Summary
Este protocolo descreve o uso de uma técnica de ultrassom aprimorada para observar e quantificar invasivamente as alterações nos tecidos hepáticos em modelos de roedores de doença hepática gordurosa não alcoólica.
Abstract
Esteatohepatite não alcoólica (NASH) é uma condição dentro do espectro da Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica (NAFLD), que é caracterizada pelo acúmulo de gordura hepática (esteatose) e inflamação que leva à fibrose. Modelos pré-clínicos que recapitulam de perto nash/NAFLD humano são essenciais no desenvolvimento de medicamentos. Embora a biópsia hepática seja atualmente o padrão-ouro para medir a progressão e o diagnóstico de NAFLD/NASH na clínica, no espaço pré-clínico, seja a coleta de amostras de fígado inteiros em vários momentos durante um estudo ou biópsia do fígado é necessária para análise histológica para avaliar o estágio da doença.
A realização de uma biópsia hepática no meio do estudo é um procedimento invasivo e intensivo em mão-de-obra, e coletar amostras hepáticas para avaliar o nível da doença aumenta o número de animais de pesquisa necessários para um estudo. Assim, há a necessidade de um biomarcador de imagem confiável, traduzível e não invasivo para detectar NASH/NAFLD nesses modelos pré-clínicos. Imagens não invasivas do modo B baseadas em ultrassom e shear wave elastography (SWE) podem ser usadas para medir esteatose, bem como fibrose hepática. Para avaliar a utilidade da SWE em modelos de roedores pré-clínicos de NASH, os animais foram colocados em uma dieta pró-NASH e foram submetidos ao modo B de ultrassom não invasivo e à imagem de elastografia de ondas de cisalhamento para medir o índice hepato-feminino (HR) e a elasticidade hepática, medindo a progressão tanto do acúmulo de gordura hepática quanto da rigidez tecidual, respectivamente, em vários pontos de tempo ao longo de um determinado estudo NAFLD/NASH.
O índice de RH e os números de elasticidade foram comparados aos marcadores histológicos de esteatose e fibrose. Os resultados mostraram forte correlação entre o índice de RH e o percentual de manchas de O Vermelho Óleo (ORO), bem como entre a elasticidade e a coloração picro-sirius vermelha (RSE) dos fígados. A forte correlação entre métodos clássicos ex vivo e resultados de imagem in vivo fornece evidências de que a elastografia de ondas de cisalhamento/imagem baseada em ultrassom pode ser usada para avaliar o fenótipo da doença e a progressão em um modelo pré-clínico de NAFLD/NASH.
Introduction
A doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD) é uma condição metabólica caracterizada por um acúmulo excessivo de gordura no fígado e está rapidamente se tornando uma doença hepática líder em todo o mundo com uma prevalência global recentemente relatada de 25%1. Esteatohepatite não alcoólica (NASH) é um estágio mais progressivo do espectro de NAFLD, caracterizado pelo excesso de gordura hepática com dano celular progressivo, inflamação e fibrose. Essas doenças são muitas vezes silenciosas, não detectadas através de exames de sangue ou exames de rotina, até que danos consideráveis já tenham ocorrido ao fígado de um paciente. Atualmente, o padrão-ouro para diagnosticar NASH em pacientes é através de exame histológico de amostras de biópsia hepática derivadas do paciente. Da mesma forma, pesquisadores pré-clínicos que trabalham para entender a patogênese de NASH/NAFLD, bem como a indústria de desenvolvimento de medicamentos, dependem da biópsia in vivo de amostras de fígado ou eutanásia terminal de coortes de satélite para histologia para medir esteatose, inflamação e fibrose.
Por exemplo, a biópsia da cunha hepática tem sido uma técnica padrão para avaliar esteatohepatite e fibrose durante o uso do modelo GUBRA NASH2. O método de biópsia da cunha hepática é invasivo e trabalhoso em animais pequenos3. O uso de biópsia hepática cunhada no meio de um estudo representa uma variável experimental adicionada em um modelo de doença, o que muitas vezes aumenta o número de animais que são necessários. Com esses fatores em mente, técnicas de imagem não invasivas que podem ser usadas para avaliar de forma confiável a esteatose e a fibrose em modelos animais NASH/NAFLD em pontos de tempo inicial se mostram valiosas. Shear wave elastography (SWE) é um método baseado em ultrassom usado para medir a elasticidade dos tecidos moles. A técnica mede a propagação de ondas de cisalhamento criadas por pulsos de ultrassom supersônicos direcionados a um alvo tecidual e, em seguida, calcula um valor chamado E modulus4. A velocidade da onda de tesoura é proporcional ao grau de rigidez tecidual.
As figuras 1 e figura 2 mostram a configuração da área de imagem e o instrumento SWE. O instrumento SWE é uma unidade única com duas telas e um painel de controle mostrado na Figura 2A. O monitor superior (Figura 2B) atua como monitor de computador e exibe imagens e diretórios do paciente. O painel de controle (Figura 2C) é uma matriz de botões e mostradores que controlam aspectos gerais da captura de imagem: congelar tela, salvar imagens, mudar de um modo para outro. A tela inferior(Figura 2D) é uma tela sensível ao toque com controles adicionais para alterar configurações e age como um teclado para inserir dados conforme necessário. O instrumento é equipado com uma caneta para usar na tela de toque, se desejar. As sondas de ultrassom se prendem ao painel frontal inferior do dispositivo. Para o modo B e a imagem SWE em roedores, foi utilizado o transdutor super-linear de 6 a 20 MHz. Essa capacidade de medir não invasivamente a rigidez tecidual faz da SWE uma ferramenta valiosa para a identificação e estadiamento da fibrose hepática5 em pacientes nash, diminuindo a necessidade de métodos mais invasivos. A SWE tem sido, de fato, usada para medir a fibrose hepática em pacientes e é um método aprovado pela FDA para escorar fibrose na clínica6. O uso da SWE para monitorar a progressão do NASH em modelos animais da doença forneceria uma ferramenta translacional para o desenvolvimento de tratamentos e, simultaneamente, melhoraria o bem-estar animal através da redução do número de indivíduos animais e do refinamento de procedimentos in vivo para minimizar a dor e a angústia.
A imagem SWE em pacientes humanos usa um transdutor de ultrassom de baixa frequência4, o que não é ideal para animais de pequeno porte. Notavelmente, técnicas de SWE de alta frequência têm sido utilizadas para avaliar a eficácia da inibição de acetil-CoA em patogênese de NASH em um modelo7de ratos , e a utilidade desta técnica tem sido descrita em modelos de ratos tetraclorito de carbono de fibrose hepática com resultados bem sucedidos quando comparados aos métodos tradicionais de pontuação histológica METAVIR8. No entanto, a literatura existente carece de informações detalhadas sobre a aplicação de imagens SWE em modelos pré-clínicos de NASH. Como descrito acima, a esteatose hepática é uma das principais características da condição NAFLD/NASH e é um estágio importante onde a intervenção pode ser considerada. Assim, avaliar o acúmulo de gordura hepática utilizando uma modalidade de imagem é tão importante quanto avaliar a fibrose hepática em modelos pré-clínicos de NASH/NAFLD.
Uma técnica de ultrassom conhecida como índice de RH, uma razão de brilho tecidual do fígado em comparação com a do córtex renal, tem sido usada como marcador substituto de esteatose na clínica9,10. Esta abordagem, no entanto, não tem sido amplamente utilizada em modelos animais pré-clínicos de NAFLD/NASH. Este artigo descreve um método de medição da elasticidade, bem como o índice de RH como um marcador substituto de fibrose hepática e esteatose, respectivamente, em um modelo de rato deficiente em colina e alta gordura (CDAHFD) do NAFLD/NASH. Este modelo induz esteatose rápida, inflamação hepática e fibrose, que é mensurável dentro de 6 semanas em camundongos11. A adição de colesterol (1%) a esta dieta tem sido demonstrada para promover a fibrogênese em ratos12, tornando este modelo um candidato adequado para estudos de validação envolvendo imagens de ondas de tesoura. No geral, essa tecnologia de imagem também pode ser aplicada a uma ampla gama de modelos/dietas NASH onde a esteatose e/ou fibrose é um ponto final de interesse.
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Protocol
Todos os procedimentos envolventes aos animais foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Pfizer e realizados em uma unidade credenciada internacional da AAALAC (Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care).
1. Indução de doenças
- Use ratos Wister Han machos (150-175 g; ~ 6-7 semanas de idade; total de 40 ratos) que estão livres de patógenos avencionários de ratos conhecidos. Abriga os ratos em pares em caging individualmente ventilado com cama de papel (ver a Tabela de Materiais) e mantê-los a 22 ± 1 °C, 40-70% de umidade relativa com um ciclo claro-escuro de 12:12 h.
- Coloque os ratos pesando 150-175 g (~6-7 semanas de idade) em uma dieta deficiente em colina, com 1% de colesterol (n = 20) ou uma chow de roedor de laboratório padrão (n = 20) dependendo do desenho do estudo.
NOTA: Neste estudo, foram inscritos 40 ratos com 20 animais por grupo. Ao final da6ª semana, metade da coorte de cada grupo foi necropsiada para análise histológica de amostras hepáticas no meio do estudo. Assim, o tamanho da amostra foi de 10 animais por grupo para os pontos de tempo de 9e 12semanas.
2. Configuração do instrumento
- Configure a área de imagem da seguinte forma: inclua uma superfície aquecida para manter o animal aquecido durante a imagem (c na Figura 1), e um cone de nariz de anestesia assegurado para entregar anestesia inalante para manter um plano de anestesia durante todo o procedimento (b na Figura 1).
- Use um suporte de sonda de ultrassom para facilitar a movimentação da sonda de ultrassom para o local desejado e para evitar que a sonda repouse sobre o animal.
- Use gel de ultrassom aquecido na pele onde a imagem do ultrassom é adquirida.
- Mantenha as seguintes configurações ao longo do procedimento, que podem ser ajustadas na tela sensível ao toque: Alimentação Acústica 0.0 dB; Sintonizador de tecido 1540 m/s; Alcance Dinâmico 60 dB; Faixa de elasticidade (para o modo SWE) < 30 kPa.
- Anexar a sonda de ultrassom ao sistema ferroviário no suporte especializado (a na Figura 1).
- Ligue o instrumento e deixe-o inicializar. Uma vez que o monitor esteja ligado, observe a imagem do Modo B com detalhes do transdutor conectado.
3. Preparação do assunto
- Certifique-se de que os animais estão em jejum pelo menos 4h antes do procedimento de imagem para evitar que o conteúdo intestinal interfira na aquisição de imagens.
- Após pelo menos 4h de jejum, coloque um rato em uma câmara de indução anestésico isoflurane até que um nível adequado de anestesia seja atingido, confirmado sem resposta ao aperto do dedo do dedo do dedo. Exponha os animais a 3-5% de isoflurane por 3-5 min para induzir anestesia.
- Para anestesia de manutenção, mantenha os animais abaixo de 2-3% de isoflurane durante a aquisição de imagens. Aplique pomada oftalmica para proteger o olho da secagem durante a anestesia.
- Uma vez alcançada a anestesia, remova um animal da câmara de indução e coloque-o em um cobertor de corrente de água quente e quente. Coloque um cone de nariz anestésico sobre o focinho, e raspe o animal do lado direito, da caixa torácica à pélvis. Use creme de depilação química para remover todos os cabelos restantes nesta área.
- Uma vez removido o cabelo, coloque um animal na recumbência lateral esquerda com patas superiores coladas acima da cabeça em uma plataforma de imagem quente(Figura 3A).
- Pressione a tecla paciente no painel de controle de instrumentos e identifique o sujeito de acordo com o desenho do estudo.
- Abra a função Teclado no instrumento tocando no ícone na tela sensível ao toque. Digite os nomes conforme desejado.
- Toque em Sair para sair da tela do nome do paciente. Observe que o modo B reabre no monitor.
4. Aquisição de imagem para medição do índice hepato-renal (HR)
- Aplique uma pequena quantidade de gel de ultrassom aquecido na região da pele depilada no animal.
- Mova a sonda de ultrassom para tocar a área coberta de gel do sujeito(Figura 3B). Uma vez que uma imagem ao vivo do modo B dos órgãos internos do sujeito apareça no monitor, mova a sonda de ultrassom para a área ligeiramente acima do quadril, apenas paralelamente às vértebras lombares (plano sagital).
- Utilizando o visor do modo B no monitor, localize o rim direito identificando a artéria renal grande e a separação do córtex/medula(Figura 4A). Além disso, observe parte do fígado em um único plano da imagem.
- Certifique-se de que há pouco ou nenhum artefato de imagem, como sombras e bolhas de ar.
- Meça uma razão de modo B para obter o índice de RH.
- Certifique-se de que tanto o córtex renal quanto o parênquim hepático estão no mesmo plano de foco. Se necessário, ajuste o foco e ganhe controle para obter uma imagem clara.
- Ajuste o foco girando o botão Focus no painel de controle. Ajuste o ganho pressionando o botão Auto TGC uma vez.
- Pressione a tecla Freeze no painel de controle. Certifique-se de que o animal está entre as respirações ao congelar a tela para evitar imagens embaçadas.
- Uma vez que a tela esteja congelada, toque em Ferramentas de Medição na tela de toque. Selecione A relação de modo B, uma ferramenta incorporada que mede o brilho relativo de um tecido de uma região de interesse selecionada. Crie um círculo de 2 mm para selecionar uma região de interesse (ROI). Ajuste o tamanho do círculo movendo um dedo ao longo da borda externa da trackball no painel de controle.
- Coloque o círculo de 2 mm na imagem hepática ROI, que deve ser localizado à direita do rim. Identifique o tecido hepático com base em sua ecogenicidade homogênea e contorno liso.
- Uma vez que o círculo esteja no lugar, pressione o botão Selecionar no painel de controle e observe o novo círculo que aparece.
- Ajuste o tamanho do novo círculo para 2 mm, e coloque-o na imagem do córtex renal. Certifique-se de manter a profundidade dos círculos no fígado e córtex renal o mesmo. Uma vez no lugar, pressione o botão Selecionar no painel de controle. Observe que a ferramenta de sistema incorporada exibe o índice de RH como uma relação de modo B.
- Pressione salvar a imagem para salvar a imagem e observe as imagens salvas que aparecem como miniaturas no lado direito do monitor.
- Pressione o botão Congelar no painel de controle para descongelar a imagem e retornar a uma imagem ao vivo do modo B.
- Certifique-se de que tanto o córtex renal quanto o parênquim hepático estão no mesmo plano de foco. Se necessário, ajuste o foco e ganhe controle para obter uma imagem clara.
- Repita a medição da razão do modo B 3 vezes em diferentes profundidades e planos de tecido. Calcule a média dessas três relações de modo B para cada animal e ponto de tempo.
5. Aquisição de imagem para Elastografia de Ondas de Tesoura
- Mova a sonda transversalmente na área subcostal direita para localizar o fígado usando o Modo B. Localize uma área do fígado que é principalmente parenchyma e livre de vasos sanguíneos grandes, como a veia portal e artéria hepática. Uma vez encontrada uma área clara do fígado, gere um mapa de elasticidade do tecido pressionando o botão SWE no painel de controle.
- Ajuste o tamanho e a posição da caixa SWE abaixo da cápsula hepática em uma área livre de sombras. Identifique a cápsula como uma linha ecogênica brilhante perto do topo do fígado.
- Observe que a caixa SWE transita para um mapa de cores dentro de 5-10 s. Uma vez que a caixa esteja cheia e estável, pressione o botão Congelar no painel de controle quando o animal estiver entre as respirações.
NOTA: A quantidade mínima de cobertura da caixa deve ser de 60-80% para avaliar com precisão a elasticidade do fígado. - Na tela de toque, toque em QBox, uma ferramenta de sistema incorporada que calcula a elasticidade de um ROI no mapa de elasticidade da onda de corte. Observe o círculo e a caixa de dados que aparecem no monitor. Ajuste a posição do QBox tocando no ícone de posição na tela de toque para a configuração desejada.
- Ajuste o tamanho do círculo para 3 mm movendo um dedo ao longo da borda externa da trackball no painel de controle. Usando o trackball, posicione o círculo em uma área livre de sombra com coloração uniforme(Figura 5A,B). Tome cuidado para evitar áreas conhecidas de rigidez, como vasos sanguíneos ou cápsula hepática, bem como sangrou para baixo dessas estruturas.
- Quando uma área adequada for encontrada, pressione Salvar imagem no painel de controle para salvar a imagem. Repita este procedimento 3 vezes em diferentes áreas do fígado. Mova a sonda para cima e para baixo ou para os lados no abdômen para coletar imagens mapeadas por SWE de diferentes áreas do fígado.
- Uma vez que todas as imagens tenham sido coletadas, pressione o Exame final no painel de controle e anote a tela de informações do paciente que aparece no monitor.
- Retire a fita das patas do animal, limpe o excesso de gel e remova o animal da fase de imagem. Deixe-o se recuperar da anestesia em uma gaiola quente e seca por si só até se recuperar totalmente. Monitore cada animal para garantir a recuperação total da anestesia, indicada por sua capacidade de manter a recumedência severa
- Repita passos nas seções 4-5 para cada animal da coorte a ser retratado.
6. Recuperação e análise de dados de imagem
- Quando as imagens de todos os animais tiverem sido coletadas, desligue a anestesia.
- Para retirar os dados da imagem da máquina, pressione o botão Revisar no painel de controle e observe todas as varreduras realizadas nesse instrumento que aparecem no monitor. Procure as varreduras desejadas usando a janela de pesquisa no canto superior da tela.
- Selecione todas as varreduras necessárias para análise de dados verificando a caixa ao lado do nome do paciente através do trackball e do botão Selecionar. Uma vez que todas as varreduras necessárias sejam destacadas, selecione Exportar JPEGs na tela de toque. Exportar dados para uma unidade de rede ou uma unidade USB (Universal Serial Bus) portátil. Localize as portas USB na parte de trás do instrumento.
- Uma vez que os arquivos tenham sido exportados, abra arquivos jpg individuais de cada varredura em um computador de estação de trabalho. Observe todos os dados do lado direito da imagem: B Mode Ratio-collect the B Ratio number; Q Caixa-coletar o valor de elasticidade média (kPa).
- Insira todos os dados em uma planilha ou outro software de gerenciamento de banco de dados e realize as análises estatísticas desejadas.
7. Análise histológica de amostras hepáticas
- Ao final da6ª semana, realizar necropsia em metade da coorte de cada grupo para análise histológica de estudo médio das amostras hepáticas. Da mesma forma, eutanize o resto da coorte de animais, e colete amostras de fígado para análise histológica no ponto de tempo de 12semanas.
- Para coloração oro, fixar seções hepáticas em formalina com tampo neutro de 10% e criopreservá-las com sacarose usando uma solução de sacarose refrigerada de 30% durante a noite, no mínimo. Crio-embede as seções em composto de temperatura de corte ideal, e crio-seção-los em slides carregados para se preparar para a coloração ORO.
- Coloque as crio-seções em 100% propilenoglicol por 2 min seguido de uma incubação noturna em solução oro de 0,5%. Após a remoção da solução ORO, diferencie as seções em 85% de propilenoglicol por 1 min, enxágue em água deionizada e contra-retém com a modificação de Hematoxilina-Lillie de Mayer por 1 min.
- Coloque as manchas nos slides usando um meio de montagem aquoso e seque-os à temperatura ambiente.
- Para PSR, deparaffinize slides de seção hepática fixas, parafinas, coloque-as durante a noite em Bouin Fluid, e depois manche-as usando um colorador de slides automatizado de acordo com o protocolo do fabricante com alguns passos otimizados (1% de ácido fosfomólico para 5 min; 0,1% Sirius Vermelho em ácido picrico saturado por 90 min; 2 x 30 s lavagem em ácido acetástico). Desidrate automaticamente os slides e, em seguida, monte-os com um meio de montagem permanente.
- Capture imagens dos slides manchados de ORO e PSR usando o scanner de microscopia digital na ampliação de 20x, salve-as em formato .svs e armazene no banco de dados de imagens do gerenciador de slides.
- Analise as imagens usando algoritmos personalizados criados em software de patologia digital. Aplique uniformemente aplicações de software de patologia digital com parâmetros limiares para identificar e quantificar a área de seções hepáticas, bem como as áreas manchadas de ORO e PSR. Exporte as medidas para uma planilha para cálculos percentuais de área.
8. Análise estatística
- Realize a análise estatística dos dados de imagem com a ANOVA bidirecional usando o teste de comparações múltiplas de Sidak para avaliar a diferença entre grupos em diferentes momentos. Assuma diferenças significativas entre os grupos para valores de probabilidade p ≤ 0,001. Além disso, realize a correlação das leituras de imagens com análises histológicas.
- Utilizar estatísticas não paramétricas para analisar os resultados da análise histológica deste estudo. Reporte os valores do grupo como ± faixa semi-interquartil (sIQR). Assuma diferenças significativas entre os grupos para valores de probabilidade p ≤ 0,001. Use um teste Mann-Whitney para comparar a quantidade de PSR e mancha histoquímica ORO entre diferentes grupos.
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Representative Results
Uma marca registrada dos animais alimentados com CDAHFD é a esteatose. O acúmulo de gordura no fígado altera as propriedades ecogênicas do tecido, que podem ser quantificadas medindo o brilho do fígado e normalizando-o ao brilho do córtex renal a partir de uma imagem do modo B tirada no mesmo plano. O valor quantificado é expresso como um índice de RH, que é uma medida indireta de esteatose. Na Figura 4A,uma imagem hepática representativa de um animal de controle mostra aproximadamente igual ou menos brilho (ecogenicidade) em comparação com o córtex renal. Assim, o índice de RH de animais normais é <1. Neste estudo, o índice médio de RH dos animais de controle no ponto de 3 semanas é de 0,645 ± 0,03. Em contraste, uma imagem representativa do modo B de um animal alimentado por CDAHFD (Figura 4A) mostra um aumento do brilho do fígado em comparação com o córtex renal. Como resultado, os índices de RH de imagens representativas dos animais dietéticos CDAHFD foram de 1,91 e 1,79 nos pontos de tempo de 6 e 12 semanas, respectivamente.
A Figura 4C mostra um gráfico de índices de RH ao longo do tempo a partir do controle e animais CDAHFD. Os animais alimentados com dieta de controle mostram pouco movimento nos valores do índice de RH a partir da linha de base, enquanto os animais CDAHFD sobem rapidamente ao longo das primeiras 3-6 semanas do estudo antes de atingir um patamar. O índice médio de RH dos animais que estavam em uma dieta CDAHFD é de 1,861 ± 0,06 em comparação com 0,328 ± 0,03 em animais de controle em 12 semanas após a indução da doença. Como esperado, o fígado apresentou uma área positiva significativamente maior para a coloração de ORO no grupo CDAHFD em comparação com o grupo de dieta controle em 6- (34,81 ± 4,66 vs. 0,49 ± 0,11) e 12- (30,08 ± 2,64 contra 1,17 ± 0,44) pontos de semana(Figura 4B,D). Também houve excelente correlação (Pearson r = 0,78) entre a área percentual de coloração oro com o índice de RH nos pontos de tempo de 6 e 12 semanas(Figura 4E). Esses resultados sugerem que o índice de RH pode ser uma leitura de imagem valiosa para quantificar a esteatose em modelos pré-clínicos de NAFLD/NASH.
Um dos elementos-chave da medição da rigidez hepática via SWE é a colocação adequada do ROI (Figura 5). O painel esquerdo (Figura 5A) mostra uma imagem representativa com modo B e mapeamento SWE do fígado de um animal de dieta de controle. A colocação adequada do ROI deve ser sobre uma área estável no mapa de cores e representa a seção do fígado sendo medida, com um sinal que não é influenciado por estruturas adjacentes, como a cápsula hepática e vasos sanguíneos. A rigidez tecidual é relatada como o módulo E, que é um cálculo baseado na velocidade da onda de cisalhamento e uma constante determinada e é expresso em quilopascals (kPa). Para animais de controle, o módulo E cai entre 3,5 kPa e 6 kPa. A média dos ROIs relatados na Figura 5A para animais de controle foi de 4,6 e 5,5 kPa nos pontos de tempo de 6 e 12 semanas, respectivamente, o que se enquadra na faixa normal esperada. A Figura 5A mostra uma imagem representativa do modo SWE de um animal CDAHFD às 6 e 12 semanas. Aqui, o ROI foi novamente colocado perto do centro da Q Box (mapa de ondas de tesoura), com base na referência colorida em cima da imagem.
Como esperado com este modelo, o módulo E é muito maior no animal alimentado pelo CDAHFD. Nessas imagens representativas, o kPa médio foi de 10,5 em 6 semanas e 23,1 kPa em 12 semanas, indicando rigidez significativa do tecido. Um estudo típico da dieta NASH utilizando CDAHFD e chow de controle deve revelar uma progressão constante da rigidez hepática devido à fibrose nos animais alimentados pelo CDAHFD, enquanto os animais de controle permanecem os mesmos. A Figura 5C mostra um aumento gradual da elasticidade do fígado em animais CDAHFD em comparação com a elasticidade estável nos animais de controle durante um período de 12 semanas. A elasticidade da dieta de controle começa em 5,80 ± 0,99 kPa no ponto de tempo de 3 semanas e não mostra muita mudança (6,14 ± 0,59) ao longo do estudo de 12 semanas. A dieta deficiente de colina, no entanto, mostra um aumento significativo muito cedo, atingindo 12,07 ± 2,37 kPa na semana 6. A tendência de aumento da elasticidade continua na dieta CDAHFD à medida que o estudo progride, atingindo 24,43 ± 9,29 kPa em 12 semanas após a iniciação da dieta especial.
Amostras de fígado foram manchadas com RSP para localização do colágeno como uma correlação de fibrose. Como esperado com este modelo, há um percentual significativamente maior de manchas hepáticas PSR-positivas observadas em animais de CDAHFD em comparação com a dieta de controle em pontos de tempo de 6 e 12 semanas(Figura 5D). Para estabelecer a utilidade da onda de cisalhamento como um método de substituto para a coloração ex vivo, os números da onda de cisalhamento E Modulus foram plotados contra a área manchada de PSR em ratos CDAHFD na Figura 5E para determinar a correlação. A análise da trama revelou um cluster apertado com um valor pearson 'r' de 0,88, indicando forte correlação. Deve-se notar que os resultados aqui relatados são representativos do que seria esperado em um estudo usando uma dieta deficiente em colina e com alto teor de gordura para induzir nash. Este método também pode ser usado com outros modelos NASH pré-clínicos; no entanto, produzirá diferentes resultados e valores de corte, dependendo do protocolo de indução da doença. Como o modelo nash de rato, a imagem SWE no modelo de camundongo NASH induzido por CDAHFD mostrou excelente correlação entre os valores de elasticidade hepática e a porcentagem de área manchada psr-positiva no fígado13. Assim, o SWE pode ser uma ferramenta valiosa para avaliar a fibrose hepática em modelos pré-clínicos de NAFLD/NASH.
Figura 1: Configuração de imagem. O transdutor de ultrassom (a) é segurado pelo braço descendente. O estágio de imagem (b) tem uma área para fixar a mangueira de anestesia e configurar um cone de nariz (c) para anestesia contínua durante a imagem. O palco também é aquecido e equipado com sondas para monitorar a temperatura corporal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: O instrumento de elastografia da onda de cisalhamento. (A) O instrumento de elastografia de ondas de cisalhamento é uma unidade única de rodas com portas de fixação para até 4 sondas de ultrassom. (B) O monitor superior serve como saída visual para visualização em tempo real de imagens, bem como exibição de dados do paciente e inventário do sistema. (C) O painel de controle central contém a maioria dos botões e botões necessários para ajustar o display e adquirir imagens. (D) O monitor inferior é uma tela sensível ao toque com controles e comandos adicionais para aquisição e ajuste de imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Posicionamento animal e colocação adequada do transdutor. (A) Uma vez que um animal tenha sido devidamente colocado no palco e contido com a recumbência lateral esquerda(B)a sonda de ultrassom é abaixada sobre o rato, tocando o gel colocado no abdômen/lado. Quando a sonda está tocando o gel na posição no painel B,o rim e o fígado podem ser vistos em justaposição no monitor. Esta é uma posição ideal para coletar o índice hepato-renal, e em alguns casos, os números de ondas de cisalhamento também. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Resultados do índice hepato-renal. (A) Imagem representativa dos índices de RH do controle e dos ratos dietéticos CDAHFD em pontos de tempo de 6 e 12 semanas. Os ROIs (vermelho) foram desenhados no rim (círculo esquerdo) e fígado (círculo direito), então foi determinada uma razão dos sinais (Proporção B, tabela de dados direito). (B) Seções histológicas manchadas de ORO representativas de amostras hepáticas do controle e ratos dietéticos CDAHFD em pontos de tempo de 6 e 12 semanas. Barras de escala = 300 μm. (C) Representação gráfica do índice de RH sobre um curso de tempo de dieta indutor de doenças. Os dados de ratos de controle são representados em azul, dados de ratos CDAHFD em vermelho. O gráfico mostra valores médios com erro padrão da média (n = 20 no ponto de tempo de 3 semanas e n = 20 para controle e n= 19 para CDAHFD em 6 semanas, n = 10 em 9 e 12 semanas pontos de tempo (comparando controle versus CDAHFD em cada ponto de tempo *, *** *** *p < 0,001). (D) Cálculos oro de fígado plotados para cada ponto de tempo (n = 10). O gráfico mostra valores medianos com intervalo interquartil (*, ** p < 0,001). (E) Gráfico de correlação comparando por cento de área oro-positiva hepática versus o índice de RH. Abreviaturas: HR = hepato-renal; CDAHFD = dieta deficiente em colina e com alto teor de gordura; ROIs = regiões de interesse; ORO = Óleo Vermelho O. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Resultados de elastografia de onda de cisalhamento. (A) Imagem representativa dos mapas SWE do controle e ratos dietéticos CDAHFD em pontos de tempo de 6 e 12 semanas. Os ROIs (vermelho) foram desenhados no rim (círculo esquerdo) e fígado (círculo direito), então foi determinada uma razão dos sinais (Proporção B, tabela de dados direito). (B) Seções histológicas manchadas de ORO representativas de amostras hepáticas do controle e ratos dietéticos CDAHFD em pontos de tempo de 6 e 12 semanas. A barra scale em seções histológicas é de 300 μm. (C) Representação gráfica da rigidez do tecido hepático em um modelo de rato NASH induzido por dieta de 12 semanas. Os grupos foram alimentados com alimentação normal (azul) ou deficiente de colina, dieta rica em gordura (vermelha) (n = 20 a 3 e 6 semanas, n = 10 em 9 e 12 horas por semana). O gráfico mostra valores médios com erro padrão da média (n = 20 a 3 e 6 semanas, n = 10 em 9 e 12 semanas pontos de tempo (comparando controle versus CDAHFD em cada ponto de tempo *, **, *** p < 0,001). (D) Representação gráfica da distribuição de colágeno em amostras de fígado histológico ex vivo utilizando mancha de PSR específica de colágeno (n = 10). O gráfico mostra valores medianos com faixa interquartil (*, ** P < 0,001) (E) Gráfico de correlação comparando área de coloração PSR hepática relativamente positiva versus elasticidade SWE. SWE = elastografia de ondas de cisalhamento; CDAHFD = dieta deficiente em colina e com alto teor de gordura; ROIs = regiões de interesse; ORO = Óleo Vermelho O; NASH = esteatohepatite não alcoólica; PSR = Picro Sirius Vermelho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Imagens baseadas em ultrassom, incluindo SWE, podem ser uma ferramenta inestimável para a avaliação longitudinal da esteatose hepática e rigidez em modelos pré-clínicos de NAFLD/NASH. Este artigo descreve metodologias detalhadas sobre como adquirir o modo B de alta qualidade, bem como imagens de SWE de fígados para a medição do índice de RH e elasticidade usando um modelo de rato induzido pela dieta CDAHFD de NASH. Além disso, os resultados mostram excelente correlação do índice de RH e elasticidade com o padrão ouro de avaliação-histológica do tecido hepático. Embora o procedimento em si pareça não ter sido complicado, existem alguns aspectos críticos do protocolo que garantirão resultados bem-sucedidos.
A colocação do transdutor é fundamental, especialmente quando se procura o rim para medir o índice de RH no modo B. Colocar a sonda muito perto das costelas pode resultar em sombra de costela, o que cria falsas medidas de atenuação do ultrassom. Além disso, a remoção de todos os cabelos usando creme de barbear e depilação é importante, pois o cabelo restante pode prender bolhas de ar, que lançarão sombras em imagens do modo B. Finalmente, como a presença de alimentos no estômago e intestinos pode obscurecer o fígado, especialmente em animais alimentados com comida normal, o jejum adequado de todos os animais é fundamental para uma imagem bem sucedida do fígado.
Embora as medidas de elasticidade hepática da SWE e do índice de RH sejam leituras valiosas para avaliar a fibrose hepática e a esteatose em modelos pré-clínicos de NASH, a técnica tem algumas limitações. Fatores como inflamação, congestão hepática, colestase e obstrução do trato de saída influenciam a rigidez hepática e, portanto, podem influenciar a especificidade geral desta técnica na medição da fibrose hepática8,14,15,16. Da mesma forma, o brilho do fígado em imagens de ultrassom no modo B pode ser influenciado pela fibrose e, portanto, pode afetar a precisão do índice de RH na medição da esteatose. Mais estudos são necessários para esclarecer a contribuição desses fatores influenciadores sobre elasticidade e esteatose e estabelecer valores de corte para essas leituras em diferentes modelos pré-clínicos de NASH. Além disso, este estudo não avaliou a sensibilidade do índice de RH como biomarcador para avaliar a esteatose hepática em um estudo de eficácia pré-clínico.
A medição da rigidez hepática usando SWE tem o potencial de se tornar uma ferramenta valiosa para entender a fisiopatologia de NASH/NAFLD, bem como para o desenvolvimento de novos tratamentos para esta condição. Ao permitir que o pesquisador determine tanto a esteatose hepática quanto a rigidez tecidual sem a necessidade de uma biópsia invasiva, animais em estudos pré-clínicos podem ser monitorados longitudinalmente, e os efeitos medicamentosos em indivíduos podem ser quantificados ao longo do tempo.
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Disclosures
Todos os autores são funcionários da Pfizer, Inc.
Acknowledgments
Os autores agradecem à Equipe de Operações de Medicina Comparada da Pfizer pelo trabalho árduo de cuidado e garantia da saúde dos animais de estudo, bem como pelo auxílio a algumas das técnicas. Além disso, os agradecimentos são devidos a Danielle Crowell, Gary Seitis e Jennifer Ashley Olson por sua ajuda com o processamento de tecidos para análises histológicas. Além disso, os autores gostariam de agradecer julita Ramirez por revisar e fornecer feedback valioso durante a preparação deste manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aixplorer | Supersonic Imagine | Shear Wave Elastography Instrument | |
| Aixplorer SuperLinear SLH20-6 Transducer | Supersonic Imagine | Transducer for Shear Wave Elastography | |
| Alpha-dri bedding | rat cages | ||
| Aperio AT2 scanner | Leica Biosystems | Digital Pathology Brightfield Scanner | |
| Compac 6 Anesthesia System | VetEquip | Anesthesia Vaporizer and Delivery System. Any anesthesia delivery system can be used, however. | |
| Manage Imager Database | Leica Biosystems | Digital Pathology | |
| Mayer's Hematoxilin | Dako/Agilent | H&E Staining/Histology | |
| Nair | Church & Dwight | Hair remover | |
| Oil Red O solution | Poly Scientific | Lipid Staining/Histology | |
| Picrosirius Red Stain (PSR) | Rowley Biochemical | F-357-2 | Collagen Stain/Histology |
| Puralube Opthalmic ointment | Dechra Veterinary Product | Lubrication to prevent eye dryness during anesthesia | |
| Tissue-Tek Prisma Plus | Sakura Finetek USA | Automated slide stainer | |
| VISIOPHARM software | Visiopharm | Digital pathology software | |
| Research Diets | A06071309i | NASH inducing diet | |
| Purina | 5053 | Control animal chow | |
| Vevo imaging station | Fujifilm VisualSonics | The Vevo imaging station is used for holding the ultrasound transducer during imaging. | |
| Wistar Han rats | Charles River Laboratories |
References
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