Summary
我们开发了一种从新鲜冷冻组织中富集和分离人类星形胶质细胞群的方法，用于下游分子分析。
Abstract
人类星形胶质细胞的复杂性在初级人体组织中仍然定义不清，需要更好的工具来分离和分子表征。荧光激活的细胞核分选（FANS）可用于从冷冻的档案组织中成功分离和研究人类神经元核（NeuN+）群体，从而避免与处理新鲜组织相关的问题。然而，缺乏从非神经元（NeuN-）元件中分离出类似星体的努力。最近开发和验证的免疫标记策略使用三种转录因子抗体同时从非患病、新鲜（未固定）速冻的死后人类颞叶新皮层组织中分离富集神经元（NeuN+）、星形胶质细胞（成对盒蛋白6 （PAX6）+NeuN-）和少突胶质细胞祖细胞 （OLIG2+NeuN-）细胞群。
该技术被证明可用于表征原发性病理性癫痫新皮层中细胞类型特异性转录组改变。转录组学分析证实，PAX6 + NeuN-分选的群体在静息和反应条件下都能强健地富集泛星形胶质细胞标志物并捕获星形胶质细胞。本文介绍了从新鲜冷冻的人皮层中分离富含星形胶质细胞的细胞群的FANS方法，包括组织解离成单核（sn）悬浮液;用抗NeuN和抗PAX6荧光偶联抗体对细胞核进行免疫标记;FANS门控策略和质量控制指标，用于优化分选过程中的灵敏度和特异性以及确认星形胶质细胞富集;并建议采购批量或Sn分辨率的下游转录组和染色质可及性测序。该方案适用于具有各种病理的非坏死，新鲜冷冻，人皮质标本，并推荐在24小时内收集死后组织。
Introduction
人类星形胶质细胞的分子复杂性在原代组织中仍然定义不清，需要更好的工具在健康和疾病中以高分辨率分离和表征它们。由于新鲜脑组织样本的获取有限，神经胶质和神经元过程的紧密相互联系的性质以及加工过程中不可避免的细胞活化，完整的人类神经元和神经胶质细胞从其生态位中分离已被证明是困难的，所有这些都限制了这些细胞类型的 离体1的分子表征。.荧光激活的细胞核分选（FANS）已成为活细胞分选的替代方案，能够从冷冻组织中解离和免疫标记细胞群。在过去的十年中，FANS已被广泛用于分离和分子表征各种脑标本和解剖区域中的人类神经元（NeuN +）细胞核群体1，2，3，4。
然而，从人体皮层中分离特定神经胶质核亚群的类似方法受到限制，导致在理解正常和患病组织中的星形胶质细胞复杂性方面相对缺乏复杂性。为此，先前发表的方案适用于使用FANS 4分离人类神经元群体，并且验证了一种使用三抗体组合富集星形胶质细胞（和少突胶质体祖细胞）的方法，在静息和反应条件下捕获星形胶质细胞5。为了特异性富集NeuN-级分中的星形胶质细胞，使用抗体对抗已知在星形胶质细胞群体中差异表达的两种转录因子之一，PAX6或SRY-box转录因子9（SOX9）6，7。PAX6在萌发区的桡骨神经胶质细胞样祖细胞内的早期胎儿发育过程中高度表达，并有助于神经发生和胶质生成8，9，10，11 以及视网膜神经元规格12。在成人中，PAX6在静息人星形胶质细胞6 中差异性过表达，并在人癫痫组织星形胶质细胞13中显示蛋白质与神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）共表达。
该协议描述了通过FANS同时分离新皮质神经元和富含星形胶质细胞的细胞核群体。首先从成人皮层收集的新鲜（未固定）速冻（即新鲜冷冻）死后组织以机械和化学方式解离。在蔗糖梯度中裂解和超速离心后，丢弃细胞质和细胞外成分，同时保留细胞核。然后用对应于所需靶谱系的荧光偶联核抗体标记细胞核，并使用FANS进行分类。遵循这种方法，在收集的PAX6 + NeuN-群体中证明了星形胶质细胞的富集，并通过靶向qPCR小组以及下游核RNA测序进行验证。
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Protocol
注意：西奈山伊坎医学院（ISMMS）的人类受试者保护计划及其机构审查委员会（IRB）确保研究的道德行为并遵守联邦，州和机构法规。在这项研究中，所有使用的死后标本都经过去鉴定，通过生物储存库在适当的同意下获得，并且被ISMMS的IRB（HS#14-01007）免除了“人类研究”的称号。
1. 缓冲液制备
注意：如果进行下游RNA测序，请使用RNase去污溶液彻底处理所有工作空间和工具，以防止mRNA降解。
- 准备裂解缓冲液。
- 将以下物质溶解在蒸馏的 H2O 至 50 mL 中：5.47 g 蔗糖（0.32 M 最终）、250 μL 1 M 氯化钙2（5 mM 最终）、150 μL 1 M Mg（CH3COO）2（3 mM 最终）、10 μL 500 mM 乙二胺四乙酸 （EDTA）（0.1 mM 最终）、500 μL 1 M 三 HCl （pH 8）（10 mM 最终）、 50 μL Triton X-100（0.1%最终）和17 μL 3M二硫代戊烯醇（DTT，1 mM最终，新鲜加入）（参见 材料表）。
- 制备蔗糖缓冲液
- 将以下内容溶解在蒸馏的H2O至50 mL中：30.78克蔗糖（1.8 M最终），150μL1MMg（CH3COO）2 （3mM最终），500μL1M Tris-HCl（pH 8）（10mM最终），17μL 3M DTT（1mM最终，加入新鲜）。
2.冷冻组织解离成单核悬浮液
- 将 4 mL 冰冷裂解缓冲液加入 7 mL 玻璃组织解液（研磨机）中，并保持在冰上。解剖约200-400mg新鲜冷冻的人成人皮质，冲洗约50x，并将组织匀浆转移到12 mL超速离心聚丙烯管中。
- 使用5 mL移液管，将6.5mL冰冷的蔗糖缓冲液加入超速离心管的底部，注意不要干扰蔗糖和组织匀浆之间的层。
注意：如果处理其他样品，请通过向较轻的样品中添加额外的裂解缓冲液来仔细平衡管的重量。超速离心管的精确平衡对于防止转子损坏并确保以适当的速度旋转至关重要。
3. 超速离心
- 在4°C下以24，400rpm（101，814× g）超速离心裂解物1小时。 小心地吸出上清液和碎屑，而不会干扰沉淀。
注意：如果从少于200毫克的组织开始，颗粒可能不可见。 - 向细胞核沉淀中加入600μL磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Ca2 +，不含Mg2 + ），并在重悬之前在冰上孵育10分钟。
- 上下移液50次，将细胞核沉淀重悬于冰上。
- 在进行下一步之前，使用血细胞计数器在显微镜下观察完整的细胞核，并确保重悬的浓度高于105 个细胞核/ mL（将10μL重悬的细胞核与10μL台盼蓝相结合）。
4. 抗体孵育
- 为了对样品进行风扇免疫标记，加入500μL重悬样品沉淀，490μL1x PBS（Ca2 +，不含Mg2 +），10μL10%BSA（0.1%最终），1μL与AF555偶联的小鼠抗NeunN抗体（NeuN-AF555，1：1000终浓度）和1μL与同种异体植物蓝蛋白（PAX6-APC，1：1000最终浓度）结合的小鼠抗PAX6抗体。
注意：可以添加与其他荧光基团偶联的替代抗体（参见讨论）。在这里，使用与AF488（1：1000浓度）共轭的小鼠抗OLIG2，结果良好。 - 仅执行 4'，6-二氨基-2-苯基吲哚 （DAPI） 和单色对照以设置浇口参数，必要时使用少量样品。
- 要进行AF555单色对照，加入20μL重悬样品沉淀，970μL1x PBS（Ca2 +，不含镁2+），10μL10%BSA（0.1%最终）和1μLNeN-AF555抗体（1：1000浓度）。
- 要进行APC单色对照，加入20μL重悬样品沉淀，970μL1X PBS（Ca2 +，不含镁2+），10μL10%BSA（0.1%最终）和1μLPAX6-APC抗体（1：1000浓度）。
- 要进行仅DAPI对照，加入20μL重悬样品沉淀，970μL1X PBS（Ca2 +，不含Mg2+）和10μL10%BSA（0.1%最终）（DAPI将稍后加入，见4.4）。
注意：如果使用两种以上的抗体，除了单色对照外，还建议进行荧光减一（FMO）对照。
- 将样品和对照在4°C下在黑暗中旋转孵育1小时。
- 将 DAPI 以 1：1000 添加到所有样本和对照中，然后继续排序。
5. 荧光激活的细胞核分选
注意：除非已经精通流式细胞术/分选技术，否则建议在经过培训的人员协助下使用机构流式细胞术设施。
- 门如下所示。
- 首先，对于每个样品，通过前向散射（FSC-A） 进行门控与侧散射（SSC-A）包括细胞核适当大小范围内的颗粒，从而排除红细胞和碎片（图1A）。
注意：非常干净的细胞核制剂可以区分较小的碎片团簇和原子核簇。 - 接下来，对于每个样品，通过 FSC-A 与 FSC-W（或 FSC-A 与 FSC-H）和 SSC-A 与 SSC-W（或 SSC-A 与 SSC-H）进行门，以仅包括单线态核（图 1B）。
- 接下来，对于每个样品，通过DAPI进行门控以包括完整的核单线态（DAPI高的门控群体），不包括碎片（DAPI-低，在门控群体的左侧）和双峰（在门控群体的右侧）（图1C）。
- 根据荧光对照设置进一步的门控，在视觉上确定为FACS图上的不同簇。
- 在没有抗体的情况下，运行仅DAPI对照以确定群体的背景染色（图1D 和 图2A）。
- 运行仅 NeuN-AF555 控制以确定 AF555 通道中 NeuN+ 染色的截止值（图 2B）。
- 运行仅 PAX6 APC 控制以确定 APC 通道中 PAX6+ 染色的截止值（图 2C）。
- 如果使用更多抗体，请运行其他单色对照（图2D，E）。
注意：如果使用两种以上的抗体，建议使用FMO对照来可视化群体的任何变化。
- 运行完所有控件后，将 NeuN+ 和 PAX6+ 集合的门绘制到高于既定阈值的位置。
- 对 NeuN+ 群体进行门控以收集神经元（图 1E 和 图 2F）。
- 将 PAX6+ 群体从 NeuN- 群体中分离出来以收集星形胶质细胞（图 1E、F 和 图 2F）。
- 从NeuN-PAX6-群体中分离并收集其他神经胶质细胞（例如少突胶质细胞祖细胞，如图OLIG2+所示）（图1F）。
注意：如果由于群体模糊，流式细胞术软件难以确定适当的门控截止值，则修改可视化的事件数量（增加或减少FANS图上的事件数量）可能会有所帮助。
- 首先，对于每个样品，通过前向散射（FSC-A） 进行门控与侧散射（SSC-A）包括细胞核适当大小范围内的颗粒，从而排除红细胞和碎片（图1A）。
- 根据预期的下游分析适当地收集样品。
6. 收集 FANS 群体以进行下游分子分析
- 对于体RNA测序，在PBS中收集50，000-500，000个细胞核（另见第7.1节）。
- 加入 2 mL 蔗糖溶液、50 μL 1 M 氯化钙2 和 30 μL 1 M Mg（CH3COO）2，并填充高达 10 mL 的 PBS。
- 倒置并在冰上孵育15分钟，然后在4°C下以900× g 离心10-15分钟。
- 吸出上清液，重悬于1mL RNA提取试剂中，涡旋，在干冰上冷冻，并储存在-80°C。
- 或者，将样品直接收集到200μLRNA提取试剂中。分选后加入最多1 mL的RNA提取试剂，保持试剂与分选样品的1：1比例。涡旋，在干冰上冷冻，并储存在-80°C。
- 对于使用测序（ATAC-seq）对转座酶可及染色质的批量测定，在涂有5%牛血清白蛋白（BSA）的微量离心管中收集PBS中的50，000-75，000个细胞核。在干冰上冷冻细胞核/-80°C或立即使用它们进行ATAC制备。
- 对于 SN RNA-seq 或 ATAC-seq，在 PBS 中收集 0.04% BSA 中的细胞核（另请参见第 7.2 节）。
7. 库前准备技巧
- 大宗核RNA测序文库制备
- 收集在RNA提取试剂中后，通过加入苯酚/氯仿并用乙醇从上层水层沉淀RNA来进行标准的苯酚/氯仿RNA提取，然后在管上消化DNA酶（15分钟）。
- 进行RNA纯化并浓缩在15μL水的最终体积中。
注意：使用这种方法，从300mg成人皮层样品中的代表性回收量约为300，000 NeuN +核（纯化和浓缩后的总RNA为15-20 ng / μL）和〜250，000 PAX6 +核（纯化和浓缩后为10-12ng / μL总RNA）。这种代表性的产量可能因样品质量、门控严格程度和RNA回收率而有很大差异。 - 在测序之前进行定量聚合酶链反应（qPCR），以基于规范星形胶质细胞标志物（GFAP，SOX9），10-甲酰基四氢叶酸脱氢酶（ALDH1L1）的高差异表达以及神经元和其他细胞谱系标志物的消耗（图1G）来确认星形胶质细胞的富集。
注意：收集双阴性群体（NeuN-PAX6-）可以对星形胶质细胞的相对富集进行更准确的多层qPCR质量控制分析（图2H）。 - 使用推荐用于低 RNA 完整性数值的试剂盒生成 RNA-seq 文库，如死后样品预期的那样。
- 单核测序文库制备
- 通过机构测序核心执行 sn 测序。
- 对于基于纳米流体的处理和测序，使用推荐浓度为1×106 个细胞/mL，在至少60μL的1x PBS + 0.04%BSA中用于单核RNA测序（snRNA-seq），使用3×106 个细胞/mL，至少20μL的1x PBS + 0.04%BSA用于单核测定，以使用测序（snATAC-seq）进行转座酶可访问染色质的单核测定。
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Representative Results
从新鲜（未固定）速冻颞新皮层组织中收集细胞核，死后收集时间为12 h。在组织解离成细胞核悬浮液后，将样品与针对NeuN，PAX6和OLIG2的抗体一起孵育，并根据 图1 和 图2所示的门控进行分类。从新核+、PAX6+新核-和寡核2+新核-排序的群体中收集（图1E，F 和 图2F）。靶向qPCR小组显示，PAX6 +（NeuN-）群体中泛星形胶质细胞标志物 GFAP 和 ALDH1L1的 富集（图1G 和 图2H）。此外，OLIG2 +群体富集少突胶质细胞祖细胞（OPC）标志物 PDGFRA （图1G）。收集的群体的批量RNA测序显示，PAX6 +（NeuN-）群体中星形胶质细胞标记的富集和神经元标记的消耗相对（图1H）。免疫荧光证实了PAX6与GFAP在成人皮质星形胶质细胞中的共定位（图1I）。
检查单色对照可显示每个标记的不同阳性和负值群体，从而能够设置准确的收集截止值（图 2A-G）。此外，将富含星形胶质细胞的FANS分离与两种针对星形胶质细胞核标志物的不同抗体SOX9和PAX6进行比较。在富含星形胶质细胞的门内，使用 PAX6 的 FANS 捕获的细胞核事件百分比（~13.8%）高于使用 SOX9 的 FANS（~6%）（图 2F，G）。一个有针对性的 qPCR 小组揭示了在 SOX9+（新新-）和 PAX6+（新-）群体中对GFAP、PAX6 和 SOX9 的富集（图 2H）。追溯比较几个样品与组织收集的不同死后间隔（PMI）的解离和染色，发现较短的PMI与更大的完整细胞核回收率相关（图3A）。PMI长达24小时的冷冻组织产生高比例的完整细胞核，高达90%;然而，在30小时PMI下，很少有完整的细胞核可以被恢复（图3A）。在标准方案中包括抗体洗涤步骤（通常省略此步骤以优化恢复）并没有显示不同NeuN + / 或PAX6 + / -群体分离的显着变化（图3B）。
偶尔，即使在具有高百分比的活核的样品中，也可以看到PAX6 + NeuN-群体的分离不良（图3C），因此需要重复组织解离和FANS方案。单核RNA-seq研究进一步将 PAX6 作为原生质和纤维成星形胶质细胞亚群中顶级差异表达的核转录因子，不仅在新皮层，而且在脑室下区（SVZ）和邻近纹状体中（图3D）。来自同一脑样本的新皮层和纹状体之间的NEUN / PAX6 / OLIG2三重风扇的比较显示PAX6 +细胞核分离的区域特异性差异（图3E）。该协议目前仅针对新皮层进行验证。
（A-F）序列风扇门控的代表性示例，以排除碎片和替身（A-C），并使用（D）仅DAPI对照组来定义背景染色，用于收集（E-F）富集神经元（NeuN +），星形胶质细胞（PAX6 + NeuN-）和OPC（OLIG2 ++ NeuN-）细胞群。（G）使用泛星形胶质细胞（GFAP，ALDH1L1），神经元（RBFOX3）和OPC（PDGFRA）标记物对收集的群体进行质量控制的最小qPCR面板（A-G：无病理学的颞叶新皮层尸检标本，12小时PMI，显示100，000个事件;虚线表示正门控的序状群体;实线表示细胞型富集群体的最终集合）。（H）从行归一化的块状RNA测序数据生成的热图，显示PAX6 +和NeuN +分选人群中规范星形胶质细胞和神经元标记物的表达（n = 3例尸检病例，无病理的颞新皮层，PMI 12-21 h）。（I）人新皮层中PAX6，GFAP和NeuN的代表性免疫荧光图像。箭头表示共表达 PAX6 和 GFAP 的星形胶质细胞。缩写：FANS =荧光激活细胞核分选;DAPI = 4′，6-二氨基-2-苯基吲哚;NeuN = 神经元核;PAX6 = 成对的盒蛋白6;OLIG2 = 少突胶质细胞转录因子2;OPC = 少突胶质细胞祖细胞;qPCR = 定量聚合酶链反应;GFAP = 神经胶质纤维酸性蛋白 ;ALDH1L1 = 10-甲酰基四氢叶酸脱氢酶;RBFOX3 = RNA结合蛋白FOX-1同源物3;PDGFRA = 血小板衍生的生长因子α;PMI = 死后间隔;侧向散射面积;前向散射面积;侧向散射宽度;FSC-W = 前向散射宽度;NeuN-555 = 小鼠反新N共轭于AF555;PAX6-APC = 小鼠抗PAX6与同种异体蓝蛋白结合;OLIG2-488 =小鼠抗OLIG2偶联到绿色荧光染料，用于488nm激光线。请点击此处查看此图的大图。
图 2：使用 PAX6 或 SOX9 抗体比较分离富含星形胶质细胞的群体.（A-E） DAPI、NeuN、PAX6、SOX9 和 OLIG2 的单色对照定义了各自荧光通道中的阳性/阴性临界值。（傅-金）使用 （F） NeuN/PAX6 或 （G） NeuN/SOX9 抗体进行星形胶质细胞富集分离的扇形胶质细胞分离的比较法。在星形胶质细胞富集的门内，PAX6 捕获的事件比例高于 SOX9 捕获的事件。（A-G：用于所有实验的相同死后非病理性颞叶新皮层标本;12小时PMI，显示10，000个事件）。（H）质量控制qPCR分析证实了从F-G到PAX6 +（NeuN-）和SOX9 +（NeuN-）分选群体中星形胶质细胞标志物富集和非星形胶质细胞标记物的消耗（数据归一化为ACTB并量化为NeuN +群体的折叠变化）。缩写： DAPI = 4′，6-二氨基-2-苯基吲哚;NeuN = 神经元核;PAX6 = 成对的盒蛋白6;OLIG2 = 少突胶质细胞转录因子2;SOX9 = 斜纹盒转录因子 9;qPCR = 定量聚合酶链反应;GFAP = 神经胶质纤维酸性蛋白 ;RBFOX3 = RNA结合蛋白FOX-1同源物3;PDGFRA = 血小板衍生的生长因子α;PMI = 死后间隔;NeuN-555 = 小鼠反新N共轭于AF555;PAX6-APC = 小鼠抗PAX6与同种异体蓝蛋白结合;OLIG2-488 =小鼠抗OLIG2偶联到绿色荧光染料，用于488nm激光线。请点击此处查看此图的大图。
（A）样品收集PMI对细胞核质量的影响：较低的PMI可以恢复更多完整的细胞核，并在24小时内获得足够的结果（ B）在视觉上包括抗体孵育后的洗涤步骤似乎不会改变FANS群体。（C）一个失败的FANS实验的例子，尽管存在完整的细胞核和低背景（左）（死后颞新皮层，非病理性，7小时PMI），但缺乏不同的PAX6 +（NeuN-）群体（右侧）。（D）成人sn RNA-seq数据的热图表示，显示PAX6和另外两个星形胶质细胞核因子SOX9和LHX2在皮质和SVZ中的原生质和纤维星形胶质细胞亚群的差异表达，与其他细胞类型相比（红色梯度表示对数归一化平均基因表达值的光谱;n = 3个不同的尸检病例，43，619个总细胞核。（E）不同的大脑区域（颞新皮层与SVZ和亚斜纹状体）显示出不同的新N/PAX6/OLIG2分离模式。缩写：FANS =荧光激活细胞核分选;DAPI = 4′，6-二氨基-2-苯基吲哚;NeuN = 神经元核;PAX6 = 成对的盒蛋白6;OLIG2 = 少突胶质细胞转录因子2;GFAP = 神经胶质纤维酸性蛋白 ;ALDH1L1 = 10-甲酰基四氢叶酸脱氢酶;LXH2 = 林同源盒 2;PMI = 死后间隔;侧向散射面积;前向散射面积;NeuN-555 = 小鼠反新N共轭于AF555;PAX6-APC = 小鼠抗PAX6与同种异体蓝蛋白结合;OLIG2-488=小鼠抗OLIG2偶联成绿色荧光染料，用于488nm激光线;SVZ = 脑室下区;A（p） = 原生质（灰质）星形胶质细胞;A（f） = 纤维（白质）星形胶质细胞;OL = 少突胶质细胞;OPC = 少突胶质细胞祖细胞;EN = 兴奋性神经元;MSN = 中等多棘神经元;MG = 小胶质细胞;BVC = 血管细胞。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
在考虑了几个生物学和技术因素后，应最终确定按照概述的方案进行的实验设计。起始组织样品是新鲜冷冻的，无需固定，并且优选具有较短的死后收集间隔，以最大限度地提高细胞核回收率。根据经验，长达24小时的PMI可以充分恢复细胞核;然而，PMI为12小时或更短时间可优选以优化完整细胞核的恢复。除PMI外的其他因素，包括身体储存温度和组织pH值，也可能影响细胞核产量，但这些研究没有考虑到14。根据轶事经验，已经发现FANS的恢复与在-80°C下储存长达五年的相同组织相当，尽管没有进行对照实验来评估细胞类型特异性表达的储存变异性。抗体孵育后清洗样品是另一个需要考虑的变量。通常，洗涤步骤会降低总产量，但可能会改善不同免疫标记群体的分离。在这些研究中，当包括或排除抗体后洗涤步骤时，在分离NEUN / PAX6群体方面没有观察到差异，但是当使用其他一抗和二抗时，该步骤可能是有益的，特别是如果它们不是预偶联的。
由于分拣设备的灵敏度可变，因此有必要在每次分拣事件中执行适当的控制。如果在血细胞计数器上观察时，在重悬的样品中看到过多的细胞外碎片，则样品可以通过40μm过滤器仅保留细胞核。如果样品有限，标记有适当荧光团的微球也可用于单色和FMO对照。如果样品似乎没有富集到所需的星形胶质细胞群体，无论是通过qPCR还是测序结果确定，则更严格地对所有NeuN-以及PAX6 + （NeuN-）群体进行门分离可能会有所帮助，从而在阳性和阴性群体的门截止值之间留出更多空间。
这里描述的大多数验证研究都是使用OLIG2以及NeuN和PAX6进行的，以同时富集神经元，星形胶质细胞和少突胶质细胞祖细胞（OPCs）细胞群。建议将OLIG2作为第三谱系标志物，以更有效地富集NeuN-级分内的皮质星形胶质细胞。FITC共轭OLIG2的存在与否似乎不会改变PAX6 +种群;因此，假设排除OLIG2的实验将导致类似的星形胶质细胞富集。值得注意的是，PAX6+群体必须与NeuN-群体隔离开来，因为一些神经元群体同时表达NeuN和PAX615。星形胶质细胞也可以根据SOX9表达进行分类;然而，与PAX6相比，使用SOX9染色和分选导致星形胶质细胞富集的稳定性降低。虽然在成年皮层的神经元，星形细胞和OPC谱系之间观察到明显的分离，但在成年SVZ和邻近纹状体中的PAX6 +和OLIG2 +群体之间没有观察到类似的分离。
虽然来自SVZ的一些星形胶质细胞可能表达低水平的OLIG2，但收集的群体仅通过qPCR验证（数据未显示）;因此，下游RNA测序可能有助于进一步确定这些群体的纯度。此外，该方案可以适应于使用群体特异性核标志物从冷冻胎儿脑组织和脑肿瘤组织中分离细胞核。由于这些组织的细胞数量要多得多，因此从较少的组织开始以尽量减少细胞核的聚集可能会有所帮助。当从肿瘤组织中分选非整倍体核时，DAPI门控被调整以考虑潜在的更高荧光。强烈建议用户在对肿瘤组织进行FANS之前进行仔细验证，因为目前的方案仅针对非肿瘤样品进行验证。总体而言，上述方案提出了一种经过验证的分离富集星形胶质细胞群的策略，该策略改编自先前建立的方案以富集神经元。该方法可用于有效地从正常和患病的皮质脑组织中分离星形胶质细胞核群体，以用于进一步的分子分析。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢西奈山伊坎医学院病理学和神经外科的成员，感谢他们帮助采购去识别化的脑组织，并感谢ISMMS的流式细胞术CORE专家建议。该研究的部分资金来自NIH RF1DA048810，R01NS106229，R03NS101581（到N.M.T.）和R61DA048207（到S.A.）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS pH 7.2 | Invitrogen | 70013073 | |
| ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60 | Millipore | MAB377A5MI | mouse anti-NeuN conjugated to a fluorescent compound AF555 (excitation, 553 nm; emission, 568 nm) |
| ANTI-OLIG2 ANTIBODY CLONE 211 | Millipore | MABN50A4MI | mouse anti-OLIG2 conjugated to a fluorescent compound AF488 (excitation, 499 nm; emission, 520 nm) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | BP9704-100 | |
| Bright-Line Counting Chamber | Hausser Scientific | 3110V | |
| Calcium Chloride Anhydrous | Fisher | C614-3 | |
| Cell Strainers, 40 µM | SP Scienceware | 136800040 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma | 43815-1G | |
| DNA Library Kit | Illumina, Nextera | FC-121–1030 | |
| DNAse I | Worthington | LS002139 | |
| Dounce Tissue Grinder | WHEATON | 357542 | |
| FACS Sorter | BD Biosciences | BD FACSAria III | |
| Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher | M13-500 | |
| PAX6 (PAX6/496) - 100 TESTS | Novus | NBP234705J | |
| RNA Clean & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian | Clontech Laboratories | 635005 | Fragmentation time of 2.5 minutes, as recommended for low RIN RNA values. |
| Sucrose, crystal certified, ACS, 500 mg | Fisher | S5500 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure | Thermo Scientific | J22638AE | |
| TritonX-100 | Fisher | BP151-500 | non-ionic surfactant in lysis buffer |
| TRIzol LS Reagent | Invitrogen | 10296028 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | reagent for isolation of RNA |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima XE-100 | A94516 | |
| Ultracentrifuge tubes PP 9/16 X 3-1/2 | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure Distilled Water (RNAse-, DNAse-free) | Invitrogen | 10977023 | referred to as distilled water |
| Ultrapure EDTA | Life Technologies | 15576-028 |
References
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