Summary
Vi har udviklet en metode, der beriger og isolerer humane astrocytpopulationer fra friskfrosset væv til brug i downstream molekylære analyser.
Abstract
Kompleksiteten af humane astrocytter forbliver dårligt defineret i primært humant væv, hvilket kræver bedre værktøjer til deres isolering og molekylær karakterisering. Fluorescensaktiveret kernesortering (FANS) kan bruges til med succes at isolere og studere humane neuronale kerner (NeuN +) populationer fra frosset arkivvæv og derved undgå problemer forbundet med håndtering af frisk væv. Imidlertid mangler bestræbelser på tilsvarende at isolere astroglia fra det ikke-neuronale (NeuN-) element. En nyligt udviklet og valideret immunotagging-strategi bruger tre transkriptionsfaktorantistoffer til samtidig at isolere beriget neuronal (NeuN +), astrocyt (parret boksprotein 6 (PAX6) + NeuN-) og oligodendrocytprogenitor (OLIG2 + NeuN-) kernepopulationer fra ikke-syge, friske (ufikserede) snapfrosne postmortem humane temporale neocortexvæv.
Denne teknik viste sig at være nyttig til karakterisering af celletypespecifikke transkriptomændringer i primær patologisk epilepsi neocortex. Transkriptomiske analyser bekræftede, at PAX6 + NeuN-sorterede populationer er robust beriget til pan-astrocytmarkører og fanger astrocytter under både hvilende og reaktive forhold. Dette papir beskriver FANS-metoden til isolering af astrocytberigede kernepopulationer fra friskfrosset human cortex, herunder vævsdissociation til single-nucleus (sn) suspension; immunotagging af kerner med anti-NeuN og anti-PAX6 fluorescerende konjugerede antistoffer; FANS gating strategier og kvalitetskontrol målinger til optimering af følsomhed og specificitet under sortering og til bekræftelse af astrocyt berigelse; og anbefalet indkøb til downstream transkriptom- og kromatintilgængelighedssekventering ved bulk- eller sn-opløsning. Denne protokol gælder for ikke-nekrotiske, friskfrosne, humane kortikale prøver med forskellige patologier og anbefalet vævsindsamling efter døden inden for 24 timer.
Introduction
Den molekylære kompleksitet af humane astrocytter forbliver dårligt defineret i primært væv, hvilket kræver bedre værktøjer til deres isolering og karakterisering ved høj opløsning, både i sundhed og sygdom. Adskillelse af intakte humane neuroner og glia fra deres niche har vist sig vanskelig på grund af begrænset adgang til friske hjernevævsprøver, den stærkt sammenkoblede karakter af glia- og neuronale processer og uundgåelig cellulær aktivering under behandlingen, som alle begrænser den molekylære karakterisering af disse celletyper ex vivo1 . Fluorescensaktiveret kernesortering (FANS) er opstået som et alternativ til levende cellesortering, hvilket muliggør dissociation og immunotagging af kernepopulationer fra frosset væv. I det sidste årti er FANS blevet meget udbredt til isolering og molekylær karakterisering af human neuronale (NeuN +) kernepopulationer i en række hjerneprøver og anatomiske regioner 1,2,3,4.
Imidlertid har lignende metoder til isolering af specifikke gliakerner subpopulationer fra human cortex været begrænsede, hvilket fører til en relativ mangel på raffinement i forståelsen af astrocytkompleksitet i både normale og syge væv. Til dette formål blev en tidligere offentliggjort protokol tilpasset til isolering af humane neuronale populationer ved anvendelse af FANS4, og en metode blev valideret til berigelse for astrocytter (og for oligodendrogliale forfædre) ved anvendelse af en tredobbelt antistofkombination, der fanger astrocytter i både hvilende og reaktive tilstande5. For specifikt at berige for astrocytter i NeuN-fraktionen blev antistoffer anvendt mod en af to transkriptionsfaktorer, der vides at være differentielt udtrykt på tværs af astrocytpopulationer, PAX6 eller SRY-box transkriptionsfaktor 9 (SOX9)6,7. PAX6 udtrykkes stærkt under tidlig fosterudvikling inden for radiale glia-lignende forfædre i kimzoner og bidrager til både neurogenese og gliogenese 8,9,10,11 samt til retinal neuronal specifikation 12. Hos voksne er PAX6 differentielt overudtrykt i hvilende humane astrocytter6 og viser protein co-ekspression med glial fibrillary acidic protein (GFAP) i humane epilepsivæv astrocytter13.
Denne protokol beskriver den samtidige isolering af neokortikale neuronale og astrocytberigede kernepopulationer af FANS. Frisk (ufiks) snapfrosset (dvs. friskfrosset) postmortemvæv opsamlet fra voksen cortex adskilles først mekanisk og kemisk. Efter lysis og ultracentrifugering i en saccharosegradient kasseres de cytoplasmatiske og ekstracellulære komponenter, mens kernerne bevares. Kerner mærkes derefter med fluorescerende konjugerede nukleare antistoffer svarende til de ønskede mållinjer og sorteres ved hjælp af FANS. Efter denne tilgang demonstreres berigelse af astrocytter i de indsamlede PAX6 + NeuN-populationer, valideret både af et målrettet qPCR-panel såvel som ved downstream nuklear RNA-sekventering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Programmet for beskyttelse af mennesker ved Icahn School of Medicine på Mount Sinai (ISMMS) og dets Institutional Review Board (IRB) sikrer den etiske forskningspraksis og overholdelse af føderale, statslige og institutionelle regler. I denne undersøgelse blev alle anvendte postmortem-prøver afidentificeret, opnået under passende samtykke gennem biorepositoriet og blev fritaget for betegnelsen "human forskning" af ISMMS's IRB (HS # 14-01007).
1. Forberedelse af buffer
BEMÆRK: Hvis du udfører downstream RNA-sekventering, skal du grundigt behandle alle arbejdsområder og værktøjer med RNase Dekontamineringsopløsning for at forhindre mRNA-nedbrydning.
- Forbered lysis buffer.
- Følgende opløses i destilleretH2Oop til 50 ml: 5,47 g saccharose (0,32 M endelig), 250 μL 1 MCaCl2 (5 mM endelig), 150 μL 1 M Mg(CH3COO)2 (3 mM endelig), 10 μL 500 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) (0,1 mM endelig), 500 μL 1 M Tris-HCi (pH 8) (10 mM endelig), 500 μL 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM endelig), 50 μL Triton X-100 (0,1% endelig) og 17 μL 3 M dithiothreitol (DTT, 1 mM final, tilsæt frisk) (se materialetabellen).
- Forbered saccharosebuffer
- Følgende opløses i destilleretH2Oop til 50 ml: 30,78 g saccharose (1,8 M endelig), 150 μL 1 M Mg (CH3COO)2 (3 mM endelig), 500 μL 1 M Tris-HCi (pH 8) (10 mM endelig), 17 μL 3 M DTT (1 mM endelig, tilsæt frisk).
2. Frosset vævsdissociation i enkeltkernesuspension
- Tilsæt 4 ml iskold lysisbuffer til en 7 ml glasvævsdouncer (kværn), og hold den på is. Disseker ca. 200-400 mg friskfrosset human voksen cortex, dounce ca. 50x, og overfør vævshomogenatet til et 12 ml ultracentrifuge polypropylenrør.
- Ved hjælp af en 5 ml pipette tilsættes 6,5 ml iskold saccharosebuffer til bunden af ultracentrifugerøret, idet man sørger for ikke at forstyrre laget mellem saccharose og vævshomogenatet.
BEMÆRK: Ved behandling af yderligere prøver skal du omhyggeligt afbalancere rørene efter vægt ved at tilføje yderligere lysisbuffer til den lettere prøve. Præcis afbalancering af ultracentrifugerørene er afgørende for at forhindre beskadigelse af rotoren og sikre rotation med den rette hastighed.
3. Ultracentrifugering
- Ultracentrifuge lysatet ved 24.400 o / min (101.814 × g) i 1 time ved 4 °C. Opsuge forsigtigt supernatanten og snavs uden at forstyrre pelleten.
BEMÆRK: En pille er muligvis ikke synlig, hvis den starter med mindre end 200 mg væv. - Der tilsættes 600 μL phosphatbufferet saltvand (PBS) (Ca2+, Mg2+ fri) til kernepellet og inkuberes på is i 10 minutter, før det genoplives.
- Pipetter op og ned 50 gange for at genoplive kernerne pellet på is.
- Brug et hæmocytometer til at visualisere de intakte kerner under et mikroskop og for at sikre, at koncentrationen af resuspensionen er over 105 kerner / ml, før du fortsætter til næste trin (kombiner 10 μL af de resuspenderede kerner med 10 μL trypanblå).
4. Antistof inkubation
- For at immuntagge prøven for FANS tilsættes 500 μL af den resuspenderede prøvepellet, 490 μL 1x PBS (Ca2+, Mg2+ fri), 10 μL 10% BSA (0,1% endelig), 1 μL muse-anti-NeuN-antistof konjugeret til AF555 (NeuN-AF555, 1:1000 slutkoncentration) og 1 μL museanti PAX6-antistof konjugeret med allofycocyanin (PAX6-APC, 1:1000 slutkoncentration).
BEMÆRK: Alternative antistoffer konjugeret med andre fluorophorer kan tilsættes (se diskussion). Her blev mus anti-OLIG2 konjugeret til AF488 (1:1000 koncentration) brugt med gunstige resultater. - Udfør kun 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI)-only og enkeltfarvekontroller for at indstille gatingparametre ved hjælp af en lille mængde af prøven efter behov.
- For at udføre AF555 enkeltfarvekontrol tilsættes 20 μL af den resuspenderede prøvepellet, 970 μL 1x PBS (Ca2+, Mg2+ fri), 10 μL 10% BSA (0,1% endelig) og 1 μL NeuN-AF555 antistof (1: 1000 koncentration).
- For at udføre APC-enkeltfarvekontrol tilsættes 20 μL af den resuspenderede prøvepellet, 970 μL 1X PBS (Ca2+, Mg2+ fri), 10 μL 10% BSA (0,1% endelig) og 1 μL PAX6-APC-antistof (1: 1000 koncentration).
- For at udføre dapi-kontrol tilsættes 20 μL af den resuspenderede prøvepille, 970 μL 1X PBS (Ca2+, Mg2+ fri) og 10 μL 10% BSA (0,1% endelig) (DAPI tilføjes senere, se 4.4).
BEMÆRK: Hvis der anvendes mere end to antistoffer, anbefales det at udføre fluorescens-minus-en (FMO) kontrol ud over enkeltfarvekontrollerne.
- Prøverne og betjeningsanordningerne inkuberes med rotation i mørke i 1 time ved 4 °C.
- Tilføj DAPI kl. 1:1000 til alle prøver og kontroller, og fortsæt med sorteringen.
5. Fluorescensaktiveret kernesortering (FANS)
BEMÆRK: Det anbefales at bruge en institutionel flowcytometrifacilitet med hjælp fra uddannet personale, medmindre det allerede er dygtigt i flowcytometri / sorteringsteknikker.
- Port som vist nedenfor.
- Først og for hver prøve, port for forward scatter (FSC-A) vs. sidespredning (SSC-A) for at inkludere partikler i det passende størrelsesområde for kerner og dermed udelukke røde blodlegemer og snavs (figur 1A).
BEMÆRK: Et meget rent kernepræparat kan skelne mellem en mindre affaldsklynge og en kerneklynge. - Dernæst og for hver prøve, gate af FSC-A vs. FSC-W (eller FSC-A vs. FSC-H) og SSC-A vs. SSC-W (eller SSC-A vs. SSC-H) for kun at omfatte singletkerner (figur 1B).
- Dernæst og for hver prøve gate by DAPI til at omfatte intakte kernesingler (DAPI-høj gated population), eksklusive affald (DAPI-lav, til venstre for gated population) og doublets (til højre for gated population) (figur 1C).
- Indstil yderligere gating baseret på fluorescenskontroller, bestemt visuelt som forskellige klynger på FACS-plot.
- Kør kun DAPI-kontrol for at bestemme baggrundsfarvning af populationer i fravær af antistof (figur 1D og figur 2A).
- Kør NeuN-AF555-only-kontrol for at bestemme afskæringen for NeuN+ farvning i kanalen for AF555 (figur 2B).
- Kør PAX6-APC-kontrol for at bestemme afskæringen for PAX6+ farvning i APC-kanalen (figur 2C).
- Kør yderligere enkeltfarvekontroller, hvis du bruger flere antistoffer (figur 2D, E).
BEMÆRK: Hvis du bruger mere end to antistoffer, anbefales en FMO-kontrol til at visualisere eventuelle skift i populationer.
- Når alle kontroller er kørt, skal du tegne portene til NeuN+ og PAX6+ samlinger over de etablerede tærskler.
- Gate NeuN + -populationen for at indsamle neuroner (figur 1E og figur 2F).
- Gate PAX6 + -populationen fra NeuN-populationen for at indsamle astrocytter (figur 1E, F og figur 2F).
- Gate og indsamle yderligere glialpopulationer (såsom oligodendrocytprogenitorceller, som vist her af OLIG2+) fra NeuN-PAX6-populationen (figur 1F).
BEMÆRK: Hvis det er vanskeligt at bestemme passende gating cutoffs med flowcytometrisoftwaren på grund af utydelige populationer, kan det være nyttigt at ændre antallet af begivenheder, der visualiseres (enten øge eller reducere antallet af hændelser på FANS-plottet).
- Først og for hver prøve, port for forward scatter (FSC-A) vs. sidespredning (SSC-A) for at inkludere partikler i det passende størrelsesområde for kerner og dermed udelukke røde blodlegemer og snavs (figur 1A).
- Der indsamles prøver på passende vis på grundlag af den påtænkte downstreamanalyse.
6. Indsamling af FANS-populationer til downstream molekylære analyser
- Til bulk RNA-sekventering opsamles 50.000-500.000 kerner i PBS (se også pkt. 7.1).
- Der tilsættes 2 ml saccharoseopløsning, 50 μL 1 MCaCl2 og 30 μL 1 M Mg(CH3COO)2, og der fyldes med PBS op til 10 ml.
- Inverter og inkuber på is i 15 minutter, og centrifuger derefter ved 900 × g i 10-15 minutter ved 4 °C.
- Aspirere supernatanten, resuspend i 1 ml RNA-ekstraktionsreagens, hvirvel, frys på tøris og opbevar ved -80 ° C.
- Alternativt indsamles prøverne direkte i 200 μL rna-ekstraktionsreagens. Rna-ekstraktionsreagenset tilsættes op til 1 ml efter sortering, idet reagensets forhold på 1:1 til den sorterede prøve opretholdes. Vortex, frys på tøris og opbevares ved -80 °C.
- Til bulkassay til transposase-tilgængelig kromatin ved hjælp af sekventering (ATAC-seq) opsamles 50.000-75.000 kerner i PBS i et mikrocentrifugerør belagt med 5% bovint serumalbumin (BSA). Kernerne fryses på tøris/-80 °C, eller de anvendes straks til ATAC-forberedelse.
- For sn RNA-seq eller ATAC-seq opsamles kerner i 0,04% BSA i PBS (se også pkt. 7.2).
7. Tips til forberedelse før biblioteket
- Bulk nuklear RNA sekventering bibliotek forberedelse
- Efter opsamling i RNA-ekstraktionsreagens udføres standard phenol / chloroform RNA-ekstraktion ved tilsætning af phenol / chloroform og udfældning af RNA fra det øverste vandige lag med ethanol efterfulgt af DNase-fordøjelse på rør (15 min).
- Udfør RNA-oprydning og koncentrer i et endeligt volumen på 15 μL vand.
BEMÆRK: Ved hjælp af denne metode er repræsentativ genopretning fra 300 mg voksen cortexprøve ~ 300.000 NeuN + kerner (15-20 ng / μL total RNA efter oprydning og koncentration) og ~ 250.000 PAX6 + kerner (10-12 ng / μL total RNA efter oprydning og koncentration). Dette repræsentative udbytte kan variere meget baseret på prøvekvalitet, gating stringens og RNA-genopretning. - Udfør kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR) før sekventering for at bekræfte berigelse af astrocytter baseret på høj differentiel ekspression af kanoniske astrocytmarkører (GFAP, SOX9), 10-formyltetrahydrofolatdehydrogenase (ALDH1L1)) og udtømning af neuronale og andre celleafstamningsmarkører (figur 1G).
BEMÆRK: Indsamling af den dobbeltnegative population (NeuN-PAX6-) giver mulighed for en mere præcis, multitiered qPCR-kvalitetskontrolanalyse for den relative berigelse af astrocytter (figur 2H). - Generer RNA-seq-biblioteker ved hjælp af et sæt, der anbefales til lave RNA-integritetstalværdier, som forventet fra postmortem-prøver.
- Forberedelse af enkeltkernesekventeringsbibliotek
- Udfør sn-sekventering gennem en institutionel sekventeringskerne.
- Til nanofluidikbaseret behandling og sekventering skal du anvende den anbefalede koncentration på 1 × 106 celler / ml i mindst 60 μL 1x PBS + 0,04% BSA til enkeltkerne RNA-sekventering (snRNA-seq) og 3 × 106 celler / ml i mindst 20 μL 1x PBS + 0,04% BSA til enkeltkerneassay til transposase-tilgængelig kromatin ved hjælp af sekventering (snATAC-sekq).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kerner blev opsamlet fra frisk (ufiks) snapfrosset temporal neocortexvæv med en postmortem-opsamlingstid på 12 timer. Efter vævsdissociation i kernesuspension blev prøver inkuberet med antistoffer mod NeuN, PAX6 og OLIG2 og sorteret i henhold til gating vist i figur 1 og figur 2. Kerner blev indsamlet fra NeuN+, PAX6+NeuN- og OLIG2+NeuN-sorterede populationer (figur 1E,F og figur 2F). Et målrettet qPCR-panel afslørede berigelse for pan-astrocytmarkørerne, GFAP og ALDH1L1, i PAX6 +(NeuN-) populationen (figur 1G og figur 2H). Derudover blev OLIG2+ populationen beriget til oligodendrocytprogenitorcellemarkøren PDGFRA (figur 1G). Bulk RNA-sekventering af de indsamlede populationer viste komparativ berigelse af astrocytmarkører og udtømning af neuronale markører i PAX6 +(NeuN-) populationen (figur 1H). Immunfluorescens bekræftede koloniseringen af PAX6 med GFAP i voksne humane kortikale astrocytter (figur 1I).
Undersøgelse af enkeltfarvekontroller afslører forskellige positive og negative populationer for hver markør, hvilket muliggjorde indstillingen af nøjagtige afskæringer til indsamling (figur 2A-G). Desuden blev astrocytberiget FANS-isolation sammenlignet med to forskellige antistoffer mod astrocytkernemarkører, SOX9 og PAX6. En højere procentdel af kernehændelser blev fanget af FANS ved hjælp af PAX6 (~ 13,8%) end af FANS, der brugte SOX9 (~ 6%) inden for den astrocytberigede port (figur 2F, G). Et målrettet qPCR-panel afslørede berigelse for GFAP, PAX6 og SOX9 i både SOX9 +(NeuN-) og PAX6+(NeuN-) populationer (figur 2H). Retroaktiv sammenligning af dissociation og farvning af flere prøver med varierende postmorteminterval (PMI) af vævsindsamling afslørede, at en kortere PMI var forbundet med større intakt kernegendannelse (figur 3A). Frosset væv med en PMI på op til 24 timer gav en høj hastighed af intakte kerner, op til 90%; ved 30 timers PMI kunne der dog genvindes meget få intakte kerner (figur 3A). Inkludering af et antistofvasktrin i standardprotokollen (som typisk udelader dette trin for at optimere genopretningen) afslørede ikke signifikante forskydninger i adskillelsen af forskellige NeuN +/- eller PAX6 +/- populationer (figur 3B).
Lejlighedsvis kunne der ses dårlig adskillelse af PAX6 + NeuN-populationer, selv i prøver med en høj procentdel af levedygtige kerner (figur 3C), hvilket nødvendiggør gentagelse af vævsdissociationen og FANS-protokollen. Enkeltkerne RNA-seq-undersøgelser prioriterede yderligere PAX6 som en topdifferentieret udtrykt nuklear transkriptionsfaktor på tværs af både protoplasmatiske og fibrøse voksne astrocytunderpopulationer, ikke kun i neocortex, men også i den subventrikulære zone (SVZ) og tilstødende striatum (figur 3D). Sammenligning af NEUN/PAX6/OLIG2 triple FANS mellem neocortex og striatum afledt af den samme hjerneprøve viste regionsspecifikke forskelle i adskillelsen af PAX6+ kerner (figur 3E). Denne protokol er i øjeblikket kun valideret for neocortex.
Figur 1: Validering af neuron- og astrocytberiget isolering af FANS. (A-F) Repræsentative eksempler på sekventiel FANS-gating for at udelukke snavs og dubletter (A-C) og definere baggrundsfarvning ved hjælp af (D) en DAPI-kun kontrol til indsamling af (E-F) beriget neuronal (NeuN+), astrocyt (PAX6+NeuN-) og OPC (OLIG2++NeuN-) kernepopulationer. (G) Minimalt qPCR-panel ved hjælp af pan-astrocyt (GFAP, ALDH1L1), neuronal (RBFOX3) og OPC (PDGFRA) markører til kvalitetskontrol af de indsamlede populationer (A-G: temporal neocortex obduktionsprøve uden patologi, 12 timers PMI, 100.000 viste hændelser; stiplede linjer repræsenterer positivt gated sekventielle populationer; faste linjer repræsenterer endelig samling af celletype berigede populationer). (H) Heatmap genereret fra rækkenormaliserede bulk RNA-sekventeringsdata, der viser ekspression af kanoniske astrocyt- og neuronale markører i PAX6+ og NeuN+ sorterede populationer (n = 3 obduktionstilfælde, temporal neocortex uden patologi, PMI 12-21 h). (I) Repræsentativ immunfluorescensbillede af PAX6, GFAP og NeuN i human neocortex. Pile angiver astrocytter, der udtrykker PAX6 og GFAP. Forkortelser: FANS = fluorescensaktiveret kernesortering; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindol; Neun = neuronale kerner; PAX6 = parret kasseprotein 6; OLIG2 = oligodendrocyt transkriptionsfaktor 2; OPC = oligodendrocyt stamcelle; qPCR = kvantitativ polymerasekædereaktion; GFAP = glial fibrillært surt protein ; ALDH1L1 = 10-formyltetrahydrofolat dehydrogenase; RBFOX3 = RNA-bindende protein FOX-1 homolog 3; PDGFRA = blodpladeafledt vækstfaktor alfa; PMI = postmortem interval; SSC-A = sidespredningsområde; FSC-A = fremadrettet spredningsområde; SSC-W = sidespredningsbredde; FSC-W = fremadgående spredningsbredde; NeuN-555 = mus anti-NeuN konjugeret til AF555; PAX6-APC = mus anti-PAX6 konjugeret til allophycocyanin; OLIG2-488 = mus anti-OLIG2 konjugeret til grønt fluorescerende farvestof til 488 nm laserlinjen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Sammenlignende isolering af astrocytberigede populationer ved hjælp af PAX6- eller SOX9-antistoffer. (A-E) Enkeltfarvekontroller for DAPI, NeuN, PAX6, SOX9 og OLIG2 definerer positive / negative cutoffs i de respektive fluorescenskanaler. (F-G) Sammenlignende FANS-metode til astrocytberiget isolering ved anvendelse af (F) NeuN/PAX6 eller (G) NeuN/SOX9 antistoffer. En større procentdel af begivenhederne fanges af PAX6 end af SOX9 inden for den astrocytberigede port. (A-G: identisk postmortem ikke-patologisk temporal neocortex-prøve anvendt til alle forsøg; 12 timers PMI; 10.000 hændelser vist). (H) Kvalitetskontrol qPCR-analyse bekræfter berigelse af astrocytmarkører og udtømning af ikke-astrocytmarkører i PAX6 +(NeuN-) og SOX9+(NeuN-) sorterede populationer fra F-G (data normaliseret til ACTB og kvantificeret som foldændring af NeuN+ populationen). Forkortelser: DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindol; Neun = neuronale kerner; PAX6 = parret kasseprotein 6; OLIG2 = oligodendrocyt transkriptionsfaktor 2; SOX9 = SRY-box transkriptionsfaktor 9; qPCR = kvantitativ polymerasekædereaktion; GFAP = glial fibrillært surt protein ; RBFOX3 = RNA-bindende protein FOX-1 homolog 3; PDGFRA = blodpladeafledt vækstfaktor alfa; PMI = postmortem interval; NeuN-555 = mus anti-NeuN konjugeret til AF555; PAX6-APC = mus anti-PAX6 konjugeret til allophycocyanin; OLIG2-488 = mus anti-OLIG2 konjugeret til grønt fluorescerende farvestof til 488 nm laserlinjen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Afhængige og uafhængige målinger for vellykkede FANS-eksperimenter. (A) Effekt af prøveindsamling PMI på kvaliteten af kerner: lavere PMI muliggør genopretning af et større antal intakte kerner med tilstrækkelige resultater op til 24 timer. (B) Inkluderingen af et vasketrin efter antistofinkubation ser ikke visuelt ud til at skifte FANS-populationer. (C) Eksempel på et mislykket FANS-eksperiment med mangel på særskilt PAX6+(NeuN-) population (til højre) på trods af tilstedeværelsen af intakte kerner og lav baggrund (til venstre) (postmortem temporal neocortex, ikke-patologisk, 7 h PMI). (D) Heatmap-repræsentation af voksne humane sn RNA-seq-data, der viser differentiel ekspression af PAX6 og to andre astrocytkernefaktorer, SOX9 og LHX2, på tværs af protoplasmatiske og fibrøse astrocyt-subpopulationer i både cortex og SVZ sammenlignet med andre celletyper (rød farvegradient repræsenterer spektrum af log-normaliserede gennemsnitlige genekspressionsværdier; n = 3 forskellige obduktionstilfælde, 43.619 samlede kerner. (E) Forskellige hjerneområder (temporal neocortex vs. SVZ og subjacent striatum) viser forskellige mønstre af NeuN/PAX6/OLIG2 adskillelse. Forkortelser: FANS = fluorescensaktiveret kernesortering; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindol; Neun = neuronale kerner; PAX6 = parret kasseprotein 6; OLIG2 = oligodendrocyt transkriptionsfaktor 2; GFAP = glial fibrillært surt protein ; ALDH1L1 = 10-formyltetrahydrofolat dehydrogenase; LXH2 = LIM homeobox 2; PMI = postmortem interval; SSC-A = sidespredningsområde; FSC-A = fremadrettet spredningsområde; NeuN-555 = mus anti-NeuN konjugeret til AF555; PAX6-APC = mus anti-PAX6 konjugeret til allophycocyanin; OLIG2-488 = mus anti-OLIG2 konjugeret til grønt fluorescerende farvestof til 488 nm laserlinjen; SVZ = subventrikulær zone; A (p) = protoplasmatiske (grå stof) astrocytter; A (f) = fibrøse (hvide substans) astrocytter; OL = oligodendrocytter; OPC = oligodendrocytprogenitorceller; EN = excitatoriske neuroner; MSN = mellemstore spiny neuroner; MG = microglia; BVC = blodkarceller. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eksperimentelt design efter den skitserede protokol bør færdiggøres efter at have overvejet flere biologiske og tekniske faktorer. Startvævsprøver er friskfrosne uden at være blevet fikseret og har helst et kort postmortem-opsamlingsinterval for at maksimere kernegendannelsen. Baseret på erfaring giver en PMI på op til 24 timer mulighed for tilstrækkelig kernegenvinding; en PMI på 12 timer eller mindre foretrækkes dog for at optimere intakt kernegenvinding. Yderligere faktorer bortset fra PMI, herunder temperaturen på kropsopbevaring og pH-niveauer i vævet, kan også påvirke kerneudbyttet, men blev ikke taget i betragtning i disse undersøgelser14. Fra anekdotisk erfaring har FANS-genopretning vist sig at være sammenlignelig med det samme væv, der opbevares op til fem år ved -80 ° C, selvom kontrollerede eksperimenter ikke blev udført for at vurdere variabiliteten af opbevaring på celletypespecifik ekspression. Vask af prøven efter antistofinkubation er en anden variabel, der muligvis skal overvejes. Generelt reducerer et vasketrin det samlede udbytte, men kan forbedre adskillelsen af forskellige immunmærkede populationer. I disse undersøgelser blev der ikke observeret nogen forskel i adskillelsen af NEUN/PAX6-populationer, når et post-antistof-vasketrin blev inkluderet eller ekskluderet, men dette trin kan være gavnligt ved anvendelse af andre primære og sekundære antistoffer, især hvis de ikke er prækonjugerede.
På grund af variationen i sorteringsudstyrets følsomhed er det nødvendigt at udføre passende kontroller ved hver sorteringshændelse. Hvis der ses overdreven ekstracellulært affald i den resuspenderede prøve, når der visualiseres på et hæmocytometer, kan prøven føres gennem et 40 μm filter for kun at bevare kernerne. Hvis prøven er begrænset, kan perler mærket med den relevante fluorofor også anvendes til enkeltfarve- og FMO-kontroller. Hvis prøverne ser ud til ikke at være beriget for de ønskede astrocytpopulationer, som bestemt enten ved qPCR eller sekventeringsresultater, kan det være nyttigt at gate alle NeuN- såvel som PAX6 + (NeuN-) populationer strengere, hvilket efterlader mere plads mellem gate cutoffs for positive og negative populationer.
De fleste af de valideringsundersøgelser, der er beskrevet her, blev udført ved hjælp af OLIG2 ud over NeuN og PAX6 for samtidig at berige for neuronale, astrocyt- og oligodendrocytprogenitor (OPCs) kernepopulationer. Det anbefales at inkludere OLIG2 som en tredje afstamningsmarkør for at berige for kortikale astrocytter mere effektivt inden for NeuN-fraktionen. Tilstedeværelsen eller fraværet af FITC-konjugeret OLIG2 ser ikke ud til at flytte PAX6+ populationen; Derfor er antagelsen, at eksperimenter, der udelukker OLIG2, vil resultere i lignende astrocytberigelse. Bemærk, at det er vigtigt, at PAX6 + -populationen er gated fra NeuN-populationen, da nogle neuronale populationer udtrykker både NeuN og PAX615. Astrocytter kan også sorteres efter SOX9-ekspression; farvning og sortering med SOX9 fører imidlertid til mindre robust berigelse af astrocytter sammenlignet med PAX6. Selvom der blev observeret klar adskillelse mellem neuronale, astrocytiske og OPC-afstamninger i den voksne cortex, blev der ikke observeret en lignende adskillelse mellem PAX6+ og OLIG2+ populationer i den voksne SVZ og tilstødende striatum.
Selvom det er muligt, at nogle astrocytter fra SVZ udtrykker lave niveauer af OLIG2, blev de indsamlede populationer kun valideret af qPCR (data ikke vist); derfor kan downstream RNA-sekventering være nyttig til yderligere at definere renheden af disse populationer. Derudover kan denne protokol tilpasses til at isolere kerner fra frosset føtalt hjernevæv og hjernetumorvæv ved hjælp af populationsspecifikke nukleare markører. Fordi disse væv er betydeligt mere cellulære, kan det være nyttigt at starte med mindre væv for at minimere aggregeringen af kerner. Ved sortering af aneuploide kerner fra neoplastisk væv justeres DAPI-gating for at tage højde for potentielt højere fluorescens. Det anbefales kraftigt, at brugerne udfører en omhyggelig validering, inden de udfører FANS på neoplastisk væv, da den nuværende protokol kun er valideret for ikke-neoplastiske prøver. Samlet set fremsætter den ovenfor beskrevne protokol en valideret strategi for isolering af berigede astrocytpopulationer, tilpasset fra tidligere etablerede protokoller til berigelse for neuroner. Denne metode kan bruges til effektivt at isolere astrocytkernepopulationer fra både normale og syge kortikale hjernevæv til brug i yderligere molekylære analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke medlemmer i patologi og neurokirurgi ved Icahn School of Medicine på Mount Sinai for hjælp til indkøb af afidentificeret hjernevæv og ISMMS's Flow Cytometry CORE til ekspertrådgivning. Undersøgelsen blev delvist finansieret af NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (til N.M.T.) og R61DA048207 (til S.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS pH 7.2 | Invitrogen | 70013073 | |
| ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60 | Millipore | MAB377A5MI | mouse anti-NeuN conjugated to a fluorescent compound AF555 (excitation, 553 nm; emission, 568 nm) |
| ANTI-OLIG2 ANTIBODY CLONE 211 | Millipore | MABN50A4MI | mouse anti-OLIG2 conjugated to a fluorescent compound AF488 (excitation, 499 nm; emission, 520 nm) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | BP9704-100 | |
| Bright-Line Counting Chamber | Hausser Scientific | 3110V | |
| Calcium Chloride Anhydrous | Fisher | C614-3 | |
| Cell Strainers, 40 µM | SP Scienceware | 136800040 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma | 43815-1G | |
| DNA Library Kit | Illumina, Nextera | FC-121–1030 | |
| DNAse I | Worthington | LS002139 | |
| Dounce Tissue Grinder | WHEATON | 357542 | |
| FACS Sorter | BD Biosciences | BD FACSAria III | |
| Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher | M13-500 | |
| PAX6 (PAX6/496) - 100 TESTS | Novus | NBP234705J | |
| RNA Clean & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian | Clontech Laboratories | 635005 | Fragmentation time of 2.5 minutes, as recommended for low RIN RNA values. |
| Sucrose, crystal certified, ACS, 500 mg | Fisher | S5500 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure | Thermo Scientific | J22638AE | |
| TritonX-100 | Fisher | BP151-500 | non-ionic surfactant in lysis buffer |
| TRIzol LS Reagent | Invitrogen | 10296028 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | reagent for isolation of RNA |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima XE-100 | A94516 | |
| Ultracentrifuge tubes PP 9/16 X 3-1/2 | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure Distilled Water (RNAse-, DNAse-free) | Invitrogen | 10977023 | referred to as distilled water |
| Ultrapure EDTA | Life Technologies | 15576-028 |
References
- Mitchell, A., Roussos, P., Peter, C., Tsankova, N., Akbarian, S. The future of neuroepigenetics in the human brain. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 128, 199-228 (2014).
- Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S.
- Akbarian, S., et al.
- Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), e914 (2008).
- Tome-Garcia, J., et al. Cell type-specific isolation and transcriptomic profiling informs glial pathology in human temporal lobe epilepsy. BioRxiv. , (2020).
- Zhang, Y., et al. Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse. Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).
- Sun, W., et al. SOX9 Is an astrocyte-specific nuclear marker in the adult brain outside the neurogenic regions. Journal of Neuroscience. 37 (17), 4493-4507 (2017).
- Manuel, M. N., Mi, D., Mason, J. O., Price, D. J. Regulation of cerebral cortical neurogenesis by the Pax6 transcription factor. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 70 (2015).
- Sakurai, K., Osumi, N. The neurogenesis-controlling factor, Pax6, inhibits proliferation and promotes maturation in murine astrocytes. Journal of Neuroscience. 28 (18), 4604-4612 (2008).
- Zhong, S., et al.
- Pollen, A., et al. Molecular identity of human outer radial glia during cortical development. Cell. 163 (1), 55-67 (2015).
- Cvekl, A., Callaerts, P. PAX6: 25th anniversary and more to learn. Experimental Eye Research. 156, 10-21 (2017).
- Goc, J., Liu, J. Y., Sisodiya, S. M., Thom, M. A spatiotemporal study of gliosis in relation to depth electrode tracks in drug-resistant epilepsy. European Journal of Neuroscience. 39 (12), 2151-2162 (2014).
- Monoranu, C. M., et al. pH measurement as quality control on human post mortem brain tissue: a study of the BrainNet Europe consortium. Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (3), 329-337 (2009).
- Ninkovic, J., et al. The transcription factor Pax6 regulates survival of dopaminergic olfactory bulb neurons via crystallin αA. Neuron. 68 (4), 682-694 (2010).
