, kan modificerede nukleinsyrer i stedet købes fra brugerdefinerede DNA-synteseleverandører, der tilbyder lyse og fototable farvestoffer, såsom Alexa og Atto-familien af farvestoffer. - Forbered 10x PBS og 1 M NaHCO3 løsninger. 10 μL af 1 mM aminligandstrengopløsningen (10 nmol) blandes med 10 μL 10x PBS, 10 μL 1 M NaHCO3 og 60 μL H2O. 50 μg Cy3B NHS-ester opløses i 10 μL DMSO umiddelbart før brug og tilsættes til blandingen til et samlet reaktionsvolumen på 100 μL. Cy3B NHS-ester tilsættes sidst. Lad reagere ved stuetemperatur i 1 time eller 4 °C natten over.
- Forbered Atto647N-låsestrengen ved at konjugere aminlåsestrengen med Atto647N NHS-ester. Forbered 10x PBS og 1 M NaHCO3 opløsning. 10 μL af 1 mM aminlåsestrengsopløsningen (10 nmol) blandes med 10 μL 10x PBS, 10 μL 1 M NaHCO3 og 60 μL H2O. 50 μg Atto647N NHS-ester opløses i 10 μL DMSO umiddelbart før brug og tilsættes til blandingen til et totalt reaktionsvolumen på 100 μL. Atto647N NHS-ester tilsættes sidst. Lad reagere ved stuetemperatur i 1 time eller 4 °C natten over.
- Efter reaktionerne fjernes biprodukter, overskydende farvestof og salte ved P2-afsaltningsgelfiltrering. Reaktionsblandingen fortyndes medH2Otil et samlet volumen på 300 μL, hvilket er passende for det efterfølgende HPLC-rensningstrin. Tilsæt 650 μL hydreret P2 gel til en centrifugalanordning og drej ned ved 18.000 x g i 1 min. Fjern væsken i bunden af enheden, tilsæt reaktionsblandingen til kolonnen indeholdende P2-gel, drej ned ved 18.000 x g i 1 min, og saml reaktionsblandingen i bunden af enheden.
BEMÆRK: P2 gel skal hydreres mindst 4 timer før brug med H2O. - Den afsaltede reaktionsblanding renses med HPLC ved hjælp af en C18-kolonne, der er beregnet til oligonukleotidrensning, med opløsningsmiddel A: 0,1 M TEAA iH2Oog B: ACN som den mobile fase for en lineær gradienteluering 10-100% B over 50 minutter ved en strømningshastighed på 0,5 ml/min. Den afsaltede reaktionsblanding injiceres i omvendt fase HPLC med en 500 μL injektionssløjfe til rensning. Det produkt, der har absorbanstoppunkt for DNA (260 nm) og absorbanstop for fluoroforen (560 nm for Cy3B og 647 nm for Atto647N), opsamles, og de tørres i en vakuumcentrifugalkoncentrator natten over (se figur 2A).
- Det tørrede oligofarvestof rekonstitueres i 100 μliter vand. Bestem koncentrationen af Cy3B-ligandstrengen og Atto647N-låsestrengen med nanodrop-spektrofotometeret. Sørg for, at farvestofmærkningsforholdet er tæt på 1: 1. Korrekt for 260 nm absorbans af farvestoffet, hvis det er nødvendigt ved bestemmelse af oligonukleotidkoncentrationen.
- Det rensede produkt valideres med MALDI-TOF-MS ved hjælp af 3-HPA som substrat i 50 % ACN/H2O med 0,1 % TFA og 5 mg/ml ammoniumcitrat ved anvendelse af 0,5 μL af produktet ved 1-5 μM til MALDI-TOF-MS-prøveforberedelse. Et eksempel på massespektrum findes i figur 2B.
- Hårnålestrengen og slukningsankerstrengen opløses i vand, og koncentrationen af stamopløsningerne er mellem 50 og 100 μM.
BEMÆRK: Hårnålestrengen er uændret og kan tilpasses direkte fra en leverandør. Ankerstrengen har en thiolforankringsgruppe og en quencher BHQ2 og kan tilpasses direkte fra en leverandør. - Aliquot alle oligonukleotiderne. Til kortvarig brug og opbevaring opbevares disse oligonukleotider ved 4 °C. Ved langtidsopbevaring fryses og opbevares ved -20 °C. På dette tidspunkt er alle oligonukleotiderne klar til DNA-spændingssondesamlingen.
BEMÆRK: Gentagne fryse-optøningscyklusser er ikke problematiske for oligonukleotider.
2. Overfladebehandling
BEMÆRK: Fremstillingen af DNA-hårnålespændingssondesubstrater tager to dage. DNA-hårnålespændingssonden vil blive funktionaliseret på glasdæksler.
- Dag 1
- De 25 mm dæksler anbringes på et hylster af polytetrafluorethylen i et 50 ml bægerglas. Hvert stativ kan rumme op til 8 coverslips. Skyl dækslerne ved at nedsænke dem i vand tre gange.
- Der tilsættes 40 ml ethanolopløsning i forholdet 1:1 (v:v) blandet med vand til bægerglasset, der indeholder risten og dækslerne, og bægerglasset forsegles ved hjælp af en paraffinfilm.
- Sonikere bægerglasset i 15 min i en ultralyd renere (driftsfrekvens 35 KHz) for at rengøre dækslerne. Efter sonikering kasseres væsken og skylles bægerglasset med stativet og dæksler i det med vand mindst 6 gange for at fjerne resterende organisk opløsningsmiddel.
- Forbered frisk Piranha-opløsning ved at blande svovlsyre og hydrogenperoxid i forholdet 3: 1. For at fremstille 40 ml Piranha-opløsning tilsættes først 30 ml svovlsyre til et rent 50 ml bægerglas og tilsættes derefter langsomt 10 mlH2O2. Piranha-opløsningen opvarmes hurtigt og bobler ved tilsætning afH2O2. Bland forsigtigt piranhaen ved hjælp af enden af en glaspipette.
- Derefter overføres stativet, der holder dæksedlerne, til bægerglasset, der indeholder forsigtigt blandet Piranha-opløsning til ætsning (figur 3A). Lad Piranha-opløsningen hydroxylat, og rengør dækslerne i 30 minutter ved stuetemperatur. Efter Piranha-ætsning overføres stativet ved hjælp af stål- eller polytetrafluorethylenpincet til et rent 50 ml bægerglas med vand og skylles igen med vand mindst 6 gange.
FORSIGTIG: Store mængder organiske stoffer kan reagere kraftigt med Piranha-opløsning og kan forårsage eksplosion. Vær forsigtig og arbejd altid med Piranha-opløsning i en stinkhætte. Sørg for at bære en labcoat, handsker og sikkerhedsbriller. Opbevar aldrig frisk Piranha-opløsning i en forseglet beholder.
BEMÆRK: Forholdet mellem hydrogenperoxid og svovlsyre skal holdes under 1: 2 (v: v) og bør aldrig overstige 1: 1. Når du nedsænker stativet med dæksler i Piranha-opløsningen, skal du placere dem langsomt og forsigtigt i opløsningen. Kassér ikke opløsningen umiddelbart efter ætsning, da den stadig er aktiv og varm. Lad det stå i bægerglasset natten over, før du hælder det i beholderen til syreaffald. - Nedsænk stativet, der holder dæksedlerne, i et 50 ml bægerglas med 40 ml ethanol for at fjerne vand. Kassér ethanolen og gentag 3 gange for at sikre, at vandet er fjernet.
- Derefter nedsænkes stativet i 3% aminopropyltriethoxysilan (APTES) (v / v) i 40 ml ethanol for at reagere med -OH på dækslerne i 1 time ved stuetemperatur (figur 3B).
BEMÆRK: Ethanol kan erstattes af acetone. - Skyl overfladerne 6 gange ved at nedsænke dem i 40 ml ethanol, og tør dem derefter i ovnen ved 80 °C i 20 minutter. Efter afkøling opbevares de tørrede aminmodificerede dæksler ved -20 °C til fremtidig brug (op til 6 måneder).
- Dæk den nederste inderside af 10 cm diameter plast petriskåle med paraffinfilm. Paraffinfilmen forhindrer dækslerne i at glide ind i petriskålen og hjælper med at holde løsningen til de næste trin i funktionaliseringen forbliver på dækslerne. Læg de afkølede aminmodificerede dæksler i petriskålene. Den side, der skal funktionaliseres, skal vende opad.
- For at ændre amingrupperne på dæksedlerne tilsættes 300 μL 0,5% w / v lipoinsyre PEG NHS (LA-PEG-SC) og 2,5% w / v mPEG NHS (mPEG-SC) i 0,1 M NaHCO3 på hver dæksel og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur (figur 3C). For hver 25 mm dæksel vejes 1,5 mg LA-PEG-SC og 7,5 mg mPEG-SC. NHS-reagenserne opløses umiddelbart før tilsætning til overfladerne, da de har en kort halveringstid (~ 10 min) i vandig opløsning ved stuetemperatur. Efter reaktionen skylles overfladerne 3 gange med vand.
BEMÆRK: NHS-reaktionen kan udføres ved 4 °C natten over. NHS-reagenser har længere halveringstid før hydrolyse ved 4 °C, hvilket er omkring 4-6 timer. Dette vil resultere i en tre-dages overfladeforberedelsesprocedure. - Der tilsættes 100 μL 0,1 M NaHCO3 indeholdende 1 mg/ml sulfo-NHS-acetat til et sæt "sandwich"-dæksedler (to dæksedler, der vender mod hinanden med reaktionsbuffer imellem). Lad passivering forekomme i mindst 30 minutter. For at spare reagens kan dette trin udføres med 50 μL 1 mg / ml sulfo-NHS-acetat. Skyl med vand tre gange efter passivering.
- Tilsæt 0,5 ml guldnanopartikler (AuNP, 8,8 nm, garvesyre, 0,05 mg / ml) til hvert dæksel og inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur (figur 3D). For at gemme reagenset kan dette trin udføres ved også at sandwiche to dæksedler. Sørg for, at der ikke er salte til stede i systemet fra tidligere trin for at undgå aggregering af guldnanopartikler. Lad ikke dæksedlerne tørre efter dette trin.
- I mellemtiden præhybridiserer 4,7 pN-hårnål, Cy3B-ligandstreng og BHQ2-ankerstreng, der danner DNA-spændingssonderne, konstrueres i et forhold på 1,1: 1: 1 i 1 M NaCl ved 300 nM i et PCR-rør. Udglød trådene ved at opvarme opløsningen op til 95 °C i 5 minutter, og afkøl derefter gradvist ved at sænke temperaturen til 20 °C over 30 minutter i en termisk cykler.
- Skyl dækslerne med vand tre gange efter 30 minutters inkubation med guldnanopartikler. Tilføj yderligere BHQ2-ankerstreng (fra 100 μM-lager) til den udglødede DNA-opløsning for at gøre forholdet mellem BHQ2-ankerstreng og Cy3B-ligandstreng 10: 1. På dette tidspunkt skal DNA-opløsningen indeholde 300 nM spændingssondekonstruktion og 2,7 μM BHQ2-streng. Der tilsættes 100 μL pr. to dæksedler for at lave "sandwichen" (figur 3E).
- Placer forsigtigt en våd laboratorievævskugle i petriskålen (væk fra dæksedler) og forsegl skålen med paraffinfilm for at forhindre, at opløsningen tørrer op. Fadet dækkes med folie og inkuberes ved 4 °C natten over.
- Dag 2
- Vask de overskydende sonder fra dæksedlerne af med 1x PBS. Kontroller for DNA-spændingssondens overfladekvalitet under et epifluorescerende mikroskop.
- Der fremstilles 40 μg/ml streptavidin i 1x PBS og inkuberes på dæksedler i 30 minutter ved stuetemperatur (figur 3F). Normalt er 100 μL tilstrækkeligt til en 25 mm dæksel. Skyl med PBS 3 gange efter inkubation for at vaske den overskydende mængde streptavidin væk.
- Forbered 40 μg/ml biotinyleret antistof/ligand i 1x PBS. Der tilsættes 50-100 μL pr. sandwich og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur (figur 3G). Skyl med PBS tre gange efter inkubation for at vaske den overskydende mængde biotinyleret antistof/ligand væk.
- Saml omhyggeligt de rene billedbehandlingskamre med overflader. Overflader kan let revnes, når kamrene strammes. Tilsæt 0,5-1 ml af Hanks afbalancerede saltopløsning (HBSS) til billeddannelseskamrene og hold dem klar til billeddannelse med celler (figur 3H).
3. Billeddannelse af cellereceptorkræfter
- Forbered immunceller af interesse i HBSS ved 1-2 x 106 celler / ml.
BEMÆRK: OT-1 CD8+ naive celler bruges som et eksempel i dette papir. Rens OT-1 CD8+ naive T-celler a fra milten fra ofrede mus ved hjælp af MACS-musens CD8+ T-celleisolationssæt med en MACS-separator efter producentens anvisninger. Isoler og berig CD8 + T-cellerne ved at fjerne eventuelle ikke-CD8 + T-celler, som magnetisk nedbrydende antistofcocktail er bundet til. Resuspender rensede OT-1 CD8+ naive T-celler i HBSS ved 2 x 106 celler/ml og opbevares på is før brug. - Kontroller kvaliteten af DNA-hårnålespændingssondens overflade under et fluorescensmikroskop (100x mål) for kvalitetskontrol, før du tilføjer ligander eller pletteringsceller. Billede og kvantificer den gennemsnitlige baggrundsintensitet i Cy3B-kanalen af en DNA-hårnålespændingssondeoverflade fra mindst 5 forskellige positioner og 3 replikater. Sørg for, at betingelserne for billedoptagelse er konsistente, så denne værdi kan bruges som en pålidelig markør for overfladekvalitet og sondetæthed (figur 4C).
BEMÆRK: Kvantificer antallet af DNA-strenge pr. guldnanopartikel og antallet af guldnanopartikler pr. μm2 de første par gange overfladeforberedelse i henhold til litteratur12, som kan bruges som en anden pålidelig markør for overfladekvalitet. - Plade ~ 4 x 10 4 - 10 x 104 celler på hver DNA-spændingssonde funktionaliseret dæksel og lad dem fastgøre og sprede sig i ~ 15 minutter ved stuetemperatur.
- Når celler belægges på DNA-hårnålespændingssonderne og begynder at sprede sig, skal du afbilde fluorescenssignalerne, der genereres i Cy3B-kanalen med 100x-målet (figur 3I).
- Når celler begynder at producere spændingssignal i realtid på DNA-hårnålespændingssondens overflade i Cy3B-kanalen, skal du erhverve billeder i både Cy3B- og Atto647N-kanaler (TIRF-mikroskopi giver bedre signal-støj-forhold end epifluorescens). Derefter tilsættes Atto647N-streng til billeddannelseskamrene ved en slutkoncentration på 200 nM til mekanisk selektiv hybridisering.
- Efter 10 minutters inkubation fjernes bufferen med den fluorescerende Atto647N-låsestreng hurtigt og forsigtigt og udskiftes med friske Hanks afbalancerede salte. Billede i både Cy3B- og Atto647N-kanaler igen, og bestem Pearsons korrelationskoefficient med Fiji-software15.
- På tidspunktet af interesse for undersøgelsen indføres ikke-fluorescerende låsestreng til cellerne i billedkammeret for at gemme spændingssignalet. Forbered låsestrengsmateriale (100 μM) og tilsæt cellerne i en slutkoncentration på 1 μM. Afpipette forsigtigt for at blande. Varigheden af låsning kan variere, men 10 min er den anbefalede tid.
- Anskaf time-lapse-film eller slutpunktsbilleder i epifluorescens til både kvalitativ spændingskortlægning og kvantitativ analyse efter behov (figur 3J og figur 5).
BEMÆRK: Hvis spændingsmåling på flere tidspunkter ønskes, skal du starte sletning af lagrede spændingssignaler ved at tilføje en oplåsningsstreng. For at undgå overdreven skylning anvendes en højere slutkoncentration af oplåsningsstreng ved 2 μM til at initiere en tåholdsmedieret strengforskydningsreaktion med låsestrengen i 3 minutter, hvilket sletter de lagrede signaler (figur 3J). Skyl forsigtigt overskydende oligonukleotider af med HBSS. DNA-hårnålespændingssondens overflade og cellerne er klar til endnu en omgang spændingslagring og kortlægning. Oplåsning af spændingssignaler er ikke nødvendig, hvis kun et tidspunkt er af interesse for undersøgelsen.
4. Analyse af data
BEMÆRK: Billedanalyse udføres ved hjælp af Fiji-software, og den kvantitative analyse udføres ved hjælp af analysesoftware.
- Ret enhver afvigelse under billedoptagelse med kommandoen Korrekt 3D-drift i Registrering under menuen Plugins .
- Fjern kameraets baggrund af billedet med kommandoen Subtraher under menuen Proces .
- Bestem Pearsons korrelationskoefficient med funktionen Colokalisering under menuen Analysér .
- Gennemsnit og træk fluorescensbaggrunden produceret af de uåbnede sonder fra tre forskellige lokale baggrundsregioner. Tegn ROI'er af celler på enten baggrundssubtraherede billeder eller RICM-billeder (refleksionsinterferenskontrastmikroskopi) med værktøjet Image J Frihåndsvalg . Mål enhver måling af interesse for ROI'erne, f.eks. integreret fluorescensintensitet og spændingsbelægning ved hjælp af måleværktøjet under menuen Analysér (figur 6).
- Eksporter målingerne til kvantitativ analyse med analysesoftware.
- Plot dataene med enhver analysesoftware.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her viser vi repræsentative overfladekvalitetskontrolbilleder (figur 4). En overflade af høj kvalitet skal have en ren baggrund i RICM-kanalen (figur 4B) og ensartet fluorescensintensitet i Cy3B-kanalen (figur 4C). Med det samme billeddannelsesudstyr og identiske betingelser for erhvervelse af fluorescensbilleddannelse bør baggrundsfluorescensintensiteten være konsistent og reproducerbar hver gang, når der udføres forsøg med DNA-sonder. Vi anbefaler at bruge det som en markør for overfladekvalitetskontrol før hvert sæt individuelle eksperimenter.
I dette papir viser vi nogle repræsentative data (figur 5) med OT-1 naive CD8 + celler som en modelcelletype, som specifikt genkender kyllingens ovalbumin. CD3ε-antistoffet indgår som en positiv kontrol for systemet, og det beslægtede antigen pMHC N4 (SIINFEKL) anvendes som eksempel. Celler blev belagt på substrater, der blev funktionaliseret med 4,7 pN DNA-hårnålesonder, der præsenterede enten antiCD3ε eller pMHC N4. Efter 30 minutter blev cellespredning i RICM og realtidsspændingen i Cy3B-kanalen fanget, og låsestrengen blev indført ved en endelig koncentration på 1 μM. Time-lapse af spændingslåsning viste, at både TCR-antiCD3ε og TCR-pMHC spændingssignaler blev forstærket på grund af hårnålelåsning og signalakkumulering. Desuden viste TCR-pMHC N4-interaktion svagt kraftsignal i realtid (0 min), sandsynligvis på grund af dets korte bindingslevetid. Låsestrengen registrerede disse kortvarige mekaniske trækhændelser, hvilket letter kvantitativ analyse. Derudover afslørede låsning mønsteret af TCR-pMHC-kraften, når den akkumuleres, hvilket var helt forskelligt fra antiCD3ε-kontrollen og lignede "bull's-eye" -mønsteret af immunsynapser. Kvantificeringen af fluorescenssignalet er beskrevet i trin 4.4. Vi bruger typisk spændingsbelægningen (defineret som procentdelen af arealet, der har spændingssignal over kontaktområdet) og integreret fluorescensintensitet for hver celle som en metrisk måling til at evaluere akkumuleret spænding, der er > 4,7 pN.
Figur 2: Eksempler på oligonukleotidpræparation. A) HPLC-kromatogram af Cy3B-ligandstrengsrensning B) MALDI-TOF-MS-spektre af produktet C) Tabel over udgangsmaterialets beregnede masse og fundne m/z-toppe og det mærkede oligonukleotid. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Funktionalisering af DNA-spændingssondesubstrater og eksperimentprocedurer. Trin er beskrevet i den tilsvarende protokol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Eksempel på DNA-spændingssondeoverflade med god kvalitet. (A) karakterisering af DNA-spændingssondens overflade (atomic force mikroskopi) og rå mikroskopibilleder af en DNA-spændingssondeoverflade i (B) RICM og (C) Cy3B-kanal. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Eksempel på rå mikroskopibilleder af et vellykket eksperiment. Billeder viser OT-1 naive CD8+ celler, der producerer TCR-kræfter mod (A) antiCD3ε og (B) pMHC N4. Skalabjælke = 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Eksempler på databehandling og kvantitativ analyse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Eksempler på vellykkede og mislykkede overflader og spændingskortlægning . (A) Celler, der ikke spredes sammenlignet med celler, der spredes på pMHC N4-overfladerne i RICM. (B) OT-1-celle, der spredte sig, men ikke genererede noget spændingssignal på en antiCD3ε-overflade med lav DNA-spændingssondetæthed. (C) Billede, der viser, at den vellykkede overflade er lyserød, og den mislykkede overflade er farveløs. (D) Billede i Cy3B-kanal, der viser fluorescerende aggregater fra en gammel DNA-bestand. (E) Mønsteret i RICM-kanal og Cy3B-kanal, der sandsynligvis skyldes enten utilstrækkelig vask eller utilsigtet overfladetørring mellem trinnene. (F) Billeder i RICM- og Cy3B-kanaler, der viser effekten af at bruge AU-NP'er af forskellig størrelse. (G) RICM- og Cy3B-billeder af OT-1-celler, der ikke udøvede spændingssignaler, men i stedet udtømte DNA. Skalabjælke = 5 μm. Bemærk, at de rå data, der vises her, blev indsamlet af forskellige gruppemedlemmer med forskellige billedoptagelsesindstillinger fra 3 mikroskoper og dermed havde forskellige fluorescensbaggrundsniveauer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med de detaljerede procedurer, der er angivet her, kan man forberede DNA-hårnålespændingssondesubstrater til at kortlægge og kvantificere receptorspændingen produceret af immunceller. Når celler belægges på DNA-hårnålespændingssondesubstratet, lander, fastgøres og spredes, når receptorerne registrerer liganderne både kemisk og mekanisk, hvoraf sidstnævnte detekteres af vores sonder. I nogle tilfælde kan celler dog ikke sprede sig (Figur 7A) eller undlader at frembringe spændingssignal. Dette er ofte en konsekvens af overfladekemiske problemer og kræver fejlfinding (Tabel 1). Lav ligandtæthed er et af de mest almindelige problemer, der resulterer i en fejl i cellespredning. Dette kan være et resultat af flere faktorer, såsom nedbrudt ligand, nedbrudte DNA-strenge, hydrolyserede reagenser som APTES og / eller LA-PEG-NHS, aggregerede guldnanopartikler eller utilstrækkelig rengøring af glasdæksel. Ved at sammenligne substratbaggrundsfluorescensintensitet over vellykkede eksperimenter og mislykkede eksperimenter (Figur 7B), kan man hurtigt vurdere kilden til problemet. For eksempel indikerer overflader med stærkt fluorescenssignal fra baggrundsmålingerne, at immobiliseringen af DNA-sonder var vellykket. Lav baggrundsintensitet antyder problemer i forberedelsestrinnene før tilsætning af streptavidin og den biotinylerede ligand. Hvis problemet skyldes liganden, kan dens kvalitet kontrolleres ved at belægge den på et glasglas eller brønde i en 96-brøndplade ved 10 μg / ml for at teste for celleadhæsion. Dette er en nyttig funktionel test af ligandaktivitet for pMHC-ligander og anti-CD3-antistoffer. Ved at observere farveændringen (lyserød) af de funktionaliserede dæksedler efter Au NP-inkubationstrinnet kan man vurdere, om problemet skyldes DNA-nedbrydning eller trinene forud for inkubation med DNA (Figur 7C). DNA-strengkvaliteten kan valideres med HPLC og MALDI-TOF-MS, hvor en enkelt DNA-prøve vil vise flere toppe, hvis den nedbrydes. Kvaliteten af Au NP'er kan bekræftes ved at sammenligne UV-Vis-spektrene og TEM-billederne med karakteriseringen fra producenten. Hvis kvaliteten af liganden, DNA-strengene og Au NP valideres, og disse reagenser ikke forårsager overfladeproblemet, anbefaler vi at udskifte reagenser, herunder APTES, LA-PEG-NHS, svovlsyre og H2O2 til fremtidig overfladebehandling i stedet for at bruge tid på præcist at lokalisere årsagen til overfladekemiproblemet. Bortset fra problemet med lav densitet, der vil forårsage en større fejl i DNA-sondesubstratet, er der et par mindre problemer, der kan påvirke datakvaliteten. Da overfladepræparatet har flere inkubationstrin, bør buffere, der anvendes under overfladebehandling, gøres friske, filtreres og opbevares ved 4 °C til opbevaring for at undgå kontaminering. Hvis en overflade er forurenet, vil den være synlig i RICM-kanalen og kan resultere i en mærkelig fluorescensbaggrund. Bortset fra kontaminering kan der dannes aggregater i DNA-stamopløsningen over tid, hvilket kan resultere i lyse prikker i Cy3B-kanalen (Figur 7D). Normalt vil nogle få aggregater ikke påvirke datakvaliteten; Men hvis en celle lander på regioner med sådanne defekter, er dataanalyse mindre pålidelig. Lejlighedsvis kan uregelmæssige mønstre, der påvirker spændingskortlægning, observeres i både RICM- og Cy3B-kanalerne, hvilket kan komme fra utilstrækkelig vask efter APTES-trinnet eller utilsigtet tørring af overfladen under trinnene, efter at guldpartikler er funktionaliseret på overfladen (Figur 7E). Disse mønstre kan påvirke spændingskortlægningen afhængigt af hvor alvorlig den er. For at spare relativt dyrebare reagenser såsom antistoffer eller pMHC'er anbefaler vi altid at kontrollere overfladekvaliteten (se 2.2.1 og 3.3) før funktionalisering af DNA-hårnålespændingssonder med antistof/ligand. Selvom denne overfladeforberedelsesprotokol har været robust og pålidelig i vores hænder, skal du bemærke, at den ikke altid tåler ændringer ved visse trin særlig godt. For eksempel, når base- og plasmaætsning anvendes i stedet for piranha-ætsning, er det meget sandsynligt, at sondedensiteten falder, og flere overfladedefekter er til stede. Ændringer af Au NP-størrelse og capping reagenser vil sandsynligvis dramatisk påvirke overfladefunktionaliseringsresultaterne (Figur 7F). For eksempel har vi fundet ud af, at 5 og 10 nm Au NP'erne ikke binder sig særlig godt til de liponsyremodificerede overflader, hvilket resulterer i minimalt DNA efter overfladeforberedelsen. Imidlertid kan 8,8 nm og 13 nm Au NP'er binde til liponsyreoverfladerne ved en meget høj densitet, hvilket er blevet observeret i RICM (ruhed) og Cy3B-kanal (fluorescensintensitet).
Når DNA-hårnålespændingssondeoverflader af god kvalitet er forberedt, kan man udføre eksperimenter med celler af interesse og erhverve data med et fluorescensmikroskop. Realtidsspændingen kan fanges med et almindeligt fluorescensmikroskop udstyret med et højt NA-mål (numerisk blænde) og EMCCD. Bemærk dog, at vi har observeret, at primære T-celler lejlighedsvis viser artefakter på DNA-spændingssondens overflader på grund af den pågældende mus' forhold. Anekdotisk er sådanne artefakter mere tilbøjelige til at ske med ældre mus. For eksempel har vi observeret negativ udtømning af fluorescensen i stedet for tændte fluorescenssignaler (figur 7G). I dette tilfælde skal du afslutte eksperimentet og gentage med en ny batch af celler. Før der anvendes ikke-fluorescerende låsestreng til kvantitativ analyse af receptorkræfter, skal spændingssignallagring og sletning bekræftes med en fluorescerende Atto647N-låsestreng. Efter indledende låsning i 10 minutter skal Atto647N-signalet være stærkt co-lokaliseret med Cy3B-signalet, da det afspejler spændingshistorie under denne inkubation. Da Cy3B-signalet ikke kun afspejler spændingshistorien, men også realtidskræfter efter fjernelse af låsestreng, er det muligt, at en lille delmængde af Cy3B-signalet ikke ledsages af Atto647N-signal (figur 3J). For en mere kvantitativ analyse af spænding anbefaler vi at bruge en ikke-fluorescerende låsestreng, som ville eliminere den potentielle energioverførsel mellem Cy3B og Atto647N samt undgå overskydende vask mellem billedoptagelser. Bemærk, at tilføjelsen af låsestreng uundgåeligt vil medføre en lille fluorescensbaggrundsforøgelse, da termodynamikken vil drive en mindre hybridisering mellem hårnålen og låsestrengen, som kan trækkes fra før kvantificering. Man kan kvantificere den integrerede intensitet af hver celle efter låseprocedure for at studere kraften genereret af en bestemt receptor. Derudover afspejler låsekinetikken sandsynligvis 2D k on og koff af en receptor til dens ligand.
| Problem | Mulig årsag | Opløsning |
| Overflader er ikke lyserøde efter AuNP-inkubation | Utilstrækkelig ætsning | Inkluder et base-ætsningstrin efter piranha-ætsning. Æts dækselslip i 0,5 M KOH i isbad i 1 time med sonikering. |
| APTES hydrolyseres | Brug nye APTES | |
| NHS-reagenser hydrolyseres | Brug nye PEG-NHS-reagenser | |
| PEG-NHS-reagenser hydrolyseres, før de tilsættes overflader | Arbejd hurtigere | |
| Au NP har samlet | Brug ny Au NP | |
| Restvand på dækslerne fortyndede Au NP | Sørg for, at der ikke er nogen/små vandrester, før du tilføjer Au NP | |
| Celler spredes ikke på overfladen | Lav DNA-sondetæthed | Hvis overfladerne ikke er så lyserøde, skal du foretage fejlfinding som beskrevet ovenfor. Hvis Au NP-funktionaliseringen er normal, syntetiseres og bruges nyt DNA |
| Lav ligandtæthed | Brug nye streptavidin- og ligandreagenser | |
| Celler spredes ikke på liganden | Kontroller cellespredning på en ligandbelagt overflade, hvis cellerne ikke spredes stadig, inkluder klæbende molekyler som beskrevet i ref.12. | |
| Celler spredes godt, men intet spændingssignal eller kun meget svagt spændingssignal observeres selv med antistofkontrol | Receptor-ligand-interaktionen har ikke kraftoverførsel | NA |
| Kraften er kortvarig, eller kraftsignalerne er sparsomme | Brug låsende oligonukleotid | |
| Overfladen er ikke passiveret godt | Forøg sulfo-NHS-acetatkonc., op til 10 mg / ml | |
| Der observeres intet låsesignal i Atto647N | Oligonukleotid er nedbrudt | Tjek med MALDI-TOF-MS |
| Låsesignalet er antilokaliseret med sonde i realtid | Receptorkraften er højere end arbejdsområdet for låsende nukleotid | Brug 19 pN hårnålesonde i realtid fra ref. 12 som beskrevet. |
Tabel 1: Fejlfinding med det DNA-baserede spændingssondesystem.
Anvendelsen af mekanisk informationslagring er særlig nyttig til kortlægning af receptorkræfter genereret af immunceller, som ofte er forbigående og mindre rigelige. Som bestemt ved enkeltmolekylespektroskopimålinger observeres den maksimale bindingslevetid ved anvendelse af ~ 10 pN kraft med en levetid fra mindre end 100 millisekunder til flere sekunder lang. Sådanne kortvarige bindinger er vanskelige at fange med konventionel DNA-hårnålespændingssondebilleddannelse15. En anden anvendelse af dette mekaniske lagringssystem er, når densiteten af receptoren af interesse er relativt lav på celleoverfladen16, hvilket resulterer i et sparsomt signal, der ofte er vanskeligt at skelne fra baggrunden med konventionelle DNA-hårnålespændingsprober. Sådanne receptorkræfter med lav densitet kan afsløres ved akkumuleret spændingskortlægning med denne strategi. Bemærk, at vi specifikt begrænser anvendelsen af denne strategi til immunceller, da kræfterne i immunceller vides at være i det lavere regime (TCR'er < 19 pN) sammenlignet med integriner i fibroblaster eller blodplader (op til eller mere end 56 pN)12,13,15. Årsagen er, at hybridiseringshastighedskonstanten khyb ikke forringes, når belastningen er mindre end 20 pN ifølge optiske pincetmålinger, hvilket ligger i området 106 M-1 S-1. Desuden forudsiges k hyb under kræfter < 20 pN at være lidt højere end ved khyb ved nul kraft, da den svage kraft hjælper med at justere strengen for den komplementære streng at hybridisere med17. På den anden side forventes større kræfter at hindre hybridiseringen, da koff øges og skaber en barriere for, at hybridisering kan ske18. For en lås, der er 15-17 nukleotid lang, vurderer vi, at en kraft omkring 27,8 til 30,8 pN vil hindre hybridiseringen. I betragtning af disse begrænsninger foreslår vi, at man udelukkende anvender denne metode i undersøgelser af immuncellereceptorkræfter. Derudover vil tilstedeværelsen af låsestrengen sandsynligvis vippe energilandskabet for hårnåleudfoldelse, hvilket kan reducere den effektive F1/2 lidt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH Grants R01GM131099, NIH R01GM124472 og NSF CAREER 1350829. Vi takker NIH Tetramer Facility for pMHC ligander. Denne undersøgelse blev delvist støttet af Emory Comprehensive Glycomics Core.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-hydroxypicolinic acid (3-HPA) | Sigma | 56197 | maldi-TOF-MS matrix |
| mPEG-SC | Biochempeg | MF001023-2K | surface prep |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Acros | AC430941000 | surface prep |
| 10x Red blood cell lysis buffer | Biolegend | 00-4333-57 | buffer |
| 8.8 nm gold nanoparticles, tannic acid | Nanocomposix | customized order | surface prep |
| Atto647N NHS ester | Sigma | 18373-1MG-F | fluorophore, oligo prep |
| Attofluor Cell Chamber, for microscopy | Thermo Fisher Scientific | A7816 | imaging |
| BD Syringes only with Luer-Lok | BD bioscience | 309657 | cells |
| biotinylated anti-mouse CD3e | ebioscience | 13-0031-82 | antibody/ligand |
| Biotinylated pMHC ovalbumin (SIINFEKL) | NIH Tetramer Core Facility at Emory University | NA | antibody/ligand |
| bovine serum albumin | Sigma | 735078001 | block non-specific interactions |
| Cell strainers | Biologix | 15-1100 | cells |
| Coverslip Mini-Rack, teflon | Thermo Fisher Scientific | C14784 | surface prep |
| Cy3B NHS ester | GE Healthcare | PA63101 | fluorophore, oligo prep |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CM | buffer |
| ethanol | Sigma | 459836 | surface prep |
| Hank’s balanced salts (HBSS) | Sigma | H8264 | buffer |
| hydrogen peroxide | Sigma | H1009 | surface prep |
| LA-PEG-SC | Biochempeg | HE039023-3.4K | surface prep |
| Midi MACS (LS) startup kit | Miltenyi Biotec | 130-042-301 | cells |
| mouse CD8+ T cell isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-104-075 | cells |
| Nanosep MF centrifugal devices | Pall laboratory | ODM02C35 | oligo prep |
| No. 2 round glass coverslips | VWR | 48382-085 | surface prep |
| NTA-SAM | Dojindo Molecular Technologies | N475-10 | surface prep |
| P2 gel | Bio-rad | 1504118 | oligo prep |
| sufuric acid | EMD Millipore Corporation | SX1244-6 | surface prep |
| Sulfo-NHS acetate | Thermo Fisher Scientific | 26777 | surface prep |
| Equipment | |||
| Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 column, 4.6 x 150 mm, 2.7 μm | 653950-702 | oligonucleotide preparation | |
| Barnstead Nanopure water purifying system | Thermo Fisher | water | |
| CFI Apo 100× NA 1.49 objective | Nikon | Microscopy | |
| Cy5 cube | CHROMA | Microscopy | |
| evolve electron multiplying charge coupled device (EMCCD) | Photometrics | Microscopy | |
| High-performance liquid chromatography | Agilent 1100 | oligonucleotide preparation | |
| Intensilight epifluorescence source | Nikon | Microscopy | |
| Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS) | Voyager STR | oligonucleotide preparation | |
| Nanodrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher | oligonucleotide preparation | |
| Nikon Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | Microscopy | |
| Nikon Perfect Focus System | Nikon | Microscopy | |
| NIS Elements software | Nikon | Microscopy | |
| quad band TIRF 405/488/561/647 cube | CHROMA | Microscopy | |
| RICM cube | CHROMA | Microscopy | |
| TIRF launcher with 488 nm (50 mW), 561 nm (50 mW), and 640 nm | Coherent | Microscopy | |
| TRITC cube | CHROMA | Microscopy | |
| oligo name | 5' modification / 3' modification | sequence (5' to 3') | Use |
| 15mer amine locking strand | 5' modification: no modification 3' modification: /3AmMO/ |
AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA | locking real-time tension signal |
| 15mer Atto647N locking strand | 5' modification: Atto647N 3' modification: /3AmMO/ |
AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA | locking real-time tension signal |
| 15mer non-fluoresccent locking strand | 5' modification: no modification 3' modification: no modification |
A AAA AAC ATT TAT AC | locking real-time tension signal for quantitative analysis |
| 4.7 pN hairpin strand | 5' modification: no modification 3' modification: no modification |
GTGAAATACCGCACAGATGCGT TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC CAGC |
hairpin probe |
| amine ligand strand | 5' modification: /5AmMC6/ 3' modification: /3Bio/ |
CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT | hairpin probe |
| BHQ2 anchor strand | 5' modification: /5ThiolMC6-D/ 3' modification: /3BHQ_2/ |
TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT | hairpin probe |
| Cy3B ligand strand | 5' modification: Cy3B 3' modification: /3Bio/ |
CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT | hairpin probe |
| unlocking strand | 5' modification: no modification 3' modification: no modification |
TAG GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT C | unlocking accumulated tension signal |
References
- Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunological Reviews. 221 (1), 77-89 (2008).
- Spillane, K. M., Tolar, P. B cell antigen extraction is regulated by physical properties of antigen-presenting cells. Journal of Cell Biology. 216 (1), 217-230 (2017).
- Feng, Y., et al. Mechanosensing drives acuity of αβ T-cell recognition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (39), 8204-8213 (2017).
- Hong, J., et al. A TCR mechanotransduction signaling loop induces negative selection in the thymus. Nature Immunology. 19 (12), 1379-1390 (2018).
- Basu, R., et al. Cytotoxic T cells use mechanical force to potentiate target cell killing. Cell. 165 (1), 100-110 (2016).
- Bashour, K. T., et al. CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (6), 2241-2246 (2014).
- Ma, V. P. Y., Salaita, K. DNA nanotechnology as an emerging tool to study mechanotransduction in living systems. Small. 15 (26), 1900961 (2019).
- Liu, Y., Yehl, K., Narui, Y., Salaita, K. Tension sensing nanoparticles for mechano-imaging at the living/nonliving interface. Journal of the American Chemical Society. 135 (14), 5320-5323 (2013).
- Glazier, R., et al. DNA mechanotechnology reveals that integrin receptors apply pN forces in podosomes on fluid substrates. Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).
- Galior, K., Liu, Y., Yehl, K., Vivek, S., Salaita, K. Titin-based nanoparticle tension sensors map high-magnitude integrin forces within focal adhesions. Nano Letters. 16 (1), 341-348 (2016).
- Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion. Nature Communications. 5, 5167 (2014).
- Liu, Y., et al. DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (20), 5610-5615 (2016).
- Zhang, Y., et al. Platelet integrins exhibit anisotropic mechanosensing and harness piconewton forces to mediate platelet aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (2), 325-330 (2018).
- Huang, J., et al. The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness. Nature. 464 (7290), 932-936 (2010).
- Ma, R., et al. DNA probes that store mechanical information reveal transient piconewton forces applied by T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (34), 16949-16954 (2019).
- Hui, E., et al. T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition. Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).
- Whitley, K. D., Comstock, M. J., Chemla, Y. R. Elasticity of the transition state for oligonucleotide hybridization. Nucleic Acids Research. 45 (2), 547-555 (2016).
- Brockman, J. M., et al. Live-cell super-resolved PAINT imaging of piconewton cellular traction forces. Nature Methods. 17 (10), 1018-1024 (2020).
