Summary
Dit protocol beschrijft het gebruik van een verbeterde ultrasone techniek om niet-invasief leverweefselveranderingen te observeren en te kwantificeren in knaagdiermodellen van niet-alcoholische leververvetting.
Abstract
Niet-alcoholische steatohepatitis (NASH) is een aandoening binnen het spectrum van niet-alcoholische leververvetting (NAFLD), die wordt gekenmerkt door ophoping van levervet (steatose) en ontsteking die leidt tot fibrose. Preklinische modellen die menselijke NASH/NAFLD nauw samenvatten, zijn essentieel bij de ontwikkeling van geneesmiddelen. Hoewel leverbiopsie momenteel de gouden standaard is voor het meten van NAFLD / NASH-progressie en diagnose in de kliniek, is in de preklinische ruimte ofwel verzameling van hele levermonsters op meerdere tijdstippen tijdens een studie of biopsie van de lever nodig voor histologische analyse om het ziektestadium te beoordelen.
Het uitvoeren van een leverbiopsie halverwege de studie is een invasieve en arbeidsintensieve procedure en het verzamelen van levermonsters om het ziekteniveau te beoordelen, verhoogt het aantal onderzoeksdieren dat nodig is voor een onderzoek. Er is dus behoefte aan een betrouwbare, vertaalbare, niet-invasieve beeldvormingsbiomarker om NASH / NAFLD in deze preklinische modellen te detecteren. Niet-invasieve echografie-gebaseerde B-modus beelden en Shear Wave Elastography (SWE) kunnen worden gebruikt om steatose en leverfibrose te meten. Om het nut van SWE in preklinische knaagdiermodellen van NASH te beoordelen, werden dieren op een pro-NASH-dieet geplaatst en ondergingen ze niet-invasieve ultrasone B-modus en shear wave elastografie beeldvorming om de hepatorenale (HR) index en leverelasticiteit te meten, waarbij de progressie van respectievelijk levervetaccumulatie en weefselstijfheid op meerdere tijdstippen in de loop van een bepaalde NAFLD / NASH-studie werd gemeten.
De HR-index en elasticiteitsgetallen werden vergeleken met histologische markers van steatose en fibrose. De resultaten toonden een sterke correlatie tussen de HR-index en het percentage Oil Red O (ORO) kleuring, evenals tussen elasticiteit en Picro-Sirius Red (PSR) kleuring van levers. De sterke correlatie tussen klassieke ex vivo methoden en in vivo beeldvormingsresultaten levert bewijs dat shear wave elastografie/echografie-gebaseerde beeldvorming kan worden gebruikt om het fenotype en de progressie van de ziekte te beoordelen in een preklinisch model van NAFLD/NASH.
Introduction
Niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) is een metabole aandoening die wordt gekenmerkt door een overmatige opeenhoping van vet in de lever en wordt snel een toonaangevende leveraandoening wereldwijd met een onlangs gerapporteerde wereldwijde prevalentie van 25%1. Niet-alcoholische steatohepatitis (NASH) is een meer gevorderd stadium van het spectrum van NAFLD, gekenmerkt door overtollig levervet met progressieve cellulaire schade, ontsteking en fibrose. Deze aandoeningen zijn vaak stil, onopgemerkt via bloedonderzoek of routineonderzoeken, totdat er al aanzienlijke schade is opgetreden aan de lever van een patiënt. Momenteel is de gouden standaard om NASH bij patiënten te diagnosticeren door histologisch onderzoek van van de patiënt afgeleide leverbiopsiemonsters. Evenzo vertrouwen preklinische onderzoekers die werken aan het begrijpen van de pathogenese van NASH / NAFLD en de geneesmiddelenontwikkelingsindustrie op in vivo wigbiopsie van levermonsters of terminale euthanasie van satellietcohorten voor histologie om steatose, ontsteking en fibrose te meten.
Leverwigbiopsie is bijvoorbeeld een standaardtechniek voor het beoordelen van steatohepatitis en fibrose tijdens het gebruik van het GUBRA NASH-model2. De leverwigbiopsiemethode is invasief en arbeidsintensief bij kleine dieren3. Het gebruik van wigleverbiopsie in het midden van een studie vertegenwoordigt een toegevoegde experimentele variabele in een ziektemodel, waardoor het aantal dieren dat nodig is vaak toeneemt. Met deze factoren in gedachten blijken niet-invasieve beeldvormingstechnieken die kunnen worden gebruikt om steatose en fibrose in NASH / NAFLD-diermodellen op vroege tijdstippen betrouwbaar te beoordelen, waardevol. Shear wave elastography (SWE) is een op echografie gebaseerde methode die wordt gebruikt om de elasticiteit van zachte weefsels te meten. De techniek meet de voortplanting van schuifgolven gecreëerd door supersonische ultrasone pulsen gericht op een weefseldoel en berekent vervolgens een waarde genaamd E modulus4. De snelheid van de schuifgolf is evenredig met de mate van weefselstijfheid.
Figuur 1 en figuur 2 tonen de opstelling van het beeldvormingsgebied en het SWE-instrument. Het SWE-instrument is een enkele eenheid op wielen met twee schermen en een bedieningspaneel in figuur 2A. De bovenste monitor(figuur 2B)fungeert als de computermonitor en geeft beelden en patiëntmappen weer. Hetbedieningspaneel (Figuur 2C)is een reeks knoppen en draaiknoppen die algemene aspecten van het vastleggen van afbeeldingen regelen: het bevriezen van het scherm, het opslaan van afbeeldingen, het overschakelen van de ene modus naar de andere. Het onderste scherm(Figuur 2D)is een aanraakscherm met extra bedieningselementen om instellingen te wijzigen en fungeert als een toetsenbord om gegevens in te voeren als dat nodig is. Het instrument is uitgerust met een stylus om desgewenst op het touchscreen te gebruiken. Ultrasone sondes worden bevestigd aan het onderste voorpaneel van het apparaat. Voor B-mode en SWE beeldvorming bij knaagdieren werd de super-lineaire 6 tot 20 MHz transducer gebruikt. Dit vermogen om weefselstijfheid niet-invasief te meten, maakt SWE een waardevol hulpmiddel voor de identificatie en stadiëring van leverfibrose5 bij NASH-patiënten, waardoor de behoefte aan meer invasieve methoden afneemt. SWE is in feite gebruikt om leverfibrose bij patiënten te meten en is een door de FDA goedgekeurde methode om fibrose in de kliniek te scoren6. Het gebruik van SWE om de NASH-progressie in diermodellen van de ziekte te volgen, zou een translationeel hulpmiddel zijn voor de ontwikkeling van behandelingen en tegelijkertijd het dierenwelzijn verbeteren door de vermindering van het aantal proefpersonen en verfijning van in vivo procedures om pijn en angst te minimaliseren.
SWE-beeldvorming bij menselijke patiënten maakt gebruik van een laagfrequente ultrasone transducer4, wat niet ideaal is voor kleine dieren. Met name zijn hoogfrequente SWE-technieken gebruikt om de werkzaamheid van acetyl-CoA carboxylase remming op pathogenese van NASH in een rat model7te evalueren , en het nut van deze techniek is beschreven in koolstoftetrachloride rat modellen van leverfibrose met succesvolle resultaten in vergelijking met traditionele METAVIR histologische scoringsmethoden8. In de bestaande literatuur ontbreekt het echter aan gedetailleerde technische en methodologische informatie over de toepassing van SWE-beeldvorming in preklinische modellen van NASH. Zoals hierboven beschreven, is leversteatose een van de belangrijkste kenmerken van de NAFLD / NASH-aandoening en is het een belangrijke fase waarin interventie kan worden overwogen. Het beoordelen van de accumulatie van levervet met behulp van een beeldvormingsmodaliteit is dus net zo belangrijk als het beoordelen van leverfibrose in preklinische modellen van NASH / NAFLD.
Een ultrasone techniek die bekend staat als de HR-index, een verhouding van weefselhelderheid van de lever in vergelijking met die van de nierschors, is gebruikt als een surrogaatmarker van steatose in de kliniek9,10. Deze benadering is echter niet op grote schaal gebruikt in preklinische diermodellen van NAFLD / NASH. Dit artikel beschrijft een methode voor het meten van elasticiteit en de HR-index als een surrogaatmarker van respectievelijk leverfibrose en steatose in een choline-deficiënt, vetrijk dieet (CDAHFD) rattenmodel van NAFLD / NASH. Dit model induceert snelle steatose, leverontsteking en fibrose, die meetbaar is binnen 6 weken bij muizen11. Het is aangetoond dat de toevoeging van cholesterol (1%) aan dit dieet fibrogenese bij rattenbevordert 12, waardoor dit model een geschikte kandidaat is voor validatiestudies met afschuifgolfbeeldvorming. Over het algemeen kan deze beeldvormingstechnologie ook worden toegepast op een breed scala aan NASH-modellen / diëten waar steatose en / of fibrose een eindpunt van belang is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures waarbij dieren betrokken zijn, werden beoordeeld en goedgekeurd door pfizer's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) en uitgevoerd in een AAALAC (Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care) Internationale geaccrediteerde faciliteit.
1. Ziekte-inductie
- Gebruik mannelijke Wister Han-ratten (150-175 g; ~ 6-7 weken oud; in totaal 40 ratten) die vrij zijn van bekende rattenavontionale pathogenen. Huisvest de ratten in paren in individueel geventileerde caging met papieren beddengoed (zie de tabel met materialen ) en houd ze op 22 ± 1 °C, 40-70% relatieve vochtigheid met een licht-donkercyclus van12:12 uur.
- Plaats de ratten met een gewicht van 150-175 g (~ 6-7 weken oud) op een choline-deficiënt, vetrijk dieet met 1% cholesterol (n = 20) of een standaard laboratoriumknaagdier chow (n = 20), afhankelijk van de onderzoeksopzet.
OPMERKING: In deze studie werden in totaal 40 ratten ingeschreven met 20 dieren per groep. Aan het einde van de6e week werd de helft van het cohort van elke groep obductie uitgevoerd voor histologische analyse van levermonsters halverwege de studie. De steekproefomvang was dus 10 dieren per groep voorde tijdspunten van de 9e en12e week.
2. Instrument instellen
- Stel het beeldvormingsgebied als volgt in: neem een verwarmd oppervlak op om het dier warm te houden tijdens de beeldvorming (c in figuur 1)en een beveiligde anesthesieneuskegel om inhalatie-anesthesie toe te staan om gedurende de hele procedure een vlak van anesthesie te behouden (b in figuur 1).
- Gebruik een ultrasone sondehouder om het verplaatsen van de ultrasone sonde naar de gewenste locatie te vergemakkelijken en om te voorkomen dat de sonde op het dier rust.
- Gebruik verwarmde ultrasone gel op de huid waar het ultrasone beeld wordt verkregen.
- Handhaaf de volgende instellingen gedurende de hele procedure, die kunnen worden aangepast op het aanraakscherm: Akoestisch vermogen 0,0 dB; Tissue Tuner 1540 m/s; Dynamisch bereik 60 dB; Elasticiteitsbereik (voor SWE-modus) < 30 kPa.
- Bevestig de ultrasone sonde aan het railsysteem in de gespecialiseerde houder (a in figuur 1).
- Schakel het instrument in en laat het opstarten. Zodra de monitor is ingeschakeld, noteer je het B Mode-beeld met aangesloten transducerdetails.
3. Voorbereiding van het onderwerp
- Zorg ervoor dat de dieren ten minste 4 uur voorafgaand aan de beeldvormingsprocedure worden gevast om te voorkomen dat de darminhoud de beeldverwerving verstoort.
- Plaats na ten minste 4 uur vasten een rat in een isofluraan-anesthetische inductiekamer totdat een geschikt niveau van anesthesie is bereikt, bevestigd door geen reactie op teenknijpen. Stel de dieren gedurende 3-5 minuten bloot aan 3-5% isofluraan om anesthesie te induceren.
- Houd de dieren voor onderhoudsanesthesie onder 2-3% isofluraan tijdens beeldverwerving. Breng oogheelkundige zalf aan om het oog te beschermen tegen uitdroging tijdens anesthesie.
- Zodra de anesthesie is bereikt, verwijdert u een dier uit de inductiekamer en plaatst u het op een warmwater circulerende deken. Plaats een verdovingsneus over de snuit en scheer het dier aan de rechterkant, van de ribbenkast tot het bekken. Gebruik chemische ontharingscrème om al het resterende haar in dit gebied te verwijderen.
- Zodra het haar is verwijderd, plaatst u een dier in linker zijdelingse lighoek met bovenpoten afgeplakt boven het hoofd op een warm beeldvormingsplatform (figuur 3A).
- Druk op de patiënttoets op het bedieningspaneel van het instrument en identificeer het onderwerp op basis van de onderzoeksopzet.
- Open de keyboardfunctie op het instrument door op het pictogram op het aanraakscherm te tikken. Typ de gewenste namen.
- Tik op Afsluiten om het scherm met de naam van de patiënt te verlaten. Merk op dat de B-modus opnieuw wordt geopend op de monitor.
4. Beeldacquisitie voor hepato-renale (HR) indexmeting
- Breng een kleine hoeveelheid verwarmde ultrasone gel aan op het ontharen van de huid op het dier.
- Beweeg de ultrasone sonde om het met gel bedekte gebied van het onderwerp aan te raken(figuur 3B). Zodra een live B-modus beeld van de inwendige organen van het onderwerp op de monitor verschijnt, verplaatst u de ultrasone sonde naar het gebied iets boven de heup, net evenwijdig aan de lumbale wervels (sagittale vlak).
- Met behulp van het B-modus display op de monitor, lokaliseer de rechter nier door de grote nierslagader en cortex / medulla scheiding te identificeren(Figuur 4A). Observeer bovendien een deel van de lever in een enkel vlak van het beeld.
- Zorg ervoor dat er weinig tot geen beeldartefacten zijn, zoals schaduwen en luchtbellen.
- Meet een B Mode ratio om de HR-index te verkrijgen.
- Zorg ervoor dat zowel de nierschors als het leverparenchym zich in hetzelfde focusvlak bevinden. Pas indien nodig de focus aan en krijg controle om een duidelijk beeld te krijgen.
- Pas de scherpstelling aan door aan de focusknop op het bedieningspaneel te draaien. Pas de versterking aan door eenmaal op de Auto TGC-knop te drukken.
- Druk op de toets Bevriezen op het bedieningspaneel. Zorg ervoor dat het dier tussen de ademhalingen door is bij het bevriezen van het scherm om wazige beelden te voorkomen.
- Zodra het scherm is vastgelopen, tikt u op Meethulpmiddelen op het aanraakscherm. Selecteer B-mode Ratio, een ingebouwd hulpmiddel dat de relatieve helderheid van een weefsel uit een geselecteerd interessegebied meet. Maak een cirkel van 2 mm om een interessegebied (ROI) te selecteren. Pas de cirkelgrootte aan door een vinger langs de buitenrand van de trackball op het bedieningspaneel te bewegen.
- Plaats de cirkel van 2 mm op de ROI van het leverbeeld, die zich rechts van de nier moet bevinden. Identificeer leverweefsel op basis van de homogene echogeniciteit en gladde contour.
- Zodra de cirkel op zijn plaats is, drukt u op de knop Selecteren op het bedieningspaneel en observeert u de nieuwe cirkel die verschijnt.
- Pas de grootte van de nieuwe cirkel aan op 2 mm en plaats deze op het beeld van de niercortex. Zorg ervoor dat de diepte van de cirkels op de lever- en nierschors hetzelfde blijft. Eenmaal op zijn plaats, drukt u op de knop Selecteren op het bedieningspaneel. Observeer dat de ingebouwde systeemtool de HR-index weergeeft als een B-modusverhouding.
- Druk op Afbeelding opslaan om de afbeelding op te slaan en bekijk de opgeslagen afbeeldingen die als miniaturen aan de rechterkant van het beeldscherm worden weergegeven.
- Druk op de knop Bevriezen op het bedieningspaneel om de afbeelding te deblokkeren en terug te keren naar een live B-modusbeeld.
- Zorg ervoor dat zowel de nierschors als het leverparenchym zich in hetzelfde focusvlak bevinden. Pas indien nodig de focus aan en krijg controle om een duidelijk beeld te krijgen.
- Herhaal de B-modusverhoudingsmeting 3 keer op verschillende diepten en vlakken van weefsel. Bereken het gemiddelde van deze drie B-modusverhoudingen voor elk dier en tijdspunt.
5. Beeldverwerving voor Shear Wave Elastography
- Beweeg de sonde dwars in het rechter subcostale gebied om de lever te lokaliseren met behulp van de B-modus. Zoek een gebied van de lever dat meestal parenchym is en vrij van grote bloedvaten zoals de poortader en de leverslagader. Zodra een duidelijk gebied van de lever is gevonden, genereert u een afschuifelasticiteitskaart van het weefsel door op de SWE-knop op het bedieningspaneel te drukken.
- Pas de grootte en positie van het SWE-vak onder de levercapsule aan in een gebied dat vrij is van schaduwen. Identificeer de capsule als een heldere echogene lijn in de buurt van de bovenkant van de lever.
- Merk op dat het vak SWE binnen 5-10 s overgaat in een kleurenkaart. Zodra de doos vol en stabiel is, drukt u op de knop Bevriezen op het bedieningspaneel wanneer het dier tussen de ademhalingen door is.
OPMERKING: De minimale hoeveelheid doosdekking moet 60-80% zijn om de elasticiteit van de lever nauwkeurig te beoordelen. - Tik op het aanraakscherm op QBox, een ingebouwde systeemtool die elasticiteit berekent op basis van een ROI op de afschuifgolfelasticiteitskaart. Observeer de cirkel en het gegevensvak die op de monitor worden weergegeven. Pas de positie van de QBox aan door op het positiepictogram op het aanraakscherm te tikken naar de gewenste instelling.
- Pas de grootte van de cirkel aan op 3 mm door een vinger langs de buitenrand van de trackball op het bedieningspaneel te bewegen. Plaats de cirkel met behulp van de trackball in een gebied zonder schaduw met uniforme kleuren(Figuur 5A,B). Zorg ervoor dat u bekende gebieden van stijfheid zoals bloedvaten of het leverkapsel vermijdt, evenals bloeden van deze structuren.
- Wanneer een geschikt gebied is gevonden, drukt u op Afbeelding opslaan op het bedieningspaneel om de afbeelding op te slaan. Herhaal deze procedure 3 keer in verschillende delen van de lever. Beweeg de sonde op en neer of zijwaarts op de buik om SWE-kaartbeelden uit verschillende delen van de lever te verzamelen.
- Zodra alle afbeeldingen zijn verzameld, drukt u op Eindexamen op het bedieningspaneel en noteren u het patiëntinformatiescherm dat op de monitor verschijnt.
- Verwijder de tape van de poten van het dier, veeg overtollige gel weg en verwijder het dier uit het beeldvormingsstadium. Laat het herstellen van anesthesie in een warme, droge kooi totdat het volledig is hersteld. Controleer elk dier om volledig herstel van anesthesie te garanderen, aangegeven door zijn vermogen om sternale ligtijd te behouden
- Herhaal de stappen in secties 4-5 voor elk dier in het cohort dat moet worden afgebeeld.
6. Ophalen en analyseren van beeldgegevens
- Wanneer beelden voor alle dieren zijn verzameld, schakelt u de anesthesie uit.
- Als u beeldgegevens van het apparaat wilt ophalen, drukt u op de knop Controleren op het bedieningspaneel en observeert u alle scans die op dat instrument zijn uitgevoerd en op de monitor worden weergegeven. Zoek naar de gewenste scans met behulp van het zoekvenster in de bovenhoek van het scherm.
- Selecteer alle scans die nodig zijn voor data-analyse door het vakje naast de naam van de patiënt aan te vinken via de trackball en de knop Selecteren. Zodra alle benodigde scans zijn gemarkeerd, selecteert u JPEG's exporteren op het aanraakscherm. Exporteer gegevens naar een netwerkstation of een draagbaar USB-station (Universal Serial Bus). Zoek de USB-poorten aan de achterkant van het instrument.
- Zodra de bestanden zijn geëxporteerd, opent u afzonderlijke jpg-bestanden van elke scan op een werkstationcomputer. Observeer alle gegevens aan de rechterkant van de afbeelding: B Mode Ratio-verzamel het B Ratio-nummer; Q Box-verzamel de gemiddelde elasticiteitswaarde (kPa).
- Voer alle gegevens in een spreadsheet of andere databasebeheersoftware in en voer de gewenste statistische analyses uit.
7. Histologische analyse van levermonsters
- Aan het einde van de6e week, voer obductie uit op de helft van het cohort van elke groep voor mid-studie histologische analyse van de levermonsters. Euthanaseer op dezelfde manier de rest van het cohort dieren en verzamel levermonsters voor histologische analyse op het tijdstip vande 12e week.
- Voor ORO-kleuring fixeert u leversecties in 10% neutraal gebufferde formaline en cryopreservert u ze met sucrose met een gekoelde 30% sucrose-oplossing gedurende een nacht op een minimum. Cryo-embed de secties in optimale snijtemperatuurverbinding en cryo-sectie ze op geladen dia's om zich voor te bereiden op ORO-kleuring.
- Plaats de cryo-secties gedurende 2 minuten in 100% propyleenglycol, gevolgd door een incubatie gedurende een nacht in 0,5% ORO-oplossing. Na verwijdering uit de ORO-oplossing, differentiëren de secties in 85% propyleenglycol gedurende 1 minuut, spoelen in gedeïoniseerd water en counterstain met Mayer's Hematoxylin-Lillie's modificatie gedurende 1 min.
- Plaats coverslips op de platen met behulp van een waterig montagemedium en droog ze bij kamertemperatuur.
- Voor PSR, deparaffiniseer formaline-gefixeerde, paraffine-ingebedde leversectieglaasjes, plaats ze een nacht in Bouin Fluid en kleur ze vervolgens met behulp van een geautomatiseerde diakleuring volgens het protocol van de fabrikant met enkele geoptimaliseerde stappen (1% fosfolybdisch zuur gedurende 5 minuten; 0,1% Sirius Rood in verzadigd picrinezuur gedurende 90 minuten; 2 x 30 s wassen in 0,5% azijnzuur). De dia's worden automatisch gedehydrateerd en vervolgens gemonteerd met een permanent montagemedium.
- Leg afbeeldingen van de ORO- en PSR-gekleurde dia's vast met behulp van de digitale microscopiescanner met een vergroting van 20x, sla ze op in .svs-indeling en sla ze op in de diamanager-afbeeldingsdatabase.
- Analyseer de afbeeldingen met behulp van aangepaste algoritmen die zijn gemaakt in software voor digitale pathologie. Pas op uniforme wijze digitale pathologiesoftwaretoepassingen toe met drempelparameters om het gebied van de leversecties en de ORO- en PSR-gekleurde gebieden te identificeren en te kwantificeren. Exporteer de metingen naar een spreadsheet voor gebiedspercentageberekeningen.
8. Statistische analyse
- Voer statistische analyse van de beeldvormingsgegevens uit met tweerichtings-ANOVA met behulp van Sidak's meervoudige vergelijkingstest om het verschil tussen groepen op verschillende tijdstippen te beoordelen. Ga uit van significante verschillen tussen groepen voor waarschijnlijkheidswaarden p ≤ 0,001. Voer bovendien correlatie van beeldvormingsuitleingen uit met histologische analyses.
- Gebruik niet-parametrische statistieken om de histologische analyseresultaten van deze studie te analyseren. Rapporteer de groepswaarden als mediaan ± semi-interkwartielbereik (sIQR). Ga uit van significante verschillen tussen groepen voor waarschijnlijkheidswaarden p ≤ 0,001. Gebruik een Mann-Whitney-test om de hoeveelheid PSR en ORO histochemische kleuring tussen verschillende groepen te vergelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een kenmerk van dieren die CDAHFD krijgen, is steatose. Accumulatie van vet in de lever verandert de echogene eigenschappen van het weefsel, die kunnen worden gekwantificeerd door de helderheid van de lever te meten en deze te normaliseren tot de helderheid van de nierschors van een B-modusbeeld dat in hetzelfde vlak is genomen. De gekwantificeerde waarde wordt uitgedrukt als een HR-index, wat een indirecte maat is voor steatose. In figuur 4Atoont een representatief leverbeeld van een controledier ongeveer dezelfde of minder helderheid (echogeniciteit) in vergelijking met de niercortex. De HR-index van normale dieren is dus <1. In deze studie is de gemiddelde HR-index van controledieren op het 3-weekse tijdstip 0,645 ± 0,03. Daarentegen toont een representatief B-modusbeeld van een CDAHFD-gevoed dier (figuur 4A) een verhoogde helderheid van de lever in vergelijking met de nierschors. Als gevolg hiervan waren de HR-indices van representatieve beelden van de CDAHFD-dieetdieren respectievelijk 1,91 en 1,79 op de 6- en 12-weekse tijdstippen.
Figuur 4C toont een plot van HR-indices in de loop van de tijd van controle- en CDAHFD-dieren. Controledieet-gevoede dieren vertonen weinig beweging in HR-indexwaarden vanaf baseline, terwijl CDAHFD-dieren snel stijgen in de loop van de eerste 3-6 weken van het onderzoek voordat ze een plateau bereiken. De gemiddelde HR-index van dieren die een CDAHFD-dieet volgden, is 1,861 ± 0,06 vergeleken met 0,328 ± 0,03 bij controledieren 12 weken na de inductie van de ziekte. Zoals verwacht vertoonde de lever een significant hoger positief procentgebied voor ORO-kleuring in de CDAHFD-groep in vergelijking met de controledieetgroep op 6- (34,81 ± 4,66 vs. 0,49 ± 0,11) en 12- (30,08 ± 2,64 vs. 1,17 ± 0,44) weektijdpunten(Figuur 4B,D). Er was ook een uitstekende correlatie (Pearson r = 0,78) tussen het procentuele gebied van ORO-kleuring met de HR-index op de 6- en 12-weekse tijdspunten (Figuur 4E). Deze resultaten suggereren dat de HR-index een waardevolle beelduitlezing kan zijn om steatose te kwantificeren in preklinische modellen van NAFLD / NASH.
Een van de belangrijkste elementen van het meten van leverstijfheid via SWE is de juiste plaatsing van de ROI(figuur 5). Het linkerdeelvenster (Figuur 5A) toont een representatief beeld met B-modus en SWE mapping van lever van een controledieetdier. De juiste ROI-plaatsing moet worden geplaatst over een gebied dat stabiel is in de kleurenkaart en het gedeelte van de lever vertegenwoordigt dat wordt gemeten, met een signaal dat niet wordt beïnvloed door aangrenzende structuren zoals het leverkapsel en de bloedvaten. Weefselstijfheid wordt gerapporteerd als de E-modulus, een berekening op basis van de afschuifgolfsnelheid en een bepaalde constante en wordt uitgedrukt in kilopascal (kPa). Bij controledieren valt de E-modulus tussen 3,5 kPa en 6 kPa. De gemiddelde kPa van de IN figuur 5A gerapporteerde ROIs voor controledieren was 4,6 en 5,5 kPa op respectievelijk de 6- en 12-weekse tijdstippen, wat binnen het verwachte normale bereik valt. Figuur 5A toont een representatief beeld van de SWE-modus van een CDAHFD-dier na 6 en 12 weken. Hier is de ROI opnieuw in de buurt van het midden van de Q Box (shear wave map) geplaatst, op basis van de gekleurde referentie bovenop de afbeelding.
Zoals verwacht met dit model, is de E-modulus veel hoger in het CDAHFD-gevoede dier. In deze representatieve beelden was de gemiddelde kPa 10,5 na 6 weken en 23,1 kPa na 12 weken, wat wijst op significante weefselstijfheid. Een typische NASH-dieetstudie met behulp van CDAHFD en controle chow zou een gestage progressie van leverstijfheid als gevolg van fibrose bij de CDAHFD-gevoede dieren moeten onthullen, terwijl controledieren hetzelfde blijven. Figuur 5C toont een geleidelijke toename van de elasticiteit van de lever bij CDAHFD-dieren in vergelijking met stabiele elasticiteit bij controledieren gedurende een periode van 12 weken. De elasticiteit van het controledieet begint bij 5,80 ± 0,99 kPa op het tijdstip van 3 weken en vertoont niet veel verandering (6,14 ± 0,59) in de loop van de 12 weken durende studie. Het choline-deficiënte dieet vertoont echter vrij vroeg een significante toename en bereikt 12,07 ± 2,37 kPa in week 6. De trend in verhoogde elasticiteit zet zich voort in het CDAHFD-dieet naarmate de studie vordert en bereikt 24,43 ± 9,29 kPa 12 weken na het starten van het speciale dieet.
Levermonsters werden gekleurd met PSR om collageen te lokaliseren als een correlatie van fibrose. Zoals verwacht met dit model, is er een significant hoger percentage lever PSR-positieve kleuring waargenomen bij CDAHFD-dieren in vergelijking met het controledieet op zowel 6- als 12-weekse tijdstippen(figuur 5D). Om het nut van de afschuifgolf als surrogaatmethode voor ex vivo kleuring vast te stellen, werden afschuifgolf E Modulus-nummers uitgezet tegen het PSR-gekleurde gebied bij CDAHFD-ratten in figuur 5E om de correlatie te bepalen. Analyse van de plot onthulde een strakke cluster met een Pearson 'r'-waarde van 0,88, wat wijst op een sterke correlatie. Opgemerkt moet worden dat de hier gerapporteerde resultaten representatief zijn voor wat zou worden verwacht in een studie met behulp van een choline-deficiënt, vetrijk dieet om NASH te induceren. Deze methode kan ook worden gebruikt met andere preklinische NASH-modellen; het zal echter verschillende resultaten en afkapwaarden opleveren, afhankelijk van het ziekte-inductieprotocol. Net als het NASH-model bij ratten vertoonde de SWE-beeldvorming in het CDAHFD-geïnduceerde NASH-muismodel een uitstekende correlatie tussen leverelasticiteitswaarden en het percentage PSR-positief gekleurd gebied in de lever13. SWE kan dus een waardevol hulpmiddel zijn om leverfibrose te beoordelen in preklinische modellen van NAFLD / NASH.
Figuur 1: Imaging setup. De ultrasone transducer (a) wordt vastgehouden door de dalende arm. De beeldvormingsfase (b) heeft een gebied om de anestheesthesieslang te klemmen en een neuskegel (c) op te zetten voor continue anesthesie tijdens beeldvorming. Het podium is ook verwarmd en uitgerust met sondes om de lichaamstemperatuur te controleren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Het Instrument voor de Elagrafie van de afschuifgolf. (A) Het afschuifgolfelagrafie-instrument is een enkele, op wielen gemonteerde eenheid met bevestigingspoorten voor maximaal 4 ultrasone sondes. (B)De bovenste monitor dient als visuele output voor real-time weergave van beelden, evenals het weergeven van patiëntgegevens en systeeminventaris. (C)Het centrale bedieningspaneel bevat de meeste knoppen en knoppen die nodig zijn om de weergave aan te passen en afbeeldingen te verkrijgen. (D) De onderste monitor is een aanraakscherm met extra bedieningselementen en opdrachten voor beeldacquisitie en -aanpassing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Positionering van het dier en juiste plaatsing van detransducer. (A) Zodra een dier op de juiste manier op het podium is geplaatst en in bedwang is gehouden met tape-in linker laterale lighouding (B) wordt de ultrasone sonde op de rat neergelaten en raakt de gel aan die op de buik / zijkant is geplaatst. Wanneer de sonde de gel in de positie in paneel Baanraakt, kunnen de nier en de lever naast elkaar op de monitor worden gezien. Dit is een optimale positie om de hepato-renale index te verzamelen, en in sommige gevallen ook de schuifgolfgetallen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Hepato-renale indexresultaten. (A) Representatief beeld van HR-indices van controle- en CDAHFD-dieetratten op tijdstippen van 6 en 12 weken. ROIs (rood) werden getekend in de nier (linkercirkel) en lever (rechtercirkel), waarna een verhouding van de signalen werd bepaald (B-ratio, rechtergegevenstabel). BRepresentatieve ORO-gekleurde histologische secties van levermonsters van controle- en CDAHFD-dieetratten op tijdstippen van 6 en 12 weken. Schaalbalken = 300 μm. (C) Grafische weergave van de HR-index over een ziekte-inducerend dieettijdverloop. Controleratgegevens worden weergegeven in blauw, CDAHFD-rattengegevens in rood. De grafiek toont gemiddelde waarden met standaardfout van het gemiddelde (n = 20 op het 3-weekse tijdspunt en n = 20 voor controle en n= 19 voor CDAHFD na 6 weken, n = 10 op 9- en 12-weekse tijdstippen (vergelijking van controle versus CDAHFD op elk tijdstip *, **, ***, ****p < 0,001). (D) Lever ORO berekeningen uitgezet voor elk tijdspunt (n = 10). De grafiek toont mediane waarden met interkwartielbereik (*, ** p < 0,001). (E) Correlatiegrafiek waarin het percentage lever ORO-positief gebied wordt vergeleken met de HR-index. Afkortingen: HR = hepato-renal; CDAHFD = choline-deficiënt, vetrijk dieet; ROIs = interessante regio's; ORO = Oil Red O. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Resultaten van de elastografie van de schuifgolf. (A)Representatieve afbeelding van SWE-kaarten van controle- en CDAHFD-dieetratten op tijdstippen van 6 en 12 weken. ROIs (rood) werden getekend in de nier (linkercirkel) en lever (rechtercirkel), waarna een verhouding van de signalen werd bepaald (B-ratio, rechtergegevenstabel). BRepresentatieve ORO-gekleurde histologische secties van levermonsters van controle- en CDAHFD-dieetratten op tijdstippen van 6 en 12 weken. De schaalbalk op histologische secties is 300 μm. (C) Grafische weergave van leverweefselstijfheid in een 12 weken dieet-geïnduceerd NASH-rattenmodel. Groepen kregen een normaal chow (blauw) of choline-deficiënt, vetrijk dieet (rood) (n = 20 na 3 en 6 weken, n = 10 op tijdstippen van 9 en 12 weken). De grafiek toont gemiddelde waarden met standaardfout van het gemiddelde (n = 20 na 3 en 6 weken, n = 10 op 9- en 12-weekse tijdstippen (waarbij controle versus CDAHFD op elk tijdstip * wordt vergeleken, **, *** p < 0,001). (D) Grafische weergave van collageenverdeling in ex vivo histologische levermonsters met behulp van collageenspecifieke PSR-kleuring (n = 10). De grafiek toont mediane waarden met interkwartielbereik (*, ** P < 0,001) (E) Correlatiegrafiek waarin procentuele positieve lever PSR-kleuringsgebied versus SWE-elasticiteit wordt vergeleken. SWE = afschuifgolf elastografie; CDAHFD = choline-deficiënt, vetrijk dieet; ROIs = interessante regio's; ORO = Olie Rood O; NASH = niet-alcoholische steatohepatitis; PSR = Picro Sirius Rood. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Echografie-gebaseerde beeldvorming, waaronder SWE, kan een waardevol hulpmiddel zijn voor de longitudinale beoordeling van leversteatose en stijfheid in preklinische modellen van NAFLD / NASH. Dit artikel beschrijft gedetailleerde methodologieën voor het verkrijgen van hoogwaardige B-modus en SWE-afbeeldingen van levers voor het meten van de HR-index en elasticiteit met behulp van een CDAHFD-dieet-geïnduceerd rattenmodel van NASH. Verder tonen de resultaten een uitstekende correlatie van de HR-index en elasticiteit met de gouden standaard van evaluatie-histologische beoordeling van leverweefsel. Hoewel de procedure zelf ongecompliceerd lijkt te zijn, zijn er enkele kritieke aspecten van het protocol die succesvolle resultaten zullen garanderen.
De plaatsing van de transducer is de sleutel, vooral bij het zoeken naar de nier om de HR-index in B-modus te meten. Het te dicht bij de ribben plaatsen van de sonde kan resulteren in ribschaduw, wat valse metingen van ultrasone verzwakking creëert. Verder is het verwijderen van al het haar met behulp van zowel scheer- als ontharingscrème belangrijk, omdat het resterende haar luchtbellen kan vangen, die schaduwen op B-modusbeelden zullen werpen. Ten slotte, omdat de aanwezigheid van voedsel in de maag en darmen de lever kan verduisteren, vooral bij normale met chow gevoede dieren, is adequaat vasten van alle dieren van cruciaal belang voor een succesvolle beeldvorming van de lever.
Hoewel leverelasticiteitsmetingen van SWE en de HR-index waardevolle uitlezingen zijn om leverfibrose en steatose te beoordelen in preklinische modellen van NASH, heeft de techniek een paar beperkingen. Factoren zoals ontsteking, levercongestie, cholestase en obstructie van het uitstroomkanaal beïnvloeden de leverstijfheid en kunnen dus de algehele specificiteit van deze techniek beïnvloeden bij het meten van leverfibrose8,14,15,16. Evenzo kan de helderheid van de lever in B-modus echografiebeelden worden beïnvloed door fibrose en kan dus de nauwkeurigheid van de HR-index bij het meten van steatose beïnvloeden. Meer studies zijn nodig om de bijdrage van deze beïnvloedende factoren op elasticiteit en steatose te verduidelijken en afkapwaarden voor deze uitleringen vast te stellen in verschillende preklinische modellen van NASH. Verder evalueerde deze studie niet de gevoeligheid van de HR-index als biomarker om leversteatose te beoordelen in een preklinische werkzaamheidsstudie.
Meting van leverstijfheid met behulp van SWE heeft het potentieel om een waardevol hulpmiddel te worden voor het begrijpen van de pathofysiologie van NASH / NAFLD en voor het ontwikkelen van nieuwe behandelingen voor deze aandoening. Door de onderzoeker in staat te stellen zowel leversteatose als weefselstijfheid te bepalen zonder dat een invasieve biopsie nodig is, kunnen dieren in preklinische studies longitudinaal worden gevolgd en kunnen medicijneffecten op individuele proefpersonen in de loop van de tijd worden gekwantificeerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs zijn werknemers van Pfizer, Inc.
Acknowledgments
De auteurs willen het Pfizer Comparative Medicine Operations Team bedanken voor hun harde werk om de gezondheid van de onderzoeksdieren te verzorgen en te waarborgen en om te helpen met enkele van de technieken. Ook zijn dank verschuldigd aan Danielle Crowell, Gary Seitis en Jennifer Ashley Olson voor hun hulp bij weefselverwerking voor histologische analyses. Daarnaast willen de auteurs Julita Ramirez bedanken voor het beoordelen en geven van waardevolle feedback tijdens de voorbereiding van dit manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aixplorer | Supersonic Imagine | Shear Wave Elastography Instrument | |
| Aixplorer SuperLinear SLH20-6 Transducer | Supersonic Imagine | Transducer for Shear Wave Elastography | |
| Alpha-dri bedding | rat cages | ||
| Aperio AT2 scanner | Leica Biosystems | Digital Pathology Brightfield Scanner | |
| Compac 6 Anesthesia System | VetEquip | Anesthesia Vaporizer and Delivery System. Any anesthesia delivery system can be used, however. | |
| Manage Imager Database | Leica Biosystems | Digital Pathology | |
| Mayer's Hematoxilin | Dako/Agilent | H&E Staining/Histology | |
| Nair | Church & Dwight | Hair remover | |
| Oil Red O solution | Poly Scientific | Lipid Staining/Histology | |
| Picrosirius Red Stain (PSR) | Rowley Biochemical | F-357-2 | Collagen Stain/Histology |
| Puralube Opthalmic ointment | Dechra Veterinary Product | Lubrication to prevent eye dryness during anesthesia | |
| Tissue-Tek Prisma Plus | Sakura Finetek USA | Automated slide stainer | |
| VISIOPHARM software | Visiopharm | Digital pathology software | |
| Research Diets | A06071309i | NASH inducing diet | |
| Purina | 5053 | Control animal chow | |
| Vevo imaging station | Fujifilm VisualSonics | The Vevo imaging station is used for holding the ultrasound transducer during imaging. | |
| Wistar Han rats | Charles River Laboratories |
References
- Younossi, Z. M., et al. Global epidemiology of nonalcoholic fatty liver disease-Meta-analytic assessment of prevalence, incidence, and outcomes. Hepatology. 64 (1), 73-84 (2016).
- Boland, M. L., et al. Towards a standard diet-induced and biopsy-confirmed mouse model of non-alcoholic steatohepatitis: Impact of dietary fat source. World Journal of Gastroenterology. 25 (33), 4904-4920 (2019).
- Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59130 (2019).
- Bercoff, J., Tanter, M., Fink, M. Supersonic shear imaging: a new technique for soft tissue elasticity mapping. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 51 (4), 396-409 (2004).
- Bavu, E., et al. Noninvasive in vivo liver fibrosis evaluation using supersonic shear imaging: a clinical study on 113 hepatitis C virus patients. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (9), 1361-1373 (2011).
- Ferraioli, G., et al. Accuracy of real-time shear wave elastography for assessing liver fibrosis in chronic hepatitis C: a pilot study. Hepatology. 56 (6), 2125-2133 (2012).
- Ross, T. T., et al. Acetyl-CoA carboxylase inhibition improves multiple dimensions of NASH pathogenesis in model systems. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (4), 829-851 (2020).
- Gu, L. H., Gu, G. X., Wan, P., Li, F. H., Xia, Q. The utility of two-dimensional shear wave elastography and texture analysis for monitoring liver fibrosis in rat model. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 20 (1), 46-52 (2020).
- Marshall, R. H., Eissa, M., Bluth, E. I., Gulotta, P. M., Davis, N. K. Hepatorenal index as an accurate, simple, and effective tool in screening for steatosis. American Journal of Roentgenology. 199 (5), 997-1002 (2012).
- Webb, M., et al. Diagnostic value of a computerized hepatorenal index for sonographic quantification of liver steatosis. American Journal of Roentgenology. 192 (4), 909-914 (2009).
- Tous, M., Ferre, N., Camps, J., Riu, F., Joven, J. Feeding apolipoprotein E-knockout mice with cholesterol and fat enriched diets may be a model of non-alcoholic steatohepatitis. Molecular and Cellular Biochemistry. 268 (1-2), 53-58 (2005).
- Kirsch, R., et al. Rodent nutritional model of non-alcoholic steatohepatitis: species, strain and sex difference studies. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 18 (11), 1272-1282 (2003).
- Journal of Ultrasound in Medicine.
- Engelmann, G., Quader, J., Teufel, U., Schenk, J. P. Limitations and opportunities of non-invasive liver stiffness measurement in children. World Journal of Hepatology. 9 (8), 409-417 (2017).
- Piscaglia, F., Salvatore, V., Mulazzani, L., Cantisani, V., Schiavone, C. Ultrasound shear wave elastography for liver disease. a critical appraisal of the many actors on the stage. Ultraschall in der Medizin. 37 (1), 1-5 (2016).
- Singh, S., Loomba, R. Role of two-dimensional shear wave elastography in the assessment of chronic liver diseases. Hepatology. 67 (1), 13-15 (2018).
