Summary
Questo protocollo descrive l'uso di una tecnica ecografica avanzata per osservare e quantificare in modo non invasivo i cambiamenti del tessuto epatico nei modelli di roditori di steatosi epatica non alcolica.
Abstract
La steatoepatite non alcolica (NASH) è una condizione all'interno dello spettro della steatosi epatica non alcolica (NAFLD), che è caratterizzata da accumulo di grasso epatico (steatosi) e infiammazione che porta alla fibrosi. I modelli preclinici che ricapitolano strettamente la NASH/NAFLD umana sono essenziali nello sviluppo di farmaci. Mentre la biopsia epatica è attualmente il gold standard per misurare la progressione e la diagnosi di NAFLD / NASH in clinica, nello spazio preclinico, è necessaria la raccolta di campioni di fegato intero in più punti temporali durante uno studio o la biopsia del fegato per l'analisi istologica per valutare lo stadio della malattia.
Condurre una biopsia epatica a metà studio è una procedura invasiva e laboriosa e la raccolta di campioni di fegato per valutare il livello di malattia aumenta il numero di animali da ricerca necessari per uno studio. Pertanto, vi è la necessità di un biomarcatore di imaging affidabile, traducibile e non invasivo per rilevare NASH / NAFLD in questi modelli preclinici. Le immagini B-mode basate su ultrasuoni non invasive e l'elastografia a onde di taglio (SWE) possono essere utilizzate per misurare la steatosi e la fibrosi epatica. Per valutare l'utilità della SWE nei modelli preclinici di NASH di roditori, gli animali sono stati sottoposti a una dieta pro-NASH e sottoposti a ecografia non invasiva in modalità B e ecografia ad onda di taglio per misurare l'indice epatorenale (HR) e l'elasticità epatica, misurando la progressione sia dell'accumulo di grasso epatico che della rigidità dei tessuti, rispettivamente, in più punti temporali nel corso di un determinato studio NAFLD / NASH.
L'indice HR e i numeri di elasticità sono stati confrontati con i marcatori istologici di steatosi e fibrosi. I risultati hanno mostrato una forte correlazione tra l'indice HR e la percentuale di colorazione Oil Red O (ORO), nonché tra elasticità e colorazione picro-sirio red (PSR) del fegato. La forte correlazione tra i metodi classici ex vivo e i risultati dell'imaging in vivo fornisce la prova che l'elastografia a onde di taglio / imaging basato su ultrasuoni può essere utilizzata per valutare il fenotipo e la progressione della malattia in un modello preclinico di NAFLD / NASH.
Introduction
La steatosi epatica non alcolica (NAFLD) è una condizione metabolica caratterizzata da un eccessivo accumulo di grasso nel fegato e sta rapidamente diventando un disturbo epatico leader in tutto il mondo con una prevalenza globale recentemente riportata del 25%1. La steatoepatite non alcolica (NASH) è uno stadio più avanzato dello spettro della NAFLD, caratterizzato da eccesso di grasso epatico con danno cellulare progressivo, infiammazione e fibrosi. Questi disturbi sono spesso silenziosi, inosservati attraverso esami del sangue o esami di routine, fino a quando non si è già verificato un danno considerevole al fegato di un paziente. Attualmente, il gold standard per diagnosticare la NASH nei pazienti è attraverso l'esame istologico di campioni di biopsia epatica derivati dal paziente. Allo stesso modo, i ricercatori preclinici che lavorano per comprendere la patogenesi della NASH / NAFLD e l'industria dello sviluppo di farmaci si affidano alla biopsia a cuneo in vivo di campioni di fegato o all'eutanasia terminale di coorti satellite per l'istologia per misurare steatosi, infiammazione e fibrosi.
Ad esempio, la biopsia del cuneo epatico è stata una tecnica standard per valutare la steatoepatite e la fibrosi durante l'utilizzo del modello GUBRA NASH2. Il metodo di biopsia del cuneo epatico è invasivo e laborioso nei piccoli animali3. L'uso della biopsia epatica a cuneo nel mezzo di uno studio rappresenta una variabile sperimentale aggiuntiva in un modello di malattia, che spesso aumenta il numero di animali necessari. Con questi fattori in mente, le tecniche di imaging non invasive che possono essere utilizzate per valutare in modo affidabile la steatosi e la fibrosi in modelli animali NASH / NAFLD nei primi momenti si rivelano preziose. L'elastografia ad onde di taglio (SWE) è un metodo basato su ultrasuoni utilizzato per misurare l'elasticità dei tessuti molli. La tecnica misura la propagazione delle onde di taglio create da impulsi ultrasonici supersonici diretti a un bersaglio tissutale, e quindi calcola un valore chiamato modulo E4. La velocità dell'onda di taglio è proporzionale al grado di rigidità del tessuto.
La Figura 1 e la Figura 2 mostrano la configurazione dell'area di imaging e lo strumento SWE. Lo strumento SWE è un'unità singola con ruote con due schermi e un pannello di controllo mostrato nella Figura 2A. Il monitor superiore (Figura 2B) funge da monitor del computer e visualizza immagini e directory dei pazienti. Il pannello di controllo (Figura 2C) è una serie di pulsanti e quadranti che controllano gli aspetti generali dell'acquisizione delle immagini: congelamento dello schermo, salvataggio delle immagini, passaggio da una modalità all'altra. Lo schermo inferiore (Figura 2D) è un touch screen con controlli aggiuntivi per modificare le impostazioni e funge da tastiera per inserire i dati in base alle esigenze. Lo strumento è dotato di uno stilo da utilizzare sul touch screen se lo si desidera. Le sonde ad ultrasuoni si attaccano al pannello frontale inferiore del dispositivo. Per l'imaging in modalità B e SWE nei roditori, è stato utilizzato il trasduttore super-lineare da 6 a 20 MHz. Questa capacità di misurare in modo non invasivo la rigidità dei tessuti rende la SWE uno strumento prezioso per l'identificazione e la stadiazione della fibrosiepatica 5 nei pazienti con NASH, diminuendo la necessità di metodi più invasivi. SWE è, infatti, stato utilizzato per misurare la fibrosi epatica nei pazienti ed è un metodo approvato dalla FDA per segnare la fibrosi nella clinica6. L'uso di SWE per monitorare la progressione della NASH in modelli animali della malattia fornirebbe uno strumento traslazionale per lo sviluppo di trattamenti e contemporaneamente migliorerebbe il benessere degli animali attraverso la riduzione del numero di soggetti animali e il perfezionamento delle procedure in vivo per ridurre al minimo il dolore e l'angoscia.
L'imaging SWE nei pazienti umani utilizza un trasduttore ad ultrasuoni a bassa frequenza4, che non è l'ideale per i piccoli animali. In particolare, sono state utilizzate tecniche SWE ad alta frequenza per valutare l'efficacia dell'inibizione dell'acetil-CoA carbossilasi sulla patogenesi della NASH in un modello di ratto7e l'utilità di questa tecnica è stata descritta in modelli di ratto tetracloruro di carbonio di fibrosi epatica con risultati positivi rispetto ai tradizionali metodi di punteggio istologico METAVIR8. Tuttavia, la letteratura esistente manca di informazioni tecniche e metodologiche dettagliate sull'applicazione dell'imaging SWE in modelli preclinici di NASH. Come descritto sopra, la steatosi epatica è una delle caratteristiche chiave della condizione NAFLD / NASH ed è una fase importante in cui può essere considerato l'intervento. Pertanto, valutare l'accumulo di grasso epatico utilizzando una modalità di imaging è importante quanto valutare la fibrosi epatica in modelli preclinici di NASH / NAFLD.
Una tecnica ecografica nota come indice HR, un rapporto di luminosità tissutale del fegato rispetto a quella della corteccia renale, è stata utilizzata come marcatore surrogato della steatosi nella clinica9,10. Questo approccio, tuttavia, non è stato ampiamente utilizzato nei modelli animali preclinici di NAFLD/NASH. Questo articolo descrive un metodo per misurare l'elasticità e l'indice HR come marcatore surrogato della fibrosi epatica e della steatosi, rispettivamente, in un modello di ratto con dieta ad alto contenuto di colina e ad alto contenuto di grassi (CDAHFD) di NAFLD / NASH. Questo modello induce steatosi rapida, infiammazione del fegato e fibrosi, che è misurabile entro 6 settimane nei topi11. L'aggiunta di colesterolo (1%) a questa dieta ha dimostrato di promuovere la fibrogenesi nei ratti12, rendendo questo modello un candidato adatto per studi di convalida che coinvolgono l'imaging delle onde di taglio. Nel complesso, questa tecnologia di imaging può anche essere applicata a una vasta gamma di modelli / diete NASH in cui la steatosi e / o la fibrosi sono un endpoint di interesse.
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Protocol
Tutte le procedure coinvolte negli animali sono state esaminate e approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) di Pfizer e condotte in una struttura accreditata AAALAC (Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care).
1. Induzione della malattia
- Utilizzare ratti Wister Han maschi (150-175 g; ~ 6-7 settimane di età; totale 40 ratti) che sono privi di patogeni avventiziali noti per ratti. Ospitare i ratti in coppia in ingabbiamento ventilato individualmente con lettiera di carta (vedi la Tabella dei materiali)e mantenerli a 22 ± 1 °C, 40-70% di umidità relativa con un ciclo luce-buio di 12:12 h.
- Posizionare i ratti del peso di 150-175 g (~ 6-7 settimane) su una dieta carente di colina e ricca di grassi con colesterolo all'1% (n = 20) o un chow di roditore da laboratorio standard (n = 20) a seconda del disegno dello studio.
NOTA: In questo studio, un totale di 40 ratti sono stati arruolati con 20 animali per gruppo. Alla fine della6a settimana, metà della coorte di ciascun gruppo è stata autopsia per l'analisi istologica a metà studio di campioni di fegato. Pertanto, la dimensione del campione era di 10 animali per gruppo per i punti temporali della9a e12a settimana.
2. Configurazione dello strumento
- Impostare l'area di imaging come segue: includere una superficie riscaldata per mantenere l'animale caldo durante l'imaging (c nella Figura 1) e un cono nasale di anestesia sicuro per fornire anestesia inalante per mantenere un piano di anestesia durante la procedura (b nella Figura 1).
- Utilizzare un supporto per sonda ad ultrasuoni per facilitare lo spostamento della sonda a ultrasuoni nella posizione desiderata e per evitare che la sonda si appoggi sull'animale.
- Utilizzare gel ad ultrasuoni riscaldato sulla pelle in cui viene acquisita l'immagine ad ultrasuoni.
- Mantenere le seguenti impostazioni durante tutta la procedura, che possono essere regolate sul touch screen: Acoustic Power 0.0 dB; Sintonizzatore Tissutale 1540 m/s; Gamma dinamica 60 dB; Intervallo di elasticità (per la modalità SWE) < 30 kPa.
- Collegare la sonda ad ultrasuoni al sistema di binari nel supporto specializzato (a nella Figura 1).
- Accendere lo strumento e consentirne l'avvio. Una volta acceso il monitor, prendere nota dell'immagine in modalità B con i dettagli del trasduttore collegato.
3. Preparazione del soggetto
- Assicurarsi che gli animali siano a digiuno almeno 4 ore prima della procedura di imaging per evitare che il contenuto intestinale interferisca con l'acquisizione delle immagini.
- Dopo almeno 4 ore di digiuno, posizionare un ratto in una camera di induzione anestetica isoflurano fino a raggiungere un livello adeguato di anestesia, confermato da nessuna risposta al pizzico. Esporre gli animali al 3-5% di isoflurano per 3-5 minuti per indurre l'anestesia.
- Per l'anestesia di mantenimento, mantenere gli animali sotto il 2-3% di isoflurano durante l'acquisizione dell'immagine. Applicare un unguento oftalmico per proteggere l'occhio dall'essiccazione durante l'anestesia.
- Una volta raggiunta l'anestesia, rimuovere un animale dalla camera di induzione e posizionarlo su una coperta di acqua calda circolante. Posizionare un cono nasale anestetico sopra il muso e radere l'animale sul lato destro, dalla gabbia toracica al bacino. Utilizzare la crema di depilazione chimica per rimuovere tutti i peli rimanenti in quest'area.
- Una volta rimossi i peli, posizionare un animale in posizione laterale sinistra con le zampe superiori nastrate sopra la testa su una piattaforma di imaging calda (Figura 3A).
- Premere il tasto Paziente sul pannello di controllo dello strumento e identificare il soggetto in base al disegno dello studio.
- Aprire la funzione Tastiera sullo strumento toccando l'icona sul touch screen. Digitare i nomi desiderati.
- Toccare Esci per uscire dalla schermata del nome del paziente. Osservare che la modalità B si riapre sul monitor.
4. Acquisizione di immagini per la misurazione dell'indice epato-renale (HR)
- Applicare una piccola quantità di gel ad ultrasuoni riscaldato sulla regione della pelle depilata sull'animale.
- Spostare la sonda ad ultrasuoni per toccare l'area coperta di gel del soggetto (Figura 3B). Una volta che un'immagine in modalità B dal vivo degli organi interni del soggetto appare sul monitor, spostare la sonda ad ultrasuoni nell'area leggermente sopra l'anca, appena parallela alle vertebre lombari (piano sagittale).
- Utilizzando il display in modalità B sul monitor, individuare il rene destro identificando la grande arteria renale e la separazione corteccia/midollo (Figura 4A). Inoltre, osservare parte del fegato in un singolo piano dell'immagine.
- Assicurati che ci siano pochi o nessun artefatto dell'immagine come ombre e bolle d'aria.
- Misurare un rapporto B Mode per ottenere l'indice HR.
- Assicurarsi che sia la corteccia renale che il parenchima epatico siano sullo stesso piano di messa a fuoco. Se necessario, regola la messa a fuoco e ottieni il controllo per ottenere un'immagine chiara.
- Regolare la messa a fuoco ruotando la manopola Focus sul pannello di controllo. Regola il guadagno premendo una volta il pulsante Auto TGC.
- Premere il tasto Blocca sul pannello di controllo. Assicurati che l'animale sia tra i respiri quando congela lo schermo per evitare immagini sfocate.
- Una volta bloccato lo schermo, toccare Strumenti di misurazione sul touch screen. Selezionare rapporto in modalità B, uno strumento integrato che misura la luminosità relativa di un tessuto da una regione di interesse selezionata. Create un cerchio di 2 mm per selezionare una regione di interesse (ROI). Regolate le dimensioni del cerchio muovendo un dito lungo il bordo esterno della trackball sul pannello di controllo.
- Posizionare il cerchio di 2 mm sul ROI dell'immagine del fegato, che deve essere posizionato a destra del rene. Identificare il tessuto epatico in base alla sua ecogenicità omogenea e al contorno liscio.
- Una volta che il cerchio è in posizione, premere il pulsante Seleziona sul pannello di controllo e osservare il nuovo cerchio che appare.
- Regolare la dimensione del nuovo cerchio a 2 mm e posizionarlo sull'immagine della corteccia renale. Assicurati di mantenere la profondità dei cerchi sul fegato e sulla corteccia renale allo stesso modo. Una volta sul posto, premere il pulsante Seleziona sul pannello di controllo. Osservare che lo strumento di sistema integrato visualizza l'indice HR come rapporto B-mode.
- Premere Salva immagine per salvare l'immagine e osservare le immagini salvate visualizzate come miniature sul lato destro del monitor.
- Premere il pulsante Blocca sul pannello di controllo per sbloccare l'immagine e tornare a un'immagine in modalità B dal vivo.
- Assicurarsi che sia la corteccia renale che il parenchima epatico siano sullo stesso piano di messa a fuoco. Se necessario, regola la messa a fuoco e ottieni il controllo per ottenere un'immagine chiara.
- Ripetere la misurazione del rapporto B Mode 3 volte a diverse profondità e piani di tessuto. Calcola la media di questi tre rapporti B-mode per ogni animale e punto temporale.
5. Acquisizione di immagini per Shear Wave Elastography
- Spostare la sonda trasversalmente nell'area subcostale destra per individuare il fegato utilizzando la modalità B. Individuare un'area del fegato che è per lo più parenchima e priva di grandi vasi sanguigni come la vena porta e l'arteria epatica. Una volta trovata un'area chiara del fegato, generare una mappa di elasticità al taglio del tessuto premendo il pulsante SWE sul pannello di controllo.
- Regolare le dimensioni e la posizione della scatola SWE sotto la capsula epatica in un'area priva di ombre. Identificare la capsula come una linea ecogenica luminosa vicino alla parte superiore del fegato.
- Osservate che la casella SWE passa a una mappa a colori entro 5-10 s. Una volta che la scatola è piena e stabile, premi il pulsante Freeze sul pannello di controllo quando l'animale è tra i respiri.
NOTA: La quantità minima di copertura della scatola dovrebbe essere del 60-80% per valutare con precisione l'elasticità del fegato. - Sul touch screen, tocca QBox, uno strumento di sistema integrato che calcola l'elasticità da un ROI sulla mappa di elasticità dell'onda di taglio. Osservare il cerchio e la casella di dati visualizzati sul monitor. Regolare la posizione del QBox toccando l'icona della posizione sul touch screen per la configurazione desiderata.
- Regolare la dimensione del cerchio a 3 mm muovendo un dito lungo il bordo esterno della trackball sul pannello di controllo. Utilizzando la trackball, posizionare il cerchio in un'area priva di ombre con colorazione uniforme (Figura 5A,B). Fare attenzione ad evitare aree note di rigidità come i vasi sanguigni o la capsula del fegato, così come sanguinare da queste strutture.
- Quando viene trovata un'area adeguata, premere Salva immagine sul pannello di controllo per salvare l'immagine. Ripeti questa procedura 3 volte in diverse aree del fegato. Spostare la sonda su e giù o lateralmente sull'addome per raccogliere immagini mappate SWE da diverse aree del fegato.
- Una volta raccolte tutte le immagini, premere End Exam sul pannello di controllo e prendere nota della schermata delle informazioni sul paziente visualizzata sul monitor.
- Rimuovere il nastro dalle zampe dell'animale, pulire il gel in eccesso e rimuovere l'animale dalla fase di imaging. Lasciarlo recuperare dall'anestesia in una gabbia calda e asciutta da solo fino a completo recupero. Monitorare ogni animale per garantire il pieno recupero dall'anestesia, indicato dalla sua capacità di mantenere la reclinenza sternale
- Ripetere i passaggi nelle sezioni 4-5 per ogni animale della coorte da immaginare.
6. Recupero e analisi dei dati delle immagini
- Quando sono state raccolte immagini per tutti gli animali, disattivare l'anestesia.
- Per estrarre i dati dell'immagine dalla macchina, premere il pulsante Revisione sul pannello di controllo e osservare tutte le scansioni eseguite su quello strumento che appaiono sul monitor. Cerca le scansioni desiderate utilizzando la finestra di ricerca nell'angolo superiore dello schermo.
- Seleziona tutte le scansioni necessarie per l'analisi dei dati selezionando la casella accanto al nome del paziente tramite la trackball e il pulsante Seleziona. Una volta evidenziate tutte le scansioni necessarie, selezionare Esporta JPEG sul touch screen. Esportare i dati su un'unità di rete o su un'unità USB (Universal Serial Bus) portatile. Individuare le porte USB sul retro dello strumento.
- Una volta che i file sono stati esportati, aprire i singoli file jpg di ogni scansione su un computer workstation. Osserva tutti i dati sul lato destro dell'immagine: B Mode Ratio-raccogli il numero B Ratio; Q Box-raccogliere il valore di elasticità media (kPa).
- Inserisci tutti i dati in un foglio di calcolo o in un altro software di gestione di database ed esegui le analisi statistiche desiderate.
7. Analisi istologica di campioni di fegato
- Alla fine della6a settimana, eseguire l'autopsia su metà della coorte di ciascun gruppo per l'analisi istologica a metà studio dei campioni di fegato. Allo stesso modo, l'eutanasia del resto della coorte di animali e raccogliere campioni di fegato per l'analisi istologica al punto temporale della12a settimana.
- Per la colorazione ORO, fissare le sezioni epatiche in formalina tamponata neutra al 10% e crioconservarle con saccarosio utilizzando una soluzione refrigerata al 30% di saccarosio durante la notte come minimo. Crio-incorporare le sezioni in un composto di temperatura di taglio ottimale e crio-sezionarle su vetrini carichi per prepararsi alla colorazione ORO.
- Posizionare le criosezioni in glicole propilenico al 100% per 2 minuti, seguite da un'incubazione notturna in soluzione ORO allo 0,5%. Dopo la rimozione dalla soluzione ORO, differenziare le sezioni in glicole propilenico all'85% per 1 minuto, risciacquare in acqua deionizzata e controbattere con la modifica di Mayer Hematoxylin-Lillie per 1 minuto.
- Posizionare i coverslip sulle diapositive utilizzando un mezzo di montaggio acquoso e asciugarli a temperatura ambiente.
- Per PSR, deparaffinizzare i vetrini di sezione epatica fissati in formalina e incorporati nella paraffina, posizionarli durante la notte in Bouin Fluid, quindi colorarli usando una scala automatica secondo il protocollo del produttore con alcuni passaggi ottimizzati (1% di acido fosfomolibdico per 5 minuti; 0,1% di Sirius Red in acido picrico saturo per 90 minuti; 2 x 30 s lavaggio in acido acetico allo 0,5%). Disidratare automaticamente le diapositive e quindi montarle con un mezzo di montaggio permanente.
- Acquisire immagini delle diapositive macchiate ORO e PSR utilizzando lo scanner digitale con ingrandimento 20x, salvarle in formato .svs e memorizzarle nel database delle immagini del gestore diapositive.
- Analizza le immagini utilizzando algoritmi personalizzati creati in software di patologia digitale. Applicare uniformemente applicazioni software di patologia digitale con parametri di soglia per identificare e quantificare l'area delle sezioni epatiche e le aree macchiate di ORO e PSR. Esportare le misurazioni in un foglio di calcolo per i calcoli percentuali dell'area.
8. Analisi statistica
- Esegui l'analisi statistica dei dati di imaging con ANOVA bidirezionale utilizzando il test di confronto multiplo di Sidak per valutare la differenza tra gruppi in diversi punti temporali. Si suppongano differenze significative tra i gruppi per i valori di probabilità p ≤ 0,001. Inoltre, eseguire la correlazione delle analisi di imaging con le analisi istologiche.
- Utilizzare statistiche non parametriche per analizzare i risultati dell'analisi istologica di questo studio. Riportare i valori del gruppo come mediani ± intervallo semi-interquartile (sIQR). Si suppongano differenze significative tra i gruppi per i valori di probabilità p ≤ 0,001. Utilizzare un test di Mann-Whitney per confrontare la quantità di macchia istochimica PSR e ORO tra diversi gruppi.
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Representative Results
Un segno distintivo degli animali nutriti con CDAHFD è la steatosi. L'accumulo di grasso nel fegato modifica le proprietà ecogeniche del tessuto, che possono essere quantificate misurando la luminosità del fegato e normalizzandola alla luminosità della corteccia renale da un'immagine B-mode presa sullo stesso piano. Il valore quantificato è espresso come indice HR, che è una misura indiretta della steatosi. Nella Figura 4A,un'immagine rappresentativa del fegato di un animale di controllo mostra approssimativamente uguale o inferiore luminosità (ecogenicità) rispetto alla corteccia renale. Pertanto, l'indice HR degli animali normali è <1. In questo studio, l'indice HR medio degli animali di controllo al time point di 3 settimane è 0,645 ± 0,03. Al contrario, un'immagine rappresentativa in modalità B di un animale alimentato con CDAHFD (Figura 4A) mostra una maggiore luminosità del fegato rispetto alla corteccia renale. Di conseguenza, gli indici HR delle immagini rappresentative degli animali della dieta CDAHFD erano 1,91 e 1,79 rispettivamente ai punti temporali di 6 e 12 settimane.
La Figura 4C mostra un grafico degli indici HR nel tempo da animali di controllo e CDAHFD. Gli animali alimentati con dieta di controllo mostrano poco movimento nei valori dell'indice HR rispetto al basale, mentre gli animali CDAHFD aumentano rapidamente nel corso delle prime 3-6 settimane dello studio prima di raggiungere un plateau. L'indice HR medio degli animali che hanno avuto una dieta CDAHFD è di 1,861 ± 0,06 rispetto a 0,328 ± 0,03 negli animali di controllo a 12 settimane dopo l'induzione della malattia. Come previsto, il fegato ha mostrato un'area percentuale positiva significativamente più alta per la colorazione ORO nel gruppo CDAHFD rispetto al gruppo con dieta di controllo a 6- (34,81 ± 4,66 vs. 0,49 ± 0,11) e 12- (30,08 ± 2,64 vs. 1,17 ± 0,44) punti temporali settimanali (Figura 4B,D). C'era anche un'eccellente correlazione (Pearson r = 0,78) tra l'area percentuale della colorazione ORO con l'indice HR ai punti temporali di 6 e 12 settimane (Figura 4E). Questi risultati suggeriscono che l'indice HR può essere una preziosa lettura di imaging per quantificare la steatosi in modelli preclinici di NAFLD / NASH.
Uno degli elementi chiave per misurare la rigidità epatica tramite SWE è il corretto posizionamento del ROI (Figura 5). Il pannello di sinistra (Figura 5A) mostra un'immagine rappresentativa con la mappatura B-mode e SWE del fegato da un animale con dieta di controllo. Il corretto posizionamento del ROI dovrebbe essere su un'area che è stabile nella mappa dei colori e rappresenta la sezione del fegato da misurare, con un segnale che non è influenzato da strutture adiacenti come la capsula epatica e i vasi sanguigni. La rigidità tissutale è riportata come modulo E, che è un calcolo basato sulla velocità dell'onda di taglio e una costante determinata ed è espresso in kilopascal (kPa). Per gli animali di controllo, il modulo E cade tra 3,5 kPa e 6 kPa. Il kPa medio dei ROI riportati nella Figura 5A per gli animali di controllo è stato di 4,6 e 5,5 kPa rispettivamente ai punti temporali di 6 e 12 settimane, che rientrano nell'intervallo normale previsto. La Figura 5A mostra un'immagine rappresentativa della modalità SWE da un animale CDAHFD a 6 e 12 settimane. Qui, il ROI è stato nuovamente posizionato vicino al centro della Q Box (mappa delle onde di taglio), in base al riferimento colorato nella parte superiore dell'immagine.
Come previsto con questo modello, il modulo E è molto più alto nell'animale alimentato con CDAHFD. In queste immagini rappresentative, il kPa medio era di 10,5 a 6 settimane e 23,1 kPa a 12 settimane, indicando una significativa rigidità tissutale. Un tipico studio sulla dieta NASH che utilizza CDAHFD e chow di controllo dovrebbe rivelare una progressione costante della rigidità epatica dovuta alla fibrosi negli animali alimentati con CDAHFD, mentre gli animali di controllo rimangono gli stessi. La Figura 5C mostra un graduale aumento dell'elasticità del fegato negli animali CDAHFD rispetto all'elasticità stabile negli animali di controllo per un periodo di 12 settimane. L'elasticità della dieta di controllo inizia a 5,80 ± 0,99 kPa al punto temporale di 3 settimane e non mostra molti cambiamenti (6,14 ± 0,59) nel corso dello studio di 12 settimane. La dieta carente di colina, tuttavia, mostra un aumento significativo abbastanza presto, raggiungendo 12,07 ± 2,37 kPa entro la settimana 6. La tendenza all'aumento dell'elasticità continua nella dieta CDAHFD man mano che lo studio progredisce, raggiungendo 24,43 ± 9,29 kPa a 12 settimane dopo l'inizio della dieta speciale.
I campioni di fegato sono stati colorati con PSR per localizzare il collagene come correlato della fibrosi. Come previsto con questo modello, c'è una percentuale significativamente più alta di colorazione PSR-positiva al fegato osservata negli animali CDAHFD rispetto alla dieta di controllo a 6 e 12 punti temporali (Figura 5D). Per stabilire l'utilità dell'onda di taglio come metodo surrogato per la colorazione ex vivo, i numeri del modulo E dell'onda di taglio sono stati tracciati contro l'area macchiata di PSR nei ratti CDAHFD nella Figura 5E per determinare la correlazione. L'analisi del grafico ha rivelato un cluster stretto con un valore "r" di Pearson di 0,88, indicando una forte correlazione. Va notato che i risultati riportati qui sono rappresentativi di ciò che ci si aspetterebbe in uno studio che utilizza una dieta carente di colina e ricca di grassi per indurre nash. Questo metodo può essere utilizzato anche con altri modelli NASH preclinici; tuttavia, produrrà risultati e valori di cut-off diversi a seconda del protocollo di induzione della malattia. Come il modello NASH del ratto, l'imaging SWE nel modello murino NASH indotto da CDAHFD ha mostrato un'eccellente correlazione tra i valori di elasticità epatica e la percentuale di area colorata PSR-positiva nel fegato13. Pertanto, SWE può essere uno strumento prezioso per valutare la fibrosi epatica in modelli preclinici di NAFLD / NASH.
Figura 1: Configurazione dell'imaging. Il trasduttore ad ultrasuoni (a) è trattenuto dal braccio discendente. Lo stadio di imaging (b) ha un'area per bloccare il tubo di anestesia e impostare un cono nasale (c) per l'anestesia continua durante l'imaging. Il palco è inoltre riscaldato e dotato di sonde per monitorare la temperatura corporea. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Lo strumento di elastografia Shear Wave. (A) Lo strumento di elastografia ad onda di taglio è una singola unità a ruote con porte di attacco per un massimo di 4 sonde ad ultrasuoni. (B) Il monitor superiore funge da uscita visiva per la visualizzazione in tempo reale delle immagini, nonché la visualizzazione dei dati dei pazienti e l'inventario del sistema. (C) Il pannello di controllo centrale contiene la maggior parte dei pulsanti e delle manopole necessari per regolare la visualizzazione e acquisire immagini. (D) Il monitor inferiore è un touch screen con controlli e comandi aggiuntivi per l'acquisizione e la regolazione delle immagini. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Posizionamento dell'animale e corretto posizionamento del trasduttore. (A) Una volta che un animale è stato correttamente posizionato sul palco e trattenuto con la reclinazione laterale sinistra con nastro adesivo (B), la sonda ad ultrasuoni viene abbassata sul ratto, toccando il gel posto sull'addome / lato. Quando la sonda tocca il gel nella posizione nel pannello B,il rene e il fegato possono essere visti in giustapposizione sul monitor. Questa è una posizione ottimale per raccogliere l'indice epato-renale e, in alcuni casi, anche i numeri delle onde di taglio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Risultati dell'indice epato-renale. (A) Immagine rappresentativa degli indici HR dei ratti con dieta di controllo e CDAHFD a 6 e 12 settimane. I ROI (rosso) sono stati disegnati nel rene (cerchio sinistro) e nel fegato (cerchio destro), quindi è stato determinato un rapporto dei segnali (rapporto B, tabella dati destra). (B) Sezioni istologiche rappresentative macchiate di ORO di campioni di fegato provenienti da ratti con dieta di controllo e CDAHFD a 6 e 12 settimane. Barre di scala = 300 μm. (C) Rappresentazione grafica dell'indice HR su un decorso dietetico che induce malattia. I dati di controllo sui ratti sono rappresentati in blu, i dati sui ratti CDAHFD in rosso. Il grafico mostra i valori medi con errore standard della media (n = 20 al punto temporale di 3 settimane e n = 20 per il controllo e n = 19 per CDAHFD a 6 settimane, n = 10 a 9 e 12 punti temporali di 12 settimane (confrontando il controllo con CDAHFD in ogni punto temporale *, **, ***, ****p < 0,001). (D) Calcoli ORO epatici tracciati per ogni punto temporale (n = 10). Il grafico mostra i valori mediani con intervallo interquartile (*, ** p < 0,001). (E) Grafico di correlazione che confronta la percentuale di area ORO-positiva al fegato rispetto all'indice HR. Abbreviazioni: HR = epato-renale; CDAHFD = dieta carente di colina, ricca di grassi; ROI = regioni di interesse; ORO = Oil Red O. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Risultati dell'elastografia ad onda di taglio. (A) Immagine rappresentativa delle mappe SWE dei ratti di controllo e della dieta CDAHFD a 6 e 12 settimane. I ROI (rosso) sono stati disegnati nel rene (cerchio sinistro) e nel fegato (cerchio destro), quindi è stato determinato un rapporto dei segnali (rapporto B, tabella dati destra). (B) Sezioni istologiche rappresentative macchiate di ORO di campioni di fegato provenienti da ratti con dieta di controllo e CDAHFD a 6 e 12 settimane. La barra di scala sulle sezioni istologiche è di 300 μm. (C) Rappresentazione grafica della rigidità del tessuto epatico in un modello di ratto NASH indotto da una dieta di 12 settimane. I gruppi sono stati alimentati con chow normale (blu) o dieta ricca di grassi carente di colina (rosso) (n = 20 a 3 e 6 settimane, n = 10 a 9 e 12 settimane). Il grafico mostra i valori medi con errore standard della media (n = 20 a 3 e 6 settimane, n = 10 a 9 e 12 punti temporali (confrontando il controllo con CDAHFD in ogni punto temporale *, **, *** p < 0,001). (D) Rappresentazione grafica della distribuzione del collagene in campioni di fegato istologico ex vivo utilizzando colorazione PSR collagen-specifica (n = 10). Il grafico mostra valori mediani con intervallo interquartile (*, ** P < 0,001) (E) Grafico di correlazione che confronta l'area di colorazione PSR epatica positiva percentuale rispetto all'elasticità SWE. SWE = elastografia ad onda di taglio; CDAHFD = dieta carente di colina, ricca di grassi; ROI = regioni di interesse; ORO = Olio Rosso O; NASH = steatoepatite non alcolica; PSR = Picro Sirio Rosso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'imaging basato su ultrasuoni, inclusa la SWE, può essere uno strumento inestimabile per la valutazione longitudinale della steatosi epatica e della rigidità nei modelli preclinici di NAFLD / NASH. Questo documento descrive metodologie dettagliate su come acquisire immagini di alta qualità B-mode e SWE di fegati per la misurazione dell'indice HR e dell'elasticità utilizzando un modello di NASH indotto dalla dieta CDAHFD. Inoltre, i risultati mostrano un'eccellente correlazione dell'indice HR e dell'elasticità con il gold standard di valutazione-valutazione istologica del tessuto epatico. Mentre la procedura stessa sembra essere semplice, ci sono alcuni aspetti critici del protocollo che garantiranno risultati positivi.
Il posizionamento del trasduttore è fondamentale, soprattutto quando si cerca il rene per misurare l'indice HR in modalità B. Posizionare la sonda troppo vicino alle costole può causare l'ombra della costola, che crea false misure di attenuazione degli ultrasuoni. Inoltre, la rimozione di tutti i capelli utilizzando sia la crema da barba che la depilazione è importante, poiché i capelli rimanenti possono intrappolare bolle d'aria, che proiettano ombre sulle immagini in modalità B. Infine, poiché la presenza di cibo nello stomaco e nell'intestino può oscurare il fegato, specialmente nei normali animali nutriti con chow, un adeguato digiuno di tutti gli animali è fondamentale per il successo dell'imaging del fegato.
Sebbene le misurazioni dell'elasticità epatica da SWE e l'indice HR siano preziose lette per valutare la fibrosi epatica e la steatosi in modelli preclinici di NASH, la tecnica ha alcune limitazioni. Fattori come l'infiammazione, la congestione epatica, la colestasi e l'ostruzione del tratto di deflusso influenzano la rigidità epatica e, quindi, possono influenzare la specificità complessiva di questa tecnica nella misurazione della fibrosiepatica 8,14,15,16. Allo stesso modo, la luminosità del fegato nelle immagini ecografiche in modalità B può essere influenzata dalla fibrosi e, quindi, può influenzare l'accuratezza dell'indice HR nella misurazione della steatosi. Sono necessari ulteriori studi per chiarire il contributo di questi fattori che influenzano l'elasticità e la steatosi e stabilire valori di cut-off per queste lettura in diversi modelli preclinici di NASH. Inoltre, questo studio non ha valutato la sensibilità dell'indice HR come biomarcatore per valutare la steatosi epatica in uno studio di efficacia preclinica.
La misurazione della rigidità epatica utilizzando SWE ha il potenziale per diventare uno strumento prezioso per comprendere la fisiopatologia della NASH / NAFLD e per lo sviluppo di nuovi trattamenti per questa condizione. Consentendo al ricercatore di determinare sia la steatosi epatica che la rigidità dei tessuti senza la necessità di una biopsia invasiva, gli animali negli studi preclinici possono essere monitorati longitudinalmente e gli effetti dei farmaci su singoli soggetti possono essere quantificati nel tempo.
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Disclosures
Tutti gli autori sono dipendenti di Pfizer, Inc.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il team operativo di medicina comparativa di Pfizer per il loro duro lavoro di cura e garanzia della salute degli animali in studio, nonché per l'assistenza con alcune delle tecniche. Inoltre, i ringraziamenti sono dovuti a Danielle Crowell, Gary Seitis e Jennifer Ashley Olson per il loro aiuto con l'elaborazione dei tessuti per le analisi istologiche. Inoltre, gli autori desiderano ringraziare Julita Ramirez per aver esaminato e fornito preziosi feedback durante la preparazione di questo manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aixplorer | Supersonic Imagine | Shear Wave Elastography Instrument | |
| Aixplorer SuperLinear SLH20-6 Transducer | Supersonic Imagine | Transducer for Shear Wave Elastography | |
| Alpha-dri bedding | rat cages | ||
| Aperio AT2 scanner | Leica Biosystems | Digital Pathology Brightfield Scanner | |
| Compac 6 Anesthesia System | VetEquip | Anesthesia Vaporizer and Delivery System. Any anesthesia delivery system can be used, however. | |
| Manage Imager Database | Leica Biosystems | Digital Pathology | |
| Mayer's Hematoxilin | Dako/Agilent | H&E Staining/Histology | |
| Nair | Church & Dwight | Hair remover | |
| Oil Red O solution | Poly Scientific | Lipid Staining/Histology | |
| Picrosirius Red Stain (PSR) | Rowley Biochemical | F-357-2 | Collagen Stain/Histology |
| Puralube Opthalmic ointment | Dechra Veterinary Product | Lubrication to prevent eye dryness during anesthesia | |
| Tissue-Tek Prisma Plus | Sakura Finetek USA | Automated slide stainer | |
| VISIOPHARM software | Visiopharm | Digital pathology software | |
| Research Diets | A06071309i | NASH inducing diet | |
| Purina | 5053 | Control animal chow | |
| Vevo imaging station | Fujifilm VisualSonics | The Vevo imaging station is used for holding the ultrasound transducer during imaging. | |
| Wistar Han rats | Charles River Laboratories |
References
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