Summary
Abbiamo sviluppato un metodo che arricchisce e isola le popolazioni di astrociti umani da tessuti freschi congelati per l'uso in analisi molecolari a valle.
Abstract
La complessità degli astrociti umani rimane scarsamente definita nel tessuto umano primario, richiedendo strumenti migliori per il loro isolamento e caratterizzazione molecolare. Lo smistamento dei nuclei attivati dalla fluorescenza (FANS) può essere utilizzato per isolare e studiare con successo le popolazioni di nuclei neuronali umani (NeuN +) dal tessuto d'archivio congelato, evitando così problemi associati alla manipolazione di tessuto fresco. Tuttavia, mancano sforzi per isolare in modo simile l'astroglia dall'elemento non neuronale (NeuN-). Una strategia di immunotagging recentemente sviluppata e convalidata utilizza tre anticorpi del fattore di trascrizione per isolare simultaneamente popolazioni di nuclei neuronali arricchiti (NeuN +), astrociti (paired box protein 6 (PAX6) + NeuN-) e oligodendrociti progenitori (OLIG2 + NeuN-) da tessuto temporale temporale umano postmortem non malato, fresco (non fisso) congelato a scatto.
Questa tecnica si è dimostrata utile per la caratterizzazione delle alterazioni del trascrittoma specifiche del tipo cellulare nella neocorteccia patologica primaria dell'epilessia. Le analisi trascrittomiche hanno confermato che le popolazioni selezionate pax6 + NeuN sono robustamente arricchite per i marcatori pan-astrocitari e catturano gli astrociti sia in condizioni di riposo che reattive. Questo articolo descrive la metodologia FANS per l'isolamento di popolazioni di nuclei arricchiti di astrociti dalla corteccia umana appena congelata, compresa la dissociazione dei tessuti in sospensione a nucleo singolo (sn); immunotagging di nuclei con anticorpi coniugati fluorescenti anti-NeuN e anti-PAX6; FANS gating strategie e metriche di controllo qualità per ottimizzare la sensibilità e la specificità durante lo smistamento e per confermare l'arricchimento degli astrociti; e l'approvvigionamento raccomandato per il sequenziamento dell'accessibilità del trascrittoma e della cromatina a valle alla risoluzione bulk o sn. Questo protocollo è applicabile per campioni corticali umani non necrotici, congelati freschi, con varie patologie e raccolta di tessuto post mortem raccomandata entro 24 ore.
Introduction
La complessità molecolare degli astrociti umani rimane scarsamente definita nel tessuto primario, richiedendo strumenti migliori per il loro isolamento e caratterizzazione ad alta risoluzione, sia in salute che in malattia. La separazione dei neuroni umani intatti e della glia dalla loro nicchia si è dimostrata difficile a causa dell'accesso limitato di campioni di tessuto cerebrale fresco, della natura fortemente interconnessa dei processi gliali e neuronali e dell'inevitabile attivazione cellulare durante l'elaborazione, che limitano la caratterizzazione molecolare di questi tipi di cellule ex vivo1 . Lo smistamento dei nuclei attivati dalla fluorescenza (FANS) è emerso come alternativa allo smistamento delle cellule vive, consentendo la dissociazione e l'immunotagging delle popolazioni di nuclei dal tessuto congelato. Negli ultimi dieci anni, FANS è diventato ampiamente utilizzato per isolare e caratterizzare molecolarmente le popolazioni di nuclei neuronali umani (NeuN +) in una varietà di campioni cerebrali e regioni anatomiche 1,2,3,4.
Tuttavia, metodi simili per isolare specifiche sottopopolazioni di nuclei gliali dalla corteccia umana sono stati limitati, portando a una relativa mancanza di sofisticazione nella comprensione della complessità degli astrociti sia nei tessuti normali che in quelli malati. A tal fine, un protocollo precedentemente pubblicato è stato adattato per isolare le popolazioni neuronali umane utilizzando FANS4 e un metodo è stato convalidato per arricchire gli astrociti (e per i progenitori oligodendrogliali) utilizzando una combinazione di tripli anticorpi, catturando gli astrociti sia in condizioni di riposo che reattive5. Per arricchire specificamente gli astrociti nella frazione NeuN-, sono stati utilizzati anticorpi contro uno dei due fattori di trascrizione noti per essere espressi in modo differenziale tra le popolazioni di astrociti, PAX6 o SRY-box transcription factor 9 (SOX9)6,7. PAX6 è altamente espresso durante lo sviluppo fetale precoce all'interno di progenitori radiali simili a glia nelle zone germinali e contribuisce sia alla neurogenesi e alla gliogenesi 8,9,10,11, sia alla specifica neuronale retinica12. Nell'adulto, PAX6 è differenzialmente sovraespresso negli astrociti umani a riposo6 e mostra co-espressione proteica con la proteina acida fibrillare gliale (GFAP) negli astrociti del tessuto epilettico umano13.
Questo protocollo descrive l'isolamento simultaneo di popolazioni di nuclei neocorticali neuronali e arricchiti di astrociti da parte di FANS. Il tessuto post-mortem fresco (non fissato) congelato a scatto (cioè fresco-congelato) raccolto dalla corteccia adulta viene prima dissociato meccanicamente e chimicamente. Dopo la lisi e l'ultracentrifugazione in un gradiente di saccarosio, i componenti citoplasmatici ed extracellulari vengono scartati mentre i nuclei vengono trattenuti. I nuclei vengono quindi etichettati con anticorpi nucleari coniugati fluorescentemente corrispondenti ai lignaggi bersaglio desiderati e ordinati utilizzando FANS. Seguendo questo approccio, l'arricchimento degli astrociti è dimostrato nelle popolazioni PAX6+ NeuN- raccolte, convalidate sia da un pannello qPCR mirato che dal sequenziamento dell'RNA nucleare a valle.
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Protocol
NOTA: Il programma per la protezione dei soggetti umani presso la Icahn School of Medicine del Monte Sinai (ISMMS) e il suo Institutional Review Board (IRB) assicurano la condotta etica della ricerca e la conformità con le normative federali, statali e istituzionali. In questo studio, tutti i campioni post-mortem utilizzati sono stati de-identificati, ottenuti con il consenso appropriato attraverso il biorepository, e sono stati esenti dalla designazione di "ricerca umana" dall'IRB dell'ISMMS (HS # 14-01007).
1. Preparazione del buffer
NOTA: se si esegue il sequenziamento dell'RNA a valle, trattare accuratamente tutti gli spazi di lavoro e gli strumenti con la soluzione di decontaminazione RNase per prevenire la degradazione dell'mRNA.
- Preparare il buffer di lisi.
- Sciogliere quanto segue in H2O distillato fino a 50 mL: 5,47 g di saccarosio (0,32 M finale), 250 μL di 1 M CaCl2 (5 mM finale), 150 μL di 1 M Mg(CH3COO)2 (3 mM finale), 10 μL di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (0,1 mM finale), 500 μL di 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM finale), 50 μL di Triton X-100 (0,1% finale) e 17 μL di 3 M ditiotreitolo (DTT, 1 mM finale, aggiungere fresco) (vedere la tabella dei materiali).
- Preparare il tampone di saccarosio
- Sciogliere quanto segue in H2O distillato fino a 50 mL: 30,78 g di saccarosio (1,8 M finale), 150 μL di 1 M Mg(CH3COO)2 (3 mM finale), 500 μL di 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM finale), 17 μL di 3 M DTT (1 mM finale, aggiungere fresco).
2. Dissociazione del tessuto congelato in sospensione monocucle
- Aggiungere 4 mL di tampone di lisi ghiacciato a un douncer di tessuto di vetro da 7 mL (grinder) e mantenere sul ghiaccio. Sezionare circa 200-400 mg di corteccia umana adulta appena congelata, dounce circa 50x e trasferire l'omogeneizzato tissutale in un tubo di polipropilene ultracentrifuga da 12 mL.
- Utilizzando una pipetta da 5 mL, aggiungere 6,5 mL di tampone di saccarosio ghiacciato sul fondo del tubo ultracentrifuga, facendo attenzione a non disturbare lo strato tra saccarosio e l'omogeneizzato tissutale.
NOTA: se si elaborano campioni aggiuntivi, bilanciare attentamente i tubi in base al peso aggiungendo un ulteriore tampone di lisi al campione più leggero. Il bilanciamento preciso dei tubi ultracentrifuga è essenziale per prevenire danni al rotore e garantire la rotazione alla velocità corretta.
3. Ultracentrifugazione
- Ultracentrifugare il lisato a 24.400 giri/min (101.814 × g) per 1 ora a 4 °C. Aspirare accuratamente il surnatante e i detriti senza disturbare il pellet.
NOTA: un pellet potrebbe non essere visibile se si inizia con meno di 200 mg di tessuto. - Aggiungere 600 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (Ca2+, Mg2+ libero) al pellet di nuclei e incubare sul ghiaccio per 10 minuti prima di risospendere.
- Pipettare su e giù 50 volte per risospese il pellet di nuclei sul ghiaccio.
- Utilizzare un emocitometro per visualizzare i nuclei intatti al microscopio e per garantire che la concentrazione della risospensione sia superiore a 105 nuclei / mL prima di procedere alla fase successiva (combinare 10 μL dei nuclei risospesi con 10 μL di tripano blu).
4. Incubazione degli anticorpi
- Per immunotattare il campione per i FANS, aggiungere 500 μL del pellet del campione risospeso, 490 μL di 1x PBS (Ca2+, Mg2+ libero), 10 μL di BSA al 10% (0,1% finale), 1 μL di anticorpo anti-NeuN di topo coniugato ad AF555 (NeuN-AF555, concentrazione finale 1:1000) e 1 μL di anticorpo anti-PAX6 di topo coniugato all'alloficocianina (PAX6-APC, concentrazione finale 1:1000).
NOTA: Possono essere aggiunti anticorpi alternativi coniugati ad altri fluorofori (vedi discussione). Qui, l'anti-OLIG2 del topo coniugato ad AF488 (concentrazione 1:1000) è stato utilizzato con risultati favorevoli. - Eseguire controlli solo 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e monocolore per impostare i parametri di gating, utilizzando una piccola quantità del campione se necessario.
- Per eseguire il controllo a colore singolo AF555, aggiungere 20 μL del pellet campione risospeso, 970 μL di 1x PBS (Ca2+, Mg2+ libero), 10 μL di BSA al 10% (0,1% finale) e 1 μL di anticorpo NeuN-AF555 (concentrazione 1:1000).
- Per eseguire il controllo APC a colore singolo, aggiungere 20 μL del pellet campione risospeso, 970 μL di 1X PBS (Ca2+, Mg2+ libero), 10 μL di 10% BSA (0,1% finale) e 1 μL di anticorpo PAX6-APC (concentrazione 1:1000).
- Per eseguire il controllo solo DAPI, aggiungere 20 μL del pellet campione risospeso, 970 μL di 1X PBS (Ca2+, Mg2+ libero) e 10 μL di BSA al 10% (0,1% finale) (DAPI verrà aggiunto in seguito, vedere 4.4).
NOTA: se vengono utilizzati più di due anticorpi, si consiglia di eseguire il controllo della fluorescenza meno uno (FMO) oltre ai controlli monocolore.
- Incubare i campioni e i controlli con rotazione al buio per 1 ora a 4 °C.
- Aggiungere DAPI a 1:1000 a tutti i campioni e controlli e procedere con l'ordinamento.
5. Selezione dei nuclei attivati dalla fluorescenza (FANS)
NOTA: Si raccomanda di utilizzare una struttura istituzionale di citometria a flusso con l'assistenza di personale addestrato, a meno che non sia già esperto in tecniche di citometria / smistamento a flusso.
- Cancello come mostrato di seguito.
- In primo luogo, e per ogni campione, gate by forward scatter (FSC-A) vs. side scatter (SSC-A) per includere le particelle nell'intervallo di dimensioni appropriato per i nuclei, escludendo così i globuli rossi e i detriti (Figura 1A).
NOTA: una preparazione di nuclei molto pulita può distinguere tra un ammasso di detriti più piccolo e un cluster di nuclei. - Successivamente, e per ogni campione, gate da FSC-A vs. FSC-W (o FSC-A vs. FSC-H) e SSC-A vs. SSC-W (o SSC-A vs. SSC-H) per includere solo nuclei singoletti (Figura 1B).
- Successivamente, e per ogni campione, gate da PARTE DI DAPI per includere singoletti nuclei intatti (popolazione GATED ALTA DAPI), esclusi i detriti (DAPI-basso, a sinistra della popolazione gated) e i doppietti (a destra della popolazione gated) (Figura 1C).
- Imposta ulteriori gating basati su controlli di fluorescenza, determinati visivamente come cluster distinti su grafici FACS.
- Eseguire il controllo solo DAPI per determinare la colorazione di fondo delle popolazioni, in assenza di anticorpi (Figura 1D e Figura 2A).
- Eseguire il controllo solo NeuN-AF555 per determinare il cutoff per la colorazione NeuN+ nel canale per AF555 (Figura 2B).
- Eseguire il controllo solo PAX6-APC per determinare il cutoff per la colorazione PAX6+ nel canale APC (Figura 2C).
- Eseguire ulteriori controlli monocolore se si utilizzano più anticorpi (Figura 2D,E).
NOTA: se si utilizzano più di due anticorpi, si consiglia un controllo FMO per visualizzare eventuali cambiamenti nelle popolazioni.
- Una volta eseguiti tutti i controlli, disegna i cancelli per le collezioni NeuN+ e PAX6+ al di sopra delle soglie stabilite.
- Gate la popolazione NeuN+ per raccogliere i neuroni (Figura 1E e Figura 2F).
- Gate la popolazione PAX6+ dalla popolazione NeuN- per raccogliere astrociti (Figura 1E, F e Figura 2F).
- Gate e raccogliere ulteriori popolazioni gliali (come le cellule progenitrici degli oligodendrociti, come mostrato qui da OLIG2+) dalla popolazione NeuN-PAX6- (Figura 1F).
NOTA: Nel caso in cui determinare i cutoff di gating appropriati sia difficile con il software di citometria a flusso a causa di popolazioni indistinte, può essere utile modificare il numero di eventi visualizzati (aumentando o riducendo il numero di eventi sul grafico FANS).
- In primo luogo, e per ogni campione, gate by forward scatter (FSC-A) vs. side scatter (SSC-A) per includere le particelle nell'intervallo di dimensioni appropriato per i nuclei, escludendo così i globuli rossi e i detriti (Figura 1A).
- Raccogliere i campioni in modo appropriato in base all'analisi a valle prevista.
6. Raccolta di popolazioni di FANS per analisi molecolari a valle
- Per il sequenziamento dell'RNA di massa, raccogliere 50.000-500.000 nuclei in PBS (vedere anche paragrafo 7.1).
- Aggiungere 2 mL di soluzione di saccarosio, 50 μL di 1 M CaCl2 e 30 μL di 1 M Mg(CH3COO)2 e riempire con PBS fino a 10 mL.
- Invertire e incubare sul ghiaccio per 15 min, quindi centrifugare a 900 × g per 10-15 min a 4 °C.
- Aspirare il surnatante, risospendere in 1 mL di reagente che estrae l'RNA, vortice, congelare su ghiaccio secco e conservare a -80 °C.
- In alternativa, raccogliere i campioni direttamente in 200 μL del reagente che estrae l'RNA. Aggiungere il reagente che estrae l'RNA fino a 1 mL dopo lo smistamento, mantenendo un rapporto 1:1 tra il reagente e il campione selezionato. Vortice, congelare su ghiaccio secco e conservare a -80 °C.
- Per il test di massa per la cromatina accessibile alla trasposasi utilizzando il sequenziamento (ATAC-seq), raccogliere 50.000-75.000 nuclei in PBS in un tubo di microcentrifuga rivestito con albumina sierica bovina al 5% (BSA). Congelare i nuclei su ghiaccio secco/-80 °C o utilizzarli immediatamente per la preparazione dell'ATAC.
- Per sn RNA-seq o ATAC-seq, raccogliere nuclei in BSA allo 0,04% in PBS (vedere anche paragrafo 7.2).
7. Suggerimenti per la preparazione pre-libreria
- Preparazione della libreria di sequenziamento dell'RNA nucleare di massa
- Dopo aver raccolto il reagente di estrazione dell'RNA, eseguire l'estrazione standard di fenolo / cloroformio RNA aggiungendo fenolo / cloroformio e precipitando l'RNA dallo strato acquoso superiore con etanolo, seguita dalla digestione della DNasi su tubo (15 min).
- Eseguire la pulizia dell'RNA e concentrarsi in un volume finale di 15 μL di acqua.
NOTA: Utilizzando questo metodo, il recupero rappresentativo da 300 mg di campione di corteccia adulta è di ~ 300.000 nuclei NeuN + (15-20 ng / μL RNA totale dopo pulizia e concentrazione) e ~ 250.000 nuclei PAX6 + (10-12 ng / μL RNA totale dopo pulizia e concentrazione). Questa resa rappresentativa può variare notevolmente in base alla qualità del campione, al rigore e al recupero dell'RNA. - Eseguire una reazione a catena quantitativa della polimerasi (qPCR) prima del sequenziamento per confermare l'arricchimento degli astrociti basato sull'elevata espressione differenziale dei marcatori astrocitari canonici (GFAP, SOX9), della 10-formiltetraidrofolato deidrogenasi (ALDH1L1)) e dell'esaurimento dei marcatori neuronali e di altri marcatori di lignaggio cellulare (Figura 1G).
NOTA: La raccolta della popolazione a doppio negativo (NeuN-PAX6-) consente un'analisi di controllo qualità qPCR più accurata e a più livelli per l'arricchimento relativo degli astrociti (Figura 2H). - Genera librerie RNA-seq utilizzando un kit consigliato per valori numerici di integrità dell'RNA bassi, come previsto dai campioni post-mortem.
- Preparazione della libreria di sequenziamento a nucleo singolo
- Eseguire il sequenziamento sn attraverso un nucleo di sequenziamento istituzionale.
- Per l'elaborazione e il sequenziamento basati sulla nanofluidica, utilizzare la concentrazione raccomandata di 1 × 106 cellule/mL in almeno 60 μL di 1x PBS + 0,04% BSA per il sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo (snRNA-seq) e 3 × 106 cellule/mL in almeno 20 μL di 1x PBS + 0,04% BSA per il test a nucleo singolo per la cromatina accessibile alla trasposasi mediante sequenziamento (snATAC-seq).
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Representative Results
I nuclei sono stati raccolti da tessuto neocorteccia temporale fresco (non fissato) congelato a scatto con un tempo di raccolta post mortem di 12 ore. Dopo la dissociazione dei tessuti in sospensione nucleica, i campioni sono stati incubati con anticorpi contro NeuN, PAX6 e OLIG2 e ordinati in base al gating mostrato in Figura 1 e Figura 2. I nuclei sono stati raccolti da popolazioni ordinate NeuN+, PAX6+NeuN- e OLIG2+NeuN- (Figura 1E,F e Figura 2F). Un pannello qPCR mirato ha rivelato l'arricchimento per i marcatori pan-astrociti, GFAP e ALDH1L1, nella popolazione PAX6+ (NeuN-) (Figura 1G e Figura 2H). Inoltre, la popolazione OLIG2+ è stata arricchita per il marcatore delle cellule progenitrici degli oligodendrociti (OPC) PDGFRA (Figura 1G). Il sequenziamento dell'RNA di massa delle popolazioni raccolte ha mostrato un arricchimento comparativo dei marcatori astrocitari e l'esaurimento dei marcatori neuronali nella popolazione PAX6+ (NeuN-) (Figura 1H). L'immunofluorescenza ha confermato la colocalizzazione di PAX6 con GFAP in astrociti corticali umani adulti (Figura 1I).
L'esame dei controlli a colore singolo rivela popolazioni positive e negative distinte per ciascun marcatore, che hanno consentito l'impostazione di cutoff accurati per la raccolta (Figura 2A-G). Inoltre, l'isolamento FANS arricchito con astrociti è stato confrontato con due diversi anticorpi contro i marcatori nucleari degli astrociti, SOX9 e PAX6. Una percentuale più elevata di eventi nucleici è stata catturata da FANS usando PAX6 (~ 13,8%) rispetto a FANS usando SOX9 (~ 6%) all'interno del gate arricchito di astrociti (Figura 2F, G). Un pannello qPCR mirato ha rivelato l'arricchimento per GFAP, PAX6 e SOX9 in entrambe le popolazioni SOX9 + (NeuN-) e PAX6 + (NeuN-) (Figura 2H). Confrontando retroattivamente la dissociazione e la colorazione di diversi campioni con intervallo post-mortem variabile (PMI) della raccolta tissutale ha rivelato che un PMI più breve era associato a un maggiore recupero dei nuclei intatti (Figura 3A). Il tessuto congelato con un PMI fino a 24 ore ha prodotto un alto tasso di nuclei intatti, fino al 90%; a 30 h PMI, tuttavia, pochissimi nuclei intatti potrebbero essere recuperati (Figura 3A). L'inclusione di una fase di lavaggio degli anticorpi nel protocollo standard (che in genere omette questo passaggio per ottimizzare il recupero) non ha rivelato cambiamenti significativi nella separazione di distinte popolazioni NeuN +/- o PAX6 + / - (Figura 3B).
Occasionalmente, è stata osservata una scarsa separazione delle popolazioni pax6+NeuN, anche in campioni con un'alta percentuale di nuclei vitali (Figura 3C), che ha reso necessaria la ripetizione della dissociazione tissutale e del protocollo FANS. Gli studi sull'RNA-seq a nucleo singolo hanno ulteriormente dato priorità a PAX6 come fattore di trascrizione nucleare differenzialmente espresso in entrambe le sottopopolazioni di astrociti adulti protoplasmatici e fibrosi, non solo nella neocorteccia, ma anche nella zona subventricolare (SVZ) e nello striato adiacente (Figura 3D). Il confronto dei tripli FANS NEUN/PAX6/OLIG2 tra la neocorteccia e lo striato derivati dallo stesso campione cerebrale ha mostrato differenze regionali specifiche nella separazione dei nuclei PAX6+ (Figura 3E). Questo protocollo è attualmente convalidato solo per la neocorteccia.
Figura 1: Validazione dell'isolamento arricchito con neuroni e astrociti da parte di FANS. (A-F) Esempi rappresentativi di FANS sequenziali per escludere detriti e doppietti (A-C) e definire la colorazione di fondo utilizzando (D) un controllo solo DAPI per la raccolta di popolazioni di nuclei neuronali (NeuN+), astrociti (PAX6+NeuN-) e OPC (OLIG2++NeuN-) arricchiti (E-F). (G) Pannello qPCR minimo che utilizza marcatori pan-astrociti (GFAP, ALDH1L1), neuronali (RBFOX3) e OPC (PDGFRA) per il controllo di qualità delle popolazioni raccolte (A-G: campione di autopsia della neocorteccia temporale senza patologia, PMI 12 ore, 100.000 eventi mostrati; le linee tratteggiate rappresentano popolazioni sequenziali positivamente chiuse; le linee solide rappresentano la raccolta finale di popolazioni arricchite di tipo cellulare). (H) Heatmap generata da dati di sequenziamento dell'RNA di massa normalizzati in fila che mostrano l'espressione di astrociti canonici e marcatori neuronali in popolazioni ordinate PAX6+ e NeuN+ (casi di autopsia n=3, neocorteccia temporale senza patologia, PMI 12-21 h). (I) Immagine rappresentativa di immunofluorescenza di PAX6, GFAP e NeuN nella neocorteccia umana. Le frecce indicano gli astrociti che co-esprimono PAX6 e GFAP. Abbreviazioni: FANS = fluorescence-activate nuclei sorting; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindolo; NeuN = nuclei neuronali; PAX6 = proteina 6 della scatola accoppiata; OLIG2 = fattore di trascrizione oligodendrocitario 2; OPC = cellula progenitrice degli oligodendrociti; qPCR = reazione a catena quantitativa della polimerasi; GFAP = proteina acida fibrillare gliale; ALDH1L1 = 10-formiltetraidrofolato deidrogenasi; RBFOX3 = proteina legante l'RNA FOX-1 omologo 3; PDGFRA = fattore di crescita alfa derivato dalle piastrine; PMI = intervallo post mortem; SSC-A = area di dispersione laterale; FSC-A = area di dispersione in avanti; SSC-W = larghezza di dispersione laterale; FSC-W = larghezza di dispersione in avanti; NeuN-555 = topo anti-NeuN coniugato ad AF555; PAX6-APC = topo anti-PAX6 coniugato ad allococianina; OLIG2-488 = topo anti-OLIG2 coniugato a colorante fluorescente verde per la linea laser a 488 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Isolamento comparativo di popolazioni arricchite di astrociti utilizzando anticorpi PAX6 o SOX9. (A-E) I controlli monocolore per DAPI, NeuN, PAX6, SOX9 e OLIG2 definiscono cutoff positivi/negativi nei rispettivi canali di fluorescenza. (F-G) Metodo COMPARATIVO FANS per l'isolamento arricchito di astrociti utilizzando (F) neun/PAX6 o (G) anticorpi NeuN/SOX9. Una percentuale maggiore di eventi viene catturata da PAX6 rispetto a SOX9 all'interno del gate arricchito di astrociti. (A-G: identico campione di neocorteccia temporale non patologica post mortem utilizzato per tutti gli esperimenti; 12 ore PMI; 10.000 eventi mostrati). (H) L'analisi qPCR del controllo di qualità conferma l'arricchimento dei marcatori astrocitari e l'esaurimento dei marcatori non astrocitari in popolazioni ordinate PAX6+ (NeuN-) e SOX9+ (NeuN-) da F-G (dati normalizzati ad ACTB e quantificati come variazione di piega della popolazione NeuN+). Abbreviazioni: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindolo; NeuN = nuclei neuronali; PAX6 = proteina 6 della scatola accoppiata; OLIG2 = fattore di trascrizione oligodendrocitario 2; SOX9 = fattore di trascrizione SRY-box 9; qPCR = reazione a catena quantitativa della polimerasi; GFAP = proteina acida fibrillare gliale; RBFOX3 = proteina legante l'RNA FOX-1 omologo 3; PDGFRA = fattore di crescita alfa derivato dalle piastrine; PMI = intervallo post mortem; NeuN-555 = topo anti-NeuN coniugato ad AF555; PAX6-APC = topo anti-PAX6 coniugato ad allococianina; OLIG2-488 = topo anti-OLIG2 coniugato a colorante fluorescente verde per la linea laser a 488 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Metriche dipendenti e indipendenti per esperimenti FANS di successo. (A) Effetto del PMI di raccolta dei campioni sulla qualità dei nuclei: pmi più basse consentono il recupero di un numero maggiore di nuclei intatti con risultati adeguati fino a 24 ore. (B) L'inclusione di una fase di lavaggio dopo l'incubazione degli anticorpi non sembra visivamente spostare le popolazioni FANS. (C) Esempio di un esperimento FANS fallito con mancanza di popolazione PAX6+(NeuN-) distinta (a destra) nonostante la presenza di nuclei intatti e fondo basso (a sinistra) (neocorteccia temporale post-mortem, non patologica, 7 h PMI). (D) Rappresentazione della mappa di calore dei dati sn RNA-seq umani adulti che mostrano l'espressione differenziale di PAX6 e di altri due fattori nucleari astrocitari, SOX9 e LHX2, attraverso sottopopolazioni di astrociti protoplasmatici e fibrosi sia nella corteccia che in SVZ, rispetto ad altri tipi di cellule (il gradiente di colore rosso rappresenta lo spettro dei valori medi di espressione genica normalizzati; n = 3 casi di autopsia distinti, 43.619 nuclei totali. (E) Regioni cerebrali distinte (neocorteccia temporale vs. SVZ e striato subjacent) mostrano diversi modelli di separazione NeuN/PAX6/OLIG2. Abbreviazioni: FANS = fluorescence-activate nuclei sorting; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindolo; NeuN = nuclei neuronali; PAX6 = proteina 6 della scatola accoppiata; OLIG2 = fattore di trascrizione oligodendrocitario 2; GFAP = proteina acida fibrillare gliale; ALDH1L1 = 10-formiltetraidrofolato deidrogenasi; LXH2 = LIM homeobox 2; PMI = intervallo post mortem; SSC-A = area di dispersione laterale; FSC-A = area di dispersione in avanti; NeuN-555 = topo anti-NeuN coniugato ad AF555; PAX6-APC = topo anti-PAX6 coniugato ad allococianina; OLIG2-488 = mouse anti-OLIG2 coniugato a colorante fluorescente verde per la linea laser 488 nm; SVZ = zona subventricolare; A(p) = astrociti protoplasmatici (materia grigia); A(f) = astrociti fibrosi (sostanza bianca); OL = oligodendrociti; OPC = cellule progenitrici degli oligodendrociti; EN = neuroni eccitatori; MSN = neuroni spinosi medi; MG = microglia; BVC = cellule dei vasi sanguigni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La progettazione sperimentale secondo il protocollo delineato dovrebbe essere finalizzata dopo aver considerato diversi fattori biologici e tecnici. I campioni di tessuto di partenza sono freschi di congelamento, senza essere stati fissati, e preferibilmente hanno un breve intervallo di raccolta post-mortem per massimizzare il recupero dei nuclei. Sulla base dell'esperienza, un PMI fino a 24 ore consente un adeguato recupero dei nuclei; tuttavia, un PMI di 12 ore o meno è preferibile per ottimizzare il recupero dei nuclei intatti. Ulteriori fattori oltre al PMI, tra cui la temperatura di conservazione del corpo e i livelli di pH del tessuto, possono anche influenzare la resa dei nuclei, ma non sono stati presi in considerazione in questi studi14. Dall'esperienza aneddotica, il recupero di FANS è risultato essere paragonabile allo stesso tessuto immagazzinato fino a cinque anni a -80 ° C, sebbene non siano stati eseguiti esperimenti controllati per valutare la variabilità della conservazione sull'espressione specifica del tipo cellulare. Lavare il campione dopo l'incubazione degli anticorpi è un'altra variabile che potrebbe richiedere considerazione. In generale, una fase di lavaggio diminuisce la resa complessiva, ma può migliorare la separazione di distinte popolazioni immunomarcate. In questi studi, non è stata osservata alcuna differenza nella separazione delle popolazioni NEUN/PAX6 quando si include o si esclude una fase di lavaggio post-anticorpo, ma questa fase può essere utile quando si utilizzano altri anticorpi primari e secondari, specialmente se non sono preconiugati.
A causa della variabilità della sensibilità dell'apparecchiatura di smistamento, è necessario eseguire controlli appropriati ad ogni evento di smistamento. Se si osservano detriti extracellulari eccessivi nel campione risospeso durante la visualizzazione su un emocitometro, il campione può essere fatto passare attraverso un filtro da 40 μm per trattenere solo i nuclei. Se il campione è limitato, le perline contrassegnate con il fluoroforo appropriato possono essere utilizzate anche per i controlli monocolore e FMO. Se i campioni sembrano non essere arricchiti per le popolazioni di astrociti desiderate, come determinato dalla qPCR o dai risultati del sequenziamento, può essere utile chiudere tutte le popolazioni NeuN e PAX6 + (NeuN-) in modo più rigoroso, lasciando più spazio tra i cutoff del gate per le popolazioni positive e negative.
La maggior parte degli studi di convalida qui descritti sono stati eseguiti utilizzando OLIG2 in aggiunta a NeuN e PAX6, per arricchire contemporaneamente le popolazioni di nuclei neuronali, astrociti e progenitori di oligodendrociti (OPC). Si raccomanda di includere OLIG2 come terzo marcatore di lignaggio per arricchire gli astrociti corticali in modo più efficace all'interno della frazione NeuN-. La presenza o l'assenza di OLIG2 coniugato con FITC non sembra spostare la popolazione PAX6+; pertanto, l'ipotesi è che gli esperimenti che escludono OLIG2 si tradurranno in un simile arricchimento degli astrociti. Da notare, è essenziale che la popolazione PAX6+ sia gated dalla popolazione NeuN-, poiché alcune popolazioni neuronali esprimono sia NeuN che PAX615. Gli astrociti possono anche essere ordinati in base all'espressione SOX9; tuttavia, la colorazione e lo smistamento con SOX9 portano ad un arricchimento meno robusto degli astrociti rispetto a PAX6. Sebbene sia stata osservata una netta separazione tra i lignaggi neuronali, astrocitici e OPC nella corteccia adulta, una separazione simile non è stata osservata tra le popolazioni PAX6+ e OLIG2+ nella SVZ adulta e nello striato adiacente.
Mentre è possibile che alcuni astrociti della SVZ esprimano bassi livelli di OLIG2, le popolazioni raccolte sono state convalidate solo da qPCR (dati non mostrati); quindi, il sequenziamento dell'RNA a valle può essere utile per definire ulteriormente la purezza di queste popolazioni. Inoltre, questo protocollo può essere adattato per isolare i nuclei dal tessuto cerebrale fetale congelato e dal tessuto tumorale cerebrale utilizzando marcatori nucleari specifici della popolazione. Poiché questi tessuti sono considerevolmente più cellulari, può essere utile iniziare con meno tessuto per ridurre al minimo l'aggregazione dei nuclei. Quando si selezionano i nuclei aneuploidi dal tessuto neoplastico, il gating DAPI viene regolato per tenere conto della fluorescenza potenzialmente più elevata. Si raccomanda vivamente agli utenti di eseguire un'attenta validazione prima di eseguire FANS su tessuto neoplastico, poiché il protocollo corrente è convalidato solo per campioni non neoplastici. Nel complesso, il protocollo sopra descritto propone una strategia convalidata per isolare popolazioni di astrociti arricchiti, adattata da protocolli precedentemente stabiliti per arricchire i neuroni. Questa metodologia può essere utilizzata per isolare efficacemente le popolazioni di nuclei di astrociti da tessuti cerebrali corticali sia normali che malati da utilizzare in ulteriori analisi molecolari.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ci piace ringraziare i membri in Patologia e Neurochirurgia presso la Icahn School of Medicine del Monte Sinai per l'aiuto con l'approvvigionamento di tessuto cerebrale de-identificato e la citometria a flusso CORE di ISMMS per la consulenza di esperti. Lo studio è stato parzialmente finanziato da NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (a N.M.T.) e R61DA048207 (a S.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS pH 7.2 | Invitrogen | 70013073 | |
| ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60 | Millipore | MAB377A5MI | mouse anti-NeuN conjugated to a fluorescent compound AF555 (excitation, 553 nm; emission, 568 nm) |
| ANTI-OLIG2 ANTIBODY CLONE 211 | Millipore | MABN50A4MI | mouse anti-OLIG2 conjugated to a fluorescent compound AF488 (excitation, 499 nm; emission, 520 nm) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | BP9704-100 | |
| Bright-Line Counting Chamber | Hausser Scientific | 3110V | |
| Calcium Chloride Anhydrous | Fisher | C614-3 | |
| Cell Strainers, 40 µM | SP Scienceware | 136800040 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma | 43815-1G | |
| DNA Library Kit | Illumina, Nextera | FC-121–1030 | |
| DNAse I | Worthington | LS002139 | |
| Dounce Tissue Grinder | WHEATON | 357542 | |
| FACS Sorter | BD Biosciences | BD FACSAria III | |
| Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher | M13-500 | |
| PAX6 (PAX6/496) - 100 TESTS | Novus | NBP234705J | |
| RNA Clean & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian | Clontech Laboratories | 635005 | Fragmentation time of 2.5 minutes, as recommended for low RIN RNA values. |
| Sucrose, crystal certified, ACS, 500 mg | Fisher | S5500 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure | Thermo Scientific | J22638AE | |
| TritonX-100 | Fisher | BP151-500 | non-ionic surfactant in lysis buffer |
| TRIzol LS Reagent | Invitrogen | 10296028 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | reagent for isolation of RNA |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima XE-100 | A94516 | |
| Ultracentrifuge tubes PP 9/16 X 3-1/2 | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure Distilled Water (RNAse-, DNAse-free) | Invitrogen | 10977023 | referred to as distilled water |
| Ultrapure EDTA | Life Technologies | 15576-028 |
References
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