Summary
Desenvolvemos um método que enriquece e isola populações de astrócitos humanos de tecido fresco congelado para uso em análises moleculares a jusante.
Abstract
A complexidade dos astrócitos humanos permanece mal definida no tecido humano primário, exigindo melhores ferramentas para seu isolamento e caracterização molecular. A triagem de núcleos ativados pela fluorescência (FANS) pode ser usada para isolar e estudar com sucesso as populações de núcleos neuronais humanos (NeuN+) a partir de tecido arquivado congelado, evitando problemas associados ao manuseio de tecido fresco. No entanto, faltam esforços para isolar a astroglia da elemento não neuronal (NeuN-) Uma estratégia de imunotagging recentemente desenvolvida e validada usa três anticorpos fator de transcrição para isolar simultaneamente populações neuronais enriquecidas (NeuN+), astrócito (proteína de caixa emparelhada 6 (PAX6)+NeuN-), e progenitor de progenitor de oligodendrocite (OLIG2+NeuN-) populações de neocórtex temporal não-doente, fresco (não fixado)
Esta técnica mostrou-se útil para a caracterização de alterações transcriptome específicas do tipo celular no neocórtex da epilepsia patológica primária. Análises transcriômicas confirmaram que as populações classificadas por PAX6+NeuN são robustamente enriquecidas para marcadores pan-astrócitos e capturam astrócitos em condições de repouso e reativas. Este artigo descreve a metodologia FANS para o isolamento de populações de núcleos enriquecidos por astrócitos a partir de córtex humano congelado fresco, incluindo dissociação de tecido em suspensão de núcleo único (sn); imunotagging de núcleos com anticorpos anti-NeuN e anti-PAX6 fluorescentemente conjugados; Estratégias de gating do FANS e métricas de controle de qualidade para otimizar sensibilidade e especificidade durante a triagem e para confirmar o enriquecimento de astrócitos; e aquisição recomendada para sequenciamento de acessibilidade de transcriptome a jusante e cromatina em resolução a granel ou sn. Este protocolo é aplicável para amostras corticais não necróticas, congeladas e humanas com várias patologias e coleta recomendada de tecido pós-morte dentro de 24 h.
Introduction
A complexidade molecular dos astrócitos humanos permanece pouco definida no tecido primário, exigindo melhores ferramentas para seu isolamento e caracterização em alta resolução, tanto na saúde quanto na doença. A separação de neurônios humanos intactos e glia de seu nicho tem se mostrado difícil devido ao acesso limitado de amostras de tecido cerebral fresco, à natureza fortemente interconectada dos processos gliais e neuronais, e à inevitável ativação celular durante o processamento, tudo isso limitando a caracterização molecular desses tipos celulares ex vivo1 . A classificação de núcleos ativados pela fluorescência (FANS) surgiu como uma alternativa à classificação de células vivas, permitindo a dissociação e o imunotagging das populações de núcleos a partir de tecido congelado. Na última década, o FANS tornou-se amplamente utilizado para isolar e caracterizar molecularmente populações de núcleos neuronais humanos (NeuN+) em uma variedade de espécimes cerebrais e regiões anatômicas 1,2,3,4.
No entanto, métodos semelhantes para isolar subpopulações específicas de núcleos gliais do córtex humano têm sido limitados, levando a uma relativa falta de sofisticação na compreensão da complexidade dos astrócitos em tecidos normais e doentes. Para isso, um protocolo publicado anteriormente foi adaptado para isolar populações neuronais humanas usando o FANS4, e um método foi validado para enriquecer para os astrócitos (e para progenitores oligodendroglial) usando uma combinação de anticorpos triplos, capturando astrócitos em condições de repouso e reativa5. Para enriquecer especificamente os astrócitos na fração de NeuN, anticorpos foram usados contra um dos dois fatores de transcrição conhecidos por serem expressos diferencialmente entre populações de astrócitos, pax6 ou fator de transcrição caixa de SRY 9 (SOX9)6,7. Pax6 é altamente expresso durante o desenvolvimento fetal precoce dentro de progenitores radiais semelhantes a glia em zonas germinais e contribui para neurogênese e gliogênese 8,9,10,11, bem como para especificação neuronal12. No adulto, pax6 é diferencialmente superexpresso em astrócitos humanosem repouso 6 e mostra co-expressão proteica com proteína ácida fibrilar gliana (GFAP) em astrócitos de tecido de epilepsia humana13.
Este protocolo descreve o isolamento simultâneo das populações de núcleos neocorticais e enriquecidos por astrócitos pelo FANS. O tecido pós-morte fresco (não fixado) (ou seja, congelado fresco) coletado do córtex adulto é primeiro dissociado mecanicamente e quimicamente. Após a lise e a ultracentrifugação em um gradiente de sacarose, os componentes citoplasmados e extracelulares são descartados enquanto os núcleos são retidos. Os núcleos são então rotulados com anticorpos nucleares fluorescentes conjugados correspondentes às linhagens alvo desejadas e classificados usando VENTILADORES. Após essa abordagem, o enriquecimento dos astrócitos é demonstrado nas populações PAX6+NeuN coletadas, validadas tanto por um painel qPCR direcionado quanto pelo sequenciamento nuclear de RNA a jusante.
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Protocol
NOTA: O Programa de Proteção de Sujeitos Humanos da Faculdade de Medicina Icahn do Monte Sinai (ISMMS) e seu Conselho de Revisão Institucional (IRB) assegura a conduta ética da pesquisa e do cumprimento das regulamentações federais, estaduais e institucionais. Neste estudo, todos os espécimes pós-morte utilizados foram desidentifitados, obtidos sob o consentimento adequado através do biorepositório, e foram isentos da designação de "pesquisa humana" pelo IRB do ISMMS (HS#14-01007).
1. Preparação do buffer
NOTA: Se realizar o sequenciamento do RNA a jusante, trate minuciosamente todos os espaços de trabalho e ferramentas com a Solução de Descontaminação RNase para evitar a degradação do mRNA.
- Prepare o tampão de lise.
- Dissolver o seguinte em H2O destilado até 50 mL: 5,47 g de sacarose (final de 0,32 M), 250 μL de 1 M CaCl2 (final de 5 mM), 150 μL de 1 M Mg(CH3COO)2 (final de 3 mM), 10 μL de 500 mM ácido triacético (EDTA) (final de 0,1 mM), 500 μL de 1 M Tris-HCl (pH 8) (final de 10 mM), 50 μL de Triton X-100 (0,1% final), e 17 μL de 3 M dithiothiothreitol (DTT, final de 1 mM, adicionar fresco) (ver a Tabela de Materiais).
- Prepare o tampão de sacarose
- Dissolver o seguinte em H2O destilado até 50 mL: 30,78 g de sacarose (final de 1,8 M), 150 μL de 1 M Mg(CH3COO)0 2 (final de 3 mM), 500 μL de 1 M Tris-HCl (pH 8) (final de 10 mM), 17 μL de 3 M DTT (final de 1 mM, adicionar fresco).
2. Dissociação de tecido congelado em suspensão de núcleo único
- Adicione 4 mL de tampão de lise gelada a um douncer de tecido de vidro de 7 mL (moedor) e mantenha no gelo. Dissecar aproximadamente 200-400 mg de córtex adulto humano congelado fresco, dounce aproximadamente 50x, e transfira o tecido homogeneizar para um tubo de polipropileno ultracentrifuuge de 12 mL.
- Usando uma pipeta de 5 mL, adicione 6,5 mL de tampão de sacarose gelada ao fundo do tubo ultracentrífuga, tomando cuidado para não perturbar a camada entre a sacarose e o tecido homogeneizar.
NOTA: Se processar amostras adicionais, equilibre cuidadosamente os tubos em peso adicionando tampão de lise adicional à amostra mais leve. O equilíbrio preciso dos tubos ultracentrifuus é essencial para evitar danos ao rotor e garantir a rotação na velocidade adequada.
3. Ultracentrifugação
- Ultracentrizar o lysate a 24.400 rpm (101.814 × g) por 1h a 4 °C. Aspire cuidadosamente o supernatante e os detritos sem perturbar a pelota.
NOTA: Uma pelota pode não ser visível se começar com menos de 200 mg de tecido. - Adicione 600 μL de soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) (Ca2+, Mg2+ livre) à pelota dos núcleos e incubar no gelo por 10 minutos antes de reutilizar.
- Pipeta para cima e para baixo 50 vezes para resuspensar a pelota dos núcleos no gelo.
- Use um hemótmetro para visualizar os núcleos intactos sob um microscópio e para garantir que a concentração da resuspensão esteja acima de 105 núcleos/mL antes de prosseguir para o próximo passo (combine 10 μL dos núcleos resuspended com 10 μL de azul trypan).
4. Incubação de anticorpos
- Para imunoterreta a amostra para FANS, adicione 500 μL da pelota amostra resuspended, 490 μL de 1x PBS (Ca2+, Mg2+ grátis), 10 μL de 10% BSA (0,1% final), 1 μL de anticorpo anti-NeuN conjugado a AF555 (NeuN-AF5555, NeuN-AF5555, 1:1000 concentração final), e 1 μL de anticorpo anti-PAX6 conjugado à alofilia (PAX6-APC, 1:1000 concentração final).
NOTA: Anticorpos alternativos conjugados a outros fluoroforos podem ser adicionados (ver discussão). Aqui, o camundongo anti-OLIG2 conjugado ao AF488 (concentração de 1:1000) foi utilizado com resultados favoráveis. - Realize 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) somente e controles de cor única para configurar parâmetros de gating, utilizando uma pequena quantidade da amostra conforme necessário.
- Para realizar o controle de cor única AF555, adicione 20 μL da pelota amostra resuspended, 970 μL de 1x PBS (Ca2+, Mg2+ grátis), 10 μL de 10% BSA (0,1% final) e 1 μL de anticorpo NeuN-AF555 (1:10000 de concentração).
- Para realizar o controle de cor única APC, adicione 20 μL da pelota amostra resuspended, 970 μL de 1X PBS (Ca2+, Mg2+ livre), 10 μL de 10% BSA (0,1% final) e 1 μL de anticorpo PAX6-APC (1:1000 de concentração).
- Para realizar o controle somente da DAPI, adicione 20 μL da pelota amostra resuspended, 970 μL de 1X PBS (Ca2+, Mg2+ livre) e 10 μL de 10% BSA (0,1% final) (DAPI será adicionado mais tarde, ver 4,4).
NOTA: Se forem utilizados mais de dois anticorpos, recomenda-se a realização do controle de fluorescência-menos-um (FMO), além dos controles de cor única.
- Incubar as amostras e os controles com rotação no escuro por 1h a 4 °C.
- Adicione DAPI em 1:1000 a todas as amostras e controles, e proceda com a classificação.
5. Classificação de núcleos ativados por fluorescência (VENTILADOR)
NOTA: Recomenda-se o uso de uma instalação de citometria de fluxo institucional com assistência de pessoal treinado, a menos que já seja proficiente em técnicas de citometria/classificação de fluxo.
- Portão como mostrado abaixo.
- Primeiro, e para cada amostra, portão por dispersão para a frente (FSC-A) vs. dispersão lateral (SSC-A) para incluir partículas na faixa de tamanho apropriada para núcleos, excluindo assim glóbulos vermelhos e detritos (Figura 1A).
NOTA: Uma preparação de núcleos muito limpos pode distinguir entre um aglomerado de detritos menor e um aglomerado de núcleos. - Em seguida, e para cada amostra, gate por FSC-A vs. FSC-W (ou FSC-A vs. FSC-H) e SSC-A vs. SSC-W (ou SSC-A vs. SSC-H) para incluir apenas núcleos singlet (Figura 1B).
- Em seguida, e para cada amostra, portão da DAPI para incluir núcleos intactos singlets (população fechada da DAPI), excluindo detritos (DAPI-baixo, à esquerda da população fechada) e dobras (à direita da população fechada) (Figura 1C).
- Defina mais gating com base em controles de fluorescência, determinados visualmente como clusters distintos em parcelas FACS.
- Execute o controle somente da DAPI para determinar a coloração de fundo das populações, na ausência de anticorpos (Figura 1D e Figura 2A).
- Execute o controle somente neun-AF555 para determinar o corte de manchas de NeuN+ no canal para AF555 (Figura 2B).
- Execute o controle somente PAX6-APC para determinar o corte para coloração PAX6+ no canal APC (Figura 2C).
- Execute controles adicionais de cor única se usar mais anticorpos (Figura 2D,E).
NOTA: Se usar mais de dois anticorpos, recomenda-se um controle FMO para visualizar quaisquer mudanças nas populações.
- Uma vez executados todos os controles, desenhe os portões para coleções NeuN+ e PAX6+ acima dos limites estabelecidos.
- Portão da população NeuN+ para coletar neurônios (Figura 1E e Figura 2F).
- Portão a população PAX6+ da população neun para coletar astrócitos (Figura 1E,F e Figura 2F).
- Portão e coletar populações gliais adicionais (como células progenitoras oligodendrocyte, como mostrado aqui pelo OLIG2+) da população NeuN-PAX6 (Figura 1F).
NOTA: Caso a determinação de cortes adequados de gating seja difícil com o software de citometria de fluxo devido a populações indistintas, pode ser útil modificar o número de eventos que estão sendo visualizados (aumentando ou reduzindo o número de eventos na trama do FANS).
- Primeiro, e para cada amostra, portão por dispersão para a frente (FSC-A) vs. dispersão lateral (SSC-A) para incluir partículas na faixa de tamanho apropriada para núcleos, excluindo assim glóbulos vermelhos e detritos (Figura 1A).
- Colete amostras adequadamente com base na análise a jusante pretendida.
6. Coleção de populações de FÃS para análises moleculares a jusante
- Para sequenciamento de RNA a granel, colete 50.000-500.000 núcleos em PBS (ver também a seção 7.1).
- Adicione 2 mL de solução de sacarose, 50 μL de 1 M CaCl2 e 30 μL de 1 M Mg(CH3COO)2, e encha com PBS até 10 mL.
- Inverta e incuba no gelo por 15 minutos, depois centrífuga a 900 × g por 10-15 min a 4 °C.
- Aspire o supernaspe, resuspend em 1 mL de reagente extrato de RNA, vórtice, congele em gelo seco e armazene a -80 °C.
- Alternativamente, colecione as amostras diretamente em 200 μL do reagente extrato de RNA. Adicione o reagente extrator de RNA até 1 mL após a classificação, mantendo uma razão de 1:1 do reagente à amostra classificada. Vórtice, congele em gelo seco e armazene a -80 °C.
- Para ensaio em massa para cromatina acessível à transposase usando sequenciamento (ATAC-seq), colete 50.000-75.000 núcleos em PBS em um tubo de microcentrifuge revestido com 5% de albumina de soro bovino (BSA). Congele os núcleos em gelo seco/-80 °C ou utilize-os imediatamente para a preparação do ATAC.
- Para sn RNA-seq ou ATAC-seq, coletar núcleos em 0,04% BSA na PBS (ver também seção 7.2).
7. Dicas de preparação para pré-biblioteca
- Preparação da biblioteca de sequenciamento de RNA nuclear a granel
- Após a coleta no reagente de extração de RNA, realize a extração padrão de RNA fenol/clorofórmio adicionando fenol/clorofórmio e precipitando RNA da camada aquosa superior com etanol, seguido pela digestão DNase no tubo (15 min).
- Realize a limpeza e o concentrado de RNA em um volume final de 15 μL de água.
NOTA: Usando este método, a recuperação representativa de 300 mg de amostra de córtex adulto é de ~300.000 núcleos NeuN+ (15-20 ng/μL total de RNA após limpeza e concentração) e ~250.000 núcleos PAX6+ (10-12 ng/μL total RNA após limpeza e concentração). Esse rendimento representativo pode variar muito de acordo com a qualidade da amostra, a stringency gating e a recuperação do RNA. - Realizar reação quantitativa em cadeia de polimerase (qPCR) antes do sequenciamento para confirmar o enriquecimento de astrócitos com base na alta expressão diferencial de marcadores astrócitos canônicos (GFAP, SOX9), desidrogenase de 10 formiltetrahidrofola (ALDH1L1)) e esgotamento de marcadores de linhagem neuronal e outras células (Figura 1G).
NOTA: A coleta da população duplamente negativa (NeuN-PAX6-) permite uma análise de controle de qualidade qPCR mais precisa e multicamadas para o enriquecimento relativo dos astrócitos (Figura 2H). - Gere bibliotecas RNA-seq usando um kit recomendado para baixos valores de número de integridade de RNA, como esperado a partir de amostras pós-morte.
- Preparação da biblioteca de sequenciamento de núcleo único
- Realize o sequenciamento de sn através de um núcleo de sequenciamento institucional.
- Para processamento e sequenciamento baseados em nanofluidos, usar a concentração recomendada de 1 × 106 células/mL em pelo menos 60 μL de 1x PBS + 0,04% BSA para sequenciamento de RNA de núcleo único (snRNA-seq) e 3 × 106 células/mL em pelo menos 20 μL de 1x PBS + 0,04% BSA para ensaio de núcleo único para Chromatina Transposase-Acessível usando sequenciamento (snATAC-seq).
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Representative Results
Os núcleos foram coletados de tecido neocórtex temporal fresco (não fixado) com um tempo de coleta pós-morte de 12 h. Após a dissociação do tecido em suspensão de núcleos, as amostras foram incubadas com anticorpos contra NeuN, PAX6 e OLIG2, e classificadas de acordo com o gating mostrado na Figura 1 e Figura 2. Os núcleos foram coletados de populações classificadas por NeuN+, PAX6+NeuN e OLIG2+NeuN (Figura 1E,F e Figura 2F). Um painel qPCR direcionado revelou enriquecimento para os marcadores pan-astrócitos, GFAP e ALDH1L1, na população PAX6+(NeuN-) (Figura 1G e Figura 2H). Além disso, a população OLIG2+ foi enriquecida para o marcador PDGFRA (Figura 1G) do marcador PDGFRA (Figura 1G). O sequenciamento do RNA em massa das populações coletadas mostrou enriquecimento comparativo de marcadores de astrócitos e esgotamento de marcadores neuronais na população PAX6+(NeuN-) (Figura 1H). A imunofluorescência confirmou a colocalização de PAX6 com GFAP em astrócitos cortical humano adultos (Figura 1I).
Examinar controles de cor única revela populações positivas e negativas distintas para cada marcador, o que possibilitou a definição de cortes precisos para coleta (Figura 2A-G). Além disso, o isolamento fan enriquecido por astrócitos foi comparado com dois anticorpos diferentes contra marcadores nucleares de astrócito, SOX9 e PAX6. Uma maior porcentagem de eventos de núcleos foi capturada por FÃS usando PAX6 (~13,8%) do que por FÃS usando SOX9 (~6%) dentro do portão enriquecido por astrócitos (Figura 2F,G). Um painel qPCR direcionado revelou enriquecimento para GFAP, PAX6 e SOX9 em populações SOX9+(NeuN-) e PAX6+(NeuN-) (Figura 2H). Comparando retroativamente a dissociação e a coloração de várias amostras com intervalo pós-morte (PMI) variado revelou que um PMI mais curto estava associado a uma maior recuperação de núcleos intactos (Figura 3A). Tecido congelado com UM PMI de até 24 horas rendeu uma alta taxa de núcleos intactos, até 90%; a 30 h PMI, no entanto, muito poucos núcleos intactos poderiam ser recuperados (Figura 3A). A inclusão de uma etapa de lavagem de anticorpos no protocolo padrão (que normalmente omite esta etapa para otimizar a recuperação) não revelou mudanças significativas na separação de populações distintas de NeuN+/- ou PAX6+/- (Figura 3B).
Ocasionalmente, a má separação das populações PAX6+NeuN podia ser observada, mesmo em amostras com alta porcentagem de núcleos viáveis (Figura 3C), necessitando da repetição da dissociação tecidual e do protocolo FANS. Estudos de RNA-seq de núcleo único priorizaram ainda mais o PAX6 como um fator de transcrição nuclear expresso diferencialmente em subpopulações protoplasmáticas e fibrosas, não apenas no neocórtex, mas também na zona subventricular (SVZ) e estriato adjacente (Figura 3D). A comparação de NEUN/PAX6/OLIG2 triplo FÃS entre o neocórtex e o estriato derivados da mesma amostra cerebral mostrou diferenças específicas da região na separação dos núcleos PAX6+ (Figura 3E). Este protocolo é atualmente validado apenas para o neocórtex.
Figura 1: Validação do isolamento enriquecido por neurônios e astrócitos pelo FANS. (A-F) Exemplos representativos de VENTILADORES sequenciais que excluem detritos e dobras (A-C) e definem a coloração de fundo usando (D) um controle somente DAPI para a coleta de núcleos neuronais (E-F) enriquecidos (NeuN+), astrócitos (PAX6+NeuN-) e OPC (OLIG2++neuN-) populações. (G) Painel qPCR mínimo usando pan-astrócito (GFAP, Marcadores ALDH1L1), neuronal (RBFOX3) e OPC (PDGFRA) para controle de qualidade das populações coletadas (A-G: amostra de autópsia de neocórtex temporal sem patologia, PMI 12 h, 100.000 eventos mostrados; linhas pontilhadas representam populações sequenciais positivamente fechadas; linhas sólidas representam coleta final de populações enriquecidas do tipo celular). (H) Mapa de calor gerado a partir de dados de sequenciamento de RNA em massa normalizados de linha mostrando expressão de marcadores de astrócitos canônicos e neuronais em populações classificadas PAX6+ e NeuN+ (n=3 casos de autópsia, neocórtex temporal sem patologia, PMI 12-21 h). (I) Imagem representativa de imunofluorescência de PAX6, GFAP e NeuN em neocórtex humano. Setas indicam astrócitos co-expressando PAX6 e GFAP. Abreviaturas: FANS = fluorescência-ativar a classificação de núcleos; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenildole; NeuN = núcleos neuronais; PAX6 = proteína de caixa emparelhada 6; OLIG2 = fator de transcrição do oligodendrocito 2; OPC = célula progenitora oligodendrocyte; qPCR = reação quantitativa da cadeia da polimerase; GFAP = proteína ácida fibrilar gliana ; ALDH1L1 = 10-formyltetrahidrofolate desidrogenase; RBFOX3 = proteína de ligação de RNA FOX-1 homólogo 3; PDGFRA = fator de crescimento derivado de plaquetas alfa; PMI = intervalo pós-morte; SSC-A = área de dispersão lateral; FSC-A = área de dispersão para a frente; SSC-W = largura de dispersão lateral; FSC-W = largura de dispersão para a frente; NeuN-555 = camundongo anti-NeuN conjugado ao AF555; PAX6-APC = camundongo anti-PAX6 conjugado à alofilia; OLIG2-488 = camundongo anti-OLIG2 conjugado a corante fluorescente verde para a linha laser de 488 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Isolamento comparativo de populações enriquecidas por astrócitos usando anticorpos PAX6 ou SOX9. (A-E) Controles de cor única para DAPI, NeuN, PAX6, SOX9 e OLIG2 definem cortes positivos/negativos nos respectivos canais de fluorescência. (F-G) Método comparativo DO FANS para isolamento enriquecido por astrócitos usando (F) NeuN/PAX6 ou (G) anticorpos NeuN/SOX9. Uma porcentagem maior de eventos são capturados por PAX6 do que pelo SOX9 dentro do portão enriquecido por astrócitos. (A-G: espécime de neocórtex temporal pós-morte idêntico usado para todos os experimentos; 12 h PMI; 10.000 eventos mostrados). (H) A análise qPCR de controle de qualidade confirma o enriquecimento de marcadores de astrócitos e o esgotamento de marcadores não-astrócitos em populações classificadas PAX6++(NeuN-) e SOX9+(NeuN-) de F-G (dados normalizados para ACTB e quantificados como mudança de dobra da população NeuN+). Abreviaturas: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilôdole; NeuN = núcleos neuronais; PAX6 = proteína de caixa emparelhada 6; OLIG2 = fator de transcrição do oligodendrocito 2; SOX9 = Fator de transcrição da caixa SRY 9; qPCR = reação quantitativa da cadeia da polimerase; GFAP = proteína ácida fibrilar gliana ; RBFOX3 = proteína de ligação de RNA FOX-1 homólogo 3; PDGFRA = fator de crescimento derivado de plaquetas alfa; PMI = intervalo pós-morte; NeuN-555 = camundongo anti-NeuN conjugado ao AF555; PAX6-APC = camundongo anti-PAX6 conjugado à alofilia; OLIG2-488 = camundongo anti-OLIG2 conjugado a corante fluorescente verde para a linha laser de 488 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Métricas dependentes e independentes para experimentos de FÃs bem-sucedidos. (A) Efeito da coleta de amostras PMI sobre a qualidade dos núcleos: PMI inferior permite a recuperação de um maior número de núcleos intactos com resultados adequados até 24 h. (B) A inclusão de um passo de lavagem após a incubação de anticorpos não parece visualmente deslocar populações DE FÃS. (C) Exemplo de um experimento de FÃS fracassado com a falta de população distinta PAX6+(NeuN-) (à direita) apesar da presença de núcleos intactos e fundo baixo (à esquerda) (neocórtex temporal pós-morte, não patológico, 7 h PMI). (D) Representação do mapa de calor de dados humanos adultos sn RNA-seq mostrando expressão diferencial de PAX6 e dois outros fatores nucleares astrócitos, SOX9 e LHX2, através de subpopulações protoplasmáticas e fibrosas em córtex e SVZ, em comparação com outros tipos de células (gradiente de cor vermelha representa espectro de valores de expressão genética média normalizados; n=3 casos distintos de autópsia, 43.619 núcleos totais. (E) Regiões cerebrais distintas (neocórtex temporal vs. SVZ e estriado subjacente) mostram diferentes padrões de separação NeuN/PAX6/OLIG2. Abreviaturas: FANS = fluorescência-ativar a classificação de núcleos; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenildole; NeuN = núcleos neuronais; PAX6 = proteína de caixa emparelhada 6; OLIG2 = fator de transcrição do oligodendrocito 2; GFAP = proteína ácida fibrilar gliana ; ALDH1L1 = 10-formyltetrahidrofolate desidrogenase; LXH2 = Lim homeobox 2; PMI = intervalo pós-morte; SSC-A = área de dispersão lateral; FSC-A = área de dispersão para a frente; NeuN-555 = camundongo anti-NeuN conjugado ao AF555; PAX6-APC = camundongo anti-PAX6 conjugado à alofilia; OLIG2-488 = camundongo anti-OLIG2 conjugado a corante fluorescente verde para a linha laser de 488 nm; SVZ = zona subventricular; A(p) = astrócitos protoplasmados (matéria cinzenta); A(f) = astrócitos fibrosos (matéria branca); OL = oligodendrocitos; OPC = células progenitoras oligodendrocyte; EN = neurônios excitatórios; MSN = neurônios espinhosos médios; MG = microglia; BVC = células dos vasos sanguíneos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O desenho experimental seguindo o protocolo delineado deve ser finalizado após considerar vários fatores biológicos e técnicos. As amostras de tecido inicial são congeladas frescas, sem terem sido fixadas, e de preferência têm um curto intervalo de coleta pós-morte para maximizar a recuperação dos núcleos. Com base na experiência, um PMI de até 24 horas permite a recuperação adequada dos núcleos; no entanto, um PMI de 12 h ou menos é preferível para otimizar a recuperação de núcleos intactos. Fatores adicionais além do PMI, incluindo temperatura do armazenamento corporal e níveis de pH do tecido, também podem afetar a produção de núcleos, mas não foram contabilizados nesses estudos14. A partir da experiência anedótica, a recuperação do FANS tem sido comparável com o mesmo tecido armazenado até cinco anos a -80 °C, embora não tenham sido realizados experimentos controlados para avaliar a variabilidade do armazenamento na expressão específica do tipo celular. Lavar a amostra após a incubação de anticorpos é outra variável que pode precisar ser considerada. Em geral, uma etapa de lavagem diminui o rendimento global, mas pode melhorar a separação de populações imunolabeled distintas. Nestes estudos, não foi observada diferença na separação das populações NEUN/PAX6 ao incluir ou excluir uma etapa de lavagem pós-anticorpo, mas essa etapa pode ser benéfica ao usar outros anticorpos primários e secundários, especialmente se não forem pré-julgados.
Devido à variabilidade na sensibilidade do equipamento de classificação, é necessário realizar controles adequados em cada evento de triagem. Se forem vistos detritos extracelulares excessivos na amostra resuspended ao visualizar em um hemótmetro, a amostra pode ser transmitida através de um filtro de 40 μm para reter apenas os núcleos. Se a amostra for limitada, as contas marcadas com o fluorohore apropriado também podem ser usadas para controles de cor única e FMO. Se as amostras parecem não ser enriquecidas para as populações de astrócitos desejadas, conforme determinado por qPCR ou resultados sequenciamento, pode ser útil para portar todas as populações de NeuN- bem como PAX6+(NeuN-) mais estritamente, deixando mais espaço entre os cortes do portão para populações positivas e negativas.
A maioria dos estudos de validação descritos aqui foram realizados utilizando-se olig2, além de NeuN e PAX6, para enriquecer simultaneamente para as populações de núcleos progenitores neuronais, astrócitos e oligodendrocyte progenitor (OPCs). Recomenda-se incluir o OLIG2 como um terceiro marcador de linhagem para enriquecer para astrócitos cortical de forma mais eficaz dentro da fração de NeuN. A presença ou ausência de OLIG2 conjugado pelo FITC não parece deslocar a população PAX6+; portanto, a suposição é que experimentos excluindo OLIG2 resultarão em enriquecimento de astrócito semelhante. Note-se que é essencial que a população PAX6+ seja fechada da população de NeuN, uma vez que algumas populações neuronais expressam tanto NeuN quanto PAX615. Os astrócitos também podem ser classificados de acordo com a expressão SOX9; no entanto, a coloração e a classificação com sox9 leva a um enriquecimento menos robusto de astrócitos em comparação com pax6. Embora tenha sido observada uma separação clara entre as linhagens neuronal, astróctica e OPC no córtex adulto, não foi observada uma separação semelhante entre as populações PAX6+ e OLIG2+ no SVZ adulto e no estriado adjacente.
Embora seja possível que alguns astrócitos da SVZ expressem baixos níveis de OLIG2, as populações coletadas só foram validadas por qPCR (dados não apresentados); portanto, o sequenciamento do RNA a jusante pode ser útil para definir ainda mais a pureza dessas populações. Além disso, este protocolo pode ser adaptado para isolar núcleos do tecido cerebral fetal congelado e tecido tumoral cerebral usando marcadores nucleares específicos da população. Como esses tecidos são consideravelmente mais celulares, pode ser útil começar com menos tecido para minimizar a agregação de núcleos. Ao classificar núcleos aneuploides a partir de tecido neoplásico, a gating de DAPI é ajustada para explicar a fluorescência potencialmente maior. Recomenda-se fortemente que os usuários realizem uma validação cuidadosa antes de realizar o FANS em tecido neoplásico, uma vez que o protocolo atual é validado apenas para amostras não neoplásicas. No geral, o protocolo acima descrito apresenta uma estratégia validada para isolar populações de astrócitos enriquecidos, adaptadas de protocolos previamente estabelecidos para enriquecer para neurônios. Essa metodologia pode ser usada para isolar efetivamente as populações de núcleos de astrócitos de tecidos cerebrais corticais normais e doentes para uso em outras análises moleculares.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Gostamos de agradecer aos membros da Patologia e Neurocirurgia da Escola de Medicina Icahn do Monte Sinai pela ajuda na aquisição de tecido cerebral desidentifitado e no CORE de Citometria de Fluxo do ISMMS para aconselhamento especializado. O estudo foi parcialmente financiado pelo NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (para N.M.T.) e R61DA048207 (para S.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS pH 7.2 | Invitrogen | 70013073 | |
| ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60 | Millipore | MAB377A5MI | mouse anti-NeuN conjugated to a fluorescent compound AF555 (excitation, 553 nm; emission, 568 nm) |
| ANTI-OLIG2 ANTIBODY CLONE 211 | Millipore | MABN50A4MI | mouse anti-OLIG2 conjugated to a fluorescent compound AF488 (excitation, 499 nm; emission, 520 nm) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | BP9704-100 | |
| Bright-Line Counting Chamber | Hausser Scientific | 3110V | |
| Calcium Chloride Anhydrous | Fisher | C614-3 | |
| Cell Strainers, 40 µM | SP Scienceware | 136800040 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma | 43815-1G | |
| DNA Library Kit | Illumina, Nextera | FC-121–1030 | |
| DNAse I | Worthington | LS002139 | |
| Dounce Tissue Grinder | WHEATON | 357542 | |
| FACS Sorter | BD Biosciences | BD FACSAria III | |
| Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher | M13-500 | |
| PAX6 (PAX6/496) - 100 TESTS | Novus | NBP234705J | |
| RNA Clean & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian | Clontech Laboratories | 635005 | Fragmentation time of 2.5 minutes, as recommended for low RIN RNA values. |
| Sucrose, crystal certified, ACS, 500 mg | Fisher | S5500 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure | Thermo Scientific | J22638AE | |
| TritonX-100 | Fisher | BP151-500 | non-ionic surfactant in lysis buffer |
| TRIzol LS Reagent | Invitrogen | 10296028 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | reagent for isolation of RNA |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima XE-100 | A94516 | |
| Ultracentrifuge tubes PP 9/16 X 3-1/2 | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure Distilled Water (RNAse-, DNAse-free) | Invitrogen | 10977023 | referred to as distilled water |
| Ultrapure EDTA | Life Technologies | 15576-028 |
References
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