Summary
Wir haben eine Methode entwickelt, die menschliche Astrozytenpopulationen aus frisch gefrorenem Gewebe anreichert und isoliert, um sie in nachgelagerten molekularen Analysen zu verwenden.
Abstract
Die Komplexität menschlicher Astrozyten ist im primären menschlichen Gewebe nach wie vor schlecht definiert und erfordert bessere Werkzeuge für ihre Isolierung und molekulare Charakterisierung. Die fluoreszenzaktivierte Nuclei Sorting (FANS) kann verwendet werden, um menschliche neuronale Kernpopulationen (NeuN +) erfolgreich aus gefrorenem Archivgewebe zu isolieren und zu untersuchen und so Probleme im Zusammenhang mit der Handhabung von frischem Gewebe zu vermeiden. Es fehlen jedoch Bemühungen, Astroglia in ähnlicher Weise vom nicht-neuronalen (NeuN-) Element zu isolieren. Eine kürzlich entwickelte und validierte Immunotagging-Strategie verwendet drei Transkriptionsfaktor-Antikörper, um gleichzeitig angereicherte neuronale (NeuN +), Astrozyten- (gepaart Boxprotein 6 (PAX6) + NeuN-) und Oligodendrozyten-Vorläufer- (OLIG2 + NeuN-) Kernpopulationen aus nicht erkranktem, frischem (nicht fixiertem) postmortalem humanem temporalem Neokortexgewebe zu isolieren.
Diese Technik erwies sich als nützlich für die Charakterisierung von zelltypspezifischen Transkriptomveränderungen im primären pathologischen Epilepsie-Neokortex. Transkriptomische Analysen bestätigten, dass PAX6+NeuN-sortierte Populationen robust für Pan-Astrozytenmarker angereichert sind und Astrozyten sowohl unter ruhenden als auch unter reaktiven Bedingungen einfangen. Dieses Papier beschreibt die FANS-Methodik zur Isolierung von Astrozyten-angereicherten Kernpopulationen aus frisch gefrorenen menschlichen Kortex, einschließlich der Gewebedissoziation in Einzelkernsussuspension (sn); Immuntagging von Kernen mit fluoreszenzkonjugierten Antikörpern gegen NeuN und PAX6; FANS Gating-Strategien und Qualitätskontrollmetriken zur Optimierung der Sensitivität und Spezifität während der Sortierung und zur Bestätigung der Astrozytenanreicherung; und empfohlene Beschaffung für die nachgelagerte Transkriptom- und Chromatin-Zugänglichkeitssequenzierung in Massen- oder SN-Auflösung. Dieses Protokoll gilt für nicht-nekrotische, frisch gefrorene, menschliche kortikale Proben mit verschiedenen Pathologien und empfohlener postmortaler Gewebeentnahme innerhalb von 24 h.
Introduction
Die molekulare Komplexität menschlicher Astrozyten ist im Primärgewebe nach wie vor schlecht definiert und erfordert bessere Werkzeuge für ihre Isolierung und Charakterisierung bei hoher Auflösung, sowohl im Gesundheits- als auch im Krankheitsbereich. Die Trennung intakter menschlicher Neuronen und Gliazellen von ihrer Nische hat sich aufgrund des begrenzten Zugangs zu frischen Hirngewebeproben, der stark miteinander verbundenen Natur von Glia- und neuronalen Prozessen und der unvermeidlichen zellulären Aktivierung während der Verarbeitung als schwierig erwiesen, die alle die molekulare Charakterisierung dieser Zelltypen ex vivoeinschränken 1 . Die fluoreszenzaktivierte Kernsortierung (FANS) hat sich als Alternative zur Lebendzellsortierung herauskristallisiert und ermöglicht die Dissoziation und Immuntagsierung von Kernpopulationen aus gefrorenem Gewebe. In den letzten zehn Jahren wurde FANS häufig zur Isolierung und molekularen Charakterisierung menschlicher neuronaler (NeuN +) Kernpopulationen in einer Vielzahl von Gehirnproben und anatomischen Regioneneingesetzt 1,2,3,4.
Ähnliche Methoden zur Isolierung spezifischer Gliakern-Subpopulationen aus dem menschlichen Kortex waren jedoch begrenzt, was zu einem relativen Mangel an Raffinesse beim Verständnis der Astrozytenkomplexität sowohl in normalem als auch in erkranktem Gewebe führte. Zu diesem Zweck wurde ein zuvor veröffentlichtes Protokoll zur Isolierung menschlicher neuronaler Populationen mit FANS4 angepasst und eine Methode zur Anreicherung für Astrozyten (und für oligodendrogliale Vorläufer) unter Verwendung einer Dreifach-Antikörper-Kombination validiert, wobei Astrozyten sowohl unter ruhenden als auch unter reaktiven Bedingungen erfasstwurden 5. Um speziell für Astrozyten in der NeuN-Fraktion anzureichern, wurden Antikörper gegen einen von zwei Transkriptionsfaktoren verwendet, von denen bekannt ist, dass sie über Astrozytenpopulationen hinweg unterschiedlich exprimiert werden, PAX6 oder SRY-Box-Transkriptionsfaktor 9 (SOX9) 6,7. PAX6 wird während der frühen fetalen Entwicklung in radialen gliaähnlichen Vorläufern in Keimzonen hoch exprimiert und trägt sowohl zur Neurogenese und Gliogenese 8,9,10,11 als auch zur retinalen neuronalen Spezifikation 12 bei. Beim Erwachsenen ist PAX6 in ruhenden menschlichen Astrozyten6 differentiell überexprimiert und zeigt eine Proteinkoexpression mit glialfibrillärem saurem Protein (GFAP) in humanen Epilepsiegewebeastrozyten13.
Dieses Protokoll beschreibt die gleichzeitige Isolierung neokortikaler neuronaler und astrozytenangereicherter Kernpopulationen durch FANS. Frisches (nicht fixiertes) schockgefrorenes (d.h. frisch gefrorenes) postmortales Gewebe, das aus dem erwachsenen Kortex entnommen wird, wird zunächst mechanisch und chemisch dissoziiert. Nach der Lyse und Ultrazentrifugation in einem Saccharosegradienten werden die zytoplasmatischen und extrazellulären Komponenten verworfen, während die Kerne erhalten bleiben. Die Kerne werden dann mit fluoreszierend konjugierten Kernantikörpern markiert, die den gewünschten Ziellinien entsprechen, und mit FANS sortiert. Nach diesem Ansatz wird die Anreicherung von Astrozyten in den gesammelten PAX6+NeuN-Populationen demonstriert, validiert sowohl durch ein gezieltes qPCR-Panel als auch durch nachgeschaltete nukleare RNA-Sequenzierung.
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Protocol
HINWEIS: Das Programm zum Schutz menschlicher Probanden an der Icahn School of Medicine at Mount Sinai (ISMMS) und sein Institutional Review Board (IRB) gewährleisten die ethische Durchführung der Forschung und die Einhaltung von Bundes-, Landes- und institutionellen Vorschriften. In dieser Studie wurden alle verwendeten Post-mortem-Proben de-identifiziert, mit entsprechender Zustimmung durch das Biorepository erhalten und von der Bezeichnung "Humanforschung" durch das IRB des ISMMS (HS#14-01007) ausgenommen.
1. Puffervorbereitung
HINWEIS: Wenn Sie eine nachgeschaltete RNA-Sequenzierung durchführen, behandeln Sie alle Arbeitsbereiche und Werkzeuge gründlich mit RNase Decontamination Solution, um den mRNA-Abbau zu verhindern.
- Bereiten Sie den Lysepuffer vor.
- In destilliertem H2 O bis zu50 ml wird Folgendes gelöst: 5,47 g Saccharose (0,32 M endg.), 250 μL 1 MCaCl2 (5 mM endg.), 150 μL 1 M mg(CH3COO)2 (3 mM endg.), 10 μL 500 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (0,1 mM endg.), 500 μL 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM endg.), 50 μL Triton X-100 (0,1% endgültig) und 17 μL 3 M Dithiothreitol (DTT, 1 mM final, frisch hinzufügen) (siehe Materialtabelle).
- Saccharosepuffer vorbereiten
- Folgendes wird in destilliertemH2Obis zu 50 ml gelöst: 30,78 g Saccharose (1,8 M endg.), 150 μL 1 M Mg(CH 3 COO)2 (3mM endg.), 500 μL 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM endg.), 17 μL 3 M DTT (1 mM final, frisch hinzufügen).
2. Gefrorene Gewebedissoziation in Einzelkernsuspension
- Fügen Sie 4 ml eiskalten Lysepuffer zu einem 7 ml Glasgewebedouncer (Grinder) hinzu und halten Sie es auf Eis. Sezieren Sie etwa 200-400 mg frisch gefrorenen menschlichen Erwachsenenkortex, douncen Sie ungefähr 50x und übertragen Sie das Gewebehomogenat auf ein 12 ml Ultrazentrifugen-Polypropylenröhrchen.
- Mit einer 5-ml-Pipette 6,5 ml eiskalten Saccharosepuffer auf den Boden des Ultrazentrifugenröhrchens geben, wobei darauf zu achten ist, dass die Schicht zwischen Saccharose und dem Gewebehomogenat nicht gestört wird.
HINWEIS: Wenn Sie zusätzliche Proben verarbeiten, balancieren Sie die Röhrchen sorgfältig nach Gewicht aus, indem Sie der leichteren Probe zusätzlichen Lysepuffer hinzufügen. Ein präzises Auswuchten der Ultrazentrifugenröhrchen ist unerlässlich, um Schäden am Rotor zu vermeiden und die Rotation mit der richtigen Geschwindigkeit sicherzustellen.
3. Ultrazentrifugation
- Ultrazentrifugieren Sie das Lysat bei 24.400 U/min (101.814 × g) für 1 h bei 4 °C. Den Überstand und die Ablagerungen vorsichtig abspritzen, ohne das Pellet zu stören.
HINWEIS: Ein Pellet ist möglicherweise nicht sichtbar, wenn es mit weniger als 200 mg Gewebe beginnt. - 600 μL phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (Ca 2+, Mg2+ frei) in das Kernpellet geben und vor dem Resuspendieren 10 min auf Eis inkubieren.
- 50 Mal auf und ab pipettieren, um das Kernpellet auf Eis zu resuspendieren.
- Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die intakten Kerne unter einem Mikroskop sichtbar zu machen und sicherzustellen, dass die Konzentration der Resuspension über 105 Kerne / ml liegt, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren (kombinieren Sie 10 μL der resuspendierten Kerne mit 10 μL Trypanblau).
4. Antikörper-Inkubation
- Um die Probe für FANS zu immuntaggen, fügen Sie 500 μL des resuspendierten Probenpellets, 490 μL 1x PBS (Ca 2+, Mg2+ frei), 10 μL 10% BSA (0,1% endgültig), 1 μL Maus-Anti-NeuN-Antikörper, konjugiert an AF555 (NeuN-AF555, 1:1000 Endkonzentration), und 1 μL Maus-Anti-PAX6-Antikörper, konjugiert an Allophycocyanin (PAX6-APC, 1:1000 Endkonzentration), hinzu.
HINWEIS: Alternative Antikörper, die mit anderen Fluorophoren konjugiert sind, können hinzugefügt werden (siehe Diskussion). Hier wurde Maus-Anti-OLIG2 konjugiert mit AF488 (1:1000 Konzentration) mit günstigen Ergebnissen verwendet. - Führen Sie 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-only und einfarbige Kontrollen durch, um Gating-Parameter einzurichten, wobei bei Bedarf eine kleine Menge der Probe verwendet wird.
- Um eine AF555-Einzelfarbkontrolle durchzuführen, fügen Sie 20 μL des resuspendierten Probenpellets, 970 μL 1x PBS (Ca 2+, Mg 2+ frei), 10 μL 10% BSA (0,1% endgültig) und 1 μL NeuN-AF555 Antikörper (1:1000 Konzentration) hinzu.
- Um eine APC-Einzelfarbkontrolle durchzuführen, fügen Sie 20 μL des resuspendierten Probenpellets, 970 μL 1X PBS (Ca 2+, Mg2+ frei), 10 μL 10% BSA (0,1% endgültig) und 1 μL PAX6-APC-Antikörper (1:1000 Konzentration) hinzu.
- Um eine reine DAPI-Kontrolle durchzuführen, fügen Sie 20 μL des resuspendierten Probenpellets, 970 μL 1X PBS (Ca 2+, Mg2+ frei) und 10 μL 10% BSA (0,1% endgültig) hinzu (DAPI wird später hinzugefügt, siehe 4.4).
HINWEIS: Wenn mehr als zwei Antikörper verwendet werden, wird zusätzlich zu den einfarbigen Kontrollen eine Fluoreszenz-Minus-Eins-Kontrolle (FMO) empfohlen.
- Die Proben und die Kontrollen werden mit Rotation im Dunkeln für 1 h bei 4 °C inkubiert.
- Fügen Sie allen Stichproben und Kontrollen DAPI bei 1:1000 hinzu, und fahren Sie mit der Sortierung fort.
5. Fluoreszenzaktivierte Kernsortierung (FANS)
HINWEIS: Es wird empfohlen, eine institutionelle Durchflusszytometrieeinrichtung mit Unterstützung von geschultem Personal zu verwenden, es sei denn, Sie beherrschen bereits die Durchflusszytometrie / Sortiertechniken.
- Tor wie unten gezeigt.
- Zuerst und für jede Probe, Gate durch Vorwärtsstreuung (FSC-A) vs. Seitenstreuung (SSC-A), um Partikel im geeigneten Größenbereich für Kerne einzuschließen, wodurch rote Blutkörperchen und Ablagerungen ausgeschlossen werden (Abbildung 1A).
HINWEIS: Eine sehr saubere Kernaufbereitung kann zwischen einem kleineren Trümmerhaufen und einem Kerncluster unterscheiden. - Als nächstes und für jede Stichprobe Gate durch FSC-A vs. FSC-W (oder FSC-A vs. FSC-H) und SSC-A vs. SSC-W (oder SSC-A vs. SSC-H), um nur Singulett-Kerne einzuschließen (Abbildung 1B).
- Als nächstes und für jede Stichprobe, Gate durch DAPI, um intakte Kern-Singlets (DAPI-hohe Gated Population) einzubeziehen, ohne Trümmer (DAPI-niedrig, links von der Gated Population) und Dubletten (rechts von Gated Population) (Abbildung 1C).
- Legen Sie weitere Gatings basierend auf Fluoreszenzkontrollen fest, die visuell als unterschiedliche Cluster auf FACS-Plots bestimmt werden.
- Führen Sie eine reine DAPI-Kontrolle durch, um die Hintergrundfärbung von Populationen in Abwesenheit von Antikörpern zu bestimmen (Abbildung 1D und Abbildung 2A).
- Führen Sie die Nur-NeuN-AF555-Steuerung aus, um den Grenzwert für die NeuN+-Färbung im Kanal für AF555 zu bestimmen (Abbildung 2B).
- Führen Sie die Nur-PAX6-APC-Steuerung aus, um den Grenzwert für die PAX6+-Färbung im APC-Kanal zu bestimmen (Abbildung 2C).
- Führen Sie zusätzliche einfarbige Kontrollen aus, wenn Sie mehr Antikörper verwenden (Abbildung 2D, E).
HINWEIS: Bei Verwendung von mehr als zwei Antikörpern wird eine FMO-Kontrolle empfohlen, um Verschiebungen in den Populationen zu visualisieren.
- Sobald alle Steuerelemente ausgeführt wurden, ziehen Sie die Tore für NeuN+- und PAX6+-Sammlungen über die festgelegten Schwellenwerte.
- Gate die NeuN+-Population, um Neuronen zu sammeln (Abbildung 1E und Abbildung 2F).
- Gate die PAX6+-Population aus der NeuN-Population, um Astrozyten zu sammeln (Abbildung 1E, F und Abbildung 2F).
- Gate und collect zusätzliche Gliapopulationen (wie Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, wie hier durch OLIG2+ gezeigt) aus der NeuN-PAX6-Population (Abbildung 1F).
HINWEIS: Falls die Bestimmung geeigneter Gating-Cutoffs mit der Durchflusszytometrie-Software aufgrund undeutlicher Populationen schwierig ist, kann es hilfreich sein, die Anzahl der zu visualisierenden Ereignisse zu ändern (entweder die Anzahl der Ereignisse auf dem FANS-Diagramm zu erhöhen oder zu reduzieren).
- Zuerst und für jede Probe, Gate durch Vorwärtsstreuung (FSC-A) vs. Seitenstreuung (SSC-A), um Partikel im geeigneten Größenbereich für Kerne einzuschließen, wodurch rote Blutkörperchen und Ablagerungen ausgeschlossen werden (Abbildung 1A).
- Sammeln Sie Proben entsprechend auf der Grundlage der beabsichtigten nachgelagerten Analyse.
6. Sammlung von FANS-Populationen für nachgelagerte molekulare Analysen
- Für die Bulk-RNA-Sequenzierung werden 50.000-500.000 Kerne in PBS gesammelt (siehe auch Abschnitt 7.1).
- 2 ml Saccharoselösung, 50 μL 1 MCaCl2 und 30 μL 1 M Mg(CH3COO)2 zugeben und mit PBS bis zu 10 ml füllen.
- Invertieren und 15 min auf Eis inkubieren, dann bei 900 × g für 10-15 min bei 4 °C zentrifugieren.
- Den Überstand abspritzen, in 1 ml RNA-extrahierendem Reagenz resuspendieren, wirbeln, auf Trockeneis gefrieren und bei -80 °C lagern.
- Alternativ können Sie die Proben direkt in 200 μL des RNA-extrahierenden Reagenzes entnehmen. Fügen Sie das RNA-extrahierende Reagenz nach dem Sortieren bis zu 1 ml hinzu, wobei ein Verhältnis von 1: 1 des Reagenzes zur sortierten Probe beibehalten wird. Wirbeln, auf Trockeneis gefrieren und bei -80 °C lagern.
- Für den Bulk-Assay auf Transposase-zugängliches Chromatin mittels Sequenzierung (ATAC-seq) werden 50.000-75.000 Kerne in PBS in einem Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt, das mit 5% Rinderserumalbumin (BSA) beschichtet ist. Kerne auf Trockeneis/-80 °C einfrieren oder sofort zur ATAC-Aufbereitung verwenden.
- Für sn RNA-seq oder ATAC-seq werden Kerne in 0,04% BSA in PBS gesammelt (siehe auch Abschnitt 7.2).
7. Tipps zur Vorbereitung der Bibliothek
- Vorbereitung der Bulk-Nu-RNA-Sequenzierungsbibliothek
- Nach dem Sammeln in RNA-Extraktionsreagenz führen Sie eine Standard-Phenol/Chloroform-RNA-Extraktion durch, indem Sie Phenol/Chloroform hinzufügen und RNA aus der oberen wässrigen Schicht mit Ethanol ausfällen, gefolgt von einem DNase-Aufschluss auf Tube (15 min).
- Führen Sie eine RNA-Reinigung durch und konzentrieren Sie sich in einem Endvolumen von 15 μL Wasser.
HINWEIS: Mit dieser Methode beträgt die repräsentative Erholung aus 300 mg adulter Kortexprobe ~ 300.000 NeuN + -Kerne (15-20 ng / μL Gesamt-RNA nach Aufreinigung und Konzentration) und ~ 250.000 PAX6 + -Kerne (10-12 ng / μL Gesamt-RNA nach Aufreinigung und Konzentration). Diese repräsentative Ausbeute kann je nach Probenqualität, Gating-Stringenz und RNA-Rückgewinnung stark variieren. - Durchführung einer quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) vor der Sequenzierung, um die Anreicherung von Astrozyten basierend auf einer hohen differentiellen Expression von kanonischen Astrozytenmarkern (GFAP, SOX9), 10-Formyltetrahydrofolat-Dehydrogenase (ALDH1L1)) und der Erschöpfung neuronaler und anderer Zelllinienmarker zu bestätigen (Abbildung 1G).
HINWEIS: Die Erfassung der doppelnegativen Population (NeuN-PAX6-) ermöglicht eine genauere, mehrstufige qPCR-Qualitätskontrollanalyse für die relative Anreicherung von Astrozyten (Abbildung 2H). - Generieren Sie RNA-seq-Bibliotheken mit einem Kit, das für niedrige RNA-Integritätszahlwerte empfohlen wird, wie von postmortalen Proben erwartet.
- Vorbereitung der Einzelkern-Sequenzierungsbibliothek
- Führen Sie eine SN-Sequenzierung über einen institutionellen Sequenzierungskern durch.
- Für die nanofluidikbasierte Verarbeitung und Sequenzierung verwenden Sie die empfohlene Konzentration von 1 × 10 6 Zellen/ml in mindestens 60 μL 1x PBS + 0,04% BSA für die Single-Nucleus-RNA-Sequenzierung (snRNA-seq) und 3 × 106 Zellen/ml in mindestens 20 μL 1x PBS + 0,04% BSA für Single-Nucleus Assay für Transposase-Accessible Chromatin mittels Sequenzierung (snATAC-seq).
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Representative Results
Die Kerne wurden aus frischem (nicht fixiertem) schockgefrorenem temporalem Neokortexgewebe mit einer postmortalen Entnahmezeit von 12 h entnommen. Nach der Dissoziation des Gewebes in die Kernsuspension wurden die Proben mit Antikörpern gegen NeuN, PAX6 und OLIG2 inkubiert und nach dem in Abbildung 1 und Abbildung 2 gezeigten Gating sortiert. Kerne wurden aus NeuN+, PAX6+NeuN- und OLIG2+NeuN- sortierten Populationen gesammelt (Abbildung 1E, F und Abbildung 2F). Ein gezieltes qPCR-Panel zeigte eine Anreicherung für die Pan-Astrozytenmarker GFAP und ALDH1L1 in der PAX6+(NeuN-) Population (Abbildung 1G und Abbildung 2H). Zusätzlich wurde die OLIG2+-Population für den Oligodendrozyten-Vorläuferzellmarker (OPC) PDGFRA angereichert (Abbildung 1G). Die Massen-RNA-Sequenzierung der gesammelten Populationen zeigte eine vergleichende Anreicherung von Astrozytenmarkern und eine Erschöpfung neuronaler Marker in der PAX6+(NeuN-) Population (Abbildung 1H). Die Immunfluoreszenz bestätigte die Kolokalisation von PAX6 mit GFAP in erwachsenen humanen kortikalen Astrozyten (Abbildung 1I).
Die Untersuchung von einfarbigen Steuerelementen zeigt unterschiedliche positive und negative Populationen für jeden Marker, wodurch genaue Grenzwerte für die Sammlung festgelegt werden konnten (Abbildung 2A-G). Darüber hinaus wurde die mit Astrozyten angereicherte FANS-Isolierung mit zwei verschiedenen Antikörpern gegen Astrozytenkernmarker, SOX9 und PAX6, verglichen. Ein höherer Prozentsatz der Kernereignisse wurde von FANS mit PAX6 (~ 13,8%) erfasst als von FANS mit SOX9 (~ 6%) innerhalb des mit Astrozyten angereicherten Gates (Abbildung 2F, G). Ein gezieltes qPCR-Panel zeigte eine Anreicherung für GFAP, PAX6 und SOX9 sowohl in SOX9+(NeuN-) als auch PAX6+(NeuN-) Populationen (Abbildung 2H). Der rückwirkende Vergleich der Dissoziation und Färbung mehrerer Proben mit einem variierenden Post-mortem-Intervall (PMI) der Gewebeentnahme ergab, dass eine kürzere PMI mit einer größeren Erholung der intakten Kerne verbunden war (Abbildung 3A). Gefrorenes Gewebe mit einem PMI von bis zu 24 h ergab eine hohe Rate an intakten Kernen von bis zu 90%; Bei 30 h PMI konnten jedoch nur sehr wenige intakte Kerne wiederhergestellt werden (Abbildung 3A). Die Einbeziehung eines Antikörper-Waschschritts in das Standardprotokoll (das diesen Schritt zur Optimierung der Erholung typischerweise auslässt) zeigte keine signifikanten Verschiebungen in der Trennung verschiedener NeuN+/- oder PAX6+/- Populationen (Abbildung 3B).
Gelegentlich konnte eine schlechte Trennung von PAX6+NeuN-Populationen beobachtet werden, selbst in Proben mit einem hohen Prozentsatz an lebensfähigen Kernen (Abbildung 3C), was die Wiederholung der Gewebedissoziation und des FANS-Protokolls erforderlich machte. Single-Nucleus-RNA-seq-Studien priorisierten PAX6 als einen der wichtigsten differentiell exprimierten nukleären Transkriptionsfaktoren sowohl in protoplasmatischen als auch in fibrösen adulten Astrozyten-Subpopulationen, nicht nur im Neokortex, sondern auch in der subventrikulären Zone (SVZ) und dem angrenzenden Striatum (Abbildung 3D). Der Vergleich von NEUN/PAX6/OLIG2-Triple-FANS zwischen Neokortex und Striatum, die aus derselben Hirnprobe stammen, zeigte regionsspezifische Unterschiede in der Trennung von PAX6+-Kernen (Abbildung 3E). Dieses Protokoll ist derzeit nur für den Neokortex validiert.
Abbildung 1: Validierung der Neuronen- und Astrozyten-angereicherten Isolierung durch FANS. (A-F) Repräsentative Beispiele für sequenzielles FANS-Gating zum Ausschluss von Trümmern und Dubletten (A-C) und zur Definition der Hintergrundfärbung unter Verwendung von (D) einer reinen DAPI-Kontrolle für die Sammlung von (E-F) angereicherten neuronalen (NeuN+), Astrozyten- (PAX6+NeuN-) und OPC- (OLIG2++NeuN-) Zellkernpopulationen. (G) Minimales qPCR-Panel mit Pan-Astrozyten- (GFAP, ALDH1L1), neuronalen (RBFOX3) und OPC-Markern (PDGFRA) zur Qualitätskontrolle der gesammelten Populationen (A-G: temporale Neokortex-Autopsieprobe ohne Pathologie, 12 h PMI, 100.000 Ereignisse gezeigt; gepunktete Linien repräsentieren positiv gated sequentielle Populationen; durchgezogene Linien stellen die endgültige Sammlung von Zelltyp-angereicherten Populationen dar). (H) Heatmap generiert aus zeilennormalisierten RNA-Sequenzierungsdaten, die die Expression kanonischer Astrozyten- und neuronaler Marker in PAX6+- und NeuN+-sortierten Populationen zeigen (n = 3 Autopsiefälle, temporaler Neokortex ohne Pathologie, PMI 12-21 h). (I) Repräsentatives Immunfluoreszenzbild von PAX6, GFAP und NeuN im menschlichen Neokortex. Pfeile zeigen Astrozyten an, die PAX6 und GFAP koexprimieren. Abkürzungen: FANS = fluoreszenzaktivierende Kernsortierung; DAPI = 4′,6-Diamidino-2-phenylindol; NeuN = neuronale Kerne; PAX6 = gepaartes Boxprotein 6; OLIG2 = Oligodendrozyten-Transkriptionsfaktor 2; OPC = Oligodendrozyten-Vorläuferzelle; qPCR = quantitative Polymerase-Kettenreaktion; GFAP = gliales fibrilläres saures Protein ; ALDH1L1 = 10-Formyltetrahydrofolat-Dehydrogenase; RBFOX3 = RNA-bindendes Protein FOX-1 Homolog 3; PDGFRA = Thrombozyten-abgeleiteter Wachstumsfaktor alpha; PMI = Post-mortem-Intervall; SSC-A = seitliche Streufläche; FSC-A = Vorwärtsstreufläche; SSC-W = seitliche Streubreite; FSC-W = Vorwärtsstreubreite; NeuN-555 = Maus-Anti-NeuN, konjugiert mit AF555; PAX6-APC = Maus-Anti-PAX6 konjugiert mit Allophycocyanin; OLIG2-488 = Maus-Anti-OLIG2 konjugiert mit grün fluoreszierendem Farbstoff für die 488-nm-Laserlinie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Vergleichende Isolierung von Astrozyten-angereicherten Populationen unter Verwendung von PAX6- oder SOX9-Antikörpern. (A-E) Einfarbige Steuerelemente für DAPI, NeuN, PAX6, SOX9 und OLIG2 definieren positive/negative Grenzwerte in den jeweiligen Fluoreszenzkanälen. (F-G) Vergleichende FANS-Methode zur astrozytenangereicherten Isolierung unter Verwendung von (F) NeuN/PAX6- oder (G) NeuN/SOX9-Antikörpern. Ein größerer Prozentsatz der Ereignisse wird von PAX6 erfasst als von SOX9 innerhalb des mit Astrozyten angereicherten Tors. (A-G: identische postmortale nicht-pathologische temporale Neokortex-Probe, die für alle Experimente verwendet wurde; 12 h PMI; 10.000 Ereignisse gezeigt). (H) Qualitätskontrolle qPCR-Analyse bestätigt die Anreicherung von Astrozytenmarkern und die Erschöpfung von Nicht-Astrozytenmarkern in PAX6+(NeuN-) und SOX9+(NeuN-) sortierten Populationen von F-G (Daten normalisiert auf ACTB und quantifiziert als Faltenänderung der NeuN+-Population). Abkürzungen: DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindol; NeuN = neuronale Kerne; PAX6 = gepaartes Boxprotein 6; OLIG2 = Oligodendrozyten-Transkriptionsfaktor 2; SOX9 = SRY-Box-Transkriptionsfaktor 9; qPCR = quantitative Polymerase-Kettenreaktion; GFAP = gliales fibrilläres saures Protein ; RBFOX3 = RNA-bindendes Protein FOX-1 Homolog 3; PDGFRA = Thrombozyten-abgeleiteter Wachstumsfaktor alpha; PMI = Post-mortem-Intervall; NeuN-555 = Maus-Anti-NeuN, konjugiert mit AF555; PAX6-APC = Maus-Anti-PAX6 konjugiert mit Allophycocyanin; OLIG2-488 = Maus-Anti-OLIG2 konjugiert mit grün fluoreszierendem Farbstoff für die 488-nm-Laserlinie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Abhängige und unabhängige Metriken für erfolgreiche FANS-Experimente. (A) Auswirkung des Probenentnahme-PMI auf die Qualität der Kerne: Ein niedrigerer PMI ermöglicht die Wiederherstellung einer größeren Anzahl intakter Kerne mit ausreichenden Ergebnissen bis zu 24 h. (B) Die Einbeziehung eines Waschschritts nach der Antikörperinkubation scheint die FANS-Populationen optisch nicht zu verschieben. (C) Beispiel eines fehlgeschlagenen FANS-Experiments mit Mangel an ausgeprägter PAX6+(NeuN-) Population (rechts) trotz des Vorhandenseins intakter Kerne und niedriger Hintergründe (links) (postmortaler temporaler Neokortex, nicht-pathologisch, 7 h PMI). (D) Heatmap-Darstellung von erwachsenen menschlichen sn-RNA-seq-Daten, die eine differentielle Expression von PAX6 und zwei anderen Astrozyten-Kernfaktoren, SOX9 und LHX2, über protoplasmatische und faserige Astrozyten-Subpopulationen in Kortex und SVZ zeigen, im Vergleich zu anderen Zelltypen (roter Farbgradient repräsentiert das Spektrum der log-normalisierten durchschnittlichen Genexpressionswerte; n = 3 verschiedene Autopsiefälle, 43.619 Gesamtkerne. (E) Unterschiedliche Hirnregionen (temporaler Neokortex vs. SVZ und subjazentes Striatum) zeigen unterschiedliche Muster der NeuN/PAX6/OLIG2-Trennung. Abkürzungen: FANS = fluoreszenzaktivierende Kernsortierung; DAPI = 4′,6-Diamidino-2-phenylindol; NeuN = neuronale Kerne; PAX6 = gepaartes Boxprotein 6; OLIG2 = Oligodendrozyten-Transkriptionsfaktor 2; GFAP = gliales fibrilläres saures Protein ; ALDH1L1 = 10-Formyltetrahydrofolat-Dehydrogenase; LXH2 = SLIM-Homöobox 2; PMI = Post-mortem-Intervall; SSC-A = seitliche Streufläche; FSC-A = Vorwärtsstreufläche; NeuN-555 = Maus-Anti-NeuN, konjugiert mit AF555; PAX6-APC = Maus-Anti-PAX6 konjugiert mit Allophycocyanin; OLIG2-488 = Maus-Anti-OLIG2, konjugiert mit grün fluoreszierendem Farbstoff für die 488-nm-Laserlinie; SVZ = subventrikuläre Zone; A(p) = protoplasmatische (graue Substanz) Astrozyten; A(f) = faserige (weiße Substanz) Astrozyten; OL = Oligodendrozyten; OPC = Oligodendrozyten-Vorläuferzellen; EN = exzitatorische Neuronen; MSN = mittelstachelige Neuronen; MG = Mikroglia; BVC = Blutgefäßzellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Das experimentelle Design nach dem skizzierten Protokoll sollte unter Berücksichtigung mehrerer biologischer und technischer Faktoren abgeschlossen werden. Beginnende Gewebeproben sind frisch gefroren, ohne fixiert worden zu sein, und haben vorzugsweise ein kurzes postmortales Entnahmeintervall, um die Kernerholung zu maximieren. Erfahrungsgemäß ermöglicht ein PMI von bis zu 24 h eine adäquate Kernerholung; Ein PMI von 12 h oder weniger ist jedoch vorzuziehen, um die Erholung intakter Kerne zu optimieren. Zusätzliche Faktoren neben dem PMI, einschließlich der Temperatur der Körperlagerung und des pH-Wertes des Gewebes, können ebenfalls die Kernausbeute beeinflussen, wurden aber in diesen Studien nicht berücksichtigt14. Aus anekdotischer Erfahrung wurde festgestellt, dass die FANS-Erholung mit der Lagerung desselben Gewebes bis zu fünf Jahre bei -80 ° C vergleichbar ist, obwohl keine kontrollierten Experimente durchgeführt wurden, um die Variabilität der Lagerung bei zelltypspezifischer Expression zu bewerten. Das Waschen der Probe nach der Antikörperinkubation ist eine weitere Variable, die möglicherweise berücksichtigt werden muss. Im Allgemeinen verringert ein Waschschritt die Gesamtausbeute, kann aber die Trennung verschiedener immunmarkierter Populationen verbessern. In diesen Studien wurde kein Unterschied in der Trennung von NEUN/PAX6-Populationen beobachtet, wenn ein Post-Antikörper-Waschschritt eingeschlossen oder ausgeschlossen wurde, aber dieser Schritt kann bei der Verwendung anderer primärer und sekundärer Antikörper von Vorteil sein, insbesondere wenn sie nicht präkonjugiert sind.
Aufgrund der Variabilität der Empfindlichkeit der Sortieranlage ist es notwendig, bei jedem Sortierereignis geeignete Kontrollen durchzuführen. Wenn bei der Visualisierung auf einem Hämozytometer übermäßige extrazelluläre Trümmer in der resuspendierten Probe beobachtet werden, kann die Probe durch einen 40-μm-Filter geleitet werden, um nur die Kerne zu halten. Wenn die Probe begrenzt ist, können Perlen, die mit dem entsprechenden Fluorophor gekennzeichnet sind, auch für einfarbige und FMO-Kontrollen verwendet werden. Wenn die Proben für die gewünschten Astrozytenpopulationen nicht angereichert zu sein scheinen, wie entweder durch qPCR oder Sequenzierungsergebnisse bestimmt, kann es hilfreich sein, alle NeuN- sowie PAX6+(NeuN-) Populationen strenger zu gaten, so dass mehr Platz zwischen den Gate-Cutoffs für positive und negative Populationen bleibt.
Die meisten der hier beschriebenen Validierungsstudien wurden mit OLIG2 zusätzlich zu NeuN und PAX6 durchgeführt, um gleichzeitig für neuronale, Astrozyten- und Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) Nukleipopulationen anzureichern. Es wird empfohlen, OLIG2 als Marker der dritten Linie einzuschließen, um kortikale Astrozyten innerhalb der NeuN-Fraktion effektiver anzureichern. Das Vorhandensein oder Fehlen von FITC-konjugiertem OLIG2 scheint die PAX6+-Population nicht zu verschieben; Daher wird davon ausgegangen, dass Experimente ohne OLIG2 zu einer ähnlichen Astrozytenanreicherung führen werden. Bemerkenswert ist, dass es wichtig ist, dass die PAX6 + -Population von der NeuN-Population abgegrenzt wird, da einige neuronale Populationen sowohl NeuN als auch PAX615 exprimieren. Astrozyten können auch nach SOX9-Expression sortiert werden; Die Färbung und Sortierung mit SOX9 führt jedoch zu einer weniger robusten Anreicherung von Astrozyten im Vergleich zu PAX6. Obwohl eine klare Trennung zwischen neuronalen, astrozytären und OPC-Linien im adulten Kortex beobachtet wurde, wurde eine ähnliche Trennung zwischen PAX6+- und OLIG2+-Populationen im erwachsenen SVZ und im angrenzenden Striatum nicht beobachtet.
Während es möglich ist, dass einige Astrozyten aus dem SVZ niedrige OLIG2-Spiegel exprimieren, wurden die gesammelten Populationen nur durch qPCR validiert (Daten nicht gezeigt); Daher kann die nachgeschaltete RNA-Sequenzierung hilfreich sein, um die Reinheit dieser Populationen weiter zu definieren. Darüber hinaus kann dieses Protokoll angepasst werden, um Kerne aus gefrorenem fetalem Hirngewebe und Hirntumorgewebe unter Verwendung populationsspezifischer Kernmarker zu isolieren. Da diese Gewebe wesentlich zellulärer sind, kann es hilfreich sein, mit weniger Gewebe zu beginnen, um die Aggregation von Kernen zu minimieren. Bei der Sortierung von aneuploiden Kernen aus neoplastischem Gewebe wird das DAPI-Gating angepasst, um eine potenziell höhere Fluoreszenz zu berücksichtigen. Es wird dringend empfohlen, dass Benutzer eine sorgfältige Validierung durchführen, bevor sie FANS auf neoplastischem Gewebe durchführen, da das aktuelle Protokoll nur für nicht-neoplastische Proben validiert wird. Insgesamt schlägt das oben beschriebene Protokoll eine validierte Strategie zur Isolierung angereicherter Astrozytenpopulationen vor, die von zuvor festgelegten Protokollen zur Anreicherung von Neuronen angepasst wurde. Diese Methodik kann verwendet werden, um Astrozytenkernpopulationen sowohl aus normalem als auch aus erkranktem kortikalem Hirngewebe für weitere molekulare Analysen effektiv zu isolieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Wir danken den Mitgliedern der Pathologie und Neurochirurgie an der Icahn School of Medicine am Mount Sinai für ihre Hilfe bei der Beschaffung von de-identifiziertem Hirngewebe und der Durchflusszytometrie CORE von ISMMS für die fachkundige Beratung. Die Studie wurde teilweise von NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (zu N.M.T.) und R61DA048207 (zu S.A.) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS pH 7.2 | Invitrogen | 70013073 | |
| ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60 | Millipore | MAB377A5MI | mouse anti-NeuN conjugated to a fluorescent compound AF555 (excitation, 553 nm; emission, 568 nm) |
| ANTI-OLIG2 ANTIBODY CLONE 211 | Millipore | MABN50A4MI | mouse anti-OLIG2 conjugated to a fluorescent compound AF488 (excitation, 499 nm; emission, 520 nm) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | BP9704-100 | |
| Bright-Line Counting Chamber | Hausser Scientific | 3110V | |
| Calcium Chloride Anhydrous | Fisher | C614-3 | |
| Cell Strainers, 40 µM | SP Scienceware | 136800040 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma | 43815-1G | |
| DNA Library Kit | Illumina, Nextera | FC-121–1030 | |
| DNAse I | Worthington | LS002139 | |
| Dounce Tissue Grinder | WHEATON | 357542 | |
| FACS Sorter | BD Biosciences | BD FACSAria III | |
| Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher | M13-500 | |
| PAX6 (PAX6/496) - 100 TESTS | Novus | NBP234705J | |
| RNA Clean & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian | Clontech Laboratories | 635005 | Fragmentation time of 2.5 minutes, as recommended for low RIN RNA values. |
| Sucrose, crystal certified, ACS, 500 mg | Fisher | S5500 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure | Thermo Scientific | J22638AE | |
| TritonX-100 | Fisher | BP151-500 | non-ionic surfactant in lysis buffer |
| TRIzol LS Reagent | Invitrogen | 10296028 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | reagent for isolation of RNA |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima XE-100 | A94516 | |
| Ultracentrifuge tubes PP 9/16 X 3-1/2 | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure Distilled Water (RNAse-, DNAse-free) | Invitrogen | 10977023 | referred to as distilled water |
| Ultrapure EDTA | Life Technologies | 15576-028 |
References
- Mitchell, A., Roussos, P., Peter, C., Tsankova, N., Akbarian, S. The future of neuroepigenetics in the human brain. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 128, 199-228 (2014).
- Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S.
- Akbarian, S., et al.
- Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), e914 (2008).
- Tome-Garcia, J., et al. Cell type-specific isolation and transcriptomic profiling informs glial pathology in human temporal lobe epilepsy. BioRxiv. , (2020).
- Zhang, Y., et al. Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse. Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).
- Sun, W., et al. SOX9 Is an astrocyte-specific nuclear marker in the adult brain outside the neurogenic regions. Journal of Neuroscience. 37 (17), 4493-4507 (2017).
- Manuel, M. N., Mi, D., Mason, J. O., Price, D. J. Regulation of cerebral cortical neurogenesis by the Pax6 transcription factor. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 70 (2015).
- Sakurai, K., Osumi, N. The neurogenesis-controlling factor, Pax6, inhibits proliferation and promotes maturation in murine astrocytes. Journal of Neuroscience. 28 (18), 4604-4612 (2008).
- Zhong, S., et al.
- Pollen, A., et al. Molecular identity of human outer radial glia during cortical development. Cell. 163 (1), 55-67 (2015).
- Cvekl, A., Callaerts, P. PAX6: 25th anniversary and more to learn. Experimental Eye Research. 156, 10-21 (2017).
- Goc, J., Liu, J. Y., Sisodiya, S. M., Thom, M. A spatiotemporal study of gliosis in relation to depth electrode tracks in drug-resistant epilepsy. European Journal of Neuroscience. 39 (12), 2151-2162 (2014).
- Monoranu, C. M., et al. pH measurement as quality control on human post mortem brain tissue: a study of the BrainNet Europe consortium. Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (3), 329-337 (2009).
- Ninkovic, J., et al. The transcription factor Pax6 regulates survival of dopaminergic olfactory bulb neurons via crystallin αA. Neuron. 68 (4), 682-694 (2010).
