Summary
यह पेपर प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा लागू रिसेप्टर बलों की छवि के लिए डीएनए-आधारित तनाव जांच का उपयोग करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। यह दृष्टिकोण वास्तविक समय में रिसेप्टर बलों >4.7pN को मैप कर सकता है और समय के साथ बलों को एकीकृत कर सकता है।
Abstract
दो पड़ोसी कोशिकाओं के बीच जंक्शन पर और कोशिकाओं और बाह्य मैट्रिक्स के बीच जंक्शन पर प्रेषित यांत्रिक बल विकास से लेकर इम्यूनोलॉजी तक कई प्रक्रियाओं को विनियमित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। इसलिए, आणविक पैमाने पर इन बलों का अध्ययन करने के लिए उपकरण विकसित करना महत्वपूर्ण है। हमारे समूह ने कोशिकाओं द्वारा उत्पन्न बलों को मापने और कल्पना करने के लिए आणविक तनाव सेंसर का एक सूट विकसित किया और विशिष्ट लिगेंड को प्रेषित किया। आणविक तनाव सेंसर के सबसे संवेदनशील वर्ग में न्यूक्लिक एसिड स्टेम-लूप हेयरपिन शामिल हैं। ये सेंसर यांत्रिक विस्तार और बल के तहत डीएनए हेयरपिन के प्रकटीकरण पर रिपोर्ट करने के लिए फ्लोरोफोरे-बुझाने वाले जोड़े का उपयोग करते हैं। डीएनए हेयरपिन तनाव सेंसर के साथ एक चुनौती यह है कि वे तनाव की समाप्ति पर तेजी से हेयरपिन के साथ प्रतिवर्ती होते हैं और इस प्रकार क्षणिक बलों को रिकॉर्ड करना मुश्किल होता है। इस लेख में, हम डीएनए तनाव सेंसर तैयार करने के प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जिन्हें यांत्रिक जानकारी के "भंडारण" को सक्षम करने के लिए "लॉक" किया जा सकता है और फिर से मोड़ने से रोका जा सकता है। यह अत्यधिक क्षणिक पिकोनवटन बलों की रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है, जिसे बाद में पूरक न्यूक्लिक एसिड के अतिरिक्त "मिटा" किया जा सकता है जो लॉक को हटाते हैं। वास्तविक समय के तनाव मानचित्रण और यांत्रिक सूचना भंडारण के बीच टॉगल करने की यह क्षमता कमजोर, अल्पकालिक और कम प्रचुर मात्रा में बलों को प्रकट करती है, जो आमतौर पर टी कोशिकाओं द्वारा उनके प्रतिरक्षा कार्यों के हिस्से के रूप में नियोजित होती हैं।
Introduction
प्रतिरक्षा कोशिकाएं एंटीजन के लिए लक्षित कोशिकाओं की सतहों को लगातार रेंगने और स्कैन करके रोगजनकों और कैंसर कोशिकाओं से बचाव करती हैं, उनकी सतह 1,2 का अध्ययन करती हैं। एंटीजन पहचान टी सेल रिसेप्टर (टीसीआर) और पेप्टाइड-प्रमुख हिस्टोकम्पैटिबिलिटी कॉम्प्लेक्स एमएचसी (पीएमएचसी) कॉम्प्लेक्स के बीच बंधन पर शुरू की जाती है जो लक्ष्य कोशिकाओं की सतह पर व्यक्त की जाती है। क्योंकि टीसीआर-पीएमएचसी मान्यता दो मोबाइल कोशिकाओं के बीच जंक्शन पर होती है, यह लंबे समय से यांत्रिक बलों का अनुभव करने का संदेह है। इसके अलावा, इसने टीसीआर सक्रियण के मेकेनोसेंसर मॉडल को जन्म दिया, जो बताता है कि टीसीआर बल इसके कार्य 3,4 में योगदान करते हैं। यह समझने के लिए कि कब, कहां और कैसे यांत्रिक बल टी सेल फ़ंक्शन में योगदान करते हैं, टी कोशिकाओं द्वारा प्रेषित आणविक बलों की कल्पना करने के लिए उपकरण विकसित करना अनिवार्य है। परंपरागत रूप से, कर्षण बल माइक्रोस्कोपी (टीएफएम) और माइक्रोपिलर सरणियों जैसे तरीकों का उपयोग सेलुलर बलों 5,6 की जांच के लिए किया जाता है। हालांकि, टीएफएम और माइक्रोपिलर सरणियों की बल संवेदनशीलता नैनोन्यूटन (एनएन) पैमाने पर है और इस प्रकार सेल रिसेप्टर्स7 द्वारा प्रेषित आणविक पिकोनेवटन (पीएन) बलों का अध्ययन करने के लिए अक्सर अपर्याप्त होती है। पता लगाने के लिए बल और स्थानिक संकल्प में सुधार करने के लिए, हमारी प्रयोगशाला ने आणविक तनाव जांच के विकास का बीड़ा उठाया, जिसे शुरू में पॉलीथीन ग्लाइकॉल (पीईजी) पॉलिमर7 का उपयोग करके संश्लेषित किया गया था। आणविक तनाव जांच में एक विस्तारयोग्य आणविक "स्प्रिंग" (पीईजी, प्रोटीन, डीएनए) शामिल होता है जो फ्लोरोफोरे और बुझाने वाले से घिरा होता है और एक सतह पर लंगर डालता है। जांच के टर्मिनस पर लागू बल इसके विस्तार की ओर ले जाते हैं, फ्लोरोफोरे और बुझाने वाले को अलग करते हैं, और इस प्रकार एक मजबूत प्रतिदीप्ति संकेत उत्पन्न करते हैं (चित्रा 1 ए) 8,9,10।
पिछले एक दशक में हमने न्यूक्लिक एसिड11, प्रोटीन10 और पॉलिमर8 से बने वसंत तत्वों के साथ आणविक तनाव जांच के विभिन्न वर्गों की एक लाइब्रेरी विकसित की है। इनमें से, डीएनए-आधारित तनाव जांच शोर अनुपात और सबसे बड़ी बल संवेदनशीलता के लिए उच्चतम संकेत प्रदान करती है, जो आसानी से कुछ pN से ~ 20 pN11 तक ट्यून की जाती है। हमने फाइब्रोब्लास्ट, कैंसर कोशिकाओं, प्लेटलेट्स और प्रतिरक्षा कोशिकाओं11,12,13 सहित कई विविध सेल प्रकारों द्वारा उत्पन्न आणविक बलों का अध्ययन करने के लिए इन वास्तविक समय डीएनए तनाव जांच का उपयोग किया है। यह पांडुलिपि पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके पीएन बल रिज़ॉल्यूशन के साथ आणविक रिसेप्टर बलों को मैप करने के लिए सतह पर डीएनए तनाव जांच को संश्लेषित और इकट्ठा करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करेगी। जबकि वर्तमान प्रक्रिया में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर (चित्रा 1 बी) को पेश करने के लिए न्यूक्लिक एसिड में रासायनिक संशोधन शामिल हैं, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि कई संशोधन और शुद्धिकरण चरणों को कस्टम डीएनए संश्लेषण कंपनियों को आउटसोर्स किया जा सकता है। इसलिए, डीएनए तनाव जांच तकनीक सरल है, और व्यापक सेल जीव विज्ञान और मेकेनोबायोलॉजी समुदायों के लिए सुलभ है।
संक्षेप में, डीएनए तनाव सेंसर को इकट्ठा करने के लिए, एक डीएनए हेयरपिन को एक हाथ पर फ्लोरोसेंट लिगैंड स्ट्रैंड और दूसरी बांह पर एक बुझाने वाले लंगर स्ट्रैंड में संकरित किया जाता है और फिर ग्लास सब्सट्रेट (चित्रा 1 सी, वास्तविक समय तनाव) पर स्थिर किया जाता है। यांत्रिक बल की अनुपस्थिति में, हेयरपिन बंद हो जाता है, और इस प्रकार प्रतिदीप्ति बुझ जाती है। हालांकि, जब लागू यांत्रिक बल एफ1/2 (संतुलन पर बल जो प्रकट होने की 50% संभावना की ओर जाता है) से अधिक होता है, तो हेयरपिन यांत्रिक रूप से पिघल जाता है, और एक फ्लोरोसेंट सिग्नल उत्पन्न होता है।
वास्तविक समय डीएनए तनाव सेंसर पर निर्माण, हम संचित बलों को मैप करने के लिए प्रोटोकॉल का भी वर्णन करते हैं, जो प्रतिरक्षा कोशिकाओं और उनके प्राकृतिक लिगैंड पर रिसेप्टर्स के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। ऐसा इसलिए है क्योंकि प्रतिरक्षा रिसेप्टर्स अक्सर अल्पकालिक बंधन 3,14 प्रदर्शित करते हैं। संचित बलों को "लॉकिंग" स्ट्रैंड का उपयोग करके चित्रित किया जाता है जो अधिमानतः डीएनए हेयरपिन को खोलता है और यांत्रिक खींचने की घटनाओं (चित्रा 1 सी, लॉक तनाव) से जुड़े प्रतिदीप्ति संकेतों के भंडारण की अनुमति देता है। लॉकिंग स्ट्रैंड को एक क्रिप्टिक बाइंडिंग साइट को बांधने के लिए डिज़ाइन किया गया है जो हेयरपिन के यांत्रिक रूप से प्रेरित पिघलने पर उजागर होता है और हेयरपिन को रिफोल्डिंग को अवरुद्ध करके खुली अवस्था में हेयरपिन को लॉक करता है, इस प्रकार तनाव संकेत को संग्रहीत करता है, और एक संचित तनाव मानचित्र उत्पन्न करता है। इसके अलावा, लॉकिंग स्ट्रैंड को आठ-न्यूक्लियोटाइड टोहोल्ड के साथ डिज़ाइन किया गया है, जो अपने पूर्ण पूरक, "अनलॉकिंग" स्ट्रैंड के साथ एक टोहोल्ड-मध्यस्थता स्ट्रैंड विस्थापन प्रतिक्रिया को सक्षम बनाता है। अनलॉकिंग स्ट्रैंड के अलावा, बाउंड लॉकिंग स्ट्रैंड को हेयरपिन निर्माण से हटा दिया जाता है, संग्रहीत तनाव संकेत को मिटा दिया जाता है और हेयरपिन को वास्तविक समय की स्थिति में वापस रीसेट किया जाता है।
चित्रा 1: अत्याधुनिक आणविक तनाव जांच की योजना । (ए) वास्तविक समय आणविक तनाव जांच का सामान्य डिजाइन, (बी) डीएनए-आधारित तनाव जांच निर्माण के लिए किस्में, और (सी) डीएनए-आधारित तनाव जांच और वास्तविक समय की स्थिति और लॉक स्थिति के बीच उनके सामंजस्य। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
मुख्य प्रोटोकॉल में चार प्रमुख खंड होते हैं - ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड तैयारी, सतह तैयारी, इमेजिंग और डेटा विश्लेषण। इस प्रोटोकॉल को हमारी प्रयोगशाला और अन्य लोगों द्वारा भोले और सक्रिय ओटी -1 सीडी 8 + टी कोशिकाओं, ओटी -2 सीडी 4 + कोशिकाओं, साथ ही हाइब्रिडोमा में सफलतापूर्वक प्रदर्शित किया गया है, और टी सेल रिसेप्टर, प्रोग्राम्ड सेल डेथ रिसेप्टर (पीडी 1), और लिम्फोसाइट फ़ंक्शन से जुड़े एंटीजन 1 (एलएफए -1) बलों सहित विभिन्न प्रतिरक्षा सेल रिसेप्टर्स से पूछताछ करने के लिए लागू किया जा सकता है। ओटी -1 सीडी 8 + भोले टी कोशिकाओं का उपयोग इस पेपर में एक उदाहरण सेल लाइन के रूप में किया जाता है।
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Protocol
ओटी -1 ट्रांसजेनिक चूहों को एमोरी विश्वविद्यालय में पशु संसाधन सुविधा विभाग में रखा गया है। सभी प्रयोगों को संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) प्रोटोकॉल के तहत अनुमोदित और प्रदर्शन किया गया था।
1. ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड तैयारी
- लिगैंड स्ट्रैंड डीएनए को पानी में घोलें (18.2 एमक्यू प्रतिरोधकता, पूरे प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है)। एक टेबलटॉप सेंट्रीफ्यूज के साथ घोल को भंवर और स्पिन करें। पानी की मात्रा को इस तरह ट्यून करें कि अंतिम एकाग्रता 1 मिमी है। 260 एनएम पर अवशोषण को मापने के लिए एक नैनोड्रॉप स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके एकाग्रता को मान्य करें और ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड के विलुप्त होने के गुणांक के आधार पर अंतिम एकाग्रता निर्धारित करें।
नोट: लिगैंड स्ट्रैंड में प्रत्येक टर्मिनस, 5 'अमाइन और 3' बायोटिन पर एक संशोधन होता है, जो फ्लोरोफोरे के साथ संयुग्मित होता है और बायोटिनीलेटेड लिगैंड पेश करता है। लिगैंड स्ट्रैंड में अमाइन समूह को फ्लोरोफोरे के साथ संयुग्मित करने की आवश्यकता होती है। Cy3B डाई का उपयोग इसकी उच्च चमक और फोटोस्टेबिलिटी के कारण इस संयुग्मन के लिए किया जाता है, लेकिन इसे आम तौर पर व्यावसायिक रूप से पेश नहीं किया जाता है और इन-हाउस संयुग्मन की आवश्यकता होती है। तदनुसार, निम्नलिखित खंड अमाइन और एनएचएस एस्टर रंगों के बीच संयुग्मन का वर्णन करता है। अंतिम उपयोगकर्ताओं के लिए जिनके पास न्यूक्लिक एसिड संशोधन के लिए सुविधाओं या संसाधनों तक पहुंच नहीं है, संशोधित न्यूक्लिक एसिड को कस्टम डीएनए संश्लेषण विक्रेताओं से खरीदा जा सकता है जो उज्ज्वल और फोटोटेबल रंगों की पेशकश करते हैं, जैसे कि एलेक्सा और एटो परिवार के रंजक। - 10x PBS और 1 M NaHCO3 समाधान तैयार करें। 1 mM अमाइन लिगैंड स्ट्रैंड घोल (10 nmol) के 10 μL को 10x PBS के 10 μL, 1 M NaHCO3 के 10 μL, और H2O के 60 μL के साथ मिलाएं। उपयोग से तुरंत पहले DMSO के 10 μL में Cy3B NHS एस्टर के 50 μg को घोलें और मिश्रण में 100 μL की कुल प्रतिक्रिया मात्रा के लिए जोड़ें। Cy3B NHS एस्टर को अंतिम रूप से जोड़ें। रात भर 1 घंटे या 4 डिग्री सेल्सियस के लिए कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया करने की अनुमति दें।
- एटो 647 एन एनएचएस एस्टर के साथ अमाइन लॉकिंग स्ट्रैंड को जोड़कर एटो 647 एन लॉकिंग स्ट्रैंड तैयार करें। 10x PBS और 1 M NaHCO3 समाधान तैयार करें। 1 mM अमाइन लॉकिंग स्ट्रैंड घोल (10 nmol) के 10 μL को 10x PBS के 10 μL, 1 M NaHCO3 के 10 μL और H2O के 60 μL के साथ मिलाएं। उपयोग से तुरंत पहले DMSO के 10 μL में Atto647N NHS एस्टर के 50 μg को घोलें और मिश्रण में 100 μL की कुल प्रतिक्रिया मात्रा के लिए जोड़ें। रात भर 1 घंटे या 4 डिग्री सेल्सियस के लिए कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया करने की अनुमति दें।
- प्रतिक्रियाओं के बाद, पी 2 डीसाल्टिंग जेल निस्पंदन द्वारा उप-उत्पादों, अतिरिक्त डाई और लवण को हटा दें। एच2ओ के साथ प्रतिक्रिया मिश्रण को 300 μL की कुल मात्रा में पतला करें, जो बाद के एचपीएलसी शुद्धिकरण चरण के लिए उपयुक्त है। एक केन्द्रापसारक डिवाइस में 650 μL हाइड्रेटेड P2 जेल जोड़ें और 1 मिनट के लिए 18,000 x g पर स्पिन करें। डिवाइस के निचले भाग में तरल निकालें, प्रतिक्रिया मिश्रण को पी 2 जेल वाले कॉलम में जोड़ें, 1 मिनट के लिए 18,000 x g पर स्पिन करें और डिवाइस के निचले भाग में प्रतिक्रिया मिश्रण एकत्र करें।
नोट: एच2ओ के साथ उपयोग करने से पहले पी 2 जेल को कम से कम 4 घंटे हाइड्रेटेड किया जाना चाहिए। - ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड शुद्धिकरण के लिए निर्दिष्ट सी 18 कॉलम का उपयोग करके एचपीएलसी के साथ डीसाल्टेड प्रतिक्रिया मिश्रण को शुद्ध करें, जिसमें विलायक ए: एच2ओ और बी में 0.1 एम टीईएए: एसीएन 0.5 एमएल / मिनट की प्रवाह दर पर 50 मिनट से अधिक रैखिक ढाल क्षालन 10-100% बी के लिए मोबाइल चरण के रूप में है। शुद्धिकरण के लिए 500 μL इंजेक्शन लूप के साथ रिवर्स-फेज एचपीएलसी में डीसाल्टेड प्रतिक्रिया मिश्रण इंजेक्ट करें। उस उत्पाद को इकट्ठा करें जिसमें डीएनए (260 एनएम) के लिए एक अवशोषण शिखर और फ्लोरोफोरे के लिए एक अवशोषण शिखर (Cy3B के लिए 560 nm और Atto647N के लिए 647 nm) है और उन्हें रात भर वैक्यूम केन्द्रापसारक कंसंट्रेटर में सुखाएं ( चित्रा 2A देखें)।
- सूखे ऑलिगो-डाई उत्पाद को 100 μL पानी में पुनर्गठित करें। नैनोड्रॉप स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ Cy3B लिगैंड स्ट्रैंड और Atto647N लॉकिंग स्ट्रैंड की एकाग्रता निर्धारित करें। सुनिश्चित करें कि डाई लेबलिंग अनुपात 1: 1 के करीब है। ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड एकाग्रता का निर्धारण करते समय यदि आवश्यक हो तो डाई के 260 एनएम अवशोषण के लिए सही है।
- माल्डी-टीओएफ-एमएस नमूना तैयार करने के लिए 1-5 μM पर उत्पाद के 0.5 μL का उपयोग करके 50% ACN/H2Oमें सब्सट्रेट के रूप में 3-HPA का उपयोग करके 0.1% TFA और 5 mg/mL अमोनियम साइट्रेट का उपयोग करके माल्डी-टीओएफ-एमएस के साथ शुद्ध उत्पाद को मान्य करें। एक उदाहरण द्रव्यमान स्पेक्ट्रम चित्रा 2 बी में पाया जा सकता है।
- हेयरपिन स्ट्रैंड और बुझाने वाले लंगर स्ट्रैंड को पानी में घोलें और सुनिश्चित करें कि स्टॉक समाधान की एकाग्रता 50 और 100 μM के बीच है।
नोट: हेयरपिन स्ट्रैंड असंशोधित है और इसे सीधे विक्रेता से कस्टम संश्लेषित किया जा सकता है। एंकर स्ट्रैंड में एक थिओल एंकरिंग समूह और एक बुझाने वाला बीएचक्यू 2 होता है और इसे सीधे विक्रेता से कस्टम संश्लेषित किया जा सकता है। - सभी ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को एलिकोट करें। अल्पकालिक उपयोग और भंडारण के लिए, इन ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। लंबे समय तक भंडारण के लिए, फ्रीज करें और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें। इस बिंदु पर, सभी ऑलिगोन्यूक्लियोटाइडडीएनए तनाव जांच असेंबली के लिए तैयार हैं।
नोट: बार-बार फ्रीज-पिघलना चक्र ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के लिए समस्याग्रस्त नहीं हैं।
2. सतह की तैयारी
नोट: डीएनए हेयरपिन तनाव जांच सब्सट्रेट ्स की तैयारी में दो दिन लगते हैं। डीएनए हेयरपिन तनाव जांच को ग्लास कवरलिप्स पर कार्यात्मक किया जाएगा।
- दिन 1
- 50 एमएल बीकर में पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन रैक पर 25 मिमी कवरलिप्स रखें। प्रत्येक रैक 8 कवरलिप्स तक पकड़ सकता है। कवरलिप्स को तीन बार पानी में डुबोकर कुल्ला करें।
- रैक और कवरलिप्स वाले बीकर में पानी के साथ मिश्रित इथेनॉल के 1: 1 अनुपात (वी: वी) समाधान के 40 एमएल जोड़ें, और पैराफिन फिल्म का उपयोग करके बीकर को सील करें।
- कवरलिप्स को साफ करने के लिए एक अल्ट्रासोनिक्स क्लीनर (ऑपरेटिंग फ्रीक्वेंसी 35 KHz) में 15 मिनट के लिए बीकर को सोनिकेट करें। सोनिकेशन के बाद, तरल को त्याग दें और किसी भी शेष कार्बनिक विलायक को हटाने के लिए बीकर को रैक और कवरलिप्स के साथ कम से कम 6 बार पानी से कुल्ला करें।
- सल्फ्यूरिक एसिड और हाइड्रोजन पेरोक्साइड को 3: 1 के अनुपात में मिलाकर ताजा पिरान्हा घोल तैयार करें। पिरान्हा घोल के 40 मिलीलीटर बनाने के लिए, पहले एक साफ 50 एमएल बीकर में 30 एमएल सल्फ्यूरिक एसिड जोड़ें और फिर धीरे-धीरे एच 2 ओ2 के 10 एमएल जोड़ें। पिरान्हा समाधान एच 2 ओ2के अतिरिक्त तेजी से गर्म और बुलबुला होगा। धीरे से एक ग्लास पिपेट के अंत का उपयोग करके पिरान्हा मिलाएं।
- इसके बाद, कवरलिप्स रखने वाले रैक को बीकर में स्थानांतरित करें जिसमें नक़्क़ाशी के लिए धीरे से मिश्रित पिरान्हा समाधान हो (चित्रा 3 ए)। पिरान्हा घोल को हाइड्रॉक्सीलेट करने दें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए कवरलिप्स को साफ करें। पिरान्हा नक़्क़ाशी के बाद, स्टील या पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन चिमटी का उपयोग करके रैक को पानी के साथ एक साफ 50 एमएल बीकर में स्थानांतरित करें और कम से कम 6 बार पानी से फिर से कुल्ला करें।
चेतावनी: बड़ी मात्रा में कार्बनिक पदार्थ पिरान्हा समाधान के साथ सख्ती से प्रतिक्रिया कर सकते हैं और विस्फोट का कारण बन सकते हैं। सावधान रहें और हमेशा फ्यूम हुड में पिरान्हा समाधान के साथ काम करें। लैबकोट, दस्ताने और सुरक्षा चश्मे पहनना सुनिश्चित करें। ताजा पिरान्हा घोल को कभी भी सीलबंद कंटेनर में स्टोर न करें।
नोट: हाइड्रोजन पेरोक्साइड से सल्फ्यूरिक एसिड अनुपात को 1: 2 (वी: वी) के तहत रखा जाना चाहिए और कभी भी 1: 1 से अधिक नहीं होना चाहिए। पिरान्हा घोल में कवरलिप्स के साथ रैक को डुबोते समय, उन्हें धीरे-धीरे और सावधानी से समाधान में रखें। नक़्क़ाशी के तुरंत बाद घोल को न छोड़ें, क्योंकि यह अभी भी सक्रिय और गर्म है। एसिड अपशिष्ट कंटेनर में डालने से पहले इसे रात भर बीकर में छोड़ दें। - पानी निकालने के लिए 40 एमएल इथेनॉल के साथ 50 एमएल बीकर में कवरलिप्स रखने वाले रैक को डुबोएं। इथेनॉल को छोड़ दें और यह सुनिश्चित करने के लिए 3 बार दोहराएं कि पानी हटा दिया गया है।
- फिर कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए कवरलिप्स पर -ओएच के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए 40 एमएल इथेनॉल में 3% एमिनोप्रोपिल ट्राइएथॉक्सी सिलेन (एपीटीईएस) (वी / वी) में रैक को डुबोएं (चित्रा 3 बी)।
नोट: इथेनॉल एसीटोन द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है। - सतहों को 40 एमएल इथेनॉल में डुबोकर 6 बार कुल्ला करें, फिर 20 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में सुखाएं। ठंडा होने के बाद, सूखे अमाइन-संशोधित कवरलिप्स को भविष्य के उपयोग (6 महीने तक) के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- पैराफिन फिल्म के साथ 10 सेमी व्यास प्लास्टिक पेट्री व्यंजन ों के निचले आंतरिक हिस्से को कवर करें। पैराफिन फिल्म कवरलिप्स को पेट्री डिश के अंदर फिसलने से रोकती है और कवरलिप्स पर रहने के लिए कार्यात्मकता के अगले चरणों के लिए समाधान रखने में मदद करती है। पेट्री व्यंजनों में ठंडा-डाउन अमाइन-संशोधित कवरलिप्स रखें। कार्यात्मक होने वाला पक्ष ऊपर की ओर होना चाहिए।
- कवरलिप्स पर अमाइन समूहों को संशोधित करने के लिए, प्रत्येक कवरस्लिप पर 0.1 एम एनएएचसीओ 3 में 0.5% डब्ल्यू / वी लिपोइक एसिड पीईजी एनएचएस (एलए-पीईजी-एससी) के 300 μL और 2.5% डब्ल्यू / वी एमपीईजी एनएचएस (एमपीईजी-एससी) जोड़ें और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें (चित्रा 3 सी)। प्रत्येक 25 मिमी कवरस्लिप के लिए, एलए-पीईजी-एससी के 1.5 मिलीग्राम और एमपीईजी-एससी के 7.5 मिलीग्राम वजन करें। सतहों में जोड़ने से पहले एनएचएस अभिकर्मकों को तुरंत भंग करें, क्योंकि कमरे के तापमान पर जलीय घोल में उनका आधा जीवन (~ 10 मिनट) होता है। प्रतिक्रिया के बाद, सतहों को पानी से 3 बार धो लें।
नोट: एनएचएस प्रतिक्रिया रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर की जा सकती है। एनएचएस अभिकर्मकों में 4 डिग्री सेल्सियस पर हाइड्रोलिसिस से पहले लंबा आधा जीवन होता है, जो लगभग 4-6 घंटे है। इसके परिणामस्वरूप तीन दिवसीय सतह तैयारी प्रक्रिया होगी। - "सैंडविच" कवरलिप्स के एक सेट में सल्फो-एनएचएस एसीटेट के 1 मिलीग्राम / एमएल युक्त 0.1 एम एनएएचसीओ3 के 100 μL जोड़ें (बीच में प्रतिक्रिया बफर के साथ एक दूसरे की ओर दो कवरलिप)। कम से कम 30 मिनट के लिए निष्क्रिय होने दें। अभिकर्मक को बचाने के लिए, यह कदम 1 मिलीग्राम / एमएल सल्फो-एनएचएस एसीटेट के 50 μL के साथ किया जा सकता है। निष्क्रिय होने के बाद पानी से तीन बार धो लें।
- प्रत्येक कवरस्लिप में 0.5 मिलीलीटर सोने के नैनोकणों (एयूएनपी, 8.8 एनएम, टैनिक एसिड, 0.05 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें (चित्रा 3 डी)। अभिकर्मक को बचाने के लिए, यह चरण दो कवरलिप्स को सैंडविच करके भी किया जा सकता है। सुनिश्चित करें कि सोने के नैनोकणों के एकत्रीकरण से बचने के लिए पिछले चरणों से सिस्टम में कोई लवण मौजूद नहीं है। इस कदम के बाद कवरलिप्स को सूखने के लिए न छोड़ें।
- इस बीच, 4.7 पीएन हेयरपिन, साइ 3 बी लिगैंड स्ट्रैंड और बीएचक्यू 2 एंकर स्ट्रैंड को प्री-हाइब्रिड करें जो डीएनए तनाव जांच बनाते हैं, पीसीआर ट्यूब में 300 एनएम पर 1 एम एनएसीएल में 1.1: 1: 1 के अनुपात में निर्माण करते हैं। 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस तक घोल को गर्म करके तारों को नष्ट करें, फिर थर्मल साइकलर में 30 मिनट से अधिक तापमान को 20 डिग्री सेल्सियस तक कम करके धीरे-धीरे ठंडा करें।
- सोने के नैनोकणों के साथ 30 मिनट के इनक्यूबेशन के बाद कवरलिप्स को पानी से तीन बार धोएं। बीएचक्यू 2 एंकर स्ट्रैंड और साइ 3 बी लिगैंड स्ट्रैंड 10: 1 के बीच अनुपात बनाने के लिए एनाल्ड डीएनए समाधान में अतिरिक्त बीएचक्यू 2 एंकर स्ट्रैंड (100 μM स्टॉक से) जोड़ें। इस बिंदु पर, डीएनए समाधान में 300 एनएम तनाव जांच निर्माण और 2.7 μM BHQ2 स्ट्रैंड होना चाहिए। "सैंडविच" बनाने के लिए प्रति दो कवरलिप्स में 100 μL जोड़ें (चित्रा 3E)।
- पेट्री डिश (कवरलिप्स से दूर) में एक गीली प्रयोगशाला ऊतक गेंद को ध्यान से रखें और घोल को सूखने से रोकने के लिए पकवान को पैराफिन फिल्म के साथ सील करें। पन्नी के साथ पकवान को कवर करें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- दिन 2
- 1x PBS के साथ कवरलिप्स से अतिरिक्त जांच को धो लें। एक एपिफ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत डीएनए तनाव जांच सतह की गुणवत्ता की जांच करें।
- 1x PBS में स्ट्रेप्टाविडिन के 40 μg / mL तैयार करें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए कवरलिप्स पर इनक्यूबेट करें (चित्रा 3 एफ)। आमतौर पर, 100 μL 25 मिमी कवरस्लिप के लिए पर्याप्त है। स्ट्रेप्टाविडिन की अतिरिक्त मात्रा को धोने के लिए इनक्यूबेशन के बाद पीबीएस से 3 बार कुल्ला करें।
- 1x PBS में 40 μg / mL बायोटिनीलेटेड एंटीबॉडी / लिगैंड तैयार करें। प्रति सैंडविच 50-100 μL जोड़ें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें (चित्रा 3 जी)। लिगैंड की अतिरिक्त मात्रा को धोने के लिए इनक्यूबेशन के बाद पीबीएस से तीन बार कुल्ला करें।
- सतहों के साथ स्वच्छ इमेजिंग कक्षों को ध्यान से इकट्ठा करें। कक्षों को कसते समय सतहों को आसानी से क्रैक किया जा सकता है। इमेजिंग कक्षों में हैंक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) के 0.5-1 एमएल जोड़ें और उन्हें कोशिकाओं के साथ इमेजिंग के लिए तैयार रखें (चित्रा 3 एच)।
3. इमेजिंग सेल रिसेप्टर बल
- 1-2 x 106 कोशिकाओं / एमएल पर एचबीएसएस में रुचि की प्रतिरक्षा कोशिकाओं को तैयार करें।
नोट: ओटी -1 सीडी 8 + भोले कोशिकाओं का उपयोग इस पेपर में एक उदाहरण के रूप में किया जाता है। निर्माता के निर्देश के बाद एमएसीएस विभाजक के साथ एमएसीएस माउस सीडी 8 + टी सेल आइसोलेशन किट का उपयोग करके बलिदान किए गए चूहों की तिल्ली से ओटी -1 सीडी 8 + भोले टी कोशिकाओं को शुद्ध करें। किसी भी गैर सीडी 8 + टी कोशिकाओं को हटाकर सीडी 8 + टी कोशिकाओं को अलग और समृद्ध करें जो चुंबकीय क्षयकारी एंटीबॉडी कॉकटेल से बंधे हैं। एचबीएसएस में शुद्ध ओटी -1 सीडी 8 + भोले टी कोशिकाओं को 2 x 106 कोशिकाओं / एमएल पर पुन: निलंबित करें और उपयोग से पहले बर्फ पर रखें। - लिगेंड या प्लेटिंग कोशिकाओं को जोड़ने से पहले गुणवत्ता नियंत्रण के लिए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप (100x उद्देश्य) के तहत डीएनए हेयरपिन तनाव जांच सतह की गुणवत्ता की जांच करें। डीएनए हेयरपिन तनाव जांच सतह के Cy3B चैनल में कम से कम 5 अलग-अलग स्थितियों और 3 प्रतिकृतियों से औसत पृष्ठभूमि तीव्रता की छवि और मात्रा निर्धारित करें। इमेजिंग अधिग्रहण की स्थिति को सुसंगत रखें ताकि इस मान का उपयोग सतह की गुणवत्ता और जांच घनत्व (चित्रा 4 सी) के विश्वसनीय मार्कर के रूप में किया जा सके।
नोट: साहित्य12 के अनुसार सतह की तैयारी के पहले कुछ समय में प्रति सोने के नैनोपार्टिकल में डीएनए स्ट्रैंड की संख्या और प्रति �2 सोने के नैनोकणों की संख्या निर्धारित करें, जिसका उपयोग सतह की गुणवत्ता के एक और विश्वसनीय मार्कर के रूप में किया जा सकता है। - प्लेट ~ 4 x 10 4 - 10 x 104 कोशिकाओं को प्रत्येक डीएनए तनाव जांच कार्यात्मक कवरस्लिप पर कार्यात्मक बनाता है और उन्हें कमरे के तापमान पर ~ 15 मिनट के लिए संलग्न और फैलाने की अनुमति देता है।
- जैसा कि कोशिकाओं को डीएनए हेयरपिन तनाव जांच पर चढ़ाया जाता है और फैलना शुरू होता है, 100x उद्देश्य (चित्रा 3I) के साथ Cy3B चैनल में उत्पन्न प्रतिदीप्ति संकेतों की छवि बनाएं।
- जब कोशिकाएं Cy3B चैनल में डीएनए हेयरपिन तनाव जांच सतह पर वास्तविक समय तनाव संकेत का उत्पादन करना शुरू कर देती हैं, तो Cy3B और Atto647N दोनों चैनलों में छवियां प्राप्त करती हैं (TIRF माइक्रोस्कोपी एपिफ्लोरेसेंस की तुलना में बेहतर सिग्नल-टू-शोर अनुपात देता है)। इसके बाद, यांत्रिक रूप से चयनात्मक संकरण के लिए 200 एनएम की अंतिम एकाग्रता पर इमेजिंग कक्षों में एटो 647 एन स्ट्रैंड जोड़ें।
- 10 मिनट के इनक्यूबेशन के बाद, फ्लोरोसेंट एटो 647 एन लॉकिंग स्ट्रैंड वाले बफर को जल्दी और धीरे से हटा दें और ताजा हैंक के संतुलित लवण के साथ बदलें। Cy3B और Atto647N दोनों चैनलों में छवि फिर से और फिजी सॉफ्टवेयर15 के साथ पियरसन के सहसंबंध गुणांक का निर्धारण करें।
- जांच के लिए रुचि के समय पर, तनाव संकेत को स्टोर करने के लिए इमेजिंग कक्ष में कोशिकाओं को गैर-फ्लोरोसेंट लॉकिंग स्ट्रैंड पेश करें। लॉकिंग स्ट्रैंड स्टॉक (100 μM) तैयार करें और 1 μM की अंतिम एकाग्रता पर कोशिकाओं में जोड़ें। मिश्रण करने के लिए धीरे से पिपेट। लॉकिंग की अवधि भिन्न हो सकती है लेकिन अनुशंसित समय 10 मिनट है।
- आवश्यकतानुसार गुणात्मक तनाव मानचित्रण और मात्रात्मक विश्लेषण दोनों के लिए एपिफ्लोरेसेंस में टाइम-लैप्स फिल्में या एंड-पॉइंट छवियां प्राप्त करें (चित्रा 3 जे और चित्रा 5)।
नोट: यदि कई समय बिंदुओं पर तनाव माप वांछित है, तो अनलॉकिंग स्ट्रैंड के अतिरिक्त संग्रहीत तनाव संकेतों को मिटाना शुरू करें। अतिरिक्त कुल्ला करने से बचने के लिए, 2 μM पर अनलॉकिंग स्ट्रैंड की एक उच्च अंतिम एकाग्रता का उपयोग 3 मिनट के लिए लॉकिंग स्ट्रैंड के साथ एक टोहोल्ड-मध्यस्थता स्ट्रैंड विस्थापन प्रतिक्रिया शुरू करने के लिए किया जाता है, जो संग्रहीत संकेतों को मिटा देता है (चित्रा 3 जे)। एचबीएसएस के साथ अतिरिक्त ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को धीरे से धोएं। डीएनए हेयरपिन तनाव जांच सतह और कोशिकाएं तनाव भंडारण और मानचित्रण के एक और दौर के लिए तैयार हैं। तनाव संकेतों को अनलॉक करना आवश्यक नहीं है यदि अध्ययन में केवल एक समय बिंदु रुचि रखता है।
4. डेटा विश्लेषण
नोट: छवि विश्लेषण फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया जाता है, और मात्रात्मक विश्लेषण विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया जाता है।
- प्लगइन्स मेनू के तहत पंजीकरण में सही 3 डी ड्रिफ्ट कमांड के साथ छवि अधिग्रहण के दौरान किसी भी बहाव को सही करें।
- प्रक्रिया मेनू के तहत घटाएं आदेश के साथ छवि की कैमरा पृष्ठभूमि को हटा दें।
- विश्लेषण मेनू के तहत कोलोकलाइजेशन फ़ंक्शन के साथ पियरसन के सहसंबंध गुणांक का निर्धारण करें।
- तीन अलग-अलग स्थानीय पृष्ठभूमि क्षेत्रों से अनओपन जांच द्वारा उत्पादित प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि को औसत और घटाएं। छवि जे फ्रीहैंड चयन उपकरण के साथ पृष्ठभूमि-घटाए गए छवियों या आरआईसीएम (प्रतिबिंब हस्तक्षेप कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी) छवियों पर कोशिकाओं के आरओआई खींचें। आरओआई की रुचि के किसी भी मीट्रिक को मापें , उदाहरण के लिए, विश्लेषण मेनू (चित्रा 6) के तहत माप उपकरण का उपयोग करके एकीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता और तनाव अधिभोग।
- विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ मात्रात्मक विश्लेषण के लिए माप निर्यात करें।
- किसी भी विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ डेटा प्लॉट करें।
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Representative Results
यहां हम प्रतिनिधि सतह गुणवत्ता नियंत्रण चित्र दिखाते हैं (चित्रा 4)। एक उच्च गुणवत्ता वाली सतह में आरआईसीएम चैनल (चित्रा 4 बी) में एक साफ पृष्ठभूमि होनी चाहिए, और Cy3B चैनल (चित्रा 4 सी) में समान प्रतिदीप्ति तीव्रता होनी चाहिए। एक ही इमेजिंग उपकरण और समान प्रतिदीप्ति इमेजिंग अधिग्रहण स्थितियों के साथ, डीएनए जांच के साथ प्रयोगों का संचालन करते समय पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति तीव्रता हर बार सुसंगत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य होनी चाहिए। हम व्यक्तिगत प्रयोगों के प्रत्येक सेट से पहले सतह गुणवत्ता नियंत्रण के लिए एक मार्कर के रूप में इसका उपयोग करने की सलाह देते हैं।
इस पेपर में हम एक मॉडल सेल प्रकार के रूप में ओटी -1 भोले सीडी 8 + कोशिकाओं के साथ कुछ प्रतिनिधि डेटा (चित्रा 5) दिखाते हैं, जो विशेष रूप से चिकन ओवएल्ब्यूमिन को पहचानते हैं। सीडी 3 एंटीबॉडी को सिस्टम के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में शामिल किया गया है और एक उदाहरण के रूप में आत्मीय एंटीजन पीएमएचसी एन 4 (एसआईआईएनएफईकेएल) का उपयोग किया जाता है। कोशिकाओं को सब्सट्रेट्स पर चढ़ाया गया था जो 4.7 पीएन डीएनए हेयरपिन जांच के साथ कार्यात्मक थे जो या तो एंटीसीडी 3 या पीएमएचसी एन 4 पेश करते थे। 30 मिनट के बाद, आरआईसीएम में फैले सेल और Cy3B चैनल में वास्तविक समय के तनाव को कैप्चर किया गया था, और लॉकिंग स्ट्रैंड को 1 μM की अंतिम एकाग्रता पर पेश किया गया था। तनाव लॉकिंग के समय-अंतराल से पता चला कि हेयरपिन लॉकिंग और सिग्नल संचय के कारण टीसीआर-एंटीसीडी 3 और टीसीआर-पीएमएचसी तनाव सिग्नल दोनों प्रवर्धित हो गए थे। इसके अलावा, टीसीआर-पीएमएचसी एन 4 इंटरैक्शन ने वास्तविक समय (0 मिनट) में कमजोर बल संकेत दिखाया, संभवतः इसके छोटे बंधन जीवनकाल के कारण। लॉकिंग स्ट्रैंड ने इन अल्पकालिक यांत्रिक खींचने की घटनाओं को दर्ज किया, जो मात्रात्मक विश्लेषण की सुविधा प्रदान करता है। इसके अतिरिक्त, लॉकिंग ने टीसीआर-पीएमएचसी बल के पैटर्न का खुलासा किया क्योंकि यह जमा होता है, जो एंटीसीडी 3 नियंत्रण से काफी अलग था और प्रतिरक्षा सिनैप्स के "बैल-आंख" पैटर्न जैसा दिखता था। प्रतिदीप्ति संकेत का परिमाणीकरण चरण 4.4 में वर्णित है। हम आम तौर पर तनाव अधिभोग (संपर्क क्षेत्र पर तनाव संकेत वाले क्षेत्र के प्रतिशत के रूप में परिभाषित) और संचित तनाव का मूल्यांकन करने के लिए मीट्रिक के रूप में प्रत्येक सेल की एकीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता का उपयोग करते हैं जो > 4.7 pN है।
चित्रा 2: ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड तैयारी के उदाहरण। (ए) साइ 3 बी लिगैंड स्ट्रैंड शुद्धिकरण का एचपीएलसी क्रोमैटोग्राम; (ख) उत्पाद का माल्डी-टीओएफ-एमएस स्पेक्ट्रा; (सी) गणना किए गए द्रव्यमान की तालिका और प्रारंभिक सामग्री और लेबल ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड के एम / जेड चोटियों को पाया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: डीएनए तनाव जांच सब्सट्रेट्स और प्रयोग प्रक्रियाओं का कार्यात्मककरण। संबंधित प्रोटोकॉल में चरणों का वर्णन किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: अच्छी गुणवत्ता के साथ डीएनए-तनाव जांच सतह का उदाहरण। (ए) डीएनए तनाव जांच सतह का परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) लक्षण वर्णन; और (बी) आरआईसीएम और (सी) साइ 3 बी चैनल में डीएनए तनाव जांच सतह की कच्ची माइक्रोस्कोपी छवियां। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: एक सफल प्रयोग की कच्ची माइक्रोस्कोपी छवियों का उदाहरण। छवियों में ओटी -1 भोले सीडी 8 + कोशिकाएं दिखाई देती हैं जो (ए) एंटीसीडी 3 और (बी) पीएमएचसी एन 4 के खिलाफ टीसीआर बलों का उत्पादन करती हैं। स्केल बार = 5 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 6: डेटा प्रोसेसिंग और मात्रात्मक विश्लेषण के उदाहरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 7: सफल और असफल सतहों और तनाव मानचित्रण के उदाहरण । (ए) कोशिकाएं जो आरआईसीएम में पीएमएचसी एन 4 सतहों पर फैलने वाली कोशिकाओं की तुलना में नहीं फैलती हैं। (बी) ओटी -1 सेल जो फैल गया लेकिन कम डीएनए तनाव जांच घनत्व के साथ एंटीसीडी 3 सतह पर कोई तनाव संकेत उत्पन्न नहीं किया। (सी) चित्र दिखा रहा है कि सफल सतह पीला गुलाबी है, और असफल सतह रंगहीन है। (डी) Cy3B चैनल में छवि एक पुराने डीएनए स्टॉक से फ्लोरोसेंट समुच्चय दिखाती है। (ङ) आरआईसीएम चैनल और साइ3बी चैनल में पैटर्न जो या तो अपर्याप्त धुलाई या चरणों के बीच आकस्मिक सतह सूखने के कारण होने की संभावना है। (एफ) आरआईसीएम और साइ 3 बी चैनलों में छवियां विभिन्न आकारों के एयू एनपी का उपयोग करने के प्रभाव को दर्शाती हैं। (जी) ओटी -1 कोशिकाओं की आरआईसीएम और साइ 3 बी छवियां जो तनाव संकेतों को नहीं बढ़ाती हैं बल्कि इसके बजाय डीएनए को कम करती हैं। स्केल बार = 5 μm। ध्यान दें कि यहां दिखाए गए कच्चे डेटा को 3 माइक्रोस्कोप से अलग-अलग छवि अधिग्रहण सेटिंग्स के साथ विभिन्न समूह के सदस्यों द्वारा एकत्र किया गया था, इस प्रकार अलग-अलग प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि स्तर थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
यहां प्रदान की गई विस्तृत प्रक्रियाओं के साथ, कोई भी प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा उत्पादित रिसेप्टर तनाव को मैप और मात्रा निर्धारित करने के लिए डीएनए हेयरपिन तनाव जांच सब्सट्रेट तैयार कर सकता है। जब कोशिकाओं को डीएनए हेयरपिन तनाव जांच सब्सट्रेट पर चढ़ाया जाता है, तो वे उतरते हैं, संलग्न होते हैं, और फैलते हैं क्योंकि रिसेप्टर्स रासायनिक और यांत्रिक रूप से लिगेंड को समझते हैं, जिनमें से बाद में हमारी जांच द्वारा पता लगाया जाता है। हालांकि, कुछ मामलों में कोशिकाएं फैलने में विफल हो सकती हैं (चित्र 7A) या तनाव संकेत उत्पन्न करने में विफल। यह अक्सर सतह रसायन विज्ञान के मुद्दों का एक परिणाम होता है और इसके लिए समस्या निवारण (तालिका 1). कम लिगैंड घनत्व सबसे आम मुद्दों में से एक है जिसके परिणामस्वरूप सेल प्रसार की विफलता होती है। यह कई कारकों का परिणाम हो सकता है, जैसे कि अवक्रमित लिगैंड, अवक्रमित डीएनए किस्में, एपीटीईएस और / या एलए-पीईजी-एनएचएस जैसे हाइड्रोलाइज्ड अभिकर्मक, एकत्रित सोने के नैनोकणों, या अपर्याप्त ग्लास कवरस्लिप सफाई। सफल प्रयोगों और असफल प्रयोगों (चित्र 7B), कोई भी समस्या के स्रोत का जल्दी से आकलन कर सकता है। उदाहरण के लिए, पृष्ठभूमि माप से मजबूत प्रतिदीप्ति संकेत वाली सतहों से संकेत मिलता है कि डीएनए जांच का स्थिरीकरण सफल था। कम पृष्ठभूमि की तीव्रता स्ट्रेप्टाविडिन और बायोटिनीलेटेड लिगैंड को जोड़ने से पहले तैयारी के चरणों में मुद्दों का सुझाव देती है। यदि समस्या लिगैंड के कारण होती है, तो सेल आसंजन के परीक्षण के लिए 10 μg / mL पर 96-वेल प्लेट में ग्लास स्लाइड या कुओं पर कोटिंग करके इसकी गुणवत्ता की जांच की जा सकती है। यह पीएमएचसी लिगेंड और एंटी-सीडी 3 एंटीबॉडी के लिए लिगैंड गतिविधि का एक उपयोगी कार्यात्मक परीक्षण है। एयू एनपी इनक्यूबेशन चरण के बाद कार्यात्मक कवरलिप्स के रंग परिवर्तन (पीला गुलाबी) को देखकर, कोई यह आकलन कर सकता है कि समस्या डीएनए क्षरण के कारण होती है इनक्यूबेशन या डीएनए (चित्र 7C). डीएनए स्ट्रैंड गुणवत्ता को एचपीएलसी और माल्डी-टीओएफ-एमएस के साथ मान्य किया जा सकता है, जिसमें एक एकल डीएनए नमूना अवक्रमित होने पर कई चोटियों को दिखाएगा। निर्माता द्वारा प्रदान किए गए लक्षण वर्णन के साथ यूवी-विस स्पेक्ट्रा और टीईएम छवियों की तुलना करके एयू एनपी की गुणवत्ता की पुष्टि की जा सकती है। यदि लिगैंड, डीएनए स्ट्रैंड्स और एयू एनपी की गुणवत्ता मान्य है और ये अभिकर्मक सतह के मुद्दे का कारण नहीं बनते हैं, तो हम एपीटीईएस, एलए-पीईजी-एनएचएस, सल्फ्यूरिक एसिड और एच सहित अभिकर्मकों को बदलने की सलाह देते हैं।2O2 सतह रसायन विज्ञान मुद्दे के कारण का सटीक पता लगाने के लिए समय बिताने के बजाय भविष्य की सतह की तैयारी के लिए। कम घनत्व वाली समस्या को छोड़कर जो डीएनए जांच सब्सट्रेट की एक बड़ी विफलता का कारण बनेगी, कुछ मामूली मुद्दे हैं जो डेटा की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं। चूंकि सतह की तैयारी में कई इनक्यूबेशन चरण होते हैं, इसलिए सतह की तैयारी के दौरान उपयोग किए जाने वाले बफर को ताजा, फ़िल्टर किया जाना चाहिए, और संदूषण से बचने के लिए भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाना चाहिए। यदि कोई सतह दूषित है, तो यह आरआईसीएम चैनल में दिखाई देगी और इसके परिणामस्वरूप एक अजीब प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि हो सकती है। संदूषण के अलावा, समय के साथ डीएनए स्टॉक समाधान में समुच्चय बन सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप Cy3B चैनल (चित्र 7D). आमतौर पर, कुछ समुच्चय डेटा की गुणवत्ता को प्रभावित नहीं करेंगे; हालांकि, यदि कोई सेल ऐसे दोषों वाले क्षेत्रों पर उतरता है, तो डेटा विश्लेषण कम विश्वसनीय होता है। कभी-कभी, तनाव मानचित्रण को प्रभावित करने वाले अनियमित पैटर्न आरआईसीएम और साइ 3 बी चैनलों दोनों में देखे जा सकते हैं, जो एपीटीईएस चरण के बाद अपर्याप्त धोने, या सतह पर सोने के कणों के कार्यात्मक होने के बाद चरणों के दौरान सतह के आकस्मिक सूखने से आ सकते हैं (चित्र 7E). ये पैटर्न तनाव मैपिंग को प्रभावित कर सकते हैं जो इस बात पर निर्भर करता है कि यह कितना गंभीर है। एंटीबॉडी या पीएमएचसी जैसे अपेक्षाकृत कीमती अभिकर्मकों को बचाने के लिए, हम एंटीबॉडी / लिगैंड के साथ डीएनए हेयरपिन तनाव जांच के कार्यात्मककरण से पहले हमेशा सतह की गुणवत्ता (2.2.1 और 3.3 देखें) की जांच करने की सलाह देते हैं। यद्यपि यह सतह तैयारी प्रोटोकॉल हमारे हाथों में मजबूत और विश्वसनीय रहा है, ध्यान दें कि यह हमेशा कुछ चरणों में परिवर्तन को बहुत अच्छी तरह से सहन नहीं करता है। उदाहरण के लिए, जब पिरान्हा नक़्क़ाशी के बजाय आधार और प्लाज्मा नक़्क़ाशी का उपयोग किया जाता है, तो यह बहुत संभावना है कि जांच घनत्व कम हो जाता है, और अधिक सतह दोष मौजूद होते हैं। एयू एनपी आकार और कैपिंग अभिकर्मकों के परिवर्तन संभवतः सतह कार्यात्मकता परिणामों (चित्र 7F). उदाहरण के लिए, हमने पाया है कि 5 और 10 एनएम एयू एनपी लिपोइक एसिड संशोधित सतहों को बहुत अच्छी तरह से बांधते नहीं हैं, जिसके परिणामस्वरूप सतह की तैयारी के बाद न्यूनतम डीएनए होता है। हालांकि, 8.8 एनएम और 13 एनएम एयू एनपी बहुत अधिक घनत्व पर लिपोइक एसिड सतहों से बंध सकते हैं, जो आरआईसीएम (खुरदरापन), और साइ 3 बी चैनल (प्रतिदीप्ति तीव्रता) में देखा गया है।
एक बार जब डीएनए हेयरपिन तनाव जांच अच्छी गुणवत्ता की सतह तैयार हो जाती है, तो कोई भी रुचि की कोशिकाओं के साथ प्रयोग कर सकता है और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ डेटा प्राप्त कर सकता है। वास्तविक समय के तनाव को एक उच्च एनए (संख्यात्मक एपर्चर) उद्देश्य और ईएमसीसीडी से लैस एक साधारण प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ कैप्चर किया जा सकता है। हालांकि, ध्यान दें कि हमने देखा है कि प्राथमिक टी कोशिकाएं कभी-कभी उस विशेष माउस की स्थितियों के कारण डीएनए तनाव जांच सतहों पर कलाकृतियों को प्रदर्शित करती हैं। उपाख्यानात्मक रूप से, ऐसी कलाकृतियों को पुराने चूहों के साथ होने की अधिक संभावना है। उदाहरण के लिए, हमने टर्न-ऑन फ्लोरेसेंस सिग्नल (चित्रा 7 जी) के बजाय प्रतिदीप्ति की नकारात्मक कमी देखी है। इस मामले में, प्रयोग को समाप्त करें और कोशिकाओं के एक नए बैच के साथ फिर से करें। रिसेप्टर बलों के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए गैर-फ्लोरोसेंट लॉकिंग स्ट्रैंड का उपयोग करने से पहले, तनाव संकेत भंडारण और मिटाने को फ्लोरोसेंट एटो 647 एन लॉकिंग स्ट्रैंड के साथ पुष्टि करने की आवश्यकता है। 10 मिनट के लिए प्रारंभिक लॉकिंग के बाद, Atto647N सिग्नल को Cy3B सिग्नल के साथ दृढ़ता से सह-स्थानीयकृत किया जाना चाहिए, क्योंकि यह इस इनक्यूबेशन के दौरान तनाव इतिहास को दर्शाता है। जैसा कि Cy3B सिग्नल न केवल तनाव इतिहास को दर्शाता है, बल्कि लॉकिंग स्ट्रैंड को हटाने के बाद वास्तविक समय बलों को भी दर्शाता है, यह संभव है कि Cy3B सिग्नल का एक छोटा उप-समूह Atto647N सिग्नल (चित्रा 3J) के साथ नहीं है। तनाव के अधिक मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, हम एक गैर-फ्लोरोसेंट लॉकिंग स्ट्रैंड का उपयोग करने की सलाह देते हैं जो Cy3B और Atto647N के बीच संभावित ऊर्जा हस्तांतरण को समाप्त कर देगा, साथ ही छवि अधिग्रहण के बीच अतिरिक्त धोने से बचेगा। ध्यान दें कि लॉकिंग स्ट्रैंड के अलावा अनिवार्य रूप से थोड़ी प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि में वृद्धि होगी, क्योंकि थर्मोडायनामिक्स हेयरपिन और लॉकिंग स्ट्रैंड के बीच कुछ मामूली संकरण को चलाएगा, जिसे परिमाणीकरण से पहले घटाया जा सकता है। एक निश्चित रिसेप्टर द्वारा उत्पन्न बल का अध्ययन करने के लिए लॉकिंग प्रक्रिया के बाद प्रत्येक सेल की एकीकृत तीव्रता की मात्रा निर्धारित की जा सकती है। इसके अतिरिक्त, लॉकिंग के कैनेटीक्स संभवतः 2 डी के ऑन और केको एक रिसेप्टर से उसके लिगैंड में दर्शाते हैं।
| समस्या | संभावित कारण | घोल |
| एयूएनपी इनक्यूबेशन के बाद सतह ें गुलाबी नहीं होती हैं | अपर्याप्त नक़्क़ाशी | पिरान्हा नक़्क़ाशी के बाद एक बेस-एचिंग स्टेप शामिल करें। सोनिकेशन के साथ 1 घंटे के लिए आइस-बाथ में 0.5 मीटर केओएच में एच कवर स्लिप। |
| एपीटीईएस हाइड्रोलाइज्ड है। | नए APTES का उपयोग करें | |
| एनएचएस अभिकर्मकों हाइड्रोलाइज्ड होते हैं। | नए पीईजी-एनएचएस अभिकर्मकों का उपयोग करें | |
| पीईजी-एनएचएस अभिकर्मकों को सतहों पर जोड़ने से पहले हाइड्रोलाइज्ड किया जाता है। | तेजी से काम करें | |
| एयू एनपी ने | नए AU NP का उपयोग करें | |
| कवरलिप्स पर अवशेष पानी ने एयू एनपी को पतला कर दिया। | सुनिश्चित करें कि एयू एनपी जोड़ने से पहले कोई / थोड़ा पानी अवशेष नहीं है | |
| कोशिकाएं सतह पर नहीं फैलती हैं। | कम डीएनए जांच घनत्व | यदि सतह ें गुलाबी नहीं हैं, तो ऊपर वर्णित समस्या निवारण करें। यदि एयू एनपी कार्यात्मकता सामान्य है, तो नए डीएनए को संश्लेषित और उपयोग करें। |
| कम लिगैंड घनत्व | नए स्ट्रेप्टाविडिन और लिगैंड अभिकर्मकों का उपयोग करें | |
| कोशिकाएं लिगैंड पर नहीं फैलती हैं। | लिगैंड-लेपित सतह पर सेल फैलने की जांच करें, यदि कोशिकाएं अभी भी नहीं फैलती हैं, तो रेफ में वर्णित अणुओं का पालन करना शामिल है। | |
| कोशिकाएं अच्छी तरह से फैलती हैं लेकिन एंटीबॉडी नियंत्रण के साथ भी कोई तनाव संकेत या केवल बहुत कमजोर तनाव संकेत नहीं देखा जाता है। | रिसेप्टर-लिगैंड इंटरैक्शन में बल संचरण नहीं होता है। | ना |
| बल अल्पकालिक होता है या बल संकेत विरल होते हैं। | लॉकिंग ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड का उपयोग करें | |
| सतह अच्छी तरह से पारित नहीं है | सल्फो-एनएचएस एसीटेट शंख को 10 मिलीग्राम / एमएल तक बढ़ाएं। | |
| Atto647N में कोई लॉकिंग सिग्नल नहीं देखा गया है। | ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड खराब हो गया है | माल्डी-टीओएफ-एमएस के साथ जाँच करें |
| लॉकिंग सिग्नल रियल-टाइम जांच के साथ एंटी-स्थानीयकृत है | रिसेप्टर बल लॉकिंग न्यूक्लियोटाइड की कार्य सीमा से अधिक है। | जैसा कि वर्णित है, रेफरी 12 से 19 पीएन रीयल-टाइम हेयरपिन जांच का उपयोग करें। |
तालिका 1: डीएनए-आधारित तनाव जांच प्रणाली के साथ समस्या निवारण।
यांत्रिक सूचना भंडारण का अनुप्रयोग प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा उत्पन्न रिसेप्टर बलों के मानचित्रण के लिए विशेष रूप से उपयोगी है, जो अक्सर क्षणिक और कम प्रचुर मात्रा में होते हैं। जैसा कि एकल-अणु स्पेक्ट्रोस्कोपी माप द्वारा निर्धारित किया गया है, पीक बॉन्ड जीवनकाल को ~ 10 pN बल के आवेदन के साथ देखा जाता है, जिसका जीवनकाल 100 मिलीसेकंड से कम से लेकर कई सेकंड लंबा होता है। इस तरह के छोटी अवधि के बॉन्ड पारंपरिक डीएनए हेयरपिन टेंशन प्रोब इमेजिंग15 के साथ पकड़ना मुश्किल है। इस यांत्रिक भंडारण प्रणाली का एक और उपयोग तब होता है जब सेल की सतह16 पर ब्याज के रिसेप्टर का घनत्व अपेक्षाकृत कम होता है, जिसके परिणामस्वरूप एक विरल संकेत होता है जो अक्सर पारंपरिक डीएनए हेयरपिन तनाव जांच के साथ पृष्ठभूमि से अलग करना मुश्किल होता है। इस तरह के कम घनत्व वाले रिसेप्टर बलों को इस रणनीति के साथ संचित तनाव मानचित्रण द्वारा प्रकट किया जा सकता है। ध्यान दें कि हम विशेष रूप से प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए इस रणनीति के आवेदन को सीमित करते हैं, क्योंकि प्रतिरक्षा कोशिकाओं में मौजूद बलों को फाइब्रोब्लास्ट या प्लेटलेट्स (56 pN तक या उससे अधिक) 12,13,15 में इंटीग्रिन की तुलना में निचले शासन (TCR < 19 pN) में जाना जाता है। कारण यह है कि ऑप्टिकल ट्वीज़र्स माप के अनुसार लोड 20 pN से कम होने पर संकरण दर स्थिर khyb बिगड़ा नहीं है, जो 106 M-1 S-1 की सीमा में है। इसके अलावा, 20 pN < बलों के तहत k hyb को शून्य बल पर khyb की तुलना में थोड़ा अधिक होने की भविष्यवाणी की जाती है, क्योंकि कमजोर बल पूरक स्ट्रैंड को17 के साथ संकरण करने के लिए स्ट्रैंड को संरेखित करने में मदद करता है। दूसरी ओर, संकरण में बाधा डालने के लिए बड़े बलों की उम्मीद की जाती है, क्योंकि केऑफ बढ़ता है और संकरण के लिए एक बाधा पैदा करताहै। 15-17 न्यूक्लियोटाइड लंबे लॉक के लिए, हम अनुमान लगाते हैं कि 27.8 से 30.8 पीएन के आसपास एक बल संकरण में बाधा डालेगा। इन सीमाओं को देखते हुए, हम प्रतिरक्षा सेल रिसेप्टर बलों की जांच में विशेष रूप से इस विधि को लागू करने का सुझाव देते हैं। इसके अतिरिक्त, लॉकिंग स्ट्रैंड की उपस्थिति हेयरपिन के सामने आने के लिए ऊर्जा परिदृश्य को झुकाने की संभावना है, जो प्रभावी एफ1/2 को थोड़ा कम कर सकती है।
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Disclosures
लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।
Acknowledgments
इस काम को एनआईएच ग्रांट्स आर 01 जीएम 131099, एनआईएच आर 01 जीएम 124472 और एनएसएफ करियर 1350829 द्वारा समर्थित किया गया था। हम पीएमएचसी लिगेंड के लिए एनआईएच टेट्रामर सुविधा को धन्यवाद देते हैं। इस अध्ययन को आंशिक रूप से, एमोरी कॉम्प्रिहेंसिव ग्लाइकोमिक्स कोर द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-hydroxypicolinic acid (3-HPA) | Sigma | 56197 | maldi-TOF-MS matrix |
| mPEG-SC | Biochempeg | MF001023-2K | surface prep |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Acros | AC430941000 | surface prep |
| 10x Red blood cell lysis buffer | Biolegend | 00-4333-57 | buffer |
| 8.8 nm gold nanoparticles, tannic acid | Nanocomposix | customized order | surface prep |
| Atto647N NHS ester | Sigma | 18373-1MG-F | fluorophore, oligo prep |
| Attofluor Cell Chamber, for microscopy | Thermo Fisher Scientific | A7816 | imaging |
| BD Syringes only with Luer-Lok | BD bioscience | 309657 | cells |
| biotinylated anti-mouse CD3e | ebioscience | 13-0031-82 | antibody/ligand |
| Biotinylated pMHC ovalbumin (SIINFEKL) | NIH Tetramer Core Facility at Emory University | NA | antibody/ligand |
| bovine serum albumin | Sigma | 735078001 | block non-specific interactions |
| Cell strainers | Biologix | 15-1100 | cells |
| Coverslip Mini-Rack, teflon | Thermo Fisher Scientific | C14784 | surface prep |
| Cy3B NHS ester | GE Healthcare | PA63101 | fluorophore, oligo prep |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CM | buffer |
| ethanol | Sigma | 459836 | surface prep |
| Hank’s balanced salts (HBSS) | Sigma | H8264 | buffer |
| hydrogen peroxide | Sigma | H1009 | surface prep |
| LA-PEG-SC | Biochempeg | HE039023-3.4K | surface prep |
| Midi MACS (LS) startup kit | Miltenyi Biotec | 130-042-301 | cells |
| mouse CD8+ T cell isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-104-075 | cells |
| Nanosep MF centrifugal devices | Pall laboratory | ODM02C35 | oligo prep |
| No. 2 round glass coverslips | VWR | 48382-085 | surface prep |
| NTA-SAM | Dojindo Molecular Technologies | N475-10 | surface prep |
| P2 gel | Bio-rad | 1504118 | oligo prep |
| sufuric acid | EMD Millipore Corporation | SX1244-6 | surface prep |
| Sulfo-NHS acetate | Thermo Fisher Scientific | 26777 | surface prep |
| Equipment | |||
| Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 column, 4.6 x 150 mm, 2.7 μm | 653950-702 | oligonucleotide preparation | |
| Barnstead Nanopure water purifying system | Thermo Fisher | water | |
| CFI Apo 100× NA 1.49 objective | Nikon | Microscopy | |
| Cy5 cube | CHROMA | Microscopy | |
| evolve electron multiplying charge coupled device (EMCCD) | Photometrics | Microscopy | |
| High-performance liquid chromatography | Agilent 1100 | oligonucleotide preparation | |
| Intensilight epifluorescence source | Nikon | Microscopy | |
| Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS) | Voyager STR | oligonucleotide preparation | |
| Nanodrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher | oligonucleotide preparation | |
| Nikon Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | Microscopy | |
| Nikon Perfect Focus System | Nikon | Microscopy | |
| NIS Elements software | Nikon | Microscopy | |
| quad band TIRF 405/488/561/647 cube | CHROMA | Microscopy | |
| RICM cube | CHROMA | Microscopy | |
| TIRF launcher with 488 nm (50 mW), 561 nm (50 mW), and 640 nm | Coherent | Microscopy | |
| TRITC cube | CHROMA | Microscopy | |
| oligo name | 5' modification / 3' modification | sequence (5' to 3') | Use |
| 15mer amine locking strand | 5' modification: no modification 3' modification: /3AmMO/ |
AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA | locking real-time tension signal |
| 15mer Atto647N locking strand | 5' modification: Atto647N 3' modification: /3AmMO/ |
AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA | locking real-time tension signal |
| 15mer non-fluoresccent locking strand | 5' modification: no modification 3' modification: no modification |
A AAA AAC ATT TAT AC | locking real-time tension signal for quantitative analysis |
| 4.7 pN hairpin strand | 5' modification: no modification 3' modification: no modification |
GTGAAATACCGCACAGATGCGT TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC CAGC |
hairpin probe |
| amine ligand strand | 5' modification: /5AmMC6/ 3' modification: /3Bio/ |
CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT | hairpin probe |
| BHQ2 anchor strand | 5' modification: /5ThiolMC6-D/ 3' modification: /3BHQ_2/ |
TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT | hairpin probe |
| Cy3B ligand strand | 5' modification: Cy3B 3' modification: /3Bio/ |
CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT | hairpin probe |
| unlocking strand | 5' modification: no modification 3' modification: no modification |
TAG GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT C | unlocking accumulated tension signal |
References
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