Summary
פרוטוקול זה מתאר את השימוש בטכניקת אולטרסאונד משופרת כדי לבחון ולכומת באופן לא פולשני שינויים ברקמת הכבד במודלים מכרסמים של מחלת כבד שומני לא אלכוהולי.
Abstract
Steatohepatitis nonalcoholic (NASH) הוא מצב בתוך הספקטרום של מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD), המאופיינת על ידי הצטברות שומן בכבד (steatosis) ודלקת המובילה פיברוזיס. מודלים פרה-קליניים מקרוב recapitulating אדם NASH / NAFLD חיוניים בפיתוח תרופות. בעוד ביופסיה בכבד היא כיום תקן הזהב למדידת התקדמות ואבחון NAFLD / NASH במרפאה, במרחב פרה קליני, או אוסף של דגימות כבד שלם בנקודות זמן מרובות במהלך מחקר או ביופסיה של הכבד נדרש לניתוח היסטולוגי כדי להעריך את שלב המחלה.
ביצוע ביופסיה בכבד באמצע המחקר הוא הליך פולשני ואינטנסיבי, ואיסוף דגימות כבד להערכת רמת המחלה מגדיל את מספר חיות המחקר הדרושות למחקר. לכן, יש צורך אמין, מתורגם, סמן ביולוגי הדמיה פולשנית כדי לזהות NASH / NAFLD במודלים פרה-אקליניים אלה. תמונות לא פולשניות מבוססות אולטרסאונד B-מצב ואלסטוגרפיה גל גחל גחל (SWE) ניתן להשתמש כדי למדוד סטאטוזיס, כמו גם פיברוזיס בכבד. כדי להעריך את התועלת של SWE במודלים מכרסמים פרה-קליניים של NASH, בעלי חיים הונחו על דיאטה פרו-NASH ועבר אולטרסאונד לא פולשני B-mode ו גל גיסת אלסטוגרפיה הדמיה כדי למדוד את מדד hepatorenal (HR) וגמישות הכבד, מדידת התקדמות של הצטברות שומן בכבד נוקשות רקמות, בהתאמה, בנקודות זמן מרובות במהלך מחקר NAFLD נתון NAFLD / NASH.
מדד משאבי האנוש ומספרי הגמישות הושוו לסמנים היסתולוגיים של סטאטוזיס ופיברוזיס. התוצאות הראו מתאם חזק בין מדד משאבי אנוש לבין אחוז כתמי O אדום שמן (ORO), כמו גם בין גמישות לבין פיקרו-סיריוס אדום (PSR) כתמים של כבדים. המתאם החזק בין שיטות ex vivo קלאסיות ותוצאות הדמיה in vivo מספק ראיות כי אלסטוגרפיה גל גחלי / הדמיה מבוססת אולטרסאונד ניתן להשתמש כדי להעריך פנוטיפ המחלה והתקדמות במודל פרה-אקליני של NAFLD / NASH.
Introduction
מחלת כבד שומני ללא אלכוהול (NAFLD) היא מצב מטבולי המאופיין על ידי הצטברות מופרזת של שומן בכבד והוא הופך במהירות למחלה כבד מובילה ברחבי העולם עם שכיחות גלובלית שדווחה לאחרונה של 25%1. steatohepatitis ללא אלכוהול (NASH) הוא שלב מתקדם יותר של הספקטרום של NAFLD, המאופיין עודף שומן בכבד עם נזק תאי מתקדם, דלקת, פיברוזיס. מחלות אלה הן לעתים קרובות שקטות, מבלי שיבחינו בהן באמצעות בדיקות דם או בדיקות שגרתיות, עד שכבר נגרם נזק ניכר לכבד של המטופל. נכון לעכשיו, תקן הזהב לאבחון NASH בחולים הוא באמצעות בדיקה היסתולוגית של דגימות ביופסיה בכבד שמקורן בחולה. באופן דומה, חוקרים פרה-קליניים שעובדים כדי להבין את הפתוגנזה של NASH / NAFLD, כמו גם את תעשיית פיתוח התרופות להסתמך על ביופסיה טריז vivo של דגימות כבד או המתת חסד סופנית של קבוצות לווין עבור היסטולוגיה למדוד סטאטוזיס, דלקת, פיברוזיס.
לדוגמה, ביופסיה טריז בכבד כבר טכניקה סטנדרטית להערכת steatohepatitis ופיברוזיס בעת שימוש ב GUBRA NASH מודל2. שיטת הביופסיה של טריז הכבד היא פולשנית ומייגעת בבעלי חיים קטנים3. השימוש ביופסיה כבד טריז באמצע מחקר מייצג משתנה ניסיוני נוסף במודל המחלה, אשר לעתים קרובות מגדיל את מספר בעלי החיים הדרושים. עם גורמים אלה בחשבון, טכניקות הדמיה לא פולשניות שניתן להשתמש בהן כדי להעריך באופן אמין סטאטוזיס ופיברוזיס במודלים בעלי חיים NASH / NAFLD בנקודות זמן מוקדמות להוכיח ערך. אלסטוגרפיה גל הגה (SWE) היא שיטה מבוססת אולטרסאונד המשמשת למדידת האלסטיות של רקמות רכות. הטכניקה מודדת את התפשטות גלי הגיהה שנוצרו על ידי פולסים אולטרסאונד על קוליים המכוונים ליעד רקמה, ולאחר מכן מחשבת ערך הנקרא E modulus4. מהירות גל הגיוע היא פרופורציונלית לדרגת נוקשות הרקמות.
איור 1 ואיור 2 מציגים את הגדרת אזור ההדמיה ואת מכשיר ה-SWE. מכשיר SWE הוא יחידה אחת עם גלגלים עם שני מסכים ולוח בקרה המוצג באיור 2A. הצג העליון (איור 2B) פועל כצג המחשב ומציג תמונות וספריות מטופלים. לוח הבקרה(איור 2C)הוא מערך של לחצנים וחוגים השולטים בהיבטים כלליים של לכידת תמונה: הקפאת מסך, שמירת תמונות, מעבר ממצב אחד למשנהו. המסך התחתון(איור 2D)הוא מסך מגע עם פקדים נוספים לשינוי הגדרות ופועל כלוח מקשים כדי להזין נתונים לפי הצורך. המכשיר מצויד בעט אלקטרוני לשימוש על מסך המגע אם תרצה. בדיקות אולטרסאונד לצרף ללוח הקדמי התחתון של המכשיר. עבור B-מצב ו- SWE הדמיה מכרסמים, מתמר סופר ליניארי 6 עד 20 MHz שימש. יכולת זו למדוד נוקשות רקמות באופן לא פולשני הופכת את SWE לכלי בעל ערך לזיהוי ובימוי של פיברוזיס בכבד5 בחולי NASH, מה שמפחית את הצורך בשיטות פולשניות יותר. SWE, למעשה, שימש למדידת פיברוזיס בכבד בחולים והיא שיטה שאושרה על ידי ה-FDA כדי ציון פיברוזיס במרפאה6. שימוש ב- SWE כדי לעקוב אחר התקדמות NASH במודלים של בעלי חיים של המחלה יספק כלי תרגום לפיתוח טיפולים ובמקביל לשפר את רווחת בעלי החיים באמצעות הפחתת מספרי נושא בעלי חיים ועידון של נהלי in vivo כדי למזער כאב ומצוקה.
דימות SWE בחולים אנושיים משתמש מתמראולטרסאונדבתדר נמוך 4 , אשר אינו אידיאלי עבור בעלי חיים קטנים. ראוי לציין, טכניקות SWE בתדר גבוה שימשו כדי להעריך את היעילות של עיכוב קרבוקסילאז אצטיל-CoA על פתוגנזה של NASH במודל חולדה7, ואת התועלת של טכניקה זו תוארה מודלים חולדת פחמן טטרכלוריד של פיברוזיס הכבד עם תוצאות מוצלחות בהשוואה לשיטות ניקוד היסטולוגי METAVIR המסורתי8. עם זאת, הספרות הקיימת חסרה טכניקה מפורטת ומידע מתודולוגיה על היישום של הדמיית SWE במודלים פרה-אקליניים של NASH. כפי שתואר לעיל, סטאטוזיס הכבד הוא אחד המאפיינים העיקריים של מצב NAFLD / NASH והוא שלב חשוב שבו התערבות יכולה להיחשב. לכן, הערכת הצטברות שומן בכבד באמצעות שיטת הדמיה חשובה כמו הערכת פיברוזיס בכבד במודלים פרה-אקליניים של NASH / NAFLD.
טכניקת אולטרסאונד המכונה מדד משאבי אנוש, יחס של בהירות הרקמה של הכבד לעומת זה של קליפת הכליה, שימש כסמן פונדקאי של סטאטוזיס במרפאה9,10. גישה זו, עם זאת, לא נעשה שימוש נרחב במודלים פרה-אקליניים בעלי חיים של NAFLD / NASH. מאמר זה מתאר שיטה של מדידת גמישות, כמו גם את מדד משאבי אנוש כסמן פונדקאי של פיברוזיס הכבד וסטיאטוזיס, בהתאמה, במודל חולדה דיאטה לקויה כולין, עתיר שומן (CDAHFD) של NAFLD / NASH. מודל זה מעורר סטאטוזיס מהיר, דלקת בכבד, פיברוזיס, אשר ניתן למדידה בתוך 6 שבועות בעכברים11. תוספת של כולסטרול (1%) לתזונה זו הוכח לקדם פירגנזה בחולדות12, מה שהופך מודל זה מועמד מתאים למחקרי אימות מעורבים הדמיית גל גזלה. בסך הכל, טכנולוגיית הדמיה זו יכולה להיות מיושמת גם על מגוון רחב של מודלים / דיאטות NASH שבו סטאטוזיס ו / או פיברוזיס הוא נקודת קצה של עניין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים המעורבים בבעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים של פייזר (IACUC) ונערך במתקן AAALAC (הערכה והסמכה של טיפול בבעלי חיים במעבדה) מתקן מוסמך בינלאומי.
1. אינדוקציה למחלות
- השתמש בחולדות ויסטר האן זכר (150-175 גרם; ~ 6-7 שבועות; סה"כ 40 חולדות) כי הם ללא פתוגנים הרפתקניים חולדה ידועה. לשכן את החולדות בזוגות ב החלפה מאווררת בנפרד עם מצעים נייר (ראה שולחן החומרים)ולשמור אותם ב 22 ± 1 °C (70%, 40-70% לחות יחסית עם מחזור 12:12 שעות בהיר כהה.
- מניחים את החולדות במשקל 150-175 גרם (~ 6-7 שבועות) על דיאטה לקויה כולין, עתיר שומן עם 1% כולסטרול (n = 20) או צ'או מכרסם מעבדה סטנדרטי (n = 20) בהתאם לעיצוב המחקר.
הערה: במחקר זה, בסך הכל 40 חולדות נרשמו עם 20 בעלי חיים לכל קבוצה. בסוף השבועהשישי, מחצית מהקבוצה מכל קבוצה נמקה לניתוח היסטולוגי באמצע המחקר של דגימות כבד. לפיכך, גודל המדגם היה 10 בעלי חיים לכל קבוצה עבור נקודות הזמן של9 ו-12 בשבוע.
2. התקנת מכשיר
- הגדירו את אזור ההדמיה כדלקמן: כלול משטח מחומם כדי לשמור על חמימות החיה במהלך ההדמיה (c באיור 1), וחרוט אף הרדמה מאובטח כדי לספק הרדמה נדיפה כדי לשמור על מישור של הרדמה לאורך כל ההליך (b באיור 1).
- השתמש מחזיק בדיקה אולטרסאונד כדי להקל על העברת בדיקה אולטרסאונד למיקום הרצוי כדי למנוע את הבדיקה ממנוחה על החיה.
- השתמש ג'ל אולטרסאונד מחומם על העור שבו תמונת אולטרסאונד נרכשת.
- שמור על ההגדרות הבאות לאורך כל ההליך, אשר ניתן להתאים על מסך המגע: כוח אקוסטי 0.0 dB; טיונר רקמות 1540 מ'/ש'; טווח דינמי 60 dB; טווח גמישות (למצב SWE) < 30 kPa.
- חברו את בדיקת האולטרסאונד למערכת הרכבות במחזיק המיוחד (א' באיור 1).
- תדליק את המכשיר ותאפשר לו לאתחל. לאחר הפעלת הצג, שים לב לתמונת מצב B עם פרטי מתמר מחוברים.
3. הכנת נושא
- ודא שבעלי החיים צמים לפחות 4 שעות לפני הליך ההדמיה כדי למנוע מתוכן המעיים להפריע לרכישת תמונות.
- לאחר לפחות 4 שעות של צום, מניחים חולדה בתא אינדוקציה הרדמה איזופלוריין עד לרמה מתאימה של הרדמה הוא הגיע, אישר על ידי שום תגובה לצבוט בוהן. לחשוף את בעלי החיים 3-5% איזופלוראן במשך 3-5 דקות כדי לגרום להרדמה.
- להרדמה תחזוקה, לשמור על בעלי החיים תחת 2-3% איזופלוראן במהלך רכישת תמונה. יש למרוח משחה עיניים כדי להגן על העין מפני ייבוש במהלך ההרדמה.
- לאחר הרדמה הושגה, להסיר בעל חיים מתא האינדוקציה ולהניח אותו על שמיכה מים חמים חמים במחזור. מניחים חרוט אף הרדמה על חוטם, ומגלחים את החיה בצד ימין שלה, מבית החזה לאגן. השתמש קרם depilation כימי כדי להסיר את כל השיער הנותר באזור זה.
- לאחר הסרת השיער, הניחו בעל חיים בנסיגה רוחבית שמאלית עם כפות רגליים עליונות מודבקות מעל הראש על משטח הדמיה חם(איור 3A).
- הקש על מקש המטופל בלוח הבקרה של המכשיר, וזיהה את הנושא בהתאם לעיצוב המחקר.
- פתח את הפונקציה Keyboard בכלי על-ידי הקשה על הסמל במסך המגע. הקלד את השמות כרצונך.
- הקש על יציאה כדי לצאת ממסך שם המטופל. שים לב שמצב B נפתח מחדש בצג.
4. רכישת תמונה למדידת מדד hepato-כליות (HR)
- החל כמות קטנה של ג'ל אולטרסאונד מחומם על אזור העור depilated על החיה.
- הזז את בדיקת האולטרסאונד כדי לגעת באזור המכוסה בג'ל של הנושא(איור 3B). לאחר תמונה חיה במצב B של האיברים הפנימיים של הנושא מופיעה על הצג, להעביר את הבדיקה אולטרסאונד לאזור מעט מעל הירך, רק במקביל לחוליות המותני (מישור קשת).
- באמצעות תצוגת מצב B על הצג, אתר את הכליה הימנית על ידי זיהוי עורק הכליות הגדול והפרדת קליפת המוח/מדולה(איור 4A). בנוסף, התבונן בחלק מהכבד במישור אחד של התמונה.
- ודא כי יש מעט מאוד חפצים תמונה כגון צללים ובועות אוויר.
- מדוד יחס מצב B כדי להשיג את אינדקס משאבי האנוש.
- ודא כי הן קליפת המוח הכליתית והן פרנצ'ימה בכבד נמצאים באותו מישור של מיקוד. במידת הצורך, התאם את המוקד וקבל שליטה כדי לקבל תמונה ברורה.
- התאם את המוקד על-ידי הפיכת ידית המוקד ללוח הבקרה. התאם את הרווח על-ידי לחיצה פעם אחת על לחצן TGC אוטומטי.
- הקש על מקש Freeze בלוח הבקרה. ודא כי החיה היא בין נשימות בעת הקפאת המסך כדי למנוע תמונות מטושטשות.
- לאחר הקפאת המסך, הקש על כלי מדידה במסך המגע. בחרו 'יחס מצב B',כלי מובנה המודד בהירות יחסית של רקמה מאזור עניין נבחר. צור עיגול של 2 מ"מ כדי לבחור אזור עניין (ROI). התאם את גודל העיגול על-ידי הזזת אצבע לאורך הקצה החיצוני של כדור המגע בלוח הבקרה.
- מניחים את עיגול 2 מ"מ על תמונת הכבד ROI, אשר צריך להיות ממוקם מימין לכליה. זהה רקמת כבד בהתבסס על ההדגניות ההומוגנית שלה ותיאור חלק.
- לאחר העיגול, לחצו על הלחצן 'בחר' בלוח הבקרה והתבוננו במעגל החדש שמופיע.
- התאימו את גודל העיגול החדש ל-2 מ"מ, והניחו אותו על התמונה של קליפת הכליה. הקפד לשמור על עומק העיגולים על הכבד ועל קליפת המוח הכליות זהה. לאחר ההצבה, לחצו על הלחצן 'בחר' בלוח הבקרה. שים לב לכלי המערכת המובנה המציג את אינדקס משאבי האנוש כיחס מצב B.
- הקש Save Image כדי לשמור את התמונה, וצפה בתמונות שנשמרו המופיעות כתמונות ממוזערות בצד ימין של הצג.
- לחצו על הלחצן 'הקפאה' בלוח הבקרה כדי להפשיר את התמונה ולחזור לתמונה במצב B חי.
- ודא כי הן קליפת המוח הכליתית והן פרנצ'ימה בכבד נמצאים באותו מישור של מיקוד. במידת הצורך, התאם את המוקד וקבל שליטה כדי לקבל תמונה ברורה.
- חזור על מדידת יחס מצב B 3 פעמים בעומקים ובמישורים שונים של רקמות. חשב את הממוצע של שלושת היחסים האלה במצב B עבור כל בעל חיים ונקודת זמן.
5. רכישת תמונות לאלסטוגרפיה של גל גט
- הזז את הבדיקה לרוחב באזור תת-צילומי הימני כדי לאתר את הכבד באמצעות מצב B. אתר אזור של הכבד כי הוא בעיקר parenchyma וללא כלי דם גדולים כגון וריד הפורטל עורק כבד. לאחר שנמצא אזור ברור של הכבד, ליצור מפת גמישות גיהר של הרקמה על ידי לחיצה על כפתור SWE בלוח הבקרה.
- התאם את הגודל והמיקום של תיבת SWE מתחת לקפסולת הכבד באזור נקי צללים. זהה את הקפסולה כקו אקוגני בהיר ליד החלק העליון של הכבד.
- שים לב שתיבת SWE עוברת למפת צבעים בטווח של 5-10. לאחר שהקופסה מלאה ויציבה, לחץ על לחצן הקפא בלוח הבקרה כאשר החיה נמצאת בין נשימות.
הערה: הכמות המינימלית של כיסוי התיבה צריכה להיות 60-80% כדי להעריך במדויק את גמישות הכבד. - במסך המגע, הקישו על QBox, כלי מערכת מובנה המחשב גמישות מתוך ROI במפת גמישות הגל הגועה. שים לב לעיגול ולתיבת הנתונים המופיעים בצג. התאם את המיקום של ה-QBox על-ידי הקשה על סמל המיקום במסך המגע להתקנה הרצויה.
- התאם את גודל העיגול ל-3 מ"מ על-ידי הזזת אצבע לאורך הקצה החיצוני של כדור המגע בלוח הבקרה. באמצעות כדור המסלול, מקם את העיגול באזור ללא צל עם צביעה אחידה (איור 5A, B). יש להקפיד להימנע מאזורים ידועים של נוקשות כגון כלי דם או כמוסת הכבד, כמו גם לדמם למטה ממבנים אלה.
- כאשר נמצא אזור מתאים, הקש Save Image בלוח הבקרה כדי לשמור את התמונה. חזור על הליך זה 3 פעמים באזורים שונים של הכבד. הזז את הבדיקה למעלה ולמטה או לצדדים על הבטן כדי לאסוף תמונות ממופות SWE מאזורים שונים של הכבד.
- לאחר איסוף כל התמונות, הקש End Exam בלוח הבקרה ושים לב למסך המידע של המטופל המופיע בצג.
- מוציאים את הקלטת מ כפותיו של בעל החיים, מנגבים ג'ל עודף ומסלקים את החיה משלב ההדמיה. אפשר לו להתאושש מהרדמה בכלוב חם ויבש בפני עצמו עד להחלמה מלאה. ניטור כל בעל חיים כדי להבטיח התאוששות מלאה מהרדמה, המצוינת על ידי יכולתה לשמור על recumbency החזה
- חזור על שלבים בסעיפים 4-5 כדי שכל בעל חיים בקוהורטה יתבהר.
6. אחזור וניתוח נתוני תמונה
- כאשר תמונות עבור כל בעלי החיים נאספו, לכבות את ההרדמה.
- כדי למשוך נתוני תמונה מהמכונה, לחץ על לחצן סקירה בלוח הבקרה ובחן את כל הסריקות שבוצעו במכשיר זה המופיעות בצג. חפש את הסריקות הרצויות באמצעות חלון החיפוש בפינה העליונה של המסך.
- בחר את כל הסריקות הדרושות לניתוח נתונים על-ידי סימון התיבה לצד שם המטופל באמצעות לחצן Trackball ולחצן בחר. לאחר שכל הסריקות הדרושות מסומנות, בחר יצא JPEGs במסך המגע. יצא נתונים לכונן רשת או לכונן נייד של אפיק טורי אוניברסלי (USB). אתר את יציאות ה- USB בגב המכשיר.
- לאחר ייצוא הקבצים, פתח קבצי jpg בודדים של כל סריקה במחשב תחנת עבודה. שים לב לכל הנתונים בצד ימין של התמונה: יחס מצב B-לאסוף את מספר יחס B; Q Box- לאסוף את ערך האלסטיות הממוצעת (kPa).
- הזן את כל הנתונים בגיליון אלקטרוני או בתוכנת ניהול מסד נתונים אחרת ובצע את הניתוחים הסטטיסטיים הרצויים.
7. ניתוח היסתולוגי של דגימות כבד
- בסוף השבועהשישי, בצע נמק על מחצית מהקבוצה מכל קבוצה לניתוח היסתולוגי באמצע המחקר של דגימות הכבד. באופן דומה, להרדים את שאר קבוצת בעלי החיים, ולאסוף דגימות כבד לניתוח היסתולוגי בנקודת הזמן של השבוע ה -12.
- להכתמת ORO, תקן מקטעי כבד בפורמלין ניטרלי של 10%, והקפא אותם עם סוכרוז באמצעות תמיסת סוכרוז בקירור של 30% למשך הלילה לכל הפחות. הטמעת החלקים בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית, וקטעו אותם על שקופיות טעונות כדי להתכונן להכתמת ORO.
- מניחים את סעיפי ההקפאה ב-100% פרופילן גליקול למשך 2 דקות ואחריו דגירה לילית בתמיסת ORO של 0.5%. לאחר הסרה מפתרון ORO, להבדיל את הסעיפים ב 85% פרופילן גליקול במשך 1 דקות, לשטוף במים deionized, ונגד עם השינוי של המטוקסילין-לילי של מאייר במשך 1 דקות.
- מניחים כיסויים על השקופיות באמצעות מדיום הרכבה מימית ומייבשים אותם בטמפרטורת החדר.
- עבור PSR, הפוך את שקופיות סעיף הכבד הקבועות בפורמלין, מוטבעות פרפין, מקם אותן למשך הלילה בנוזל בוין, ולאחר מכן מכתים אותן באמצעות מכתים שקופיות אוטומטי לפי פרוטוקול היצרן עם כמה שלבים ממוטבים (1% חומצה פוסמווליבית למשך 5 דקות; 0.1% סיריוס אדום בחומצה פיקרית רוויה למשך 90 דקות; 2 x 30 לשטוף ב 0.5% חומצה אצטית). ייבשו את השקופיות באופן אוטומטי ולאחר מכן הרצו אותן עם מדיום הרכבה קבוע.
- לכוד תמונות של השקופיות מוכתמות ORO ו- PSR באמצעות סורק המיקרוסקופיה הדיגיטלי בהגדלה של פי 20, שמור אותן בתבנית .svs ואחסן במסד הנתונים של התמונה של מנהל השקופיות.
- נתח את התמונות באמצעות אלגוריתמים מותאמים אישית שנוצרו בתוכנת פתולוגיה דיגיטלית. יש למרוח באופן אחיד יישומי תוכנה לפתולוגיה דיגיטלית עם פרמטרי סף כדי לזהות ולכומת את אזור מקטעי הכבד, כמו גם את האזורים מוכתמים ב- ORO ו- PSR. יצא את המידות לגיליון אלקטרוני עבור חישובי אחוזי שטח.
8. ניתוח סטטיסטי
- בצע ניתוח סטטיסטי של נתוני ההדמיה באמצעות ANOVA דו-כיווני באמצעות מבחן ההשוואות המרובות של Sidak כדי להעריך את ההבדל בין קבוצות בנקודות זמן שונות. נניח הבדלים משמעותיים בין קבוצות עבור ערכי הסתברות p ≤ 0.001. בנוסף, לבצע מתאם של קריאות הדמיה עם ניתוחים היסתולוגיים.
- השתמש בסטטיסטיקות לא פרמטריות כדי לנתח את תוצאות הניתוח ההיטולוגי ממחקר זה. דווח על ערכי הקבוצה כטווח חצי-אינטר-שוויוני ± חצי-חציי (sIQR). נניח הבדלים משמעותיים בין קבוצות עבור ערכי הסתברות p ≤ 0.001. השתמש בבדיקת מאן-ויטני כדי להשוות את כמות הכתם היסטוכימי PSR ו- ORO בין קבוצות שונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סימן היכר אחד של בעלי חיים האכילו CDAHFD הוא סטאטוזיס. הצטברות של שומן בכבד משנה את המאפיינים echogenic של הרקמה, אשר ניתן לכמת על ידי מדידת הבהירות של הכבד ונורמליזציה אותו לבהירות של קליפת הכליה מתמונה במצב B שצולמה באותו מישור. הערך המכומת מתבטא כמדד משאבי אנוש, שהוא מדד עקיף של סטאטוזיס. באיור 4A, תמונת כבד מייצגת של חיית שליטה מראה בהירות שווה או פחות (echogenicity) בהשוואה לקליפת הכליות. לפיכך, מדד משאבי האנוש של בעלי חיים רגילים הוא <1. במחקר זה, מדד משאבי האנוש הממוצע של בעלי חיים שליטה בנקודת הזמן של 3 שבועות הוא 0.645 ± 0.03. לעומת זאת, תמונה מייצגת במצב B של חיה הניזונה מ-CDAHFD(איור 4A)מראה בהירות מוגברת של הכבד בהשוואה לקליפת הכליות. כתוצאה מכך, מדדי משאבי האנוש של תמונות מייצגות של חיות הדיאטה CDAHFD היו 1.91 ו 1.79 בנקודות הזמן של 6 ו -12 שבועות, בהתאמה.
איור 4C מציג עלילה של מדדי משאבי אנוש לאורך זמן מבעלי שליטה ו-CDAHFD. בעלי חיים הניזונים מתזונה שולטת מראים תנועה מועטה בערכי מדד משאבי אנוש מקו הבסיס, בעוד שבעלי חיים CDAHFD עולים במהירות במהלך 3-6 השבועות הראשונים של המחקר לפני שהם מגיעים לרמה. מדד משאבי האנוש הממוצע של בעלי חיים שהיו בדיאטת CDAHFD הוא 1.861 ± 0.06 לעומת 0.328 ± 0.03 בחיות שליטה ב 12 שבועות לאחר אינדוקציה לאחר המחלה. כצפוי, הכבד הראה אזור חיובי גבוה משמעותית עבור מכתמי ORO בקבוצת CDAHFD בהשוואה לקבוצת דיאטת הביקורת ב 6- (34.81 ± 4.66 לעומת 0.49 ± 0.11) ו 12- (30.08 ± 2.64 לעומת 1.17 ± 0.44) נקודות זמן שבועיות(איור 4B, D). היה גם מתאם מצוין (Pearson r = 0.78) בין אזור האחוזים של הכתמת ORO לבין מדד משאבי האנוש בנקודות הזמן של 6 ו -12 שבועות (איור 4E). תוצאות אלה מצביעות על כך שמדד משאבי אנוש יכול להיות קריאת הדמיה חשובה לכימות סטאטוזיס במודלים פרה-אקליניים של NAFLD/NASH.
אחד המרכיבים העיקריים של מדידת נוקשות הכבד באמצעות SWE הוא מיקום נכון של ה- ROI(איור 5). החלונית השמאלית (איור 5A) מציגה תמונה מייצגת עם מצב B ומיפוי SWE של כבד מבעל חיים דיאטה שליטה. מיקום ROI תקין צריך להיות מעל אזור יציב במפת הצבע ומייצג את החלק של הכבד נמדד, עם אות שאינו מושפע מבנים סמוכים כגון כמוסת הכבד וכלי הדם. נוקשות רקמות מדווחת כמו מודולוס E, שהוא חישוב המבוסס על מהירות גל הגלד וקבוע נחוש ומתבטא בקילפסקלים (kPa). עבור חיות שליטה, מודולוס E נופל בין 3.5 kPa ו 6 kPa. ממוצע ה-kPa של החזרי ההון שדווחו באיור 5A עבור חיות שליטה היה 4.6 ו-5.5 kPa בנקודות הזמן של 6 ו-12 שבועות, בהתאמה, הנופלות בטווח הנורמלי הצפוי. איור 5A מציג תמונה מייצגת של מצב SWE מבעל חיים CDAHFD ב-6 וב-12 שבועות. כאן, ה- ROI הוצב שוב ליד מרכז תיבת Q (מפת גלי גזה), בהתבסס על ההפניה הצבעונית מעל התמונה.
כצפוי עם דגם זה, מודולוס E הוא הרבה יותר גבוה בחיה המוזנת CDAHFD. בתמונות מייצגות אלה, kPa הממוצע היה 10.5 ב 6 שבועות ו 23.1 kPa ב 12 שבועות, המציין נוקשות רקמות משמעותית. מחקר דיאטה NASH טיפוסי ניצול CDAHFD ולשלוט צ'או צריך לחשוף התקדמות קבועה של נוקשות בכבד עקב פיברוזיס בבעלי חיים המוזנים CDAHFD, בעוד בעלי חיים שליטה נשארים זהים. איור 5C מראה עלייה הדרגתית בגמישות הכבד בבעלי חיים CDAHFD בהשוואה לגמישות יציבה בבעלי חיים שליטה על פני תקופה של 12 שבועות. גמישות דיאטה שליטה מתחילה ב 5.80 ± 0.99 kPa בנקודת הזמן של 3 שבועות ואינו מציג הרבה שינוי (6.14 ± 0.59) במהלך המחקר 12 שבועות. הדיאטה כולין לקוי, עם זאת, מראה עלייה משמעותית די מוקדם, להגיע 12.07 ± 2.37 kPa בשבוע 6. המגמה בגמישות מוגברת ממשיכה בדיאטת CDAHFD ככל שהמחקר מתקדם, ומגיע ל-24.43 ± 9.29 kPa ב-12 שבועות לאחר ייזום דיאטה מיוחדת.
דגימות כבד היו מוכתמות PSR כדי למקם קולגן כמתאם של פיברוזיס. כצפוי במודל זה, יש אחוז גבוה משמעותית של כתמים חיוביים לכבד PSR שנצפו בבעלי חיים CDAHFD לעומת דיאטה בקרה הן 6 ו 12 שבועות נקודות זמן (איור 5D). כדי לבסס את התועלת של גל הגיסת כשיטה פונדקאית להכתמת ויוו, מספרי גל הגוויה E Modulus זווו נגד האזור מוכתם PSR בחולדות CDAHFD באיור 5E כדי לקבוע את המתאם. ניתוח העלילה חשף אשכול הדוק עם ערך 'r' פירסון של 0.88, המציין מתאם חזק. יש לציין כי התוצאות שדווחו כאן מייצגות את מה שצפוי במחקר באמצעות תזונה לקויה כולין, עתירת שומן כדי לגרום לנאש. שיטה זו יכולה לשמש גם עם דגמי NASH פרה-אקליניים אחרים; עם זאת, זה יפיק תוצאות שונות וערכים מנותקים בהתאם לפרוטוקול אינדוקציה המחלה. בדומה לדגם החולדה NASH, הדמיית SWE במודל העכבר NASH המושרה על ידי CDAHFD הראתה מתאם מצוין בין ערכי גמישות הכבד לבין אחוז האזור המוכתם החיובי PSR בכבד13. לכן, SWE יכול להיות כלי בעל ערך להערכת פיברוזיס בכבד במודלים פרה-אקליניים של NAFLD / NASH.
איור 1: הגדרת הדמיה. מתמר אולטרסאונד (א) מוחזק על ידי הזרוע היורדת. שלב ההדמיה (b) כולל אזור להדק את צינור ההרדמה ולהגדיר חרוט אף (c) להרדמה מתמשכת במהלך ההדמיה. הבמה מחוממת ומצוידת גם בבדיקות לניטור טמפרטורת הגוף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: כלי האלסטוגרפיה של גל הגימרה. (A)מכשיר האלסטוגרפיה של גל הגיסה הוא יחידה אחת עם גלגלים עם יציאות חיבור עד 4 בדיקות אולטרסאונד. (B)הצג העליון משמש כפלט החזותי לצפייה בזמן אמת בתמונות, כמו גם להצגת נתוני מטופלים ומלאי מערכת. (C)לוח הבקרה המרכזי מכיל את רוב הלחצנים והידיות הדרושים להתאמת התצוגה ולרשות תמונות. (D)הצג התחתון הוא מסך מגע עם פקדים ופקודות נוספים לרכישת תמונה והתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מיקום בעלי חיים ומיקום מתמר תקין. (א)לאחר שבעל חיים הונח כראוי על הבמה ומרוסן עם טייפ-אין בצד שמאל (B)בדיקת האולטרסאונד יורדת על החולדה, נוגעת בג'ל המונח על הבטן / הצד. כאשר הבדיקה נוגעת בג'ל במצב בפאנל B, ניתן לראות את הכליה והכבד בסמיכות על הצג. זוהי עמדה אופטימלית לאסוף את מדד כליות hepato, ובמקרים מסוימים, מספרי גל הגלד גם כן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תוצאות מדד כליות Hepato. (A)תמונה מייצגת של מדדי משאבי אנוש משליטה ו- CDAHFD דיאטת חולדות בנקודות זמן של 6 ו -12 שבועות. ROIs (אדום) צוירו בכליות (עיגול שמאל) ובכבד (עיגול ימני), ואז נקבע יחס של האותות (יחס B, טבלת נתונים ימנית). (B)חלקים היסתולוגיים מוכתמים ORO של דגימות כבד משליטה ו- CDAHFD דיאטה בנקודות זמן של 6 ו -12 שבועות. מוטות קנה מידה = 300 מיקרומטר. (C)ייצוג גרפי של מדד משאבי אנוש על פני קורס זמן דיאטה גורם למחלות. נתוני חולדת בקרה מיוצגים בכחול, נתוני חולדת CDAHFD באדום. הגרף מציג ערכים ממוצעים עם שגיאה סטנדרטית של הממוצע (n = 20 בנקודת הזמן של 3 שבועות ו- n = 20 עבור שליטה ו- n = 19 עבור CDAHFD ב- 6 שבועות, n = 10 בנקודות זמן של 9 ו - 12 שבועות (השוואת בקרה לעומת CDAHFD בכל נקודת זמן *, **, ***, ****p < 0.001). (D)חישובי ORO בכבד שותנו עבור כל נקודת זמן (n = 10). הגרף מציג ערכים חציוניים עם טווח בין-ערכי (*, ** p < 0.001). (E)גרף מתאם המשווה אחוזי כבד ORO חיובי אזור לעומת מדד משאבי אנוש. קיצורים: HR = hepato-כליות; CDAHFD = כולין לקוי, דיאטה עתירת שומן; ROIs = אזורי עניין; ORO = שמן אדום O. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תוצאות אלסטוגרפיה של גל גט. (A)תמונה מייצגת של מפות SWE משליטה ו- CDAHFD דיאטת חולדות בנקודות זמן של 6 ו -12 שבועות. ROIs (אדום) צוירו בכליות (עיגול שמאל) ובכבד (עיגול ימני), ואז נקבע יחס של האותות (יחס B, טבלת נתונים ימנית). (B)חלקים היסתולוגיים מוכתמים ORO של דגימות כבד משליטה ו- CDAHFD דיאטה בנקודות זמן של 6 ו -12 שבועות. סרגל קנה המידה בקטעים היסתולוגיים הוא 300 מיקרומטר. (C)ייצוג גרפי של נוקשות רקמת כבד במודל עכברוש NASH המושרה בדיאטה של 12 שבועות. קבוצות קיבלו אוכל רגיל (כחול) או כולין-לקוי, דיאטה עתירת שומן (אדום) (n = 20 ב 3 ו 6 שבועות, n = 10 ב 9- ו 12 שבועות נקודות זמן). הגרף מציג ערכים ממוצעים עם שגיאה סטנדרטית של הממוצע (n = 20 ב- 3 ו- 6 שבועות, n = 10 בנקודות זמן של 9 ו- 12 שבועות (השוואת בקרה לעומת CDAHFD בכל נקודת זמן *, **, *** p < 0.001). (D)ייצוג גרפי של התפלגות קולגן בדגימות כבד היסטולוגיות ex vivo באמצעות כתם PSR ספציפי לקולגן (n = 10). הגרף מציג ערכים חציוניים עם טווח בין-קוורטיל (*, ** P < 0.001) (E)גרף מתאם המשווה אחוזים חיוביים של אזור הכתמת PSR בכבד לעומת גמישות SWE. SWE = אלסטוגרפיה של גל גיסא; CDAHFD = כולין לקוי, דיאטה עתירת שומן; ROIs = אזורי עניין; ORO = שמן אדום O; NASH = steatohepatitis nonalcoholic; פ.ס.ר = פיקרו סיריוס אדום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הדמיה מבוססת אולטראסאונד, כולל SWE, יכול להיות כלי לא יסולא בפז להערכה אורכית של סטאטוזיס הכבד ונוקשות במודלים פרה-קליניים של NAFLD / NASH. מאמר זה מתאר מתודולוגיות מפורטות על איך לרכוש באיכות גבוהה B-מצב, כמו גם תמונות SWE של כבדים למדידה של מדד משאבי אנוש וגמישות באמצעות מודל עכברושים הנגרמת על ידי דיאטה CDAHFD של NASH. יתר על כן, התוצאות מראות מתאם מצוין של מדד משאבי אנוש וגמישות עם תקן הזהב של הערכה-היסתולוגית של רקמת הכבד. בעוד ההליך עצמו נראה מסובך, ישנם כמה היבטים קריטיים של הפרוטוקול שיבטיח תוצאות מוצלחות.
המיקום של המתמר הוא המפתח, במיוחד כאשר מחפשים את הכליה כדי למדוד את מדד HR במצב B. הצבת הבדיקה קרוב מדי לצלעות יכול לגרום צל צלעות, אשר יוצר אמצעים שווא של הנחתת אולטרסאונד. יתר על כן, הסרת כל השיער באמצעות קרם גילוח ו depilation חשוב, כמו השיער הנותר יכול ללכוד בועות אוויר, אשר יטיל צללים על תמונות במצב B. לבסוף, כמו נוכחות של מזון בבטן ובמעיים יכול לטשטש את הכבד, במיוחד בבעלי חיים ניזונים צ'או רגיל, צום נאות של כל בעלי החיים הוא קריטי הדמיה מוצלחת של הכבד.
למרות מדידות גמישות הכבד מ- SWE ומדד משאבי אנוש הן קריאות יקרות ערך להערכת פיברוזיס בכבד וסטיאטוזיס במודלים פרה-אקליניים של NASH, לטכניקה יש כמה מגבלות. גורמים כגון דלקת, גודש בכבד, cholestasis, חסימת דרכי היציאה להשפיע על נוקשות הכבד ולכן, עשוי להשפיע על הספציפיות הכוללת של טכניקה זו במדידת פיברוזיס הכבד8,14,15,16. באופן דומה, בהירות הכבד בתמונות אולטרסאונד במצב B יכולה להיות מושפעת מפיברוזיס ולכן, עשויה להשפיע על הדיוק של מדד משאבי אנוש במדידת סטאטוזיס. דרושים מחקרים נוספים כדי להבהיר את תרומתם של גורמים משפיעים אלה על גמישות וסטיאטוזיס ולהקים ערכים מנותקים עבור קריאות אלה במודלים פרה קליניים שונים של NASH. יתר על כן, מחקר זה לא העריך את הרגישות של מדד משאבי אנוש כסם ביולוגי להערכת סטאטוזיס בכבד במחקר יעילות פרה-אקלינית.
מדידת נוקשות בכבד באמצעות SWE יש פוטנציאל להיות כלי בעל ערך להבנת הפתופיזיולוגיה של NASH / NAFLD, כמו גם לפיתוח טיפולים חדשניים עבור מצב זה. על ידי מתן אפשרות לחוקר לקבוע הן סטאטוזיס בכבד והן נוקשות רקמות ללא צורך ביופסיה פולשנית, בעלי חיים במחקרים פרה-קליניים ניתן לפקח לאורך, ואת ההשפעות סמים על נושאים בודדים ניתן לכמת לאורך זמן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
כל המחברים הם עובדים של פייזר בע"מ
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות לצוות התפעול של פייזר לרפואה השוואתית על עבודתם הקשה בטיפול והבטחת בריאותם של בעלי החיים המחקריים, כמו גם סיוע בחלק מהטכניקות. כמו כן, תודה לדניאל קראוול, גארי סייטיס וג'ניפר אשלי אולסון על עזרתם בעיבוד רקמות עבור ניתוחים היסתולוגיים. בנוסף, המחברים רוצים להודות לחוליטה רמירז על סקירה ומתן משוב בעל ערך במהלך הכנת כתב יד זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aixplorer | Supersonic Imagine | Shear Wave Elastography Instrument | |
| Aixplorer SuperLinear SLH20-6 Transducer | Supersonic Imagine | Transducer for Shear Wave Elastography | |
| Alpha-dri bedding | rat cages | ||
| Aperio AT2 scanner | Leica Biosystems | Digital Pathology Brightfield Scanner | |
| Compac 6 Anesthesia System | VetEquip | Anesthesia Vaporizer and Delivery System. Any anesthesia delivery system can be used, however. | |
| Manage Imager Database | Leica Biosystems | Digital Pathology | |
| Mayer's Hematoxilin | Dako/Agilent | H&E Staining/Histology | |
| Nair | Church & Dwight | Hair remover | |
| Oil Red O solution | Poly Scientific | Lipid Staining/Histology | |
| Picrosirius Red Stain (PSR) | Rowley Biochemical | F-357-2 | Collagen Stain/Histology |
| Puralube Opthalmic ointment | Dechra Veterinary Product | Lubrication to prevent eye dryness during anesthesia | |
| Tissue-Tek Prisma Plus | Sakura Finetek USA | Automated slide stainer | |
| VISIOPHARM software | Visiopharm | Digital pathology software | |
| Research Diets | A06071309i | NASH inducing diet | |
| Purina | 5053 | Control animal chow | |
| Vevo imaging station | Fujifilm VisualSonics | The Vevo imaging station is used for holding the ultrasound transducer during imaging. | |
| Wistar Han rats | Charles River Laboratories |
References
- Younossi, Z. M., et al. Global epidemiology of nonalcoholic fatty liver disease-Meta-analytic assessment of prevalence, incidence, and outcomes. Hepatology. 64 (1), 73-84 (2016).
- Boland, M. L., et al. Towards a standard diet-induced and biopsy-confirmed mouse model of non-alcoholic steatohepatitis: Impact of dietary fat source. World Journal of Gastroenterology. 25 (33), 4904-4920 (2019).
- Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59130 (2019).
- Bercoff, J., Tanter, M., Fink, M. Supersonic shear imaging: a new technique for soft tissue elasticity mapping. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 51 (4), 396-409 (2004).
- Bavu, E., et al. Noninvasive in vivo liver fibrosis evaluation using supersonic shear imaging: a clinical study on 113 hepatitis C virus patients. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (9), 1361-1373 (2011).
- Ferraioli, G., et al. Accuracy of real-time shear wave elastography for assessing liver fibrosis in chronic hepatitis C: a pilot study. Hepatology. 56 (6), 2125-2133 (2012).
- Ross, T. T., et al. Acetyl-CoA carboxylase inhibition improves multiple dimensions of NASH pathogenesis in model systems. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (4), 829-851 (2020).
- Gu, L. H., Gu, G. X., Wan, P., Li, F. H., Xia, Q. The utility of two-dimensional shear wave elastography and texture analysis for monitoring liver fibrosis in rat model. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 20 (1), 46-52 (2020).
- Marshall, R. H., Eissa, M., Bluth, E. I., Gulotta, P. M., Davis, N. K. Hepatorenal index as an accurate, simple, and effective tool in screening for steatosis. American Journal of Roentgenology. 199 (5), 997-1002 (2012).
- Webb, M., et al. Diagnostic value of a computerized hepatorenal index for sonographic quantification of liver steatosis. American Journal of Roentgenology. 192 (4), 909-914 (2009).
- Tous, M., Ferre, N., Camps, J., Riu, F., Joven, J. Feeding apolipoprotein E-knockout mice with cholesterol and fat enriched diets may be a model of non-alcoholic steatohepatitis. Molecular and Cellular Biochemistry. 268 (1-2), 53-58 (2005).
- Kirsch, R., et al. Rodent nutritional model of non-alcoholic steatohepatitis: species, strain and sex difference studies. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 18 (11), 1272-1282 (2003).
- Journal of Ultrasound in Medicine.
- Engelmann, G., Quader, J., Teufel, U., Schenk, J. P. Limitations and opportunities of non-invasive liver stiffness measurement in children. World Journal of Hepatology. 9 (8), 409-417 (2017).
- Piscaglia, F., Salvatore, V., Mulazzani, L., Cantisani, V., Schiavone, C. Ultrasound shear wave elastography for liver disease. a critical appraisal of the many actors on the stage. Ultraschall in der Medizin. 37 (1), 1-5 (2016).
- Singh, S., Loomba, R. Role of two-dimensional shear wave elastography in the assessment of chronic liver diseases. Hepatology. 67 (1), 13-15 (2018).
